Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Vi beskriver metoder for å isolere hjørnetann nøytrofile fra hele blod og visualisere netto formasjon i live nøytrofile bruker fluorescens mikroskopi. Også beskrevet er protokoller å kvantifisere netto dannelse og citrullinated histone H3 (citH3) uttrykk med immunofluorescence mikroskopi.

Abstract

Svar på invaderende patogener, slipp nøytrofile nøytrofile ekstracellulære feller (nett), som er ekstracellulære nettverk av DNA dekorert med histones og antimikrobielle proteiner. Overdreven netto dannelse (NETosis) og citH3 utgivelse i sepsis er tilknyttet flere orgel dysfunksjon og dødelighet i mus og mennesker, men konsekvensene i hunder er ukjent. Her, beskriver vi en teknikk for å isolere hjørnetann nøytrofile fra fullblod for observasjon og kvantifisering av NETosis. Leukocytter-rich plasma, generert av dekstran sedimentering, deles av kommersielt tilgjengelig tetthet gradert separasjon media og granulocytter samlet antall og levedyktighet testing. For å observere sanntid NETosis i live nøytrofile, legges cellen permeant og celle impermeant fluorescerende nukleinsyre flekker til nøytrofile aktivert lipopolysakkarid (LPS) eller phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Endringer i kjernefysiske morfologi og netto formasjon er observert over tid ved fluorescens mikroskopi. In vitro NETosis er mer preget av co-colocalization av celle-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) og citrullinated histone H3 (citH3) bruker en modifisert dobbel-immunolabelling-protokoll. Å objektivt kvantifisere netto dannelse og citH3 uttrykk med fluorescens mikroskopi, garn og citH3-positive celler er kvantifisert på forblindet måte med tilgjengelig programvare. Denne teknikken er en bestemt analysen vurdere i vitro kapasiteten av hjørnetann nøytrofile å gjennomgå NETosis.

Introduction

Nøytrofile er kortvarige granulocytter ansvarlig for det første forsvaret mot invaderende patogener. Nøytrofile, rekruttert til området av smitte, eliminerer mikroorganismer fagocytose, omfatter degranulering og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS)1. I nærvær av bakterier eller endotoxins dekorert nøytrofile utgivelsen nøytrofile ekstracellulære feller (nett), består av ekstracellulære chromatin med histones og detaljert proteiner som elastase og myeloperoxidase (MPO)2. Selv om garn har uunnværlig antimikrobielle egenskaper, antyder øke experimental og klinisk bevis at overivrig netto formasjon under sepsis kan føre til flere orgel dysfunksjon og død3,4, 5 , 6.

Fordi garn kan spille en liknende patofysiologiske rolle i hunder, kan terapeutisk intervensjon som forhindre eller redusere netto formasjon tjene som ny behandling strategier i septisk dyr. Derfor er det behov for en pålitelig teknikk for å vurdere og kvantifisere NETosis og netto komponenter i hundene. NET komponenter, inkludert celle-gratis DNA (cfDNA) og nucleosomes har tidligere blitt evaluert i hjørnetann nøytrofile og plasma klinisk hundene7,8,9. Bruker fluorescens analyser, fant Goggs og Letendre at septisk hunder har høyere nivåer av cfDNA enn rask hundene8. Selv om disse teknikkene er svært objektive og kvantitativ, er måling av cfDNA og nucleosomes som angir NETosis uspesifisert siden de kan utledes fra nekrotisk celler enn NETosing nøytrofile. Her beskriver vi en teknikk som bruker fluorescens mikroskopi for å undersøke atferd av live NETosing nøytrofile. Vi har også detalj en endret protokoll med dobbel-immunolabeling subjektivt kvantifisere garn og deres komponenter som MPO og citH3 i hjørnetann nøytrofile10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of California, Davis (protokoll nummer: 18338).

1. blod samling

  1. Trekke 10 mL blod fra enten cephalic eller jugulare venen bruker en 21 G nål av sprøyte aspirasjon.
  2. For å unngå overdreven skjæring stress, fjerne nålen fra sprøyten før du overfører blod i lysrør som inneholder natrium heparin (75 USP). Forsiktig Inverter rør noen ganger å sikre tilstrekkelig blande med antikoagulerende og blod. Se etter bevis for klumper eller røde celle aggregater før du plasserer prøvene på is.

2. nøytrofile isolasjon

  1. Fortynne anticoagulated blod med en lik mengde iskalde Dubecco fosfat-bufret saltvann (DPBS) (pH 7.4, uten divalent kasjoner). Overføring 8 mL utvannet blod inn i et 50 mL polypropylen konisk rør som inneholder 25 mL av 3% dekstran (fra Leuconostoc spp. oppløst i 0,9% sodium chloride løsning). Sett røret oppreist i romtemperatur i 30 min å tillate aggregering og sedimentering av erytrocytter.
  2. Nøye lag 5 mL av leukocytter-rich plasma (figur 1) på 5 mL tetthet gradert medium i en 14 mL polypropylen runde bunn rør. Være forsiktig ikke for å blande 2 løsninger11.
  3. Sentrifuge rørene på 400 x g med akselerasjon/retardasjon (A/D) satt til 0 (ingen brems) i 30 min ved romtemperatur.
  4. Bruke en 5 mL serologisk Pipetter samle granulocytt celle laget ved å omgå plasmaet og perifert blod mononukleære celle (PBMC) lag (figur 1). Bruk en ny Pipetter hver gang å minimere forurensning.
  5. Sett 4 til 6 mL av polymorphnuclear (PMN) cellen laget i et 50 mL polypropylen konisk rør. Siden litt røde blodlegemer aggregater kan være aspirated sammen med PMN laget, kan du bruke en 1 mL serologisk Pipetter forsiktig fjerne de røde blodlegemer aggregatene som utlignes på bunnen av røret.
  6. Lyse de gjenværende erytrocyttene med 20 mL kaldt ultrapure vann. Forsiktig Inverter røret flere ganger for 30 til 60 s å sikre tilstrekkelig lysing før du legger til en lik mengde iskald 1,8% sodium chloride løsning.
  7. Sentrifuge 112 x g for 10 min på 4 ° C, A/D-satt til 0.
  8. Gjenta røde blodlegemer lysis trinnet hvis denne pellet vises røde. Forkast nedbryting med en serologisk Pipetter og forsiktig resuspend pellet i 100 µL av DPBS (5 mM druesukker, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 og 1% bovin serum albumin, pH 7.3). Kombiner alle resuspended celler og plassere på is.
  9. Utføre en celletall bruker en automatisert celle analyserer og kontroller greven av en hemocytometer. Eventuelt konsentrere PMNs på et glass lysbilde ved hjelp av en cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) og finne ut prosentandelen av nøytrofile ved å telle antall nøytrofile av antall celler.
  10. Bestemme levedyktigheten til nøytrofile ved å utføre en trypan blå utelukkelse test som skissert av Strober et al. 12 vellykket isolasjon skal gi en levedyktighet fra 95 til 100% og nøytrofile må være større enn 95%.
  11. Bestemme konsentrasjonen av nøytrofile ved å multiplisere den totale celletall prosent levedyktighet og prosent nøytrofile. Vellykket isolasjon skal gi en konsentrasjon av nøytrofile fra 1,5 til 6 x 106/mL.
  12. Fortynn nøytrofile til en siste konsentrasjon av 1 x 106/mL med DPBS med 5 mM druesukker, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2og 1% bovin serum albumin pH justert til 7.3.

3. fluorescerende mikroskopi av Live nøytrofile

  1. Sted 200 til 400 μL nøytrofile (1 x 106/mL) i hver brønn av en poly-L-lysine belagt 12-vel kultur plate. Tillate nøytrofile å forholde seg til bunnen av brønnene av rugende cellene på 37 ° C i 30 min.
  2. Etiketten nukleinsyrer med 1 μM en av to nukleinsyre fargestoffer, som flekker i celler med intakt membraner og som flekker i celler med permeable membraner (se Tabell for materiale), i 10 minutter ved romtemperatur.
  3. Aktivere nøytrofile med 100 μg/mL lipopolysakkarid (LPS) (E. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) som positive kontroll eller tilsvarende mengde DPBS som negativ kontroll for 180 min på 37 ° C.
  4. Hente bilder ved hjelp av GFP (eksitasjon: 470/22 nm, utslipp: 525/50 nm) og Texas Red kanaler (eksitasjon: 585/29 nm, utslipp: 628/32 nm) på en fluorescens mikroskopi på 40 X forstørrelse på følgende tidspunkt: 30, 90, 120 og 180 min.

4. NET kvantifisering og påvisning av netto komponenter med Immunofluorescence

  1. Forsiktig plassere 18 mm diameter Poly-D-lysine belagt cover slips i brønnene av en 12-brønnen plate. Merk brønnene korrekt.
  2. Frø 100 til 200 μL av isolert nøytrofile (1 x 106/mL) direkte på coverslips og tillate nøytrofile overholder cover papirlapper med rugende cellene på 37 ° C i 30 min.
  3. Aktivere nøytrofile som beskrevet i 3.3. Hemmer netto dannelsen av pretreating nøytrofile med 200 µΜ Cl-amidine (15 min, 37 ° C) før aktivering som tidligere beskrevet av Li et al. 13 sikre at kontrollen riktig kjøretøy (DMSO) er inkludert i eksperimentet.
  4. Forsiktig fjerne dekselet slips med fine tang. Laget en parafin filmen ark over en reagensglasset stå å grunne brønner 2 til 3 dråper 4% PFA i hver vel10. Merk brønnene korrekt og forsiktig lå dekket papirlapper opp ned på PFA fylt brønnene. Lar celler fikses ved romtemperatur for 20 min.
  5. Vask cellene 3 ganger i DPBS i 5 minutter, ved å flytte dem fra en brønn til neste.
  6. Hvis immunolabelling ikke kan utføres etter nøytrofile aktivisering og fiksering, Tillat cover følgesedler skal lufttørkes ved å plassere den dekker slips opp på absorbansen papir. Cover slips kan lagres i opptil 1 uke opp i en merket 12-vel kultur plate på 4 ° C til videre analyse. Vask cellene 3 ganger i DPBS for 1 min ved hjelp av samme teknikk som beskrevet i 4.4 før du fortsetter til neste trinn.
  7. For å permeabilize celler, forsiktig lå cover slip opp ned på en dråpe 1% NP-40 for 1 min ved hjelp av teknikken beskrevet i 4.4. Vask 3 ganger i DPBS for 1 min på en rocker.
  8. Tilfeldig tilordne hver prøve mange og bruke merketråd diamant punkt for å merke coverslips tilsvarende.
  9. Forberede og etiketten personlige Petri retter foret med parafin film og plassere 100 til 200 μL av 5% geit serum på filmen (blokkering buffer). Legge coverslips opp ned på blokkering buffer. Plasser på en rocker og ruge 1t på 37 ° C.
  10. Vask 3 ganger i DPBS i 5 min på en rocker.
  11. Fortynne primære antistoffer (1:400 kanin polyklonale anti-citrullinated histone H3 (citH3) i 5% geit serum). Inkuber celler i merket Petri retter med parafin film. Lå hver cover slip opp ned på 50 til 100 μL utvannet antistoff løsningen. Plasser på en rocker og ruge 1t på 37° C.
  12. Vask 3 ganger i DPBS i 5 min på en rocker.
  13. Fortynne sekundære antistoff konjugert til en fluorophore (1:200) i 5% geit serum. Inkuber celler i merket Petri retter med parafin film. Lå hver cover slip opp ned på 50 til 100 μL utvannet antistoff løsningen. Plasser på en rocker og ruge 1t på 37 ° C i mørket.
  14. Vask 3 ganger i DPBS i 5 min på en rocker i mørket.
  15. Samtidige deteksjon av myeloperoxidase (MPO) Følg fremgangsmåten for en modifisert dobbel immunolabeling protokoll som beskrevet av Li et al. 13
  16. Inkuber celler i merket Petri retter med parafin film. Lå hver cover slip opp ned på 100 til 200 μL av 10% kanin serum under milde rocking (over natten, 4 ° C, i mørket).
  17. Vask 3 ganger i DPBS i 5 min på en rocker i mørket.
  18. Inkuber celler i 50 μg/mL unconjugated geit anti-kanin Fab fragmenter for 2 timer ved romtemperatur på en rocker i mørket.
  19. Vask 3 ganger i DPBS i 5 min på en rocker i mørket.
  20. Fortynne primære antistoff (1:200 kanin polyklonale anti-MPO antistoff) 5% geit serum. Inkuber celler i merket Petri retter med parafin film. Lå hver cover slip opp ned på 50 til 100 μL utvannet antistoff løsningen. Plasser på en rocker og ruge 1t på 37° C i mørket.
  21. Fortynne sekundære antistoff konjugert til en fluorophore på 5% geit serum og Inkuber som beskrevet i 4.8
  22. Vask 3 ganger i DPBS i 5 min på en rocker i mørket.
  23. Forstyrrelser kontroller bør være forberedt ved å ekskludere inkubasjon med enten primære antistoffer i andre immun-merking trinn.
  24. Stain DNA med 300 nM i 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) i 5 min i mørket ved romtemperatur.
  25. Vask 3 ganger i DPBS for 1 min på en rocker i mørket.
  26. Påfør en dråpe (~ 50 μl) av antifade tilstopper på et glass lysbilde. Forsiktig Tapp kanten av dekkglassvæske på et tørkepapir for å fjerne overflødig buffer før montering dekkglassvæske med celler opp ned. Montering medium bør danne et tynt lag mellom dekkglassvæske og av objektglass. For å fjerne luftbobler, svært forsiktig Trykk på dekkglassvæske med fine tang.
  27. Tillate prøver herdes natten i mørket på 4 ° C. Montering mediet forherde for mikroskopisk analyse med nedsenking linser. Lagre prøver i 4 ° C i mørket.

5. nøytrofile ekstracellulære felle kvantifisering

  1. Blind operator(s) skaffe og analysere mikroskop bilder til eksperimentelle forhold.
  2. Bruker fluorescens mikroskop på 40 X forstørrelse, ta 10 bilder tilfeldig fra forskjellige regioner i hver dekkglassvæske i et eksperiment under de respektive kanalene. Kontroller at eksponeringstid, lysstyrken og kontrasten av hver kanal holdes konsistent gjennom oppkjøpet av bilder.
  3. Analysere bildene benytter tilgjengelig programvare som ImageJ (NIH). Identifisere nett basert på co lokalisering av cfDNA, citH3 og MPO (figur 3A, B). Kvantifisere garn og nøytrofile i 10 tilfeldige felt for hver eksperimentelle tilstand. Tall av garn utgitt kan uttrykkes som forholdet (antall garn: Totalt antall nøytrofile) for hver eksperimentelle betingelse.
  4. For å evaluere behandling effekter på intracellulær citH3 uttrykk, telle antall nøytrofile med intracellulære citH3 og antall nøytrofile uten intracellulær citH3 i 10 tilfeldige felt på 40 X forstørrelse under de respektive kanalene ( Figur 3, røde piler). Intracellulær citH3 uttrykk kan uttrykkes som forholdet mellom antall nøytrofile med intracellulære citH3 antall nøytrofile uten intracellulær citH3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker denne protokollen, om levende celle bildebehandling, kan etterforskere observere kjernefysiske morfologi, plasma membranen integritet og tilstedeværelsen av cfDNA i levende nøytrofile. En celle impermeant kjernefysiske fargestoffet flekker kjerner syrer rød i celler med skadede. En annen celle-permeant fargestoff, etiketter intracellulær nucleic syrer i levende celler med intakt plasma membraner. Alle intakt nøytrofile, uansett deres behandlinger, bør vises grønne og viser karakteristiske lobulated kjerner 0 til 30 minutter etter stimulering (figur 2A). Kjerner av PMA-behandlet nøytrofile begynner å miste utseendet lobulated av rundt 60 min og fortsette å decondense frem til lanseringen av cfDNA (figur 2B). LP-plater, en langsommere og mer fysiologiske stimulerende av hjørnetann nøytrofile, vanligvis ikke resulterer i chromatin decondensation eller NETosis inntil 90 min etter stimulering (figur 2B). Ved 120 min, kan LP-plater og PMA-aktivert nøytrofile sees omgitt av cfDNA. Forhold til LPS, miste mer-PMA aktivert nøytrofile deres plasma membranen integritet som de er farget rød av celle impermeant fargestoff (figur 2C). Unstimulated nøytrofile (DPBS kontroll) bør opprettholde lobulated kjerner og intakt plasma membran gjennom inkubasjonstiden (figur 2A-C).

NET komponenter består av cfDNA, blir citH3 og MPO granulater funnet ved hjelp av dobbel immunolabeling protokollen. Utgivelsen av garn, identifiseres basert på co lokalisering av cfDNA, citH3 og MPO, i henhold til LPS og PMA er vist i figur 3A og 3B, henholdsvis. Nøytrofile stimulert av LPS i 180 min produsere diskret web-lignende stillaser av garn i nærheten nærliggende nøytrofile (figur 3A). Derimot produsert PMA-aktivert nøytrofile store mengder garn som var merkbart større i området (figur 3B, D). Citrullination av histones H3, katalysert av enzymet peptidylarginine deiminase (PAD), er et kjennetegn på NETosis. PMA, en potent stimulerende av PAD, gir et høyere antall celler som uttrykker intracellulær citH3 forhold til unstimulated og LPS-stimulert nøytrofile (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: en skjematisk diagram viser trinnene hjørnetann nøytrofile isolasjon. Utvannet heparinized fullblod er først blandet med 3% dekstran for sedimentering av røde blodlegemer (RBC). Leukocytter-rich plasma deretter samles og lagdelt på like volum av kommersielt tilgjengelig tetthet gradert separasjon media. Etter sentrifugering (400 x g, 30 min), RBC-granulocytt laget er pakket ut og de resterende RBCs er fjernet av hypotonisk lyse. Etter 1,8% NaCl, granulocytter er spunnet ned (112 x g, 5 min) og resuspended i dedikert buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant fluorescerende bilder av live hjørnetann nøytrofile. Isolert nøytrofile ble aktivert med 100 µg/mL LPS, 100 nM PMA eller tilsvarende mengde Dubeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) som negativ kontroll for totalt 180 min. Nucleic syrer i live intakt nøytrofile var farget grønn med hjelp av en celle-permeant fargestoff mens cfDNA og nøytrofile med kompromittert cellemembraner var farget rød med en celle-impermeant fargestoff. (A, D) DPBS - og LPS-behandlet nøytrofile alle opprettholdt en intakt cellemembranen med lobulated kjerner (stjerne). (A, E) Kjerner i PMA-aktivert nøytrofile begynte å gjennomgå decondensation (pilspisser). (B, F) 90 min., hadde de fleste atomkjerner i LPS - eller PMA-aktivert nøytrofile mistet utseendet lobulated (blå pilspisser). (C) etter 120 min, alle PMA-aktivert nøytrofile hadde permeable plasma membraner omgitt av cfDNA mens cfDNA kan sees rundt et lite antall LPS-aktivert nøytrofile (piler). Unstimulated nøytrofile produserer ikke cfDNA eller hadde kompromittert cellemembranen til enhver tid (Vekselstrøm). (AB) Opprinnelige 40 X forstørrelse. Skala bar = 100 µm. (D-F) 80 X forstørrelse. Skala bar = 30 µm. eksperiment ble replikert dobbelt fra nøytrofile isolert fra 3 ulike givere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: NET formasjonen. (A-C) Representant immunofluorescent bilder i vitro netto-formasjonen. Isolert nøytrofile fra en enkelt donor ble løst, permeabilized og farget for DNA (blå), myeloperoxidase (MPO, grønn) og citrullinated histone H3 (citH3, rød) etter stimulering med (A) 100 µg/mL LPS, (B) 100 nM PMA eller (C) DPBS for 180 min. er garn, identifisert av co lokalisering av cfDNA, MPO og citH3, beskrevet (stiplede linjer) på (A) LPS- og (B) PMA-aktivert nøytrofile. Eksempler på intracellulær uttrykk for citH3 er angitt med røde piler. (C) ingen garn eller intracellulær citH3 er sett unstimulated nøytrofile. Skala bar = 100 µm. (D, E) representant boksen og whisker tomter netto dannelse og intracellulær citH3 uttrykk i nøytrofile isolert fra 4 hunder. Boksen strekker seg fra den 25th til 75th persentil og værhår spenner fra de minste til den største verdien. LP-plater og PMA stimulering resultert i betydelige (D) netto dannelse og (E) intracellulær citH3 uttrykk i forhold til unstimulated nøytrofile. + representerer mener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer her en protokoll for å observere endringene i kjerner conformation og cfDNA utgivelse i levende hjørnetann nøytrofile med både en celle permeant fargestoff og en celle impermeant fargestoff. Den største fordelen med denne analysen er at det tillater for sanntids deteksjon av netto dannelsen av høy oppløsning mikroskopi i live nøytrofile uten celle fiksering, derfor gir et enkelt og nyttig verktøy for å observere i vitro netto formasjon. Siden denne analysen ikke krever antistoffer for påvisning av netto komponenter, er det ideelt for å studere NETosis i arter med begrenset tilgjengelighet av artsspesifikke antistoffer. Bruker denne analysen, forfatterne vist at hjørnetann nøytrofile gjennomgå chromatin decondensation under LPS eller PMA stimulering før NETosis13. En stor ulempe med denne teknikken er at det ikke er spesifikke for NETosis. Fordi cellen impermeant fargestoffet flekker også nukleinsyrer i nekrotisk celler eller nukleinsyrer løslatt fra lysed nøytrofile, tolkes cfDNA eller celle impermeant-positive celler feilaktig som garn eller NETosing nøytrofile. Alternativt kan spesifisiteten til NETosis økes ved å inkludere PMA - eller LPS-aktivert nøytrofile som er forbehandlet med PAD4-hemmer, Cl-amidine. Vi vist her betydningen av å sikre steriliteten og forsvarlig håndtering av nøytrofile gjennom isolasjon prosessen som forurensning og ren styrker kan føre til nekrose i vitro og celle lysis. Vi anbefaler også overholde tilstrekkelig temperaturene gjennom protokoller og hindre langvarig (> 1 min) hypotonisk lyse. For å bekrefte levedyktigheten til isolerte nøytrofile overtid, anbefales en Trypan blå utelukkelse test samt en negativ kontroll bestående av unstimulated nøytrofile sterkt.

Fordi cfDNA oppdaget av celle-ugjennomtrengelig nukleinsyre fargestoffer ikke er spesifikke for NETosis, utviklet vi en dobbel-immunolabeling protokoll for kvantifisering i vitro netto dannelse og intracellulær citH3 uttrykk i hjørnetann nøytrofile. Som nøytrofile slipper detaljert proteiner som MPO cfDNA og citH3 i den ekstracellulære plassen, er netto kvantifisering basert på co lokalisering av cfDNA, citH3 og MPO mer spesifikke forhold til andre analyser som cfDNA, nucleosomes eller DNA-MPO kompleks 14. på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av antistoffer som cross-react med hjørnetann proteiner, vi brukte primære antistoffer som kommer fra en annen art (kanin). For å unngå fangst av primære antistoffer av gjenværende ledig bindende områder på sekundære antistoffer i enten trinn i farging prosessen, utnyttet vi først kanin serum etterfulgt av unconjugated Fab fragmenter å mette webområdene gratis bindende. En kritisk trinn i denne fremgangsmåten er å sikre tilstrekkelig vask for å hindre overflødig binding av immunglobuliner og Fab fragmenter som kan forstyrre oppdagelsen av andre protein av interesse. Vi anbefaler også teste forskjellige fortynninger av primære og sekundære antistoffer å minimere uspesifikke bindende og forstyrrelser. For å sikre at sekundære antistoffer fra enten immunolabelling trinn binder seg spesifikt til sin primære antistoff, bør etterforskere inneholde 2 forskjellige kontroller som ekskluderer enten primære antistoff i andre immunolabelling trinn. Non-spesifikke bindingen skjer når signaler fra både sekundære antistoffer oppdages.

Histone citrullination eller deamination, katalysert av enzymet peptidylarginine deminase 4 (PAD4), er avgjørende for bakterier-assosiert NETosis i mus og mennesker15,16. Bruker denne analysen, kunne vi fastslå at LPS-indusert NETosis inne hundene likeledes behøver histone H3 citrullination av PAD13. For å teste om sentralstimulerende rundt induserer NETosis av PAD4 aktivisering, anbefaler vi at inkludering av positiv kontroller bruker kjente PAD4 aktivator som PMA eller kalsium ionophore, A2318717. Hvis nøytrofile viser negative flekker for citH3 i positiv kontroll utvalgene, revideres protokollen før et tilstrekkelig positiv flekker er resulterte. Vi anbefaler også inkluderingen av biologiske negative kontroller bestående av unstimulated nøytrofile eller nøytrofile behandlet med pute hemmer, Cl-amidine.

Nøyaktig identifikasjon av forskjellige nett strukturen kan være utfordrende bruker denne teknikken. Dette kan være spesielt vanskelig i prøver med omfattende NETosis, som en sammenslåing av netto strukturer fra flere tilstøtende nøytrofile kan føre til undervurdering av NETotic hendelser. Resultatene av denne analysen kan være korrelert med andre mer objektive analyser som flowcytometri eller ELISA, som ennå ikke er godkjent for bruk i hjørnetann nøytrofile. For å unngå dannelse av confluent NET struktur, kan etterforskere frø en lavere konsentrasjon av celler. Eventuelt kan redusere den totale inkubasjon tiden unngå omfattende NETosis og sammenslåing av netto strukturer. Selv om denne protokollen kan brukes til å undersøke NETosis i andre arter, basert på forfatternes erfaring, kan nøytrofile response til LPS eller PMA variere blant arter.

Oppdagelsen av garn i hundene fremhever at NETosis er en bevart mekanisme medfødt immunitet under mikrobielle infeksjoner og immun-mediert sykdom. Analyser presenteres her kan være et verdifullt verktøy for å studere NETosis i hunder og andre arter. En bedre forståelse av sepsis-indusert NETosis vil lette videre forskning i utvikling av ny behandling strategier for sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Tilsvarende forfatter ble finansiert av Morris dyr Foundation (D15CA-907). Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, senter for Equine helse og senter for følgesvenn dyr sunnhet (2016-24-F). Forfatterne ønsker å erkjenne Geena Ng for henne hjelp med tall og Nghi Nguyen for henne hjelp med video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  3. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  4. Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
  5. Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
  6. Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
  7. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  8. Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
  9. Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
  11. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  12. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  13. Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
  14. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  15. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  16. Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
  17. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 138 Immunofluorescence mikroskopi sepsis granulocytt isolasjon histone citrullination peptidylarginine deiminase
<em>In Vitro</em> Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R. H. L., Tablin, F. In… More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter