Summary
Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.
Abstract
Patojenler istila yanıt olarak, nötrofil histon ve antimikrobiyal proteinler ile dekore edilmiş DNA hücre dışı ağları olan ekstraselüler nötrofil tuzakları (ağlar), serbest bırakın. Aşırı NET formasyonu (NETosis) ve citH3 yayın sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve fareler ve insanlar mortalite ile ilişkili ama köpeklerde olan etkileri bilinmemektedir. Burada, tam kan gözlem ve NETosis miktar üzerinden köpek nötrofil yalıtmak için bir teknik açıklar. Lökosit açısından zengin plazma dextran sedimantasyon tarafından oluşturulan, piyasada bulunan yoğunluk gradient ayrılık medya tarafından ayrılmış ve granülosit toplanan hücre sayımı ve Viabilite test. Canlı nötrofil içinde gerçek zamanlı NETosis gözlemlemek için hücre permeant ve hücre impermeant floresan nükleik asit lekeleri nötrofil lipopolysaccharide (LPS) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) tarafından aktive eklenir. Nükleer Morfoloji ve NET oluşumu değişiklikler zamanla floresans mikroskobu tarafından gözlenir. Vitro NETosis daha fazla co-değiştirilmiş bir çift-immunolabelling iletişim kuralı kullanılarak colocalization tarafından boş hücre DNA'ın (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ve citrullinated histon H3 (citH3) ile karakterizedir. Objektif olarak NET oluşumu ve citH3 ifade floresans mikroskobu, kullanarak ölçmek için ağlar ve citH3 pozitif hücreleri mevcut yazılım kullanarak kör bir şekilde sayılabilir. Bu teknik NETosis geçmesi köpek nötrofil vitro kapasitesini değerlendirmek için belirli bir tahlil olduğunu.
Introduction
Nötrofil kısa ömürlü granülosit patojenler istila karşı ilk savunma sorumlu vardır. Nötrofiller, enfeksiyon, siteye işe mikroorganizmalar tarafından fagositoz, degranulation ve reaktif oksijen türleri (ROS)1nesil ortadan kaldırmak. Bakteri veya endotoxins huzurunda, nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), hücre dışı kromatin oluşan histon ve elastase ve myeloperoxidase gibi taneli proteinler (MPO)2süslenmiş. NETs vazgeçilmez antimikrobiyal özellikleri olsa da, deneysel ve klinik kanıt artan hevesli NET oluşumu sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve ölüm3,4' e, neden olabilir gösteriyor 5 , 6.
NETs köpeklerde benzer bir patofizyolojik rol oynayabilir çünkü önlemek veya azaltmak NET oluşumu tedavi müdahaleler roman tedavi stratejileri septik hayvanlarda olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, güvenilir bir teknik NETosis ve köpeklerde NET bileşenler ölçmek ve değerlendirmek için bir ihtiyaç vardır. NET bileşenleri boş hücre DNA (cfDNA) ve oluşturarlar dahil olmak üzere daha önce köpek nötrofil ve plazma klinik köpekler7,8,9değerlendirilir. Floresans deneyleri kullanarak, Goggs ve Letendre septik köpeklerin cfDNA yüksek düzeyde sağlıklı köpekler8' den vardır bulundu. Bu teknikler son derece objektif ve nicel olmakla birlikte, onlar NETosing nötrofil dışında nekrotik hücrelerden elde edilebilir bu yana oluşturarlar ve cfDNA NETosis işaretleri olarak non-spesifik ölçümdür. Burada floresans mikroskobu canlı NETosing nötrofil davranışları incelemek için kullanan bir tekniğini tanımlamak. Biz de subjektif ağlar ve bileşenlerinin MPO ve citH3 köpek nötrofil10gibi ölçmek için çift-immunolabeling kullanan bir değiştirilmiş Protokolü ayrıntı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaliforniya Üniversitesi Davis tarafından kabul edildi (protokol numarası: 18338).
1. kan toplama
- 10 mL kan ya 21 G iğne şırınga aspirasyon tarafından kullanarak sefalik veya şah damarı çizin.
- Aşırı kesme stres önlemek için kan sodyum heparin (75 USP) içeren tüpler aktarmadan önce iğneyi şırıngadan çıkarın. Tüpler birkaç kez yavaşça tersine çevirin yeterli antikoagülan ve kan karıştırma sağlamak için. Pıhtı veya kırmızı hücre toplamları kanıtı için buza örnekleri yerleştirmeden önce kontrol edin.
2. nötrofil yalıtım
- Anticoagulated kan ile buz gibi Dubecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) (pH 7.4, divalent katyonlar olmadan) eşit bir güç oranında seyreltin. Seyreltilmiş kan 8 mL 25 mL % 3 dextran (üzerinden % 0,9 sodyum klorür çözümde çözünmüş Leuconostoc spp.) içeren bir 50 mL polipropilen konik tüp içine aktarın. Tüp dik toplama ve eritrositler sedimantasyon izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında yerleştirin.
- Dikkatle lökosit açısından zengin plazma (Şekil 1) 5 mL 5 mL de bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt tüp yoğunluğu degrade medyada üzerine katman. 2 çözümleri11karıştırmak değil dikkatli olun.
- 400 x g hızlanma/yavaşlama (A/D) ayarlamak için 0 (fren yok), oda sıcaklığında 30 dakika ile de tüpler santrifüj kapasitesi.
- 5 mL kullanarak serolojik damlalıklı plazma ve periferik kan mononükleer hücre (PBMC) katmanları (Şekil 1) atlayarak granülosit hücre katmanı toplamak. Yeni damlalıklı kirlenme en aza indirmek için her zaman kullanın.
- 4-6 mL 50 mL polipropilen konik tüp içinde polymorphnuclear (PMN) hücre tabakasının bir yer. Eritrosit toplamları az miktarda PMN katmanla birlikte Aspire beri 1 mL serolojik damlalıklı yavaşça tüp alt kısmında yerleşmiş eritrosit toplamları kaldırmak için kullanın.
- 20 mL soğuk Ultrasaf Su ile kalan eritrositler parçalayıcı. 30-60 için birden çok kez tüpü yavaşça tersine çevirin s yeterli eşit bir buz gibi %1.8 sodyum klorür çözeltisi hacmi eklemeden önce lysing emin olmak için.
- 112 x g 4 ° C'de 10 dakika, A/D 0 olarak ayarlanırsa, santrifüj kapasitesi.
- Bu Pelet kırmızı görüntülenirse eritrosit lizis adımı tekrarlayın. Süpernatant dikkatle ile serolojik damlalıklı atın ve yavaşça Pelet DPBS (5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2 ve %1 sığır serum albümin, pH 7.3) 100 µL içinde resuspend. Tüm resuspended hücreleri birleştirmek ve buza koyun.
- Bir otomatik hücre Çözümleyicisi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek ve bir hemasitometre tarafından Kont doğrulayın. Gerekirse, bir cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) kullanarak bir cam slayt PMNs konsantre ve nötrofil hücrelerinin toplam sayısı dışında sayısını sayarak nötrofil yüzdesini belirlemek.
- Strober ve ark. tarafından belirtildiği gibi bir trypan mavi dışlama test gerçekleştirerek nötrofil canlılığı belirlemek 12 başarılı yalıtım bir canlılık % 100 95 verim ve nötrofil % 95'den büyük olmalıdır.
- Nötrofil konsantrasyonu yüzde canlılığı ve yüzde nötrofil ile toplam hücre sayısı çarpılarak belirler. Başarılı yalıtım bir konsantrasyon nötrofil 6 x 106/mL için 1.5 ile verim.
- 1 x 106/mL son bir konsantrasyon için nötrofil 7,3 için ayarlanır pH 5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2ve %1 sığır serum albümin içeren DPBS ile oranında seyreltin.
3. Floresan Mikroskobu canlı nötrofil
- Yer 200'e 400 μL nötrofil (1 x 106/mL) bir poli-L-lizin her kuyuya 12-şey kültür plaka kaplı. Nötrofil kuyu dibine 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin verir.
- Nükleik asitler iki nükleik asit boyalar biri, bir o sağlam Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri ve bir oda sıcaklığında 10 dakika için (bkz. Tablo reçetesi) geçirgen Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri 1 mikron ile etiketleyin.
- Nötrofil 100 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. coli O55. ile etkinleştirmek B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olumlu denetim veya DPBS olarak 37 ° C'de 180 dk için negatif kontrol eşdeğer hacmi olarak
- GFP kullanarak görüntüleri (uyarma: 470/22 nm, emisyon: 525/50 nm) ve Texas kırmızı kanalları (uyarma: 585/29 nm, emisyon: 628/32 nm) aşağıdaki zaman noktalarda 40 X büyütme, floresans mikroskobu Tarih: 30, 90, 120 ve 180 dk.
4. NET miktar ve NET bileşenler ayirt kullanarak tespiti
- Dikkatle 18 mm çap Poly-D-lizin kaplı kapak paket fişi 12-şey kültür plaka kuyu yerleştirin. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin.
- Tohum 100-200 μL, nötrofil (1 x 106/mL) doğrudan coverslips izole ve nötrofil kapak irsaliyeleri için 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin.
- Nötrofil 3.3 içinde açıklandığı gibi etkinleştirin. NET oluşumu ile 200 µΜ nötrofil pretreating tarafından inhibe Cl-amidine (15 dk, 37 ° C) daha önce Li vd tarafından açıklandığı gibi harekete geçirmek önce 13 uygun araç kontrol (DMSO) denemeye dahil emin olun.
- Dikkatli bir şekilde kapak paket fişi ile iyi forseps çıkarın. Parafin film sayfası sığ kuyular oluşturmak ve 2-3 damla % 4'lük yerleştirmek için bir test tüpü sandalyesinden katman her iyi10PFA. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin ve yavaşça kapak paket fişi ters İngiltere'de yılın dolu kuyu yatıyordu. Hücreleri 20 dk için oda sıcaklığında düzeltilmesi için izin.
- Hücreleri DPBS 5 dk, 3 kez bir kuyudan diğerine taşıyarak yıkayın.
- İmmunolabelling kısa bir süre sonra nötrofil harekete geçirmek ve fiksasyon gerçekleştirilemez, kapak absorbans kağıda kapak paket fişi yüz-up yerleştirerek kuru hava olmaya makbuzları olanak verir. Kapak paket fişi en fazla 1 hafta yüz-up 4 ° C'de bir etiketli 12-şey kültür plaka için daha fazla çözümleme kadar saklanabilir. Hücreleri 3 kez DPBS için 1dk 4.4 sonraki adıma devam etmeden önce açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak yıkayın.
- Hücreleri permeabilize için yavaşça kapak notu baş aşağı bir damla %1 4.4 içinde NP-40 için 1dk tekniği kullanarak açıklanan yatıyordu. 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 1 dakika yıkayın.
- Rastgele her örnek için bir numara atamak ve bir elmas noktası işaretçisi coverslips buna göre etiketlemek için kullanın.
- Hazırlamak ve etiket bireysel Petri yemekler parafin film ile kaplı ve 100-200 μL %5 keçi serum (arabellek kütük parçası) film üzerine yerleştirin. Coverslips baş aşağı engelleme arabellek üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
- Birincil antikor seyreltik (1: 400 tavşan poliklonal anti-citrullinated histon H3 (citH3) % 5 keçi serumda). Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
- Seyreltik ikincil antikor %5 keçi serumda fluorophore (1: 200) için Birleşik. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.
- 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
- Myeloperoxidase (MPO) eşzamanlı tespiti için Li vd tarafından açıklandığı gibi değiştirilmiş Çift Kişilik immunolabeling iletişim kuralı için aşağıdaki adımları izleyin 13
- Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı (bir gecede, 4 ° C, karanlıkta) hafif sallanan altında serum % 10 tavşan 100-200 μL üzerinde yatıyordu.
- 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
- Karanlıkta bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 2 h için anti-tavşan Fab parçaları 50 μg/mL çekimsiz keçi hücrelerde kuluçkaya.
- 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
- Birincil antikor (1: 200 tavşan poliklonal anti-insan MPO antikor) % 5 keçi serumda sulandırmak. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.
- İkincil antikor %5 keçi serumda fluorophore için Birleşik sulandırmak ve 4,8 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya
- 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
- Parazit kontrolleri ile her iki birincil antikorlar bağışıklık etiketleme ikinci adımda kuluçka hariç tutarak hazırlanmalıdır.
- DNA ile 300 leke nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 5 min için.
- 3 kez karanlık bir rocker üzerinde 1 dk DPBS içinde yıkayın.
- Antifade mountant bir cam slayt üzerine bir damla (~ 50 μl) uygulanır. Yavaşça ters coverslip hücreleri ile montaj önce aşırı arabellek kaldırmak için bir emici kağıt üzerine coverslip kenarına dokunun. Montaj orta coverslip ve cam slayt arasındaki ince bir tabaka oluşturmalıdır. Hava kabarcıkları kaldırmak için çok yavaşça coverslip üzerinde iyi forseps ile tuşuna basın.
- Örnekleri 4 ° C'de karanlık gecede tedavi etmek izin Montaj orta daldırma lensler ile mikroskopik analiz için sertleşmesine. Örnekleri karanlıkta 4 ° C'de depolayın.
5. nötrofil hücre dışı tuzak miktar
- Edinme ve deneysel koşullar mikroskop resimlere analiz operator(s) kör.
- Bir floresan mikroskop 40 X büyütme oranında kullanarak, 10 resim Rastgele her coverslip bir deneyde ilgili kanalları altında farklı bölgelerinden al. Çekim hızı, parlaklık ve kontrast her kanal görüntüleri edinimi tutarlı tutulmasını sağlamak.
- Mevcut yazılım gibi ImageJ (NIH) kullanarak görüntüleri analiz. CfDNA, citH3 ve MPO (Şekil 3A, B) Co yerelleştirilmesini tabanlı ağlar tanımlamak. Ağlar ve deneysel her koşul için 10 rasgele alan nötrofil sayısı ölçmek. Yayımlanan ağlar numaraları bir oranı olarak ifade (ağlar sayısı: nötrofil sayısı) deneysel her koşul için.
- Hücre içi citH3 ifade tedavi etkisini değerlendirmek için nötrofil ile hücre içi citH3 ve nötrofil hücre içi citH3 ilgili kanalları ( altında 40 X büyütme, 10 rasgele alan olmadan sayısını saymak Şekil 3, kırmızı oklar). Hücre içi citH3 ifade ile hücre içi citH3 nötrofil hücre içi citH3 olmadan sayıda nötrofil sayısı oranı olarak ifade edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı hücre görüntüleme bu iletişim kuralını kullanan, müfettişler nükleer morfoloji, plazma membran bütünlüğü ve yaşam nötrofil cfDNA varlığı gözlemleyebilirsiniz. Bir hücre impermeant nükleer boya çekirdek asitleri kırmızı hücrelerin hasarlı hücre zarı ile lekeleri. Başka bir hücre permeant boya, bozulmamış plazma membran ile canlı hücrelerde hücre içi nükleik asitler Etiketler. Kendi tedavileri ne olursa olsun tüm bozulmamış nötrofil yeşil görünür ve karakteristik loblu çekirdeklerin 0-30 dk sonra stimülasyon (Şekil 2A) sergilemek gerekir. PMA tedavi nötrofil çekirdekleri loblu görünümlerini yaklaşık 60 dk tarafından kaybetmek ve cfDNA (Şekil 2B) yayın kadar decondense devam başlar. LPS, daha yavaş ve daha fizyolojik uyarıcı köpek nötrofil, genellikle tam yol kromatin decondensation veya NETosis kadar 90 dk sonra stimülasyon (Şekil 2B). 120 min tarafından LPS ve PMA aktif nötrofil cfDNA ile çevrili görülebilir. Hücre impermeant boya (Şekil 2C) kırmızı lekeli LPS için karşılaştırıldığında, daha fazla-PMA aktif nötrofil onların plazma membran bütünlüğü kaybetmek. Unstimulated nötrofil (DPBS denetimi) loblu çekirdeği ve kuluçka süresi (Şekil 2A-C) boyunca bozulmadan plazma zarı korumak gerekir.
NET bileşenler, cfDNA oluşan citH3 ve MPO granül Çift Kişilik immunolabeling protokolü kullanılarak tespit edilir. Ağlar, tanımlanan sürümü cfDNA Co yerelleştirilmesini göre citH3 ve LPS ve PMA yanıt MPO Şekil 3A ve 3B, sırasıyla gösterilir. Nötrofil LPS tarafından 180 dakikadır uyarılmış ağlar ayrı web benzeri iskele yakınında yakındaki nötrofil (Şekil 3A) üretirler. Buna ek olarak, PMA aktif nötrofil (Şekil 3B, D) alanında belirgin bir şekilde daha büyük ağlar büyük miktarda üretilen. Histon H3, enzim peptidylarginine deiminase (PAD), tarafından katalize Citrullination NETosis damgasını olduğunu. Daha yüksek bir sayı hücre hücre içi citH3 unstimulated ve LPS uyarılmış nötrofiller için (3E rakam) göre ifade PMA, ped, güçlü bir uyarıcı sonuçlanır.
Şekil 1: köpek nötrofil yalıtım adımları gösteren bir Şematik diyagramı. Seyreltilmiş heparinized tam kan ilk sedimantasyon kırmızı kan hücrelerinin (RBC) için % 3 dextran ile karıştırılır. Lökosit açısından zengin plazma sonra toplanan ve ticari olarak mevcut yoğunluğu degrade ayrılık medya eşit birimlerini katmanlı. Santrifüjü (400 x g, 30 min), RBC-granülosit katman elde edilir ve kalan RBCs hipotonik lizis tarafından kaldırılır. Sonra % 1,8 ilavesi NaCl, granülosit (112 x g, 5 min) döndü ve adanmış bir arabellek resuspended. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi floresan görüntüleri canlı köpek nötrofil. İzole nötrofil 100 µg/mL LPS ile etkinleştirildi, Dubecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) olmak üzere toplam 180 dk. nükleik asitlerin canlı sağlam nötrofil içinde negatif kontrol olarak 100 nM PMA veya eşdeğer birim hücre permeant kullanarak yeşil lekeli cfDNA ve nötrofil güvenliği aşılan hücre zarlarında ile bir hücre impermeant boya ile kırmızı lekeli ise boya. (A, D) Nötrofil tüm DPBS ve LPS tedavi sağlam bir hücre zarı loblu çekirdeği (yıldız işareti) ile yapılmaktadır. (A, E) Decondensation (ok uçları) geçmesi PMA aktif nötrofil çekirdekleri başladı. (B, F) 90 dk tarafından çoğu çekirdeği LPS veya PMA aktif nötrofil loblu görünümlerini (mavi ok uçları) kaybetmişti. (C) sonra 120 dakika, tüm PMA aktif nötrofil geçirgen plazma membran cfDNA LPS-harekete geçirmek nötrofil (oklar) az sayıda çevreleyen görülebilir iken cfDNA tarafından çevrili vardı. Unstimulated nötrofil cfDNA üretmek değil ne de herhangi bir zamanda noktada (A-C) hücre zarı tehlikeye. (A-B) Orijinal 40 X büyütme. Ölçek çubuğu 100 µm. (D-F) 80 X büyütme =. Ölçek çubuğu = 30 çoğaltılmış iki kez 3 farklı bağışçılardan izole nötrofil üzerinden µm. deney. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: NET oluşumu. (A-C) Vitro NET oluşumu temsilcisi immünfloresan görüntüler. Tek bir donörden izole nötrofil tespit edildi, permeabilized ve DNA (mavi), myeloperoxidase (MPO, yeşil) ve citrullinated histon H3 lekeli (citH3, kırmızı) stimülasyon (A) 100 µg/mL LPS, (B) 100 ile sonra nM PMA ya da (C) DPBS 180 dk. için ağlar, cfDNA, MPO ve citH3, Co yerelleştirme tarafından tanımlanan Seviyelendirilmiş (noktalı çizgiler) (A) LPS - ve (B) PMA aktif nötrofil vardır. CitH3 hücre içi ifade örnekleri kırmızı oklarla belirtilmiştir. (C) Hayır ağlar ne de hücre içi citH3 unstimulated nötrofil görülmektedir. Ölçek çubuğu 100 µm. (D, E) temsilcisi kutusu ve bıyık araziler NET oluşumu ve hücre içi citH3 ifadede nötrofiller 4 köpekler izole =. Kutusu 25inci 75inci testlerinde genişletir ve bıyık span en küçük en büyük değeri için. LPS ve PMA stimülasyon önemli (D) NET oluşumu ve (E) hücre içi citH3 ifade için unstimulated nötrofil karşılaştırıldığında sonuçlandı. + temsil demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada değişmek içinde çekirdek uyum ve cfDNA serbest bırakmak içinde yaşayan köpek nötrofil hücre permeant boya ve bir hücre impermeant boya kullanarak gözlemlemek için bir protokol mevcut. Bu tahlil en büyük avantajı bu NET oluşumu gerçek zamanlı algılama için yüksek çözünürlüklü mikroskobu canlı nötrofil hücre fiksasyon, olmadan tarafından bu nedenle, vitro NET oluşumu gözlemlemek için basit ve değerli bir araç sağlayan sağlanmıştır. Bu tahlil NET bileşenler tespiti için antikorlar gerektirmez, NETosis türler species-specific antikorlar ile sınırlı eğitim için idealdir. Bu tahlil kullanarak, yazarlar köpek nötrofil kromatin decondensation LPS veya PMA altında geçmesi gösterdi stimülasyon NETosis13önce. Bu tekniğin büyük bir dezavantaj bu NETosis için özel değildir. Hücre impermeant boya Ayrıca nükleik asitler nekrotik hücrelerdeki veya nükleik asitler lysed nötrofil yayımlanan lekeleri çünkü cfDNA veya hücre impermeant-pozitif hücre ağlar veya NETosing nötrofil yanlış yorumlanabilir. Alternatif olarak, NETosis özgüllüğü PAD4-engelleyici ile Cl-amidine ön işleme bu PMA veya LPS aktif nötrofil dahil ederek artırılabilir. Biz burada kısırlık ve kirlenme olarak nötrofil yalıtım sürecinde doğru kullanımı sağlamak önemi gösterdi ve katıksız kuvvetleri vitro nekroz için kurşun ve hücre lizis. Biz de yeterli sıcaklık protokolleri boyunca uygun tavsiye ve önleme uzun süreli (> 1 dk) hipotonik lizis. İzole nötrofil fazla mesai canlılığı onaylamak için bir Trypan mavi dışlama testi yanı sıra unstimulated nötrofil oluşan bir negatif kontrol önerilir.
Hücre geçirimsiz nükleik asit boyalar tarafından tespit cfDNA NETosis için spesifik değildir çünkü biz vitro NET oluşumu ve hücre içi citH3 ifadede köpek nötrofil miktarının bir çift-immunolabeling iletişim kuralı geliştirilmiştir. Nötrofil hücre dışı uzaya cfDNA ve citH3 ile birlikte MPO gibi taneli proteinler olarak, cfDNA, citH3 ve MPO Co yerelleştirilmesini dayalı NET miktar diğer deneyleri cfDNA, oluşturarlar veya DNA-MPO karmaşık gibi daha özel karşılaştırılır 14. köpek proteinler ile cross-react antikorlar sınırlı yer nedeniyle, biz başka bir tür (tavşan) kaynaklanan birincil antikorlar kullanılır. İkincil antikor boyama işleminin her adımı sitelerinde artık ücretsiz bağlama tarafından birincil antikorların yakalama önlemek için ilk çekimsiz Fab parçaları tarafından ücretsiz bağlayıcı siteleri emdirmek takip tavşan serum kullanılmaktadır. Bu yordamın bir kritik adım immünglobulin ve ilgi ikinci protein tespiti ile girişime neden olabilir Fab parçaları aşırı bağlama önlemek için yeterli yıkama sağlamaktır. Biz aynı zamanda farklı dilutions birincil ve ikincil antikorların nonspesifik bağlama ve etkileşimler en aza indirmek için test etmenizi öneririz. Her iki immunolabelling adım ikincil antikorlar birincil antikor özellikle bağlar emin olmak için Müfettişler ikinci immunolabelling adımda her iki birincil antikor hariç 2 farklı kontrol içermelidir. Spesifik olmayan bağlayıcı her iki ikincil antikorlar gelen sinyalleri algılandığı zaman oluşur.
Histon citrullination veya enzim peptidylarginine deminase 4 (PAD4), tarafından katalize deaminasyon, bakteri ilişkili NETosis fareler ve insanlar15,16içinde önemlidir. Bu tahlil kullanarak, biz LPS kaynaklı NETosis köpeklerde de PAD13tarafından histon H3 citrullination gerektirir belirlemek başardık. Uyarıcı ilgi NETosis PAD4 etkinleştirme tarafından ikna olup olmadığını sınamak için PMA ya da kalsiyum ionophore, A2318717gibi bilinen PAD4 harekete geçirmek kullanan olumlu denetim eklenmesi önerilir. Nötrofil citH3 pozitif kontrol örnekleri için boyama negatif gösterirsen, bir yeterli olumlu boyama sonuçlandı kadar Protokolü revize edilmesi gerekir. Ayrıca unstimulated nötrofiller veya PAD inhibitörü, Cl-amidine ile tedavi nötrofil oluşan biyolojik negatif denetimleri dahil öneririz.
Farklı ağlar yapısı doğru tanımlaması bu tekniği kullanarak zor olabilir. AĞ yapıları birden çok bitişik nötrofil serbest birleştirme NETotic olayları küçümseme için yol açabilir bu örneklerde ile geniş NETosis, özellikle zor olabilir. Bu testin sonuçları henüz köpek nötrofil olarak kullanılmak üzere doğrulanmış değil daha objektif diğer deneyleri gibi akış sitometresi veya ELISA, ile ilişkili. Konfluent NET yapı oluşumunu önlemek için araştırmacılar hücre düşük yoğunluklu tohum. Alternatif olarak, toplam kuluçka süreyi kısaltır geniş NETosis ve NET yapılarının birleştirme önleyebilirsiniz. Yazarın deneyimlerine dayanarak diğer türlerin NETosis araştırmak için bu protokolü kullanılabilse LPS ya PMA nötrofil yanıt türleri arasında büyük ölçüde değişebilir.
NETs keşfi köpeklerde NETosis doğuştan gelen bağışıklık korunmuş bir mekanizma mikrobiyal enfeksiyon ve immün aracılı hastalığı sırasında olduğunu vurgulamaktadır. Burada sunulan deneyleri NETosis çalışma köpekler ve diğer türler için değerli bir araç olabilir. Sepsis kaynaklı NETosis daha iyi bir anlayış sepsis için yeni tedavi stratejileri geliştirme içine daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarın Morris hayvan Vakfı (D15CA-907) tarafından finanse edildi. Çalışma fon University of California, Davis, Equine Sağlık Merkezi ve refakatçi hayvan sağlığı merkezi tarafından desteklenmiştir (2016-24-F). Yazarlar Geena Ng onun hakkında yardım almak için rakamlar ve Nghi Nguyen video ile yardımını kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
