Summary
Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.
Abstract
Tecido adiposo desempenha um papel central na homeostase de energia e termorregulação. Ele é composto de diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, vasos sanguíneos e projeções de nervo. Embora o controle molecular da especificação do tipo de célula e como interagem estas células foram delineados cada vez mais, uma compreensão mais abrangente destas células adiposo-residente pode ser alcançada através da visualização de sua distribuição e arquitetura em todo o tecido todo. As abordagens existentes de imuno-histoquímica e imunofluorescência para analisar histologia tecido adiposa dependem de seções finas de parafina. No entanto, seções finas captura apenas uma pequena porção de tecido; Como resultado, as conclusões podem ser influenciadas por qual parte do tecido é analisada. Portanto, nós desenvolvemos um tecido adiposo, limpeza técnica, Adipo-Clear, para permitir a completa visualização tridimensional de padrões moleculares e celulares nos tecidos adiposos. Adipo-Clear foi adaptado de iDISCO / iDISCO +, com modificações específicas feitas para remover completamente os lipídios armazenados no tecido, preservando a morfologia do tecido nativo. Em combinação com microscopia de fluorescência de luz-folha, vamos mostrar aqui o uso de Adipo-Clear método para obter imagens de alta resolução volumétricas, de um tecido adiposo inteira.
Introduction
Até recentemente, tecido adiposo foi concebido como uma coleção amorfa de células de gordura. Ao longo das últimas décadas, nosso entendimento tem crescido mais sofisticado, com gordura agora reconhecida para ser um órgão complexo que contém diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, a vasculatura e projeções de nervo. Interações entre estas células adiposo-residente tem pronunciado efeitos no tecido adiposo e a fisiologia e fisiopatologia1. Embora estudos emergentes têm desvendados importantes mecanismos moleculares subjacentes a certas interações, uma compreensão mais abrangente requer perfil estrutural confiável do tecido inteiro em três dimensões (3D).
Nosso conhecimento atual da morfologia do tecido adiposo é amplamente baseado na análise histológica de seções finas (5 μm), com imagens relativamente alta ampliação (mais de 10 X)2,3. No entanto, esta abordagem tem várias limitações significativas. Primeiras, intricadas estruturas filamentosas como nervos simpáticos e a vascularização, que são conhecidas por desempenhar um papel importante na função do tecido adiposo4,5,6,7, são difíceis de avaliar através de seções finas. Em segundo lugar, devido à sua forma aparentemente amorfa e a falta de unidades estruturais representativas para focar, é difícil apreciar o tecido adiposo estruturas baseadas apenas na coloração de seção. Em terceiro lugar, o tecido adiposo tem um muito alto teor lipídico, criando desafios na obtenção de secções seriais consistentes que são adequadas para a reconstrução anatômica 3D, um método convencional usado para estudar o cérebro inteiro morfologia8. Tendo em conta estes factores, há uma grande necessidade de uma abordagem de conjunto de montagem que pode fornecer a visualização 3D de um depósito de tecido adiposo inteira e ainda alcançar a resolução do celular.
Imagem em 3D volumétrica de um órgão inteiro é um desafio devido aos efeitos obscuring de dispersão de luz. Uma importante fonte de dispersão de luz no tecido biológico vem de interfaces lipid-aquosa. Apesar dos esforços para eliminar a dispersão através da remoção de lipídios foram em curso para mais de um século, tem havido um grande número de recentes inovações9. Um tal método de limpeza de tecidos recém-desenvolvido é uma imagem de 3D habilitado para immunolabeling de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO / iDISCO +)10,11. No entanto, o tecido adiposo apresenta um desafio particular, dado o seu alto nível de lipídios e portanto, modificações adicionais para o iDISCO / iDISCO + protocolo são necessário para extrair totalmente os lipídios, protegendo o tecido de entrar em colapso. O protocolo modificado que desenvolvemos, agora chamado Adipo-Clear, emprega baseada em metanol/diclorometano delipidation do tecido adiposo para alcançar a transparência ideal apropriada para imagiologia volumétrica de alta resolução12. Porque o delipidation passo largamente sacia endogenamente expressas proteínas fluorescentes como GFP e RFP, visualização de tais proteínas deve ser alcançada por immunolabeling. Em geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização nível de tecido adiposo-residente células, rastreamento de linhagem de células progenitoras de adipócitos e tecido adiposo morfogênese durante o desenvolvimento.
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Protocol
Experimentação e cuidados com animais foram realizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de uso na Universidade Rockefeller e cuidados institucionais do Animal.
1. tecido preparação
- Execute padrão perfusão intracardíaca com ~ 20 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C até que o sangue é completamente removido do tecido.
- Alterne o perfusato para ~ 20 mL da solução de fixador (paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x) a 4 ° C até o pescoço e a cauda significativamente foi uma brincadeira.
Atenção: O PFA é tóxico. Evite o contacto com a pele, olhos e mucosas. Soluções devem ser feitas dentro de uma coifa. - Disse as almofadas de gordura de interesse cuidadosamente para retirar o forro de gordura todo sem danificá-lo. Use fórceps sem corte-terminado para evitar comprimir ou apertar o tecido. Evite a contaminação do tecido dissecado com qualquer pele.
- Fixar o tecido em 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Para cada almofada gorda, fixe com ~ 10 mL da solução de fixação em um tubo cônico de 15 mL.
- Lave o tecido 3 vezes (1h cada) com PBS 1x à temperatura ambiente (RT).
- Armazenar o tecido para a curto prazo (até 2 semanas) em PBS 1x a 4 ° C e protegido da luz. Para armazenamento a longo prazo (por exemplo, 1-2 anos), alterne o buffer para 1X PBS com 0,05% de azida sódica (como conservante).
Atenção: A azida de sódio é altamente tóxica quando ingerido oralmente ou absorvido pela pele. Concentrado de soluções (em 5% ou maior) devem ser tratadas sob uma coifa de azida de sódio.
2. Delipidation e permeabilização
Tempo: 1-2 dias
- Prepare-se 20%, 40%, 60% e 80% gradiente de metanol com B1n buffer (tabela 1) (v/v), por exemplo, para reserva de 20% de metanol/B1n, misture 20 mL de metanol e 80 mL de tampão de B1n. Armazenar todos os buffers a 4 ° C. Cristais de glicina irão precipitar de buffers de metanol/B1n 60% e 80% devido à saturação. Evite remover os cristais; Use a solução líquida para as lavagens seguintes.
Atenção: O metanol é volátil, irritantes e inflamáveis. Evite a pele ou olhos. - Remova cuidadosamente o cabelo da amostra sob um microscópio de dissecação. Qualquer cabelo, fiapos ou detritos anexado à amostra causará sombras durante a imagem latente. Transferi a amostra limpa para um tubo novo.
- Execute todas as etapas seguintes no gelo ou a 4 ° C a menos que indicado de outra forma. Para pequenas amostras (por exemplo, posteriores almofadas de gordura subcutânea/perigonadal de jovens ratos magras), utilizar 2 mL microcentrifuga tubos com 1,6 mL da solução. Para amostras grandes ou as amostras com alto teor lipídico (por exemplo, almofadas de gordura de ratos obesos), usar tubos de 5 mL com 4 mL de solução.
- Coloque os tubos contendo as amostras horizontalmente em um agitador orbital de ~ 100 rpm. Certifique-se que as amostras podem circular livremente no interior do tubo.
- Desidrate a amostra em uma série graduada de 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanol/B1n buffer para a hora indicada (tabela 2). Minimize a solução de reporte.
- Delipidate a amostra com o diclorometano (DCM) de 100% (3 vezes), cada um com o tempo de incubação indicado na tabela 2. A amostra deve afundar até o fundo do tubo no final das segunda e terceiros lavagens de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para garantir delipidation completo (por exemplo, estender de 30 min a 1-2 h).
Cuidado: DCM deve ser tratado dentro de uma coifa. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos que são feitos de polipropileno para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DCM. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com DCM. DCM é altamente volátil. Transferi a amostra para solução fresca rapidamente para evitar a dessecação. - Lave duas vezes com 100% de metanol para a hora indicada (tabela 2).
- Opcional: Se a amostra não é bem perfundida, a cor da hemoglobina das células vermelhas do sangue restantes pode causar forte autofluorescência. Descorar com 5% H2O2 em metanol (1 volume de 30% H2O2 a 5 volumes de metanol) durante a noite a 4 ° C.
- Reidratar a amostra em uma série de amortecedor invertido metanol/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n e 100% B1n tampão (2 vezes) para a hora indicada (tabela 2).
- Lavar a amostra com buffer de PTxwH (tabela 1) para 2 h em RT
- Armazenar a amostra de deslipemizado no buffer de PTxwH a 4° C (até 1 ano) ou proceder de imediato à etapa de imunocoloração.
3. toda montagem imunocoloração
Tempo: 8-10 dias
Nota: Todas as etapas a seguintes devem ser efectuadas em RT salvo indicação em contrário, com a agitação e a proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução. Recomenda-se primeiro validar os anticorpos em pequenos pedaços de tecido ou secções de tecido Tratado de metanol.
- Dilua o anticorpo primário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações.
- Incube a amostra deslipemizado com a solução de anticorpo primário durante o tempo indicado (tabela 2).
- Lavar a amostra com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.
- Dilua o anticorpo secundário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações.
Nota: Para evitar o fundo elevado causado por tecido autofluorescência, anticorpos secundarios conjugados com fluorophores que emitem luz nas regiões do vermelhas e far-red são recomendados. Dependendo do número de linhas de laser disponíveis em um microscópio, até 3-4 marcadores pode ser fotografada simultaneamente em uma amostra. - Incube a amostra com a solução de anticorpo secundário durante o tempo indicado (tabela 2).
- Amostra de lavagem com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.
- Opcional: Para tipos de tecido que são frágeis, fixe o tecido manchado com 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, para ajudar a preservar a morfologia do tecido.
Nota: Este passo pode aumentar a imagem de fundo. Não é necessário efectuar este passo para o tecido adiposo. - Lavar a amostra com PBS 1x em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min e 30 min.
- Remova cuidadosamente o fiapo da amostra sob um microscópio de dissecação.
4. tecido clareira
Tempo: 1-2 dias
- Opcional: Incorpore a amostra em agarose para facilitar a montagem de amostra para microscopia de luz-folha.
Nota: Este passo é fortemente recomendado para tecido adiposo estabilizar sua forma durante a imagem latente.- Prepare a solução de encastre com agarose a 1% em 1X PBS (p/v). Esfriar a solução incorporação de ~ 40 ° C para evitar a exposição da amostra ao calor excessivo.
- Colocar a amostra limpa em um molde (por exemplo, placa de Petri ou barco de pesagem) e organizá-lo para a posição desejada. Evite qualquer transição líquida. Delicadamente, despeje a solução de incorporação da amostra. Evite quaisquer bolhas de ar.
- Deixe o agarose totalmente solidificar no RT. corte para fora de um bloco que contém a amostra.
Nota: Todas as etapas seguintes, incluindo a incubação do durante a noite devem ser efectuadas RT, com agitação e proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução.
- Desidrate a amostra em gradiente de metanol com H2O: 25%, 50%, 75% e 100% (3 vezes) para a hora indicada (tabela 2).
Nota: Amostra pode ser deixada durante a noite no passo metanol 100%. - Incube a amostra em 100% o DCM para 1 h com agitação (3 vezes). Amostra deve afundar até o fundo do tubo na extremidade de cada lavagem de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para assegurar a remoção completa de metanol. Amostra pode ser deixada durante a noite no passo DCM 100%.
- Incube a amostra em éter dibenzyl (DBE) durante a noite com agitação suave para alcançar o índice de refração de correspondência.
Nota: Amostra vai eventualmente se tornar transparente à luz visível.
Atenção: O DBE é perigosa. Evite qualquer contacto com a pele. Lidar com isso dentro de uma coifa com duas camadas de luvas. Descarte as luvas quando está contaminado com DBE. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos (polipropileno) para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DBE. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com o DBE. Limpe qualquer vazamento com 100% de etanol. - Incubar a amostra com DBE fresco com leve agitação por 2 h. loja da amostra RT no escuro ou proceder diretamente à imagem.
Nota: As amostras são recomendadas para ser fotografada dentro de um mês. Embora certas fluorophores são mais estáveis do que outros, armazenamento a longo prazo das amostras nesta fase não é recomendado.
5. microscopia
- Imagem com um microscópio de luz-folha que é compatível com o DBE.
Nota: Apenas os objetivos que são aprovados para geração de imagens baseada em solvente orgânica e combinados com o índice de refração do DBE podem ser usados como mergulhando objectivos em imagiologia DBE-imerso.- Monte a amostra de agarose-encaixadas em um suporte que pode impedir o movimento durante a imagem latente. Imergir a amostra em uma câmara cheia de DBE.
- Recolha uma z-pilha cobrindo toda a amostra (por exemplo, ampliação de X 1-2) para obter a distribuição de todo tecido/estrutura do marcador de interesse.
- Alternar para um objectivo com maior ampliação (por exemplo, ampliação de 4-12 X) para ampliar as regiões de interesse para estruturas detalhadas da imagem.
Nota: O colágeno é dos principais contribuintes para a matriz extracelular do tecido adiposo, que envolve todas as células de gordura13. Colagénio tem um espectro de emissão típico que variam de cerca de 400 nm a 550 nm14. Imagem da amostra com a linha de 488 laser (verde) e recolher a luz emitida em um intervalo de comprimento de onda que se encontra dentro do espectro de emissão de colágeno (por exemplo, 525-550 nm) irão fornecer o sinal de autofluorescência de tecido, que anteriormente foi mostrado para delinear o contorno da célula de gordura e de arquitetura de tecido geral12.
- Geração de imagens com uma invertida confocal ou um microscópio de dois fotões.
- Coloca a amostra de agarose-incorporado em um slide de câmara com um fundo de vidro sem tocar qualquer peças de plástico (ou outra câmara de imagem compatível com o DBE que pode selar). Certifique-se de que DBE não vazar.
- Escolha os objectivos com longas distâncias de trabalho para alcançar penetração mais profunda.
Nota: A imagem deve ser feita com um microscópio confocal ou dois fotões invertido através do vidro de fundo do slide câmara. Evite o contato direto entre a amostra e mergulhando objectivos que não são sugeridos para geração de imagens baseada em DBE.
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Representative Results
Adipo-Clear preparado toda gordura almofadas podem ser fotografadas em 3D para analisar como interações de morfologia e celular do tecido são afetadas nos Estados magros e obesos. Esse método pode ser facilmente aplicado para analisar a estrutura geral do tecido adiposa, recolhendo o sinal de autofluorescência de tecido no canal verde. Anteriormente mostramos que a autofluorescência sinal em sobreposições de tecido adiposas favoravelmente com perilipin de coloração, um marcador comumente usado para delinear adipócitos maduros12. Por exemplo, digitalização de um posterior subcutânea do tecido (psWAT) usando um microscópio de luz-folha com baixa ampliação (1.3 X) mostra a organização lobular de adipócitos (figura 1A e B). Informações mais detalhadas, tais como o tamanho dos adipócitos, podem ser reveladas por zoom para as regiões de interesse com maior ampliação (4x) (Figura 1 e D).
Adipo-Clear é particularmente útil para a visualização de estruturas filamentosas como projeções de nervos e vasos sanguíneos, que são um desafio para captura ou rastreamento em seções finas. O sistema nervoso simpático (SNS) desempenha um papel crucial no controle da lipólise e termogênese no tecido adiposo4,5. Imagem de uma almofada de psWAT manchada com Tirosina Hidroxilase (TH), um marcador para o SNS, revela as estruturas que aparecem como feixes nervosos grande, inervação dos vasos sanguíneos, bem como a densa arborização terminal no parênquima do tecido (Fig. 2A-H). Além disso, as projeções parenquimatosas TH + mostram variação regional dentro de psWAT, com a porção inguinal, tendo uma densidade mais elevada em relação a porção dorsolombar (Figura 2E-H; Filme complementar 1). Nosso trabalho anterior demonstrou que arborização terminal SNS pode ser rastreada computacionalmente e reconstruída usando a ferramenta de FilamentTracer do software Imaris para avaliar a densidade de inervação12.
Tecido adiposo é conhecido por ser fortemente vascularizado. As mudanças nas demandas metabólicas de adiposo são frequentemente associadas com remodelação dinâmica de sua vasculatura6,7. Robusta e rápida caracterização das todo-tecido vasculatura pode fornecer análise imparcial adicional para a remodelação da embarcação de sangue. Usando a molécula de adesão celular endotelial de plaquetas (PECAM-1, também conhecido como CD31) como um marcador para os vasos sanguíneos do rótulo, observamos que todos os adipócitos estão em contacto com os capilares em todo o tecido inteiro (Figura 3A-H; Complementar Movie 2), apoiando a alta demanda por nutrientes eficiente e oxigênio troca no adiposo.
Células do sistema imunológico são outro componente crucial do tecido adiposo. No estado obeso, torna-se inflamed tecido adiposo, que é acompanhado por infiltração de macrófagos pro-inflamatórios que formam a "coroa" estruturas circundantes adipócitos mortos15,16. Almofadas de gordura de animais obesos são particularmente difíceis de limpar devido ao seu grande tamanho e alto teor de lipídios. No entanto, a versão estendida do Adipo-Clear (descrito na tabela 2 para grande tecido ou tecido com alto teor de gordura) pode obter compensação consistente de toda alta-gordura-laden tecido. Por exemplo, gordura epidídimo de um rato alimentado com 16 semanas de dieta hiperlipídica mostra densas "coroa-como estruturas", immunolabeled por CD68, em todo o tecido inteiro (Figura 4A e B). Importante, seções óticas retiradas várias posições ao longo de toda a profundidade do tecido (~ 4-5 mm) mostrar imagens, demonstrando a completa limpeza do tecido (Figura 4-F) igualmente nítidas.
Figura 1: análise da morfologia do tecido adiposo usando o sinal de autofluorescência. Todos os painéis são imagens de microscopia (LSFM) de fluorescência folha de luz de uma almofada de psWAT preparado Adipo-Clear isoladas de um rato masculino de 8 semanas de idade C57Bl/6J alojado no RT O sinal de autofluorescência é coletado pela verificação da amostra apurada com o canal verde. Seções óticas (cortes transversais do meio da amostra) da de região dorsolombar (A) e região inguinal (B) tomadas pelo objectivo de X 1.3. (C, D) Seções de óticas de alta ampliação (4x) das regiões in a box de A e B. Gânglios linfáticos são indicados por asteriscos. Barras de escala são indicadas em cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: 3D imagem de inervação simpática no tecido adiposo. Todos os painéis são imagens LSFM de um psWAT rotulado com Tirosina Hidroxilase (TH) (a mesma amostra como na Figura 1). Máximos projeções do reconstruído dorsolombar zona (A) e região inguinal (B) tomadas pelo objectivo X 1.3. (C, D) Seções óticas do meio de A e B. (E, F) Seções de óticas de alta ampliação (4x) das regiões in a box de C e D. (G, H) Alta ampliação ópticas seções da sobreposição entre TH (verde) e autofluorescência (magenta). Setas indicam padrões distintos de inervação simpática: bundle (1) nervo; (2) inervação dos vasos sanguíneos; (3) parenquimatosa arborização. Gânglios linfáticos são indicados por asteriscos. Barras de escala são indicadas em cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: 3D de imagens de vasos sanguíneos no tecido adiposo. Todos os painéis são LSFM imagens de um CD31 rotulado psWAT (a mesma amostra como na Figura 1). (A, B) Máximos projeções do reconstruído dorsolombar zona (A) e região inguinal (B) tomadas pelo objectivo X 1.3. (C, D) Seções óticas do meio de A e B. (E, F) Seções de óticas de alta ampliação (4x) das regiões in a box de C e D. (G, H) Alta ampliação ópticas seções da sobreposição entre CD31 (vermelho) e autofluorescência (ciano). Gânglios linfáticos são indicados por asteriscos. Barras de escala são indicadas em cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagem em 3D de "estruturas semelhantes a coroa" no tecido adiposo. Todos os painéis são imagens LSFM de uma almofada de eWAT preparado Adipo-Clear isoladas de um rato masculino alimentado com dieta de alta gordura por 16 semanas. A amostra foi immunolabeled com CD31 e CD68. (A, B) Projeções máximos da amostra reconstruída com uma profundidade total de mais de 4 mm. (A) vista de X-Y. (B) vista de Y-Z. (C-F) Seções óticas das profundezas indicadas em B. Barras de escala são indicadas em cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer de | Produto químico | Concentração final |
| B1n reserva | ||
| Glicina | 0.3 M | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| H2O | Solvente | |
| Azida de sódio (conservante, opcional) | 0,01% (p/v) | |
| Ajustar o pH para 7 com NaOH | ||
| Buffer de PTxwH | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton X-100 | 0,1% (v/v) | |
| Tween 20 | 0,05% (v/v) | |
| Heparina | 2 µ g/ml | |
| H2O | Solvente | |
| Azida de sódio (conservante, opcional) | 0,01% (p/v) |
Tabela 1: lista de buffers e soluções. Esta tabela contém receitas para os buffers usados em Adipo-Clear. Para armazenamento a longo prazo dos buffers, é aconselhável acrescentar azida sódica como conservante.
| Buffer de | Tecido pequeno | Tecido grande (ou com alto teor de gordura) | Temperatura |
| buffer de metanol/B1n 20% | 30 min | 1 h | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 40% | 30 min | 1 h | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 60% | 30 min | 1 h | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 80% | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, ou durante a noite | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% metanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| Opcional: 5% H2O2/methanol | Durante a noite | Durante a noite | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 80% | 30 min | 1 h | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 60% | 30 min | 1 h | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 40% | 30 min | 1 h | 4° C |
| buffer de metanol/B1n 20% | 30 min | 1 h | 4° C |
| B1n reserva | 30 min | 1 h | RT |
| B1n reserva | Durante a noite | Durante a noite | RT |
| Buffer de PTxwH | 2 h | 2 h | RT |
| Buffer de PTxwH | Armazenamento | Armazenamento | 4° C |
| Incubação do anticorpo primário | 3 dias | 4-5 dias | RT |
| Incubação do anticorpo secundário | 3 dias | 4-5 dias | RT |
Tabela 2: tempos de incubação para delipidation e imunocoloração. Esta tabela contém os tempos de incubação para os delipidation e imunocoloração etapas do protocolo. O peso aproximado de tecido pequeno é < 300 mg.
Complementar filme 1: 3D imagem de inervação simpática no tecido adiposo. Tirosina Hidroxilase (TH) imunocoloração de uma amostra de psWAT (mesmo como ilustrado na Figura 2). O filme mostra o voar através de seções óticas (4 X a partir do dorsolombar) e regiões inguinais de psWAT, com uma profundidade total de ~ 2 mm. a TH é a mostrada em verde. Autofluorescência é mostrada em magenta. A região da porção dorsolombar aparenta ter menor densidade do SNS. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementar Movie 2: 3D imagem da vasculatura no tecido adiposo. CD31 imunocoloração de uma amostra de psWAT (mesmo como na Figura 3). O filme mostra o voar através de seções óticas (4 X a partir do dorsolombar) e regiões inguinais de psWAT, com uma profundidade total de ~ 2 mm. a CD31 é a mostrada em vermelho. Autofluorescência é mostrada em ciano. Todos os adipócitos parecem ser estreitamente cercado por capilares. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Adipo-Clear é um método simples e robusto para limpar o tecido adiposo, que pode ser facilmente executado em uma configuração de laboratório normal. Em comparação com outros métodos de limpeza à base de solvente como iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear é especialmente otimizado para limpar o tecido adiposo e outros tecidos com alto teor de gordura. A etapa de delipidation remove completamente os lipídios do adiposo e facilita, portanto, immunolabeling em todo o tecido inteiro e em grande medida minimiza a dispersão de luz, permitindo que a imagem latente to-end sem nenhuma perda de resolução XY. Além de fluorescência de luz-folha microscópios, que proporcionam a digitalização rápida de tecido grande, confocal e dois fotões microscópios também podem ser usados para obter maior resolução e mais detalhes.
A delipidation baseada em metanol/DCM é um passo crítico. Delipidation insuficiente pode resultar em imagens tremidas, especialmente em direção ao núcleo do tecido. É importante assegurar a remoção completa dos lipídios pela observação de amostras de tecido adiposas afundando em DCM. As amostras que contêm uma mistura de tipos de tecido (por exemplo, gordura epidídimo com o epidídimo e testículo anexado) não podem afundar totalmente mesmo com estendido incubação do DCM. No entanto, incubar estas amostras durante a noite em DCM deve alcançar delipidation completa. Devido a desnaturação das proteínas nestes solventes orgânicos, certos anticorpos podem não ser compatíveis com o passo de delipidation. Portanto, a escolher um anticorpo adequado torna-se mais um passo crítico para este protocolo. Recomenda-se primeiro validar os anticorpos em secções de tecido Tratado de metanol ou pequenos pedaços de tecido processado por Adipo-Clear. Da mesma forma, a compatibilidade dos corantes químicos com metanol/DCM/DBE também deve ser testada antes da aplicação.
Uma limitação do protocolo é o resfriamento das proteínas fluorescentes endogenamente expressas. Os delipidation à base de solventes orgânico e as medidas de compensação em grande parte desnaturam tais proteínas. Para visualizar as proteínas fluorescentes endógenas, anticorpo rotulagem precisa ser empregado. A disponibilidade de combinações de anticorpo adequado limita a capacidade de executar altamente multiplexados de imagem. Os microscópios de luz-folha atuais disponíveis apenas nos permitam a imagem até 4 canais.
Adipo-Clear é particularmente útil para a visualização de estruturas filamentosas e populações de células que têm relativamente baixa densidade no tecido adiposo. No entanto, sinais densos de imagem torna-se limitada com esta abordagem. Quando os anticorpos são usados para rotular os sinais densos, eles podem ficar isolados pelos epítopos localizados na superfície da amostra, bloqueando o acesso ao interior do tecido. Portanto, pequenas sondas químicas são recomendadas para manchar estruturas densas. Devido à mesma questão, a aplicação de Adipo-claro a marrom de tecido adiposo é limitada. Gordura marrom é um depósito de tecido adiposo com estruturas densas. Além da densa dos vasos sanguíneos e inervação do nervo, é também firmemente embalado com adipócitos pequenos que contêm um grande número de mitocôndrias17. Ao aplicar CD31 e TH manchando com o mesmo procedimento como descrito acima, a gordura marrom, apenas a superfície da amostra foi rotulado (dados não mostrados). Além disso, a gordura marrom produz tecido forte autofluoresence, levando a baixa relação sinal-ruído durante a imagem latente. Recomenda-se cortar a gordura marrom em pedaços menores e usar sondas químicas quando possível.
Em geral, Adipo-Clear permite a caracterização simultânea das várias estruturas de interesse com alta resolução em todo tecido adiposo. Usando essa abordagem, pode-se analisar como estruturas tais como projeções de nervo, a vasculatura, células do sistema imunológico e adipócitos interagem em todo o bloco todo gordo. Fornece dados de imageamento imparciais, evitando o corte ou a escolha de regiões de interesse. Adipo-Clear também pode ser aplicado para estudar o desenvolvimento de tecido adiposo como eventos durante a morfogênese precoce, bem como a distribuição das células progenitoras e precursor de adipócitos em estudos de rastreamento de linhagem. Além do adiposo, Adipo-Clear também pode facilitar 3D análise de toda a montagem de outros tecidos que tenham alto teor lipídico ou estão rodeados por gordura, tais como a glândula mamária e gordos do nó de linfa. Esse método também oferece a oportunidade de estudar a histologia do tecido adiposo humano em condições fisiológicas e patológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North do centro de recursos Bioimaging da Universidade Rockefeller, de assistência e apoio. Agradecemos também Xiphias Ge Zhu para edição de filme. Este trabalho foi apoiado pelo humano Frontier ciência programa organização (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
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