Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie
Summary
Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.
Abstract
Cancer de la vessie est un problème de santé important. On estime que plus de 16 000 personnes mourront cette année aux Etats-Unis d’un cancer de la vessie. Alors que 75 % des cancers de la vessie sont non invasif et peu susceptible de métastaser, environ 25 % évoluer vers un modèle de croissance invasive. Jusqu’à la moitié des patients atteints de cancers invasifs développera la rechute métastatique létale. Comprendre le mécanisme de progression invasive dans le cancer de la vessie est donc cruciale pour prédire des résultats pour les patients et de prévenir les métastases mortelles. Dans cet article, nous présentons un modèle d’invasion du cancer en trois dimensions qui permet l’incorporation des cellules tumorales et stromales composants pour reproduire in vivo les conditions rencontrées dans le microenvironnement de tumeur de la vessie. Ce modèle offre la possibilité d’observer le processus invasif en temps réel en utilisant l’imagerie Time-lapse, interroger les voies moléculaires impliquées utilisant des composés confocale par immunofluorescence, imagerie et écran risquent de bloc invasion. Ce protocole met l’accent sur le cancer de la vessie, mais il est probable que des méthodes similaires pourraient servir à examiner l’invasion et la motilité dans d’autres types de tumeur.
Introduction
Invasion est une étape essentielle dans la progression du cancer, qui est nécessaire pour les métastases et est associé à une survie plus faible et de mauvais pronostic chez les patients. Dans le cancer de la vessie humaine, la malignité plus courante du tractus urinaire, ce qui provoque environ 165 000 décès par an dans le monde entier, pronostic, traitement et stade de cancer sont directement liés à la présence ou l’absence d’invasion1. Environ 75 % des cas de cancer de la vessie sont envahissantes non musculaires et sont gérés avec résection locale. En revanche, les cancers de la vessie envahissement musculaire (environ 25 % des cas) sont des tumeurs agressives avec des taux élevés de métastatiques et sont traités avec la multimodalité agressif thérapie2,3. Comprendre les voies moléculaires déclenchant une invasion est donc essentiel de mieux caractériser le risque de progression invasive et de développer des interventions thérapeutiques qui peuvent empêcher la progression invasive.
La progression des tumeurs invasive se produit dans un environnement tridimensionnel complexe de (3-d) et implique l’interaction des cellules tumorales avec les autres cellules de la tumeur, stroma, membrane basale et d’autres types de cellules dont les cellules immunitaires, les fibroblastes, les cellules musculaires et vasculaires cellules endothéliales. Support perméable (p. ex., Transwell), systèmes de dosage sont couramment employées pour doser le cancer cell invasion4, mais ces systèmes sont limités car ils ne permettent pas suivi microscopique du processus invasion en temps réel et la Il est difficile de la récupération des échantillons pour une coloration plus loin et l’analyse moléculaire. Développement d’un système de sphéroïde de tumeur vessie 3D pour étudier l’invasion est souhaitable car elle permet l’incorporation de composants micro-environnementales définis avec la commodité des systèmes d’in vitro .
Dans ce protocole, nous décrivons un système pour interroger les processus invasifs des cellules cancéreuses de la vessie humaine à un dosage d’invasion de sphéroïde 3D intégrant des matrices de gel à base de collagène et de la microscopie confocale à permettre aux enquêteurs de surveiller la motilité cellulaire et invasion en temps réel (Figure 1A). Ce système est polyvalent et peut être modifié pour interroger les différents réglages/tumeur stromale. Il peut intégrer la plupart lignées de cellules cancéreuses de la vessie ou les tumeurs de vessie primaire et des cellules stromales supplémentaires telles que le cancer lié les fibroblastes et les cellules immunitaires5,6,7. Ce protocole décrit une matrice composée de collagène de type 1, mais peut être modifié pour incorporer d’autres molécules telles que la fibronectine, la laminine ou d’autres protéines de collagène. Processus invasifs peuvent être suivis pendant 72 heures ou plus en fonction de la capacité du microscope et le système. Fixation et immunofluorescence souillant de la tumeur, enfoui dans la matrice 3D avant, pendant et après l’invasion permet l’interrogation des protéines surexprimées dans les cellules envahissantes, fournissant ainsi des informations cruciales qu’habituellement absents ou difficiles à recueillir à l’aide d’autres modèles 3D de la culture. Ce système peut également être utilisé pour préliminaire des composés qui bloquent l’invasion et pour délimiter les voies de signalisation touchés par ces composés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un modèle de sphéroïde de tumeur 3D qui permet l’observation en temps réel de l’invasion de cancer de la vessie qui est essentielle pour la progression du cancer et des métastases. Ce système se prête à l’intégration des diverses composantes stromales et cellulaires pour permettre aux enquêteurs de rappel mieux le microenvironnement de tissu où s’effectue l’invasion du cancer de la vessie. Les sphéroïdes de cancer de la vessie peut provenir de diverses sources telles que les lig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Howard Crawford (Université du Michigan) pour le support technique et mode de matériaux et équipements pour cette étude et Alan Kelleher pour le support technique.
Ce travail a été financé par des subventions de l’Université du Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01 a 1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
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