Summary
여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.
Abstract
Microdialysis은 동작 또는 병리학 (예를 들어, 발작의 특정 결과와 뇌 틈새 공간으로 확산 하는 신경학 활성 물질의 변화를 상관 관계가 확고 신경 과학 기법 대 한 간 질). 간 질을 공부, microdialysis 기술 단기 또는 장기 심지어 비디오-electroencephalography (뇌 파) 자발적인 발작 빈도, 심각도, 진행 및 클러스터링을 평가 하기 위해 모니터링 종종 결합 됩니다. 결합 된 microdialysis 뇌 파 여러 메서드 및 악기의 사용을 기반으로 합니다. 여기, 우리가 쥐 모델에서 간 질의 자연 역사의 여러 단계에서 시간이 지남에 모니터 조미료와 aspartate 유출 녹음 지속적 비디오 뇌 파 vivo에서 microdialysis를 수행. 결합 된 이렇게 페어링 신경 전달 물질 방출에 변화 질병 개발 및 진행의 특정 단계를 수 있습니다. Dialysate는 아미노산 농도 액체 크로마토그래피에 의해 결정 되었다. 여기, 우리가 설명 방법 및 개요 주 예방 조치 한 비보에 microdialysis 동안 해야한다-stereotaxic 수술에 특히 주의 microdialysis, 깊이 중 기저 및 높은 칼륨 자극 뇌 파 전극 뇌 파 기록 및 aspartate 및 조미료는 dialysate에 고성능 액체 크로마토그래피 분석. 이 방법을 적용할 수 있습니다 aspartate 및 두뇌에 조미료의 생리 적 농도의 변화를 유도 하는 약물 이나 질병의 다양 한 테스트. 적절 한 분석 분석 결과의 여부에 따라 그것은 사용할 수 있습니다 더 이상 뇌 파 기록을 동시에 채용 하는 경우 다른 수용 성 분자를 테스트 하.
Introduction
기능 장애 조미료-중재 흥분 성의 GABAergic 금지 neurotransmission 측 두 엽 간 질 (TLE)에 자발적인 발작의 결과에 대 한 통찰력을 제공 하려면 우리는 체계적으로 extracellular 농도의 모니터링 GABA1 와 나중 자연 질병의 다양 한 시간 포인트에서 쥐의 복 부 해 마에 있는 microdialysis에 의해 조미료와 aspartate2 수준 과정, 즉, 개발 및 간 질의 진행 하는 동안. 우리는 TLE pilocarpine 모델 쥐, 모방 행동, electrophysiological 및 histopathological 변경3,4 면에서 매우 정확 하 게 질병을 이용 했다 그리고 우리 상관의 아미노 dialysate 농도 그것의 다른 단계에 산: epileptogenic 모욕, 대기 시간 단계, 첫 번째 자발적인 발작과 만성 phass5,,67시간 후 급성 단계. 질병 단계 프레임 장기 비디오-뇌 파 모니터링 및 정확한 뇌 파 및 자발적인 발작의 임상 특성에 의해 활성화 되었습니다. Microdialysis 기술에의 응용 프로그램은 장기 비디오-뇌 파 모니터링 TLE neuropathology에 대 한 기계적 가설을 제안 하 연관. 요약 하자면,이 원고에 설명 된 기술을 neurochemical 변경 개발 및 간 질 동물 모델에서의 진행으로 정의 된 뇌 영역 내에서 쌍 수 있습니다.
이점된 장치, microdialysis 정에 juxtaposed 깊이 전극의 구성 종종 간 질 연구 연구 신경 활동에 신경 전달 물질, 그들의 대사 산물, 또는 에너지 기질 변화 한다 상관 하는 어디에서 채택 된다. 대부분의 경우 그것은 자유롭게 행동 하는 동물에서 사용 하지만 그것은 또한 예를 들어, 수술8전에 깊이 전극 조사 수립이 저항 간 질 환자에서 인간의 비슷한 방식으로 지휘 될 수 있다. 뇌 파 기록 및 dialysate 컬렉션은 별도로 수행할 수 있습니다 (예를 들어를 한 반구에는 microdialysis 전극 이식도 수행 하는 동안 동물의 한 그룹에는 microdialysis을 수행 또는 다른 반구에 프로브 유일한 뇌 파 동물의 또 다른 그룹에). 그러나, 프로브를 전극 커플링 여러 장점을 있습니다: stereotaxic 수술을 간소화, 한 반구 조직 손상을 제한 (다른 하면서 조직학 연구에 대 한 제어로 그대로), 그리고이 결과 homogenizes 같은 뇌 영역 고 같은 동물에서 얻을 수 있습니다.
다른 한편으로, 그것은 집에서 만든 경우 기술 및 시간 결합 된 microdialysis 프로브 전극 장치 준비 해야 합니다. 하나는 시장에서 구입한 경우 상대적으로 높은 금액을 보낼 수 있습니다. 또한 때 microdialysis 프로브 (프로브 팁 직경 및 길이가 7-12 mm에서 200-400 µ m는 일반적으로)9및 EEG 전극 (전극 팁은 일반적으로 300-500 µ m의 직경, 및 충분히 관심10의 뇌 구조에 도달) 결합 하 여, 탑재 된 장치는 동물을 위해 번잡 하 고 특히 연결 하면 투 석 펌프 및 하드 와이어 EEG 레코딩 시스템 손실 될 경향이 머리의 한쪽에 크고 상대적으로 무거운 개체를 나타냅니다. 이 측면은 처리 하기 어렵고 덜 microdialysis 세션에 적응형 간 질 동물에 더 적합 합니다. 적절 한 수술 기법 및 적절 한 수술 치료는 최소한의 동물 불편을 일으키는 원인이 되 고 조합 microdialysis-뇌 파 실험10,11, 에 대 한 추구 되어야 오랫동안 임 플 란 트에 발생할 수 있습니다 12.
장점과 한계 microdialysis 기술의 세부 사항에 많은 신경 과학자에 의해 평가 되었습니다. 그것의 주요 장점은 다른 비보에 관류 기법 (예를 들어, 빠른 흐름 푸시 풀 또는 대뇌 피 질의 컵 관류)에 프로브는 관심13,14, 비교적 정확한 면적의 작은 직경 15. 둘째, microdialysis 막 조직과 perfusate; 사이의 물리적 장벽을 만듭니다. 따라서, 높은 분자 무게 물질 교차 하지 않는다 고 분석16,17방해 하지 않습니다. 또한, 조직 perfusate18의 난 류 흐름에서 보호 됩니다. 다른 중요 한 장점은 perfusate에서 분석 농도 극대화 하기 위한 perfusate 흐름 수정 가능성 (즉, microdialysis 과정 잘 수학적으로 정의 될 수 있습니다와 높이를 수정할 수 있습니다 샘플에 있는 분석의 농도)19. 마지막으로, 관심의 조직에 약물 또는 약리학 내용물을 고취 하 고 개입20의 사이트에 그들의 효과 결정 하는 기술을 사용할 수 있습니다. 다른 한편으로, microdialysis는 전기 화학 또는 생물 센서;에 비해 제한 된 해상도 시간이 (일반적으로 이상 샘플 수집에 필요한 시간이 1 분) 그것은 조직 손상; 하는 침략 적 기법 그것은 관심의 실정이 함께 perfusate를 입력 하는 모든 녹는 물질의 지속적인 농도 기온 변화도 때문에 막 주위 공간 내에서 neurochemical 균형 타협. 마지막으로, microdialysis 기술은 높은 분석 기법에는 perfusate9,,2122,23 물질의 정량화에 대 한 고용의 제한에 의해 영향을 . 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 후 조미료와 aspartate 생물 샘플 분석에 대 한 orthophthaldialdehyde와 derivatization 잘 검증된24,,2526 , 27 그리고 그것의 광범위 한 토론이이 원고의 범위 이지만이 메서드를 사용 하 여 생성 하는 데이터를 자세히 설명 합니다.
제대로 하 고 perfusate 구성의 수정 없이 수행, microdialysis 신경 전달 물질 방출의 기초 수준에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공할 수 있습니다. 기초 수준의 가장 큰 부분이 가능성이9시 냅 스 송신기 넘침의 결과 이다. 많은 경우에 추가 시 냅 스 공간에서 신경 전달 물질의 간단한 샘플링은 조사 목표를 추구 하기에 충분 하지, 때문에 microdialysis 기술을 채택 될 수 있다 또한 뉴런을 자극 하거나 중요 한의 그들을 박탈 하는 것은 K+ 또는 캘리포니아2 +연상 하거나 신경 전달 물질의 방출을 방지 등 생리 이온.
높은 K+ 자극 깨어 동물 뿐만 아니라 기본 및 organotypic 문화에 신경 활동을 자극 하는 신경 생물학에 종종 사용 됩니다. K+ (40-100 m m)의 높은 농도 가진 솔루션 건강 한 중추의 노출 신경 전달 물질28의 경과 끝. 간 질 동물1 과 다른 신경 퇴행 성 질환29,30높은 K+ 에 추가 릴리스를 제공 하는 뉴런의이 능력을 손상 될 수 있습니다. 마찬가지로, 캘리포니아2 + 부족 (Ca2 + 무료 솔루션 perfusing에 의해 얻은) 칼슘 의존을 설정 하는 데는 microdialysis에 의해 측정 하는 대부분 신경 전달 물질의 릴리스. 반면 캘리포니아2 + 독립적인 자료 명과에서 유래 하지만 많은 연구 캘리포니아2 +의 의미 논란 제기 Ca2 + 종속 릴리스 신경 원산지는 일반적으로 믿어진다-민감한 측정의 예 조미료 또는 GABA9: 따라서, 만약에 가능 하다 면, 그것은이 후자는 더 높은 공간적 해상도 전극 시 냅 스31에 가까이 있게 microsensor 연구, microdialysis 연구를 지 원하는 것이 좋습니다.
간 질 동물에 microdialysis 연구에 대 한 그들의 대부분에서 얻은 데이터는 비디오 또는 비디오-뇌 파 모니터링 발작, 즉, 표지판 때문에 비정상적인 증상의 일시적 발생의 의존을 강조 하는 것이 중요 하다 과도 한 또는 동기 신경 활동 두뇌32에서. Pilocarpine 치료 동물 실험을 준비할 때 고려해 야 하는 electrographic 발작의 몇 가지 특성을 확인 하 고 있습니다. 자발적인 발작 뒤에 자주 뇌 파 interictal 스파이크3 우울된 활동 하 고 클러스터33,34에서 발생. 가짜 운영된 비 간 질 동물 발작 같은 활동35 전시 수 있습니다 따라서 뇌 파 기록 평가 대 한 매개 변수는 표준된36 여야 고, 만약에 가능 하다 면, microdialysis 세션의 타이밍 잘 정의 되어야 합니다. 마지막으로, 우리는 매우 좋습니다 전문가의 국제 리그 간 질 반대와 미국 간 질 학회 그들의 아주 최근 보고서37에 의해 제시 된 원리와 방법론 표준 비디오-뇌 파 모니터링 제어 성인 설치류에 대 한 ,38.
여기, 우리 microdialysis 조미료 및 간 질 동물에서 장기 비디오-뇌 파 기록 및 그들의 분석에서 dialysate HPLC에 의해 동시에 aspartate의 설명. 우리 하나 최상의 결과 위해 처리 해야 하는 프로토콜의 중요 한 단계를 강조 합니다.
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Protocol
페라라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해와 이탈리아 보건부에 의해 모든 실험 절차 승인 (승인: D.M. 246/2012-B) 유럽 공동체에 설명 된 지침에 따라 1986 년 11 월 24 일 (86/609/EEC)의 위원회 지시문입니다. 이 프로토콜은 특히 쥐 뇌 dialysates microdialysis 세션 간 질 및 간 질 비 쥐의 뇌 파 제어에서 얻은에 조미료와 aspartate 결정에 대 한 조정 됩니다. 여기는 자료의 많은 수 있습니다 쉽게 대체 뇌 파 기록 또는 microdialysis에 대 한 그의 실험실에서 사용 하는 그.
1. Microdialysis 프로브-전극 장치 조립
- 3-채널 2 트위스트 전극 (등록 전극의 길이 잘라 적어도 20 m m와 긴 전극 접지 10 cm) 사용 하 고 장치를 준비 하는 가이드 정 커플. 3-채널 전극과 가이드 정 투 그림 1A에대 한 예제를 참조 하십시오-1B.
- (그림 1C)을 제거 하 고 동물에 microdialysis 프로브에 대 한 그것의 스위치의 순간에 (그림 1D) 몇 번의 제거를 쉽게 하기 위해서는 사용 전에 더미 플라스틱 캐 뉼 러에 금속 가이드 cannula를 삽입.
- 등록 전극 두 번 꼬인된 와이어 벤드 (그림 1E-1 층) 가이드의 더미 정으로 와이어를 정렬 하 고 전극 팁 (그림 1G) 0.5 m m 가이드 정 (그림의 끝 보다 긴 것을 잘라 1 H) 디지털 캘리퍼스를 사용 하 여.
- 1mm 긴 실리콘 고리를 준비 (마약과 2 m m, 두께 0.3 m m; 그림 1I) 그리고 가이드 정의 팁과 트위스트 전극의 팁 핀셋 (그림 1J)를 사용 하 여 실리콘 고리에 삽입. 그것을 수정 가이드의 발에 정 받침대 급속 한 행동 또는 수 지 (그림 1 K)의 폴리머 접착제. 그림 1 L 와 그림 2A에서 완성 된 장치의 예를 참조 하십시오.
- 소독 살 균 자외선 아래 장치 4 h. 회전 장치를 통해 그렇게 각 측면의 4 배를 1 시간에 대 한 빛에 노출.
참고: 많은 집에서 만든 전극 및 microdialysis 프로브는 비슷한 방식으로 조립 될 수 있습니다. 쥐에 대 한 설명된 임 플 란 트 위에 머리에 다음 크기는: x 발가락; 받침대 위에서 10 m m 길이 7 m m 폭 x 5 m m 깊이 임 플 란 트 팁 직경에서 600 µ m 및 모든 장치 무게 약 330-360 밀리 그램 약 11 m m, 이다. 장치 수 있습니다 다시 사용할 2 ~ 3 번 접지 전극의 (i) 충분 한 길이 남아 있는 경우 두개골에 다음 사용 하 고 수술 하는 동안 (ii) 때 동물을 살해 하 고 치과 시멘트 아세톤에 남아 함께 복구 된 장치 overnigh t, 등을 시멘트 기계적 disaggregated 수 있습니다, 장치 세척 하 고 다시 소독.
2. stereotaxic 수술
- Stereotaxic 장치 및 프로브 클립 홀더 (그림 2B)를 사용 하 여 다음과 같은 무 균 하 고 통증 없는 수술39,,4041현대 표준 장치 주입에 대 한.
- 케 타 민/xylazine 혼합 (43 mg/kg 및 7 mg/kg, i.p.) 성인 Sprague-Dawley 쥐 anesthetize 고 stereotaxic 프레임에 그것을 해결. 그것은 시간에 마 취의 깊이 제어할 수로 초기 케 타 민/xylazine 주입에 isoflurane 마 취 (공기에서 1.4%, 1.2 mL/min)를 추가 합니다. 동물의 머리에 모피를 면도.
- 무 균 수술39에 대 한 준비를 70% 에탄올 뒤 요오드 기반 솔루션으로 머리 피부 표면 면봉.
- 다음 좌표를 사용 하 여 오른쪽 복 부 해 마에 우선 (1.1-1.5)에 준비 가이드 정 전극 장치 임 플 란 트: 코 바 + 5.0 m m,-3.4 m m, L + 4.5 m m, P + 6.5 m m bregma1,2. 따라 stereotaxic 수술10,,1112에 대 한 표준 기술.
- 그것은 고정 나사를 커버 하지 않습니다 확인 합니다. Stereotaxic 장치에 장착,이 프로브 홀더를 쉽게 정렬 될 수 있습니다으로 가이드 정 머리에 대 한 장치를 파악.
- 두개골 뼈 (오른쪽 정면 뼈 격판덮개, 정수 리 왼쪽으로 1 나사 및 interparietal 뼈 격판덮개로 1 개의 스크류로 왼쪽과 1 나사에 1 나사)에 그들을 속이 고 적어도 4 개의 스테인리스 나사를 가진 두개골에 장치를 앵커. 추가 수정 두개골 뼈에 각 나사를 조직 접착제의 방울을 추가 합니다.
- 스크류 스레드 酸 시멘트의 절반을 커버. 시멘트의 바인딩 부착을 증가 뼈에 얕은 홈을 만들어 홍보.
- 일단 장치의 뇌 조직에, 위치 고정 나사 3 지상 전극의 와이어 트위스트. 모든 탑재 된 나사와 치과 시멘트12,,4243장치 커버.
- 직 립 및 감 금 소의 이동까지 그 후 동물을 수술 하는 동안 고 약 1 시간에 대 한 모니터링 합니다. 저체온증을 피하기 위해 온난 패드에 그들을 유지. 쥐 장치 이식 후 적어도 7 일 동안 복구를 허용 합니다.
- 통증이 나 고통의 흔적에 대 한 수술 후 3 일 동안 적어도 한 번 매일 동물을 모니터링 합니다. 감염 및 진통제를 방지 하기 위해 베인 가까운 항생제 크림 (gentamycin 0.1%)와 동물에 게 (tramadol 5 mg/kg, i.p.) 수술 후 통증을 방지 하기 위해 3 일 동안.
3. 측 두 엽 간 질 유도 Pilocarpine 및 동물 실험 그룹의 할당
- 수술 후 회복의 일주일 후 동물 임의로 그룹에 할당: (i) 제어 동물 차량 및 (ii) 간 질 동물 pilocarpine 수신할 수신. 동물의 비례 높은 수를 사용 하 여 모든는 pilocarpine 투여 쥐 이후 간 질 그룹에 대 한 질병을 개발할 것입니다.
- Pilocarpine (350 mg/kg, i.p.) 상태 epilepticus (SE) 유도에 한 주입 후 methylscopolamine (1 mg/kg, 사우스 캐롤라이나) 및 30 분 복용량을 주사. Methylscopolamine 및 차량 (염 분) 제어 쥐에 주사. 1 mL 주사기를 사용 하 여 모든 i.p. 행정에 대 한 25 G 바늘.
- 동물 행동 발작 (vibrissa 사지를 복제 하는 머리를 끄 덕 5 분 이내 이동)을가지고 시작을 시각적으로 확인 하 고 지속적으로 모든 신체 (SE)을 25 분 이내.
- 다이아 제 팜 (20 mg/kg, i.p.)의 행정에 의해 약 25% 사망률과 약 10 일의 평균 잠 기간을 발병 후 h SE 2를 체포. 관찰 및 pilocarpine 주사 직후 발작 동작 시작 어떤을 기록 하 고 그 후 적어도 6 h에 대 한 계속.
- 주고 동물 식 염 수 (1 mL, i.p.) 25g 바늘과 자당 솔루션 (1 mL, 사서함) 1 mL 주사기를 사용 하 여를 사용 하 여 1 mL 주사기와 유연한 먹이 17 G 바늘 SE 후 2-3 일 동안 몸 무게 감량의 회복을 촉진.
- Pilocarpine SE 연구 (SE, 몸 무게 후속 불가능 하지 후 24 h를 죽인 급성 그룹) 제외 후 첫 주 내 초기 몸 무게를 달성 하지 않는 동물을 제외 합니다.
- 게시물-SE 동물을 임의로 다른 실험 그룹 (그림 3) 할당: 급성 단계 (여기서는 microdialysis 일어난 24 시간 SE 후), 대기 (SE 후 7-9 일), 첫 번째 자발적인 발작 (약 11 일 이후 SE), 및 만성 기간 ( SE, 즉 약 10 일 후에 첫 번째 발작 후 약 22-24 일 시작). 자발적인 발작의 발생에 대 한 동물을 모니터링 합니다.
참고: 간 질 쥐 추가 실험에 대 한 다음 포함/제외 기준을 사용 하 여: pilocarpine 관리; 후 1 시간 이내 경련의 개발 무게는 SE 및 microdialysis 프로브 및 전극의 올바른 위치 후 첫 주에 얻을.
4. 간 질 동작 모니터링 및 분석
- 간 질 행동의 장기 모니터링
- Pilocarpine 관리 (즉, 연구원에 의해 직접 관찰의 끝에), 후에 대략 6 h는 동물 깨끗 한 집 새 장 놓고 24 시간 비디오 모니터링을 시작 합니다.
- 24 시간 비디오 5 일까 모니터링, 디지털 비디오 감시 시스템을 사용 하 여 계속 합니다.
- 5 일에 시작, 속박 되 뇌 파 기록 시스템을 그들의 가정 직사각형 장에 쥐를 연결 하 고 24 시간 비디오 모니터링을 계속.
- 연결 되지 않은 제작한 앰프 패러데이 케이지 (각 단일 동물의 뇌 파 신호의 특이성에 따라 각 채널에 설정된 증폭 요인)와 뇌 파 신호를 관찰 하는 시작 뇌 파 인수 이외의 위치에 매개 변수 설정 케이블입니다. 사용 하 여 샘플링 200 Hz 속도 그리고 낮은 0.5 hz 필터 집합을 전달 합니다.
- 케이블 들고 한 손을 뻗어 손가락 두 개 사이 동물의 머리와 다른 자유 재량을 사용 하 여 전극 받침대 커넥터 아래로 속이 고 동물을 연결 합니다. 인수를 시작 합니다.
주의: 신호 유물의 무료 인지 확인 합니다. 일반적인 아티팩트는 크게 규모를 초과 하는 스파이크. - 하루 전에 microdialysis 실험, microdialysis에 대 한 플 렉 시 유리 실린더 장착 속박 되 뇌 파 시스템으로 동물을 전송 합니다. 동물 동물 제 지 없이 전극에서 커넥터를 속이 고 집 안의 시스템을 tethering 뇌 파에서 분리 합니다. 높은 플 렉 시 유리 실린더에 동물을 놓습니다.
- 하루 전에, microdialysis 세션 중 간 질 동작의 모니터링
- 패러데이 새 장 밖에 위치 하는 증폭기에 스위치. 뇌 파 소프트웨어를 엽니다. 연결 되지 않은 케이블 제작한 뇌 파 신호를 관찰 하는 EEG 수집 시작 합니다.
- 한 손을 뻗어 손가락 두 개 사이 동물의 머리를 들고와 다른 자유 재량을 사용 하 여 전극 받침대 커넥터 아래로 속이 고 속박 되 뇌 파 기록 시스템에 동물을 연결 합니다. 규모에 뇌 파 신호는 증폭 요인 (이득) 단일 동물의 전극 신호에 따라 앰프의 각 채널에 설정. 연구원의 직접 관찰에서 적어도 1 시간에 대 한 새로운 케이지 (실린더)을 탐험 하는 동물을 보자.
- 참고: 전에 microdialysis h 24 실험, 쥐 짧게 isoflurane microdialysis 프로브를 가이드 뉼의 스위치와 마 취. 때 그들은 뇌 파 기록 시스템에 그들을 연결 하 취는 순간의 활용.
- 단축 또는 동물의 필수품에 매달린 케이블을 연장. 케이블 동물의 움직임과 거짓말 자세와 함께 방해 하지 않습니다 다는 것을 확인 하십시오.
- 비디오 카메라의 올바른 이미지 프레임에 대 한 확인 하십시오. 비디오-뇌 파 녹음을 시작 합니다.
- 발작과 뇌 파 활동의 id
- 소프트웨어 플레이어를 사용 하 여 동영상을 보고. 동영상 8 번 실시간 재생 보다 빠르게 스크롤한 일반화 된 발작 (forelimb clonus와 뒤쪽으로 동물 또는 동물 양육 forelimb clonus 떨어지고 참조) individuate. 비디오 느려집니다 고 행동 발작의 끝의 처음의 정확한 시간 합니다.
- 프로세스 일반화 된 발작의 수를 계산 하 여 데이터 비디오 레코드의 24 시간에서 관찰 하 고 발작 빈도와 기간 24 시간 관찰 하는 모든 발작의 값을 의미 들을 표현.
- 높은 주파수의 발작 활동 기간으로 뇌 파 발작을 정의 (> 5 Hz) 특징으로 > 3 s2,44 의 최소 지속 스파이크 주파수의 진행 초기에 3 진폭 증가 또는 유사한28. 뇌 파 소프트웨어를 사용 하 여 원시 뇌 파 기록 처리. 뇌 파 추적 1 h 조각으로 분할. 뇌 파 추적 분수 소프트웨어 자동 스파이크 분석에 대 한 파일을 복사 합니다.
- 뇌 파 소프트웨어 및 미리 정의 된 매개 변수 (4.3.3)를 사용 하 여 뇌 파 활동 데이터를 분석 합니다. 두 개의 독립적인 조사 분석 된 동물의 그룹에 대 한 눈 먼 사람에 모든 비디오 분석을 수행 합니다. 발산, 경우 다시 함께 합의45에 연결할 데이터를 검토 있도록.
5입니다. Microdialysis
- 체 외에서 조사 복구
- 그 보호 슬리브에서 처리 제조업체의 지침에 따라 최초의 사용에 대 한 조사를 준비 합니다.
- 3 중에서 실험을 실행: 준비 3 1.5 mL 시험관 1 mL의 표준 (조미료의 2.5 µ M)과 aspartate의 2.5 µ M의 혼합물을 포함 하는 벨의 솔루션으로 그들을 로드. 37 ° C에 블록 히터 세트로 3 로드 1.5 mL 테스트 튜브를 넣고는 활동가에 위치.
참고: 크로마토그래피 교정에 대 한 동일한 표준 솔루션을 사용 합니다. - 파라핀 영화 테스트 튜브 1.5 mL를 봉인 하 고 직경에서 약 1 m m의 구멍을 만들기 위하여 날카로운 핀셋으로 펑크.
- 프로브를가지고 하 고 파라핀 필름에서 만든 구멍에 삽입 합니다. 솔루션 수준에서 2 mm 이상 막 담가. 파라핀 필름에 의해 더 프로브 테스트 튜브 1.5 mL를 수정.
주의: 팁 1.5 mL 시험관의 벽에는 영향을 만지지 않는다 있는지 확인 합니다. - 프로브 입구 FEP 튜브 및 배관 어댑터를 사용 하 여 주입 펌프에 주사기를 연결 합니다. 필요에 따라 사용 잘 연결 0.28 m m ID와 0.61 m m OD 및 컬러 튜브 어댑터 (빨간색과 파란색 튜브 어댑터)의 폴 리 에틸렌 튜브를 낳았다.
- 2 µ L/min에서 펌프를 시작 하 고 액체 출구 끝에 표시를 하자. FEP 튜브 및 배관 어댑터를 사용 하 여 테스트 튜브를 수집 0.2 mL를 프로브 콘센트를 연결 합니다.
참고: FEP 튜브를 사용 하 여 모든 연결에 대 한. 면도날을 사용 하 여 원하는 길이의 튜브를 잘라. 다른 색상의 튜브 어댑터를 사용 하 여 입구와 출구 조사에 대 한. 누수에 대 일 분 확인에 대 한 실행 하 고 기포 펌프를 하자. 이 존재 해서는 안됩니다. - 흐름 속도 2 µ L/분에 펌프를 설정 하 고 배관의 출구 쪽에 샘플을 수집 하기 시작.
- 3 30 분 perfusate 샘플 및 1.5 mL 테스트 튜브에 있는 솔루션의 3 개의 동등한 볼륨 샘플을 수집 합니다. 1.5 mL 테스트 튜브 1.5 mL 테스트 튜브에서 표준 솔루션으로 포장 하는 microsyringe를 사용 하 여 매일 30 분에서에서 동일한 볼륨 샘플을 가져가 라.
- 반복 실험 (5.1.1-5.1.8) 두 개의 다른 관류 흐름 율을 사용 하는 경우 프로브 복구 비교를 펌프 흐름 율 3 µ L/min (5.1.7)를 설정 합니다.
- 완료 되 면 펌프를 중지와 증류수, 70% 에탄올으로 튜브를 헹 구 고 그것으로 공기를 밀어. 깨끗 한 증류수로 가득 유리병에 프로브를 저장 합니다. 저장 전에 증류수로 2 µ L/분에 perfusing에 의해 조사를 철저 하 게 린스.
- 크로마토그래피에 의해 조미료와 샘플에 aspartate의 농도 분석 (세부 사항 참조 아래; 6.3).
- 다음 수식을 사용 하 여 복구를 계산.
복구 (%) = (Cperfusate /C솔루션 dialysed) x 100.
- 자유롭게 이동 하는 쥐에 Microdialysis 세션
- 대리점 절차: 삽입 프로브 및 테스트 주입 펌프 설정 및 시작
- 제조 업체의 설명서에 따라 첫 번째 사용에 대 한 microdialysis 프로브를 준비 하 고 벨의 솔루션 그들을 채우십시오. 약 10 cm FEP 튜브의 긴 조각을 잘라내어 다른 색상의 튜브 어댑터를 사용 하 여 프로브의 입구 및 출구 뉼 연결.
- 튜브 어댑터에서 모든 연결 없는 죽은 공간을 지 다는 것을 확인 하십시오.
- 5.2.1.3 24 h microdialysis 실험 하기 전에 잠시 휴식 때까지 유도 실에서 isoflurane (공기에 5%)와 동물 anesthetize. 핀셋을 사용 하 고 동물의 머리를 단단히 잡고 그것의 가이드에서 더미 정을 제거 합니다. Dialyzing 막 가이드 정으로 부여 microdialysis 프로브를 삽입 하 고 회사 더 microdialysis 뉼 클레이 모델링 함으로써 그들의 가이드에 삽입.
주의: 프로브를 추출할 때 보호 프로브 소매의 벽을 터치 하지 마십시오. - 플 렉 시 유리 실린더에 동물을 넣고 새로운 분위기를 탐험 하자. 위에서 설명한 대로 속박 되 뇌 파 기록 시스템에 동물을 연결 (4.2.2 및 4.2.3 포인트에 따라).
- 깨어 따라 쥐의 움직임을 자유롭게 이동 하 고 무딘 22 G 바늘 튜브 어댑터를 사용 하 여 벨의 솔루션을 포함 하는 프로브의 입구 2.5 mL 주사기를 연결. 10에서 벨의 솔루션의 1 mL를 꺼내기 프로브 내부 벨의 솔루션을 밀어 2.5 mL 주사기의 피스톤을 지속적으로 추진 하는 s. 콘센트에 액체의 하락에 대 한 확인 하십시오. 프로브는 이제 사용할 준비가 되었습니다.
- 벨의 솔루션 튜브 어댑터 FEP 튜브에 연결 하는 2.5 mL 주사기를 작성 하 고 주입 펌프에 탑재. 2 µ L/min에서 펌프를 시작 합니다. 밤새 실행 하자.
참고: 모든 FEP 튜브의 원하는 길이 사용 하지만 튜브 죽은 볼륨 높은 K+ 자극 시작할 때 알아야 하 고 동물성 두뇌에 있는 neurochemical 변화 정량화 데이터 상관 관계를 계산 합니다. 작업 흐름에서 튜브에서 만든 공기 거품을 사용 하 여이 시간을 계산.
- 뇌 파 기록 및 칼륨 자극 중의 샘플 수집
- 3 h 샘플 컬렉션 (비디오-뇌 파 기록)의 앞에서 발작의 부재를 확인 하 고 계속 microdialysis 동안 발작 활동을 모니터링.
- 벨의 솔루션으로 채워 cannulated FEP 튜브 주사기를 들고 펌프를 중지 합니다. 다른 세트 2.5 mL 주사기 펌프에 마운트에 연결 FEP 튜브 100mm를 포함 하는 수정된 벨의 솔루션과 채워 어댑터 튜브와 K+ 솔루션.
- 2 µ L/min에서 펌프를 시작 하 고 그것을 실행 하자. 튜브의 더 빠른 작성을 위한 충전의 시간에 대 한 펌프 5 µ L/min에서 설정 합니다. 시스템에서 공기 방울의 부재를 확인 합니다. 튜브 어댑터에서 모든 연결 없는 죽은 공간 접촉 확인 합니다.
- 동물 (5.2.1.5) 위에서 설명한 대로 조사 사용 하기 위해 준비 하는 경우 테스트 합니다.
참고: 어떤 이유로 프로브 작동 하지 않으면, 그것을 변경 합니다. 이러한 경우에 대 한 몇 가지 준비 microdialysis 프로브 microdialysis-뇌 파 워크 스테이션 근처 사용할 준비가 유지. 동물 뇌 파 케이블에서 분리 하 고 anesthetize 그것 짧게 isoflurane와 변화를 실현 하기 위해 필요한 경우. - 벨의 솔루션의 각 동물에는 콘센트의 끝에 액체 방울의 모양에 대 한 대기 프로브 입구 정을 채워 주사기의 FEP 튜브를 연결 합니다.
- FEP-튜브, 테스트 튜브에 수집에 이르게에 탐사선의 콘센트를 연결 합니다. 구멍이 모자와 함께 닫힌된 0.2 mL 테스트 튜브에 FEP 튜브를 삽입 합니다. 튜브 숙박 장소에 모델링 찰 흙의 조각으로 고정 하 여 확인 합니다.
- 60 분 2 µ L/분에 equilibrate 시스템 (영 샘플) 샘플을 수집 하지 않고 실행 하는 펌프를 계속 합니다.
- 초기 조건 (일반 벨소리 솔루션 관류)에서 5 연속 30 분 dialysate 샘플 (60 µ L 각각 볼륨)를 수집 합니다. 얼음에 샘플을 저장 합니다.
- 액체 펌프에서 동물의 머리 (죽은 양의 튜브, 즉, 공기 거품 시간 의존)에 전달 하는 시간을 계산 하 고 포함 된 주사기를 정상적인 벨의 솔루션을 포함 하는 주사기가는 FEP 튜브 전환 펌프를 중지 하지 않고이 시간에 (100 m m K+) 벨의 솔루션을 수정. 시스템에서 공기 방울의 부재를 확인 합니다. 펌프 10 분 동안 실행 하자.
주의: 높은 K+ 자극의 10 분, 동물 frenetically 자신을 이동 하 고 일반적으로 쉐이크 젖은 강아지의 큰 번호를 제시 하는 경향이 (제어 및 발작 클러스터 동물에서) 행동 발작 (간 질 동물), 그래서 개입 하 게 준비 되어 있을 또는 트위스트에서 튜브 및 케이블을 보호 합니다. - 10 분 후 정상적인 벨소리 솔루션 100 m m K+ 벨 솔루션을 포함 하는 주사기에서 튜브를 전환 그리고 실행 하는 펌프. 설정 하지 마십시오 펌프 솔루션 변경 시를 그 라인에 연결 되어 있어야 튜브의 끝에 액체의 하락 있을 것입니다.
- dialysate 포함 높은 칼륨, 즉, 다섯 번째 후 평형 dialysate의 수집 후 순간부터 1 h. 수집 3 추가 30 분 dialysate 샘플 dialysate 분수 마다 10 분 (20 µ L)을 수집 하 고 중지는 펌프입니다. 얼음에는 샘플을 저장 합니다.
- HPLC 분석까지-80 ° C에서 샘플 실험 후 저장 합니다.
- microdialysis 급성 (24 시간) 및 첫 번째 발작 그룹, 있는 하나의 microdialysis 세션 후에 일어난다 24 시간 SE 후 또는 24 시간 이내 첫 번째 자발적인 발작 (그림 3)를 제외한 3 일 연속에 대 한 실험을 반복 합니다.
- 각 실험의 완료, 마 취 과다와 동물을 안락사 하 고 프로브 및 전극 배치의 두뇌를 제거 합니다.
- 대리점 절차: 삽입 프로브 및 테스트 주입 펌프 설정 및 시작
- 포스트 microdialysis 절차
- 증류수를 사용된 microdialysis 프로브를 헹 구 고 깨끗 한 증류수 다음 사용까지 가득 유리병에 보관.
참고: 재사용된 막 침투성; 증가 할 수 있습니다. 프로브 복구의 반복된 사용 하기 전에 확인 하십시오. - (튜브, 커넥터 및 주사기) 70% 에탄올 다음 증류수와 설정 전체 microdialysis 린스. 공기와 에탄올을 대체 하 고 메 마른 환경에서 집합을 저장.
- 기저 dialysate 샘플 20 µ L 조각으로 분할 하 고 아미노산 기저 농도 분석에 대 한 하나의 20 µ L 분수를 사용 합니다. 추가 또는 확실 한 분석-80 ° c.에 대 한 나머지 샘플 볼륨을 저장
- 10% 포 르 말린에 머리를 해결 하 고 파라핀 포함1그들을 보존. Coronally 조각으로 두뇌를 섹션 하 고 오신 hematoxylin와 그들을 얼룩. 정확한 조사 및 전극 배치1,2두뇌를 검사 합니다.
참고: 두뇌 냉각된 2-methylbutane에서 수정 하 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 어떤 다른 검증 된 얼룩 프로브 및 전극으로 시각화를 허용 하는 신경 조직 섹션에 사용 합니다.
- 증류수를 사용된 microdialysis 프로브를 헹 구 고 깨끗 한 증류수 다음 사용까지 가득 유리병에 보관.
6. 조미료와 Aspartate의 컬럼에 분석
- Derivatizing 에이전트의 준비
- 각 20:1 (v/v)의 볼륨 orthophthaldialdehyde 시 약 (OPA)와 2-mercaptoethanol (5-ME) 유리병에 혼합. 유리병 뚜껑 및 공기 꽉 심장을 사용 하 여 닫습니다.
주의: 화학 후드 작동 합니다. - 회오리 준비 솔루션 autosampler derivatizing 에이전트에 대 한 위치에 넣어.
- 각 20:1 (v/v)의 볼륨 orthophthaldialdehyde 시 약 (OPA)와 2-mercaptoethanol (5-ME) 유리병에 혼합. 유리병 뚜껑 및 공기 꽉 심장을 사용 하 여 닫습니다.
- Dialysate 샘플의 준비
- 하단 봄 유리 삽입을 2 mL 갈색 autosampler 유리병에 넣습니다. 하나의 일괄 처리에서 측정 하는 모든 샘플에 대 한 튜브를 준비 합니다.
- -80 ° C 냉장고에서 20 µ L 투 석 샘플을 받아 고 녹여 그들. 솔루션의 1 µ L을 제거 하 고 1 µ L 내부 표준 (IS)의 추가 L Homoserine (50 µ M) 19 µ L의 샘플, 따라서 샘플 포함 IS의 2.5 µ M. 유리병에 유리 삽입으로 투 석 샘플의 20 µ L 플라스틱 그것을 봉인 한 공기가 꽉 심장으로.
- 컬럼에 소프트웨어를 사용 하 여 그들의 위치에서 샘플을 autosampler에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓습니다.
- 조미료와 aspartate 농도 결정 하는 샘플의 컬럼에 분석
- Spectrofluorometric 검출 액체 크로마 토 그래프 시스템에서 분석을 실행 합니다. 2 분 전 열 derivatization 20 μ와 orthophthaldialdehyde/5-mercaptoethanol 20: 1의 (v/v) 샘플의 20 μ에 추가 후 아미노산을 감지 합니다.
- 아미노산 분석을 위한 시스템을 준비 합니다. autosampler, 펌프는 degasser, 검출기와 함께 컴퓨터 제어 장치에 스위치.
- 모바일 단계를 포함 하는 병으로는 siphons를 담가 그리고 분석에 사용할 컬럼에 펌프의 채널을 제거.
- 열에 대 한 압력을 확인 하는 모바일 위상의 흐름을 증가 시작 (예를 들어, 0.2 mL/min에서 시작 하 고 작업 흐름을 달성까지 추가 0.2 mL/min 마다 5 분에 대 한 흐름을 증가). 하자 작업에서 실행 하는 시스템에는 적어도 1 h 열을 equilibrate를 위한 0.8 mL/min 흐름.
주의: 불안정 압력 시스템의 공기의 존재를 나타냅니다. 압력 25 MPa를 초과 하지 않아야 합니다. - 345/455에 검출기에는 이득, 높은 감도 여기 및 방출 파장을 설정 nm 각각. 검출기 신호 (오토)를 다시 설정 합니다.
- 컬럼에 소프트웨어를 사용 하 여 악기를 메서드를 보냅니다. 이제는 크로마 토 그래프 측정 준비 되어야 합니다.
- 분리 dialysate 샘플, 표준 아군 dialysate 샘플 뿐만 아니라 적절 한 컬럼에 열에 표준 (0.25 µ M-2.5 µ M aspartate 및 벨의 솔루션에 조미료). 컬럼에 메서드를 보정 하 고 투 석 샘플 분석 하기 전에 탐지 및 정량화 한계를 설정.
- 단일 분석 활성화 또는 크로마토그래피 소프트웨어를 사용 하 여 분석할 샘플 시퀀스 만들고 시퀀스를 실행 합니다.
주의: 방법은 정확도 제어 하기 위해 하나 이상의 빈 샘플 및 dialysate 샘플의 시퀀스 내에서 다른 표준 샘플을 실행 합니다. - chromatograms 획득 되 면 착 색 인쇄기 소프트웨어와 함께 그들을 분석 합니다. 교정 줄거리로 관심의 봉우리의 통합을 확인 하십시오. 정량화에 대 한 피크 높이 또는 피크 영역을 사용 합니다.
- 샘플 녹음 완료 되 면 채울 열 및 시스템 (예를 들어, 초순에 50% 이기) 유기 용 매에 노화 및 금형의 성장을 방지 하기 위해.
- 시스템을 종료 합니다.
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Representative Results
프로브 복구
평균 복구 (즉, 유리병 솔루션의 동일 볼륨에 콘텐츠의 perfusate에 평균 아미노산 콘텐츠) 되었고 2 μ/min와 조미료 3 μ/분 6.32 ± 0.64의 유량에서 15.49 ± 0.42 %14.89 ± 0.36 %2의 흐름 율에 Μ/분 고 10.13 ± 0.51 aspartate cuprophane 막 프로브를 사용 하는 경우에 대 한 3 μ/분. 평균 복구 조미료 3 μ/분 6.55 ± 1.07의 2 μ/min 흐름 속도로 13.67 ± 0.42% 이었고 2 μ/min와 aspartate 3 μ/분 8.49 ± 0.15의 흐름 율 14.29 ± 0.62 %polyacrylonitrile 막 프로브를 사용 하는 경우 (그림 4A-4B). 그것은 명확 하 게 그림 4A에서 볼 수 있는, 느린 유량 (2 μ/분)는 두 프로브 dialyzing 성능을 향상 시킵니다. 다음 흐름 속도 2 μ/분에 끼얹는다 cuprophane 막 부여 조사 실험을 위해 선택 되었다, 평균 복구 높았다 (도 아니라면 크게) 모두 analytes에 대 한 실험적인 연속성 (이 프로브에 때문에이 흐름 속도에 있기 때문에 위해 사용 되었다 우선 순위1에 GABA를 분석).
발작 개발 및 상태 epilepticus 후 질병의 진행
행동 및 뇌 파 모니터링 발작, 그들의 평가의 개발 및이에 TLE 질병의 진행을 확인 하이 연구에서 사용 하는 모든 동물에 이루어졌다.
다이아 제 팜을 사용 하 여 3 h 후 중단 되었다, 강력한 경련 SE pilocarpine 주입 후 25±5 분을 발생 했습니다. 그럼, 모든 동물 입력 대기 상태는 그들이 확실히 잘 하 고 그들이 지속적으로 비디오-뇌 파 모니터링 없는 자발적인 발작 첫 번째 9 일에 발생 한 확인 하려면 또는 각각에 대 한 첫 번째 자연 스러운 발작을 식별 하 대기 시간 고 첫 번째 발작 그룹입니다. 첫 번째 자연 발작 발생 11.3 ± 0.6 일 세 후 (± sem의 의미 n = 21). 그 후, 발작 클러스터에서 발생 하 고 시간에 악화. 늦은 만성 단계 (SE 후 일 55-62)에서 간 질 쥐 경험 3.3±1.2 (± sem의 의미 n = 12) 매일 발작을 일반화. 질병의 명확한 진행이 했다. 많은, 하지만 모든 뇌 파 발작, 행동 발작 활동 대응 했다. 그림 5B 는 관찰 되었다 약 500 ms 전에 행동 발작 중 기록 된 발작 epileptiform 활동을 보여 줍니다. 그림 5A 비 간 질 쥐에서 제어 흔적을 보여줍니다.
조미료의 릴리스를 자극 하는 아미노산 microdialysis perfusate 및 칼륨의 대표적인 기저 값
만성 간 질 쥐 (0.87 ± 0.06 μ M)에서 발견 하는 기초 조미료 농도 제어 동물 (0.59 ± 0.03 µ M, 테스트 및 컨트롤, 일방통행 ANOVA와 포스트 hoc Dunnett의 p < 0.05) 보다 상당히 높은 했다. 만성 간 질 (0.31 ± 0.04 µ M)과 비 간 질 동물 (0.30 ± 0.05 µ M) 기초 또는 높은 K+ 에 갖는 aspartate 농도 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 내용은2에 대 한 원래의 문서를 참조 하십시오. 쥐는 그 비슷한 다른 사람에 의해 발견에 따라 컨트롤에 조미료의 보고 기초 수준 연구 (즉, 0.75 µ M 2 µ L/min 흐름 및 효과적인 길이 2mm의 막을 사용 하는 경우에 대 한)46,47,48 ,49,,5051,,5253. 그러나, 많은 다른 요인 microdialysis, 프로브 및 차단 막의 효과적인 길이 예의 결과 좌우할 수 있다.
높은 K+-조미료 제어 쥐에서 약 30 분 그리고 만성 간 질 쥐 (그림 6)에서 약 60 분의 추가 릴리스를 불러 일으켰다. 내용은2에 대 한 원래의 문서를 참조 하십시오. 묘사 시간 코스에서 볼 수 있듯이 10 분 시간 분해능 microdialysis의 동물의 두 그룹에 발견 하는 조미료 릴리스에서 차이 캡처하는 데 충분 했다.
HPLC 교정 및 제한
조미료와 aspartate 및 내부 표준 L-homoserine의 표준 솔루션으로 얻은 보정 곡선을 기준으로 데이터 계산 했다. 신경 전달 물질의 조미료와는 perfusates에 aspartate의 농도 절대값 (µ / L)에 표현 했다. 각 교정 플롯 조미료 및 4 개의 농도 수준 (각 수준에서 5 복제)에 aspartate의 솔루션의 분석에 의해 건설 되었다. 교정 플롯에 대 한 회귀 계수 계산: y k= x + q, 여기서 x aspartate 또는 L-homoserine (IS)에 조미료의 농도 비율 있었고 y aspartate 또는 L-homoserine (조미료의 해당 피크 지역 비율 입니다.) 결정 (r2) 계수 계산 했다. HPLC 방법의 적용은도 내에서; 정량화의 더 낮은 한계는 각각 최저 농도 표준 보정 곡선 및 교정, 아미노산 analytes 최고 사용 농도 정량화의 상한으로 결정 했다. 탐지 (LOD)의 제한도 계산 했다. 이러한 값 중 일부는 표 1에 구분 된. 빈 샘플의 모델 크로마, 표준 샘플 및 수집 된 투 석 샘플 위에 설명한 방법으로 얻은 그림 7에 나와 있습니다.
프로브 지역화
Microdialysis 프로브 및 기록 전극 오른쪽 복 부 해 마에 이식 했다 그리고 그들의 정확한 위치를 확인 했다. 안정된 좌표 ( 그림 8참조)에서 500 μ m에 극대로 주입 있던 동물 들만 분석에 포함 됐다.
그림 1입니다. 이식 될 디바이스의 단계별 준비. (A) 3-채널 10 cm 긴 microdialysis 장치를 조립 하는 데 필요한 권리에 대 한 왼쪽 및 가이드 정에 그 보호 슬리브에서 전극 접지 전극. (B). 자세히 맨 전극과 가이드 정. (C)를 제거 하 고 삽입 (D) 금속 가이드 정에서 그리고 그것의 플라스틱 더미를 몇 번으로 쉽게 동물의 머리에 이식 한 번 출시 하는 첫 번째 단계가입니다. 두 번째 단계는 두 번 투 석 가이드 정 (E, F)에 꼬인된 등록 전극 벤드. (G)는 전극 팁 0.5 m m 금속 가이드 정 맥의 끝 보다 긴 것을 잘라 되어야 합니다. (H) 디지털 캘리퍼스를 사용 하 여 컷의 정밀도를 확인 합니다. 그 후, 약 1 m m 긴 실리콘 고리 사용 되어야 한다 (I) 정 발을 안내 하는 전극의 맞춤을 해결 하기 위해. (반지 전극과 정 샤프트를 안내 하는 방법 J) 사진. 마지막 단계를 (K) 실리콘 고리 고정 가이드 정 주 춧 대에 수 지 또는 접착제의 방울을 넣어 것입니다. (L) 조립된 장치 살 균 될 준비가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Microdialysis-뇌 파 쥐 사용에 대 한 장치의 다양 한 종류의 사진 (A) 및 (B) 이러한 장치를 이식 하는 데 사용 하는 프로브 클립 홀더의 사진. (A)는 가이드 정 (녹색)으로 대체 됩니다 microdialysis 정 일반적으로 실험 하기 전에 24 시간. 장치의 전원 커넥터 (왼쪽이이 원고에서 설명 녹음을 위해 사용 되었다) 증폭기 및 데이터 수집 장비에 전기 신호를 수행 하는 전선의 첨부 파일을 허용. 장치는 수술 마 취 쥐의 두개골에 연결 하 고 녹음 자유롭게 행동 하는 쥐에 통증이 나 불편을 유발 하지 않고 나중에 얻을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 실험적인 디자인. 상태 epilepticus (SE) 유도 전에 주 쥐 장치와 함께 설치 되지 않습니다. SE pilocarpine와 동물에 의해 유도 된다 (dialyzed 및 SE; 후 24 시간에서 사망 하지 않을 경우 급성 그룹에서 쥐) 5 일 (파란 선), 감시 비디오 다음 비디오-뇌 파 모니터링 자신의 집 새 (녹색 선)에 발작 빈도 기간을 평가 하는. Microdialysis 실험에 대 한 간 질 및 각각 비 간 질 제어 쥐 microdialysis 세션 전에 24 시간 새 장에 실린더 장착 및 아직도 비디오-뇌 파를 설정 하는 다른 뇌 파 전송 됩니다 (빛 녹색 선)을 모니터링 합니다. 빨간색 세로줄이 간 질 질병 개발의 다른 시간 지점에서 투 석 세션을 나타냅니다. 빨간 수평선의 간 질 동물 (각각 비 간 질 동물), 다양 한 그룹을 화살표는 microdialysis의 마지막 날과 동물의 죽음의 주를 나타냅니다 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 두 투 프로브 복구 생체 외에서 . (A) 2 μ/min와 (B) 3 µ L/min 흐름 속도에 aspartate 및 조미료 (둘 다 1 m m 긴 dialyzing 막 부여) 하는 두 개의 다른 상용 microdialysis 프로브를 사용 하 여 체 외에서 복구 (%)를 의미 합니다. 데이터는 평균 ± 3 독립적인 실험의 SEM triplicates에서 실행. 다양 한 검색의 효율성 간의 통계적 차이 없습니다 (학생의 짝이 없는 t-검정, p < 0.05). 흐름 속도 2 μ/분 조미료 복구 3 µ L/min 흐름 속도에 비해 약 5%의 증가 사용 하 여, 따라서 느린 흐름 속도 사용 되었다 microdialysis 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 제어 및 간 질 쥐에 만성 단계에서 볼 수 있듯이 paraoxystic 활동의 복 부 해 마에서 설명을 뇌 파 기록. (A) 두 개의 대표적인 흔적 두 염 치료 비 간 질 쥐에 기록. (B) 추적 두 간 질 쥐에 기록. Epileptiform 방전 클래스 3 행동 발작이이 쥐에 대응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 쥐 해 마에서 조미료 석방에 칼륨의 효과의 시간 과정. Microdialysis 실험의 대표적인 결과 6 제어 (오픈 원), 6 만성 간 질 쥐 (검은 동그라미)에 실시. 그래프는 microdialysis 실험 과정 및 높은 100 m m K+ 자극 동안 dialysate 조미료 농도의 시간적 변화를 보여줍니다. 높은 K+ 자극 (10 분)의 시간 그래프의 하단에 검은 막대로 표시 됩니다. 데이터는 그룹 당 6 동물의 수단 ± SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. Chromatograms의 일러스트. 알려진된 봉우리 표시 되어 있습니다. 추적 핑크: OPA/5-ME derivatization (빈 샘플) 후 의도적으로 추가 된 아민 없이 명종의 솔루션의 크로마. 추적 블루: derivatization 아미노산의 봉우리를 보여주는 후 dialysate 샘플의 크로마: aspartate (tR 4.80 분), 조미료 (tR 6.75 분)와 글루타민 (tR 9.19 분)와 피크의 IS L-homoserine (2.5 µ M, 보존 기간, t R 9.83 분). 붉은 추적: 크로마 aspartate (2.5 µ M)과 벨의 솔루션에 조미료 (2.5 µ M)의 표준의. 하늘색과 노란색 배경의 모바일 단계 A에 대 한 그림 스탠드 (azure) 및 모바일 단계 B (노랑) 부분 analytes 차입에 대 한 사용. 빨간색 사각형 표시 영역 (tR 10.41 분 및 추가) 알 수 없는 물질 및 OPA 저하 제품의 봉우리를 보여줍니다. 모든 사출 볼륨 20 µ L 이었다입니다. 파생 상품 0.8 mL/분의 유량에서 분리 되었다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8입니다. 대표 이미지 결합된 전극-프로브 내에서 배치 복 부 마. (A) 사진은 겁 장치 팁 세부 (검은색 화살표)에서 왼쪽입니다. (12 쥐의 이식된 복 부 해 마 내에서 전극 프로브 팁 위치 B) 회로도 그림. (일부 중복) 솔리드 사각형 올바르게 지역화 된 프로브-전극 팁을 나타냅니다. 열린 사각형 표시 잘못 지역화 된 프로브-전극 팁 동물 연구에서 제외 (n = 3). 코로나 뇌 조각 프로브를 포함 하 고 사이트를 녹화는 조직학 분석을 위한 실험 후 처리 되었습니다. Bregma에서 거리를 표시 하는 그림 위의 숫자 (쥐 뇌; 코 바 + 5.0 m m의 펠 레그 리노 외. 1979 아틀라스에 따르면 좌표 사용:-3.4 m m, m L + 5.4 m; A P + 경질에서 7.5 m m)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 실정이 | c (μmol/l) | k | q | r2 | LOD (pmol/l) |
| 조미료 | 0.25-2.5 | 5.215 | 1043.79 | 0.999 | 19.4 |
| Aspartate | 0.25-2.5 | 2.258 | 1994.72 | 0.998 | 31.7 |
표 1입니다. 아미노산 결정을 위해 사용 하는 HPLC 방법의 특성을 정량화. 농도 보정을 설명 하는 표준 (c), 기울기 (k), 절편 (q), 결정 (r2) 계수 및 탐지 (LOD)의 제한의 범위 플롯 조미료와 aspartate의 표준 솔루션으로 얻은 (0.25, 0.5, 1.0, 2.5 µ M )과 내부 표준 L homoserine (2.5 µ M) spectrofluorometric 감지 설명된 HPLC 방법을 사용 하 여.
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Discussion
이 작품에서는, 우리는 TLE의 실험 모델에서 연속 비디오-뇌 파 기록 microdialysis와 결합을 수행 하는 방법을 보여줍니다. 비디오-뇌 파 기록 기법 올바르게 다른 동물에 있는 질병의 진행 단계를 진단 하는 데 사용 됩니다 및 microdialysis 기술 (변경 되었습니다 발견에 대 한 시간에 발생 하는 조미료 릴리스의 변경 사항을 설명 하는 이전에 게시 연구2에 aspartate). 좋습니다는 단일 장치/임 플 란 트를 수행 하기 위해를 사용 하 여 각 동물에서 둘 다 소개에서 설명 하는 이유로.
때마다, 행동 방해를 최소화 하 고 피해 위험 및 동물54에 대 한 고통을 감소 radiotelemetry 만성 뇌 파 기록에 대 한 속박 되 시스템을 선호 해야 합니다. 그러나, 곁된 EEG 기록은 이다 원격 측정법 보다 훨씬 저렴.
우리의 실험실 커넥터 전선 및 튜브 두 개의 다른 회전에 연결 되도록 시스템 및 microdialysis 동시에 튜브를 기록 하는 뇌 파를 사용 하 여. 이것은이 실험에 대 한 가장 중요 한 문제 이다: 전선 및 튜브 동물의 움직임으로 인해 자주 교차 하는 경향이 있다. 따라서, 우리는 동물 (일반적으로 칼륨 자극 관찰 하는 동작) 그것의 자신의 꼬리를 쫓아 또는가 고 일반화 된 간 질 발작 동안 롤 수 있도록 커넥터와 튜브 충분히 사용 합니다. 그것은 회사 더 microdialysis 뉼 가이드 (때때로, microdialysis 뉼 일반화 된 발작 동안 감 금 소의 벽에 부딪혀 고 수와 함께 그들의 접촉을 강화 하기 위해 점토, 모델링 하 여 그들의 가이드에 삽입 하는 것이 좋습니다. 슬립에서)입니다. 다른 한편으로, 그것은 가능한 neurochemical 시간과 컬렉션 시간 사이의 지연 시간을 최소화 하기 위해 튜브를 유지 하는 것이 좋습니다. 이 컬렉션 기간 짧은 때 특히 중요 하다. 일반적으로, microdialysis 튜브의 적절 한 길이 이어야 하며 샘플링 시간 되도록 용량 투 콘센트와 컬렉션 사이의 시간을 초과 하지 않습니다. 용액 튜브 죽은 시간이 샘플링 속도55우수한 경우 일부 플러그 사이 더 확산 하는 경향이 관찰 되었다. 따라서, microdialysis 튜브의 실험적인 죽은 시간/볼륨 가능한 만큼 감소 한다 고 동물의 행동 신경 데이터 연관 하기 매우 정확 하 게 결정. 마지막으로, 회전 및 전극 결합 된 뇌 파 및 microdialysis 연구에 대 한 정 맥과 함께 상업적으로 사용할 수는 중요 하다. 따라서, 가능 하다 면, 뇌 파 시스템 microdialysis 실험을 수행 하는 옵션을 설정 합니다.
사소한 권고는: (i) 어떤 실험을 시작 하기 전에 뇌 파 기록 시스템 및/또는 microdialysis를 설정 제대로 작동 하는지 확인 하 고 해결 어떤 문제 든 지; 데 하는 것이 좋습니다 때 준비 (다른 펌프 주사기에 장착 하 고 배관 작업 솔루션으로 가득의 완료와 함께)를 설정 하는 한 예비 실험을 수행 뿐만 아니라, 충분 한 수의 microdialysis를 사용할 준비가 프로브 깨진 변경 것 들; (그것은 두 번째 사람을 지원 하 고 인수; 시작 도움이 작업 뇌 파 microdialysis로 동물을 전송 하는 경우 ii) (iii) 확인 열 및 autosampler 크로마토그래피; 하기 전에 적절 한 온도 도달 함을 확인 또한, 표준 사용과 dialysate 샘플 모든 컬럼에 열;에 주입 하기 전에 교정 플롯을 구성 (v) 언제 든 지 필요를 크로마 또는 동시에 여러 analytes를 측정 하는 다른 분석 방법 개발 하려고 합니다.
Neurotransmission 변경 많은 CNS 장애 (간 질 포함)에 의미 있고 큰 관심 질병 표현 형에 건강에서 진행 하는 동안 이러한 변화를 정량화 하 년간 되었습니다. 오늘만 몇 가지 기술을 일 또는 달 신경 전달 물질 수준에 변화의 측정을 하실 수 있습니다. Microdialysis는 이러한 기술 중 하나입니다. 여기, 설명 같은 경우의 많은 수에서 자유롭게 이동 하는 동물에서 수행 이며 그것에 도달 하는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 모 세관 전기 이동 법 (세 륨), 같은 기존의 오프 라인 분석 분석 실험을 결합 5-30 최소 시간 해상도31,56 명확 하 게,이 샘플링 간격의 근처에 역학 synapses, 하지만 일부 장기 microdialysis 응용 프로그램 (예를 들어, 질병 개발 또는 약물 효과 연구) 요구 하는 편리한 될 수 있습니다 빠른 신경 전달 물질을 반영 하지 않습니다. 커플링 neurochemical, 뇌 파 및 행동 데이터입니다. 그러나, 다른 연구는 주로 실시간 측정 또는 신경 전달 물질의 실시간 변화 가까이 해제. 이들을 위해, microdialysis 기술 (샘플 볼륨을 줄여) 샘플링의 속도 증가 하는 세련 된 해야 합니다. 실제로, 고전적인 microdialysis 기술은 종종 가난한 시간 (분) 및 공간 해상도 (기존의 프로브는 시 냅 스 갈라진 틈 보다 훨씬 더 큰)에 대 한 비판9,,2156, 그러나 57., 분석 방법의 질량 감도 결합 microdialysis microdialysis 시간 분해능을 결정 하는 무슨 이다 (즉, 해상도는 분석에 의해 검출 될 충분 한 샘플을가지고 하는 데 필요한 시간 기술56)입니다. 따라서 때 작은 양의 샘플을 생성 하는 microdialysis 정량화 기법의 감도 증가 합니다. 날짜 하려면, microdialysis 기술의 시간적 해상도 같은 개선 3 다른 라인을 따 랐 다. 이들 중 하나 열의 소형화 및 고전적인 HPLC 방법;의 탐지 세포 표현 이 UHPLC (울트라 performant HPLC) 기법 이라고과 1 ~ 10 분 시간 해상도58,,5960을 달성 수 있습니다. 다른 방법은 고전적인 HPLC 질량 분석 (MS) 또는 탠덤 (MS/MS) dialysates 뇌에서에서 신경 전달 물질의 다중 분석을 하는 것입니다. 결합 된 HPLC MS 분석 우수한 감도 있고 1-5 분 시간 해상도56,61,,6263에 대 한 도달. 개선의 세 번째 줄은 모 세관 전기 이동 법 (세 륨)의 수정에 존재합니다. CE를 사용 하 여 레이저 유도 형광 탐지 (CE-LIFD), 그것은 모든 5 분55,64,65 얻은 nanoliter 분수에서 다양 한 신경 전달 물질의 submicromolar 농도의 결정 수 있습니다. 또는 10 s 간격56에서도. 분명 UHPLCs 또는 고급 CEs 분석 접근에서 나온다는 장점은 자유롭게 이동 하지 저하는 자연 스러운 행동 되어야 관찰 하며 분석 실험 동물에서 샘플링을 할 수 있습니다. 다른 한편으로, 시간적 해상도 (예: 효소 반응 기 온라인 분석 실험 또는 dialysate의 물방울 컬렉션 MS 기술에 결합), 심지어 백 밀리초 두뇌 dialysate 샘플링을 허용 하는 방법이 있다 하지만 이들은 일반적으로 사용에 절제 된 동물66 또는 전신67,,6869행동 연구와 몇 가지 microdialysis을 허용 하지.
Microdialysis, 즉, 상대적으로 낮은 공간 해상도 (자주에 대 한 직경에서 0.5 m m, 길이가 1-4 mm)는 막으로, 대안의 2 차로 가장 중요 한 약점을 고려할 때 개발 있을 수 있습니다 microprobes는 낮은-흐름 푸시-풀 샘플링입니다. 두 개의 실리 카 모 세관 (20 µ m ID와 200 µ m OD)의 융합 하는 측면-의해-측면 및 고분자 튜빙 끼우고이 프로브에 의하여 이루어져 있다. 실험 기간 동안이 모 세관 액체 한 모 세관을 꺼내와 동일한 흐름 율에서 다른 샘플 검색 되도록 매우 낮은 흐름 율에 끼얹는다는. 샘플링 프로브 팁을에 발생 하기 때문에 공간 해상도 microdialysis70프로브 보다 큽니다. 또 다른 가능성 microelectrode 배열 (바이오 센서) 실시간 신경 전달 물질 평가 위한 소형된 프로브에서 전환 하는 것입니다. 다른 전기 화학 기술 (주로 voltammetry 또는 기반 amperometry) 실정이 샘플링 매우 냅 (마이크론 단위) 그리고 1 s31,,7071에 허용 합니다. 이 소자는 여러 뇌 영역에서 여러 analytes의 농도 측정할 수 있습니다. 그러나, 그들은 또한 예 고 상대적으로 급격 한 악화를 피하기 위해 몇 가지 수정 필요 합니다.
Vivo에서 neurochemical 모니터링에 최신 기술을, 고려 보인다는 다른 송신기 샘플링 방법을 결합 됩니다 하나의 센서에 가까운 장래에. ﹙ 샘플링 프로브에 대 한 작업은 이미 시작 하 고, 그리고 우리가 분석 발전 함께 제작 기술에 더 이상 진행 neurochemical 모니터링 조사 vivo에서 용이 하 게 추가 됩니다 믿습니다. 그러나이 시점에서, EEG에 상관 하는 기존의 microdialysis 많은 신경 과학 응용 프로그램에 대 한 유효한 방법 남아 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 안 나 Binaschi, 파올로 Roncon 우선 출판 원고에 그들의 공헌에 대 한 엘 레 노어 팔 마를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml - tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml - diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
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