Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Abstract

Microdialysis is een gevestigde neurowetenschappen techniek die correleert de veranderingen van neurologisch werkzame stoffen verspreiden in de interstitiële ruimte van de hersenen met het gedrag en/of de specifieke resultaten van een pathologie (bijvoorbeeld aanvallen voor epilepsie). Bij de studie van epilepsie, wordt de microdialysis-techniek vaak gecombineerd met korte of zelfs lange termijn video-elektro-encefalografie (EEG) toezicht om spontane inbeslagneming frequentie, Ernst, progressie en clustering te beoordelen. De gecombineerde microdialysis-EEG is gebaseerd op het gebruik van verschillende methoden en instrumenten. Hier, we uitgevoerd in vivo microdialysis en continue video-EEG opnemen op glutamaat en aspartaat uitstroom van de monitor na verloop van tijd in verschillende fasen van de natuurlijke geschiedenis van epilepsie in een rat-model. Deze gecombineerde aanpak maakt het mogelijk de koppeling van veranderingen in de release neurotransmitter met specifieke stadia van de ontwikkeling van de ziekte en de progressie. De concentratie van het aminozuur in de dialysate werd bepaald door vloeistofchromatografie. Hier beschrijven we de methoden en het overzicht van de belangrijkste bewarende maatregelen één tijdens in vivo microdialysis moet-EEG, met bijzondere aandacht voor de stereotaxic operatie, basale en hoge kalium stimulatie tijdens microdialysis, diepte elektrode EEG opname en krachtige vloeibare chromatografie analyse aspartaat of glutamaat in het dialysate. Deze aanpak kan worden aangepast voor het testen van een scala aan drugs of ziekte veroorzaakte wijzigingen van de fysiologische concentraties aspartaat of glutamaat in de hersenen. Afhankelijk van de beschikbaarheid van een passende analytische bepaling, kan het verder worden gebruikt voor het testen van verschillende oplosbare moleculen als EEG opname tegelijkertijd in dienst.

Introduction

Als u wilt bieden inzicht in de functionele aantasting van glutamaat-gemedieerde excitatory en remmende transmissie GABAergic resulterend in spontane aanvallen in de temporale kwab epilepsie (TLE), we systematisch worden gecontroleerd extracellulair concentraties van GABA1 en later de niveaus van glutamaat en aspartaat2 door microdialysis in de ventrale hippocampus van ratten op verschillende tijdstippen van de natuurlijke ziekte cursus, dat wil zeggen, tijdens de ontwikkeling en de vooruitgang van epilepsie. We profiteerde van de TLE pilocarpine model bij ratten, die de ziekte zeer nauwkeurig op het gebied van gedrags-, elektrofysiologische en histopathologische veranderingen3,4 bootst en wij de dialysate concentratie van amino gecorreleerd zuren zijn verschillende fasen: de acute fase na de epileptogene belediging, de latentie fase, het moment van de eerste spontane inbeslagneming en de chronische phass5,6,7. Framing van de fasen van de ziekte werd ingeschakeld door op lange termijn video-EEG toezicht en de precieze EEG en klinische karakterisering van spontane aanvallen. Toepassing van de techniek van de microdialysis in verband met langdurige video-EEG toezicht stond ons voor te stellen van mechanistische hypothesen voor TLE Neuropathologie. Kortom, de techniek beschreven in dit manuscript maakt het mogelijk de koppeling van neurochemical wijzigingen binnen een gedefinieerde hersenen gebied met de ontwikkeling en de progressie van epilepsie in een dierlijk model.

Gepaarde apparaten, samengesteld uit een diepte-elektrode heb geplaatst naar een canule microdialysis zijn vaak werkzaam in epilepsie onderzoeken waar veranderingen in neurotransmitters, hun metabolieten of energie substraten moeten worden gecorreleerd aan Neuronale activiteit. In de overgrote meerderheid van de gevallen, het wordt gebruikt in de dieren vrij te gedragen, maar het kan ook op een vergelijkbare manier mensenhandel, bijvoorbeeldin farmaco-resistente epileptische patiënten die een diepgaand onderzoek van de elektrode voorafgaand aan chirurgie8kunnen worden uitgevoerd. Zowel EEG opname en dialysate collectie kan afzonderlijk worden uitgevoerd (bijvoorbeeldhet implanteren van de elektrode in een halfrond en de microdialysis sonde in het andere halfrond of zelfs de microdialysis uitvoeren in één groep van dieren tijdens het uitvoeren van de enige EEG in een andere groep van dieren). Koppelen van de elektroden aan sondes echter wellicht meerdere voordelen: het vereenvoudigt stereotaxic chirurgie, beperkt weefselschade slechts één halfrond (terwijl anderzijds, intact, als een besturingselement voor histologisch onderzoek), en de resultaten als dit homogenizes zijn verkregen uit de dezelfde regio van de hersenen en hetzelfde dier.

Aan de andere kant, vereist de voorbereiding van de gekoppelde microdialysis sonde-elektrode apparaat vaardigheden en tijd als het zelfgemaakte. Men kan relatief hoge hoeveelheden geld uitgeven als gekocht uit de markt. Bovendien, wanneer microdialysis sondes (sonde tips zijn meestal 200-400 µm in diameter en 7-12 mm lang)9en EEG elektroden (elektrode tips zijn meestal van 300-500 µm in diameter, en lang genoeg om te bereiken de hersenstructuur van belang10) zijn het gemonteerde apparaat gekoppeld, en vertegenwoordigt een omvangrijk en relatief zwaar object aan één zijde van het hoofd, dat is lastig voor de dieren en gevoelig te worden verloren, met name wanneer deze is aangesloten op de pomp van de dialyse en de harde-draads EEG opnamesysteem. Dit aspect is meer relevant in epileptische dieren die zijn moeilijk te behandelen en minder aanpassen aan de microdialysis-sessies. Juiste chirurgische technieken en de juiste post-operatieve zorg kunnen resulteren in langdurige implantaten die minimale dier ongemak veroorzaken en moeten worden gestreefd naar voor combinatorische microdialysis-EEG10,11, experimenten 12.

De voordelen en beperkingen van de techniek van de microdialysis zijn in detail onderzocht door vele neurowetenschappers. Het primaire voordeel ten opzichte van andere in vivo perfusie technieken (bijvoorbeeld, snelle stroom push-pull of corticale cup perfusie) is een kleine diameter van de sonde die een betrekkelijk nauwkeurige van belang13,14oppervlakte, 15. Ten tweede, het microdialysis-membraan creëert een fysieke barrière tussen het weefsel en het perfusaat; Daarom, hoog-moleculair gewicht stoffen niet doen oversteken en interfereert niet met de analyse16,17. Bovendien, het weefsel is beschermd tegen de turbulente stroming van het perfusaat18. Een ander belangrijk voordeel is de mogelijkheid om te wijzigen de perfusaat stroom voor het maximaliseren van de concentratie van de analyt in het perfusaat (dat wil zeggen, het proces van microdialysis kan wiskundig goed worden gedefinieerd en kan worden aangepast voor hoog rendement concentraties van de analyt in het monster)19. Tenslotte kan de techniek gebruikt worden om de infusie van de drugs of de farmacologisch werkzame stoffen in het weefsel van belang te bepalen van hun effect op de site van interventie20en. Aan de andere kant, heeft microdialysis een beperkte resolutie tijd (meestal meer dan 1 min te wijten aan de tijd die nodig is voor het verzamelen van monsters) in vergelijking met elektrochemische of biologische sensoren; het is een invasieve techniek waardoor weefselschade; het compromissen de neurochemical evenwicht binnen de ruimte rond het membraan als gevolg van de continue helling van de concentratie van alle oplosbare stoffen die het perfusaat samen met de analyt van belang treedt. Tot slot, de microdialysis-techniek is sterk beïnvloed door de grenzen van de analytische technieken gebruikt voor de kwantificering van stoffen in het perfusaat9,21,22,23 . De krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) nadat de bewerking met orthophthaldialdehyde voor glutamaat en aspartaat analyse in biologische monsters is goed gevalideerde24,25,26 , 27 en haar uitgebreide discussie valt buiten het bereik van dit manuscript, maar de gegevens die zijn geproduceerd met behulp van deze methode zal in detail worden beschreven.

Wanneer uitgevoerd naar behoren en zonder wijziging van de samenstelling van het perfusaat, kan microdialysis bieden betrouwbare informatie over het basale niveau van de neurotransmitter release. Het grootste deel van het basale niveau is waarschijnlijk het gevolg van de zender-spill-over van de synapsen9. Omdat in veel gevallen de eenvoudige bemonstering van de neurotransmitter in de extra synaptic ruimte niet voldoende is om de doelstellingen van een onderzoek, kan de techniek van de microdialysis ook worden ingezet ter stimulering van neuronen of te ontnemen van belangrijke fysiologische ionen zoals K+ of Ca2 +, te roepen of te voorkomen van het vrijkomen van de neurotransmitter.

Hoge+ K-stimulatie wordt het vaak gebruikt in de neurobiologie ter stimulering van de neuronale activiteit niet alleen in wakker dieren, maar ook in culturen van primaire en organotypic. De blootstelling van een gezond zenuwstelsel aan oplossingen met hoge concentraties van K+ (40-100 mM) roept de efflux van neurotransmitters28. Dit vermogen van neuronen te bieden een extra release in reactie op de hoge K+ kan worden aangetast in epileptische dieren1 en in andere neurodegeneratieve ziekten29,30. Ook de Ca2 + ontbering (verkregen door zoogdierlevercellen Ca2 + gratis oplossingen) wordt gebruikt om de calcium-afhankelijke release van meeste neurotransmitters gemeten door microdialysis. Het is over het algemeen geloofd dat Ca2 + afhankelijke versie van neuronale oorsprong, overwegende dat Ca2 + onafhankelijke release is afkomstig uit glia, maar veel studies verhoogd controverse over de betekenis van Ca2 +-gevoelige metingen van bv glutamaat of GABA9: dus, indien mogelijk, het is raadzaam om steun microdialysis studies met microsensor studies, omdat deze laatste hogere ruimtelijke resolutie hebben en de elektroden toestaat om dichter bij synapsen31.

Over microdialysis onderzoeken bij epileptische dieren is het belangrijk te benadrukken dat de gegevens die zijn verkregen van de meeste van hen afhankelijk van video of video-EEG monitoring van vangsten, dat wil zeggen, van de voorbijgaande voorkomen van tekenen en/of symptomen als gevolg van abnormale overmatig of synchrone Neuronale activiteit in de hersenen-32. Er zijn enkele specifieke kenmerken van electrographic vangsten in pilocarpine behandelde dieren die bij de voorbereiding van het experiment moeten worden onderzocht. Spontane aanvallen worden gevolgd door depressief activiteit met frequente EEG the spikes3 en optreden in clusters33,34. Schijnvertoning bediende niet-epileptische dieren vertonen inbeslagneming-achtige activiteit35 en daarom de parameters voor EEG opnames evaluatie moeten gestandaardiseerde36 en, indien mogelijk, de timing van microdialysis sessies goed gedefinieerd moet worden. Ten slotte raden we na de beginselen en de methodologische standaarden voor video-EEG toezicht bij controle volwassen knaagdieren beschreven door deskundigen van de International League tegen epilepsie en American epilepsie Society in hun zeer recente verslagen37 ,,38.

Hier beschrijven we microdialysis van glutamaat en aspartaat parallel met de lange termijn video-EEG opnamen in epileptische dieren en hun analyse in de dialysate door HPLC. Wij zullen de kritische stappen van het protocol waarmee men voor het beste resultaat zorgen moet benadrukken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Ferrara institutionele Animal Care en gebruik Comité en door het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (vergunning: D.M. 246/2012-B) overeenkomstig de richtsnoeren in de EUROPESEGEMEENSCHAPPEN Richtlijn van de Raad van 24 November 1986 (86/609/EEG). Dit protocol is speciaal aangepast voor glutamaat en aspartaat bepaling in de rat hersenen dialysates verkregen onder controle van de EEG van microdialysis sessies bij epileptische en niet-epileptische ratten. Veel van de hier beschreven materialen kunnen gemakkelijk vervangen worden die men in zijn laboratorium voor EEG opnamen of microdialysis gebruikt.

1. montage van de Microdialysis sonde-elektrode-apparaat

  1. Gebruik van een 3-kanaals twee-twisted elektrode (met minimaal 20 mm gesneden van de lengte van de registratie elektrode en een 10 cm lange aarding elektrode) en het aan een gids canule ter voorbereiding van het apparaat te koppelen. Voorbeelden van 3-kanaals elektrode en gids canule voor dialyse in figuur 1A-1B.
  2. Verwijderen (Figuur 1 c) en (Figuur 1 d) de canule metalen gids in de dummy kunststof canule een paar keer voorafgaand aan het gebruik om te verlichten zijn verwijdering plaats op het moment van de switch voor microdialysis sonde in dier.
  3. Buig de getwiste draden elektrode tweemaal te registreren (figuur 1E-1F) om het uitlijnen van de draden met de dummy canule van de gids en snijd de elektrode tip (figuur 1G) 0.5 mm langer zijn dan het uiteinde van de canule gids (figuur 1 H) met behulp van de digitale remklauw.
  4. De 1 mm lange silicium circlet gereed (OD 2 mm, dikte 0,3 mm; Figuur 1I) en plaats het uiteinde van de canule gids en het uiteinde van de twisted elektroden in de silicium circlet met behulp van het pincet (figuur 1J). Eraan op de voet van de gids canule sokkel met polymeer lijm van snelle actie of hars (Figuur 1 K). Zie het voorbeeld van de voltooide apparaten in Figuur 1 L en figuur 2A.
  5. Steriliseren het apparaat onder Kiemdodende UV-licht voor 4 h. beurt over het apparaat viermaal zo als elk van de zijden is blootgesteld aan het licht voor 1 h.
    Opmerking: Vele eigengemaakte elektroden en microdialysis sondes kunnen worden gemonteerd op een vergelijkbare manier. Het hoofd van de hierboven beschreven implantaat voor ratten heeft de volgende afmetingen: 7 mm breedte x 5 mm (diepte) x 10 mm lengte van boven naar sokkel teen; de implantaat tip is ongeveer 11 mm lang, 600 µm in diameter en alle het apparaat weegt ongeveer 330-360 mg. Het apparaat mag twee of drie keer worden hergebruikt als (i) een voldoende lengte van de grond elektrode wordt gelaten op de schedel tijdens de operatie voor het volgende gebruik en (ii) wanneer het dier wordt gedood, en het apparaat hersteld samen met de tandheelkundige cement het is links in aceton overnigh t, zodanig dat het cement kan mechanisch worden uitgesplitst en het apparaat gewassen en opnieuw gesteriliseerd.

2. stereotaxic chirurgie

  1. Gebruik een stereotaxic apparaat en sonde clip houder (figuur 2B) voor de inplanting van de apparaat na de hedendaagse normen voor aseptische en pijn-vrij operaties39,40,41.
    1. Anesthetize van de volwassen Sprague-Dawley ratten met ketamine/xylazine mengsel (43 mg/kg en 7 mg/kg, i.p.) en repareren op het stereotaxic frame. Isofluraan anesthesie (1,4% in lucht; 1,2 mL/min) aan eerste ketamine/xylazine injectie toevoegen aangezien het toestaat om te controleren de diepte van de verdoving in de tijd. Scheren van de vacht op de kop van het dier.
  2. Swab het hoofd huidoppervlak door jodium gebaseerde oplossing gevolgd door 70% ethanol ter voorbereiding op aseptische chirurgie39.
    1. Implantaat de gids canule-elektrode apparaat voorbereid in voorrang (1.1-1.5) in de juiste ventrale hippocampus met de volgende coördinaten: neus bar 5.0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm tot bregma1,2. Volg standaardtechnieken voor stereotaxic operaties10,11,12.
    2. Zorg ervoor dat het omvat niet de verankerende schroeven. Bij het mounten op het stereotaxic apparaat, pak het apparaat voor het hoofd van de canule gids als dit gemakkelijk kan worden uitgelijnd aan de houder van de sonde.
  3. Verankeren het apparaat op de schedel met ten minste vier RVS schroeven schroeven ze in het bot van de schedel (1 schroef in de linker- en 1 schroef in de juiste voorhoofdsbeen platen, 1 schroef in de pariëtale links en 1 schroef in de interparietal bot-platen). Voeg een druppel weefsel lijm voor verdere positiebepaling elke schroef tot op het bot van de schedel.
    1. Betrekking hebben op de helft van schroefdraad met methacrylzuur cement. De binding van het cement door ondiepe groeven in het bot te verhogen van de hechting te bevorderen.
  4. Zodra het puntje van het apparaat wordt geplaatst in het hersenweefsel, draai de draad van de elektrode van de grond rond de 3 schroeven verankeren. Dekking van alle gekoppelde schroeven en het apparaat met de tandheelkundige cement12,42,43.
  5. Het bewaken van de dieren tijdens de operatie en gedurende ongeveer 1 uur daarna tot rechtop en bewegen van de kooi. Houd ze op een opwarming pad te voorkomen hypothermie. Het toestaan van de ratten terug te vorderen ten minste 7 dagen na de inplanting van het apparaat.
  6. Controleren van de dieren ten minste eenmaal per dag gedurende 3 dagen na de operatie tekenen van pijn of leed. Geven de dieren met het antibioticum crème (gentamycine 0,1%) dicht bij de ingesneden site om te voorkomen dat de infectie en pijnstiller (tramadol 5 mg/kg, i.p.) voor 3 dagen om te voorkomen dat de post chirurgische pijn.

3. temporaalkwab epilepsie inductie door Pilocarpine en toewijzing van dieren aan experimentele groepen

  1. Na een week van na chirurgisch herstel, de dieren willekeurig aan groepen toewijzen: (i) de controledieren voertuig en (ii) epileptisch dieren die pilocarpine ontvangt ontvangen. Gebruik een proportioneel hoger aantal dieren voor epileptische groep omdat niet alle van de pilocarpine toegediend ratten zal de ziekte ontwikkelen.
  2. Het injecteren van een dosis van methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) en 30 min na, een enkele injectie van pilocarpine (350 mg/kg, i.p.) ertoe de status epilepticus (SE). Injecteren methylscopolamine en het voertuig (zoutoplossing) de controle ratten. Gebruik 1 mL spuit met 25G naald voor alle i.p. overheidsdiensten.
    1. Controleer visueel de dieren om te beginnen met gedrags aanvallen (bewegende vibrissa binnen 5 min, knikken hoofd, klonen van de ledematen) hebben en binnen 25 min te klonen voortdurend alle het lichaam (SE).
  3. De SE-2 h arresteren na het begin te hebben een mortaliteit ongeveer 25% en een gemiddelde latente periode van ongeveer 10 dagen door administratie van diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observeren en registreren van elke inbeslagneming gedrag begin direct na de injectie pilocarpine en blijven voor ten minste 6 uur daarna.
  4. Geef de dieren saline (1 mL, i.p.) 1 mL spuit met 25G naald en sacharose oplossing (1 mL, p.o.) met behulp van 1 mL spuit en flexibele voeding 17G naald 2-3 dagen na SE ter bevordering van het herstel van lichaam gewichtsverlies.
    1. Uitsluiten van de dieren die niet het eerste lichaamsgewicht binnen de eerste week na pilocarpine SE uit de studie (met uitzondering van de acute groep gedood 24u na SE bereiken, wanneer het gewicht van lichaam follow-up niet mogelijk is).
  5. Post-SE dieren willekeurig aan verschillende experimentele groepen (Figuur 3) toewijzen: acute fase (waar het microdialysis vindt plaats 24 h na SE), latency (7-9 dagen na SE), de eerste spontane inbeslagneming (ongeveer 11 dagen na SE), en chronische periode ( begint ongeveer 22-24 dagen na SE, d.w.z. ongeveer 10 dagen na de eerste inbeslagneming). Controleren van de dieren ten behoeve van het voorkomen van spontane aanvallen.
    Opmerking: Gebruik de volgende criteria van de opnemen/uitsluiten voor verdere experimenten bij epileptische ratten: ontwikkeling van convulsive SE binnen 1 uur na toediening van de pilocarpine; gewichtstoename in de eerste week na de SE en de juiste positionering van de microdialysis sonde en de elektrode.

4. epileptische gedrag Monitoring en analyse

  1. Op lange termijn monitoring van epileptische gedrag
    1. Ongeveer 6 uur na toediening van de pilocarpine (dat wil zeggen, aan het einde van directe observatie door de onderzoekers), plaats van de dieren in de schoon huis kooien en start de videobewaking van 24 h.
    2. De 24-uurs video monitoring tot dag 5, met behulp van een digitale video-surveillancesysteem te blijven.
    3. Vanaf dag 5, de ratten in hun huis rechthoekige kooi verbinden met vastgebonden EEG-opname-systeem en blijven de 24-uurs videobewaking.
    4. Set de parameters op de versterker geplaatst buiten de kooi van Faraday (set amplificatie factor op elk kanaal volgens de specificiteit van het EEG signaal van elk één dier) en start de EEG overname observeren van het EEG signaal geproduceerd door Los kabels. Gebruik bemonstering 200 Hz stem en low pass filter set tot 0,5 Hz.
    5. Het dier verbinden met kabels van een dier hoofd tussen twee gestrekte vingers van één hand te houden en schroeven beneden de verbindingslijnen naar het voetstuk van de elektrode met behulp van de andere vrije hand. Beginnen met de overname.
      Let op: Zorg ervoor dat het signaal vrij van artefacten is. Gemeenschappelijke artefacten zijn de spikes overtreffen de schaal.
    6. Een dag voordat de microdialysis experimenteren, breng de dieren in de vastgebonden EEG systeem voorzien van plexiglas cilinders voor microdialysis. De dieren verbreken door de EEG binden systeem in kooi schroeven up de connectors van de elektrode zonder beperking van het dier. Plaats het dier in de hoge plexiglas cilinders.
  2. Monitoring van epileptische gedrag per dag vóór en tijdens de microdialysis vergadering
    1. Schakel op de versterker geplaatst buiten de kooi van Faraday. De EEG-software niet openen. Start de overname van de EEG observeren van het EEG signaal geproduceerd door losse kabels.
    2. Sluit het dier aan de vastgebonden EEG-opname-systeem van bedrijf van het dier hoofd tussen twee gestrekte vingers van één hand en schroeven beneden de verbindingslijnen naar het voetstuk van de elektrode met behulp van de andere vrije hand. Stel een factor van de versterking (gain) op elk kanaal van versterker volgens elektrode signaal van één dier zodat het EEG signaal in omvang is. Laat het dier verkennen de nieuwe kooi (cilinder) gedurende ten minste 1 uur onder de directe observatie van de onderzoeker.
    3. Opmerking: 24 h vóór de microdialysis experiment, de ratten zijn kort verdoofd met Isofluraan voor de switch van de gids cannulas microdialysis sonde. Profiteer van het moment wanneer ze zijn verdoofd hen verbinden met de EEG-opname-systeem.
    4. Verkorten of verlengen van hangende kabel volgens dierlijke grondstoffen. Zorg ervoor dat de kabels niet met de bewegingen en de liggende houding van het dier bemoeien.
    5. Controleer voor de bepaling van de juiste afbeelding van de videocamera's. De video-EEG opname te starten.
  3. Identificatie van de vangsten en EEG-activiteit
    1. Gebruik een software speler bekijken. De film 8 keer sneller dan de echte tijd spelen scrollen en individuate de gegeneraliseerde aanvallen (Zie dier aan achterzijde met voorpoot clonus of dieren fokken en vallen met voorpoot clonus). Vertragen van de video en noteer de exacte tijd van het begin en het einde van de gedragsmatige inbeslagneming.
    2. Proces de gegevens door het tellen van het aantal gegeneraliseerde aanvallen waargenomen in 24 uren van video records en hen uitdrukken in termen van inbeslagneming frequentie en duur als gemiddelde waarden van alle vangsten waargenomen in 24 h.
    3. Definiëren van de EEG-vangsten als de periodes van paroxysmale activiteit van hoogfrequente (> 5 Hz) gekenmerkt door een > 3-voudig amplitude toename over basislijn met progressie van de spike frequentie dat minimaal 3 s2,44 duurt of soortgelijke28. EEG-software gebruiken voor het verwerken van de raw opnames van de EEG. De sporen van de EEG in 1 h breuken splitsen. Kopieer de EEG tracering breuken tot het dossier voor de software automatische spike analyse.
    4. Het analyseren van de EEG-activiteitsgegevens met EEG software en vooraf gedefinieerde parameters (4.3.3.). Alle video-analyses in twee onafhankelijke onderzoekers die blind is voor de groep van de geanalyseerde dieren voeren. In het geval van divergentie, laten de gegevens samen om het bereiken van een consensus45opnieuw te onderzoeken.

5. Microdialysis

  1. In vitro sonde herstel
    1. De sonde voor het eerste gebruik volgens de instructies van de fabrikant, gehanteerd in zijn beschermhoes voor te bereiden.
    2. Uitvoeren van het experiment in drievoud: bereiden van drie 1,5 mL reageerbuisjes, ze worden geladen met 1 mL Ringer's oplossing met het mengsel van normen (2,5 µM van glutamaat) en 2,5 µM van aspartaat. Drie geladen 1,5 mL reageerbuisjes gestoken in de blok kachel ingesteld op 37 ° C en plaats ze op de roerder.
      Opmerking: Gebruik dezelfde standaard oplossingen voor chromatografie kalibraties.
    3. Verzegel de 1,5 mL reageerbuisjes met paraffine film en het doorprikken door scherpe pincet om een gat van ongeveer 1 mm in diameter.
    4. Neem de sonde en plaatst u deze in het gat maakte in paraffine film. Dompel het membraan ten minste 2 mm onder het niveau van de oplossing. Fix verder de sonde naar 1,5 mL reageerbuis door paraffine film.
      Let op: Zorg ervoor dat de tip niet aan de muren van de reageerbuis 1,5 mL raakt.
    5. Verbind de inlaat van de sonde met de spuit gemonteerd op de infusiepomp met behulp van FEP-Slangen en buizen adapters. Eventueel droeg gebruik fijne polyethyleen buis van 0,28 mm ID en 0.61 mm OD en gekleurde buizen adapters (rode en blauwe buis adapters) voor verbindingen.
    6. Start van de pomp op 2 µL/min. en laat de vloeistof verschijnen aan het uiteinde van de uitlaat. Sluit de uitgang van de sonde aan de 0,2 mL verzamelen reageerbuis met behulp van FEP-Slangen en buizen adapters.
      Opmerking: FEP Slangen gebruikt voor alle verbindingen. Knip de gewenste lengte van de buis met behulp van een scheermesje. Buis adapters van verschillende kleur voor inlaat en uitlaat van de sonde te gebruiken. Laat de pomp lopen voor 60 min. Check op lekkages en luchtbellen. Deze moeten niet aanwezig zijn.
    7. De pomp ingesteld op de stroom tarief 2 µL/min en beginnen met het verzamelen van de monsters aan de uitlaat kant van de buis.
    8. Drie 30 min perfusaat monsters en drie monsters van gelijk volume van de oplossing in de reageerbuis 1,5 mL verzamelen. Monsters te nemen de gelijk volume van de reageerbuis 1,5 mL elke 30 min met behulp van de microsyringe ondergedompeld in de standaard oplossing in de reageerbuis 1,5 mL.
    9. Herhaal het experiment (5.1.1-5.1.8) de pomp aan de flow rate 3 µL/min (5.1.7) instellen dat een sonde herstel vergelijking bij het gebruik van twee verschillende perfusie debiet.
    10. Wanneer u klaar bent, stop de pomp en spoel de buis met gedistilleerd water, 70% ethanol en duw de lucht in het. Winkel de sonde in een flesje gevuld met zuiver gedestilleerd water. Spoel de sonde grondig door het zoogdierlevercellen op 2 µL/min. door gedestilleerd water voorafgaande de opslag.
    11. De concentratie van de glutamaat en aspartaat in de monsters analyseren door chromatografie (Zie de details hieronder; 6.3).
    12. Bereken het herstel met behulp van de volgende vergelijking:
      Herstel (%) = (Cperfusaat /Cdialysed oplossing) x 100.
  2. Microdialysis sessies in vrij bewegende ratten
    1. Voorbereidende procedures: sonde inbrengen en beproeving, infusie pomp instelling en start
      1. Voorbereiden van de microdialysis-sondes voor het eerste gebruik volgens de gebruikershandleiding van de fabrikant en vul ze met Ringer's solution. Knip ongeveer 10 cm lange stukken van FEP-Slangen en hen verbinden met inlaat en uitlaat cannulas van de sonde met behulp van de buis-adapters van verschillende kleuren.
      2. Zorg ervoor dat de buis de adapters met geen dode ruimte in alle verbindingen raakt.
      3. 5.2.1.3. 24 h vóór de microdialysis experiment, anesthetize kort het dier met Isofluraan (5% in lucht) in een zaal van de inductie totdat ligfiets. Verwijder de dummy canule uit haar gids met behulp van de pincet en hoofd van het dier vast te houden. Invoegen van de microdialysis sonde, begiftigd met een dialyzing membraan, in de gids canule en onderneming verder de cannulas van de microdialysis ingevoegd in hun gids door het modelleren van klei.
        Let op: Laat niet de sonde raken de muren van de beschermende sonde mouw wanneer uitpakken.
      4. Zet het dier in de cilinder van het plexiglas en laat het verkennen van de nieuwe sfeer. Het dier verbinding te maken met de vastgebonden EEG-opname-systeem zoals hierboven beschreven (volg de punten 4.2.2 en 4.2.3).
      5. Volg de wakker en vrij verplaatsen rat bewegingen en de inlaat van de sonde verbinden met de 2,5 mL spuit met afgestompte 22G naald met Ringer's oplossing met behulp van de buis-adapters. Duw Ringer's oplossing binnen de sonde uitwerpen van 1 mL van Ringer's oplossing in 10 s duwen voortdurend de zuiger van 2.5 mL spuit. Controleer voor de daling van de vloeistof die voorkomen op het stopcontact. De sonde is nu klaar voor gebruik.
      6. Vullen opwaarts naar de 2.5 mL spuiten verbonden met FEP-Slangen door buizen adapters met Ringer's solution en mount ze op de infusiepomp. Start de pomp op 2 µL/min. Laat het 's nachts.
        Opmerking: De gewenste lengte van alle FEP Slangen gebruiken maar berekenen van het dode volume van de buis om te weten wanneer de hoge K+ stimulatie moet worden gestart en de kwantificering gegevens correleren met neurochemical veranderingen in dierlijke hersenen. Gebruik de luchtbel in de buis onder de werkende stroom gemaakt om deze tijd te berekenen.
    2. Het verzamelen van monsters tijdens EEG opname en kalium stimulatie
      1. Controleer of het ontbreken van de vangsten in de 3 h voorafgaand aan het begin van de sample collectie (video-EEG recordings) en blijven volgen van inbeslagneming activiteit tijdens microdialysis.
      2. Stoppen met de uitvoering van het spuiten van de FEP-Slangen gecanuleerd opgevuld met Ringer's solution pomp. Mount op de pomp een andere van 2.5 mL spuiten set aangesloten op de FEP-tubing met buizen gevuld met een gewijzigde Ringer's oplossing met 100 mM adapters K+ oplossing.
      3. Start van de pomp op 2 µL/min. en laat het lopen. Voor een snellere vullen van de buis, vastgesteldop de pomp 5 µL/min voor de tijd van vullen. Controleren op de afwezigheid van luchtbellen in het systeem. Zorg ervoor dat de slang de adapters met geen dode ruimte in alle verbindingen aanraakt.
      4. Test de sonde als klaar voor gebruik in diervoeding zoals beschreven hierboven (5.2.1.5).
        Opmerking: Als om wat voor reden de sonde niet werkt, wijzigen. Houd een paar bereid microdialysis sondes klaar voor gebruik in de buurt van het microdialysis-EEG werkstation voor deze gevallen. Het dier verbreken EEG kabels en anesthetize het kort met Isofluraan indien nodig om te beseffen van de verandering.
      5. Sluit de FEP-Slangen van spuiten gevuld met Ringer's oplossing voor de canule van de inlaat van de sonde in elk dier en wachten op het uiterlijk van de vloeibare druppel op het uiteinde van de uitlaat.
      6. Sluit de uitgang van de sonde op de FEP-Slangen, die tot de collectie in de reageerbuis leidt. Invoegen de FEP-Slangen in de reageerbuis gesloten 0,2 mL met een geperforeerde cap. Zorg ervoor dat de buis in de plaats blijft door de vaststelling van met een stukje modellering klei.
      7. Blijven de pomp op 2 µL/min voor 60 min lopen zonder het verzamelen van monsters om equilibreer van het systeem (nul monster).
      8. 5 opeenvolgende 30 min dialysate monsters (60 µL respectieve volume) verzamelen onder uitgangssituatie (perfusie met normale Ringer's solution). Monsters op ijs opslaan.
      9. Berekenen hoe lang die het duurt vloeibare te passeren van de pomp in van het dier hoofd (het hangt dood volume van buizen, dat wil zeggen, bubble zendtijd) en schakelen de FEP-buis die loopt van het spuiten met normale Ringer's oplossing voor spuiten met bewerkt (100 mM K+) Ringer's oplossing op dit moment zonder te stoppen de pomp. Controleren op de afwezigheid van de luchtbellen in het systeem. Laat de pomp voor 10 min lopen.
        Let op: In 10 min van hoge K+ stimulatie, de dieren hebben de neiging te verplaatsen zich krampachtig en meestal een groot aantal natte hond shakes (controle en uit inbeslagneming cluster dieren) of gedrags vangsten (epileptische dieren), dus klaar om te interveniëren om te de buizen en kabels beschermen tegen draaien.
      10. Na 10 min, schakelen de slang van het spuiten met 100 mM K+ Ringer-oplossing voor normale Ringer's oplossing en laat de pomp draaien. Zet niet uit de pomp tijdens de oplossing wijzigingen zodat die zal er een daling van de vloeistof bij het einde van de buis worden aangesloten in de lijn.
      11. Vanaf het moment waartegen de dialysate hoog kalium, dat wil zeggen, na het verzamelen van de vijfde na evenwichtsinstelling dialysate bevat, verzamelen de dialysate breuken elke 10 min (20 µL) voor 1 h. verzamelen 3 extra 30 min dialysate monsters en stop de pomp. De monsters worden opgeslagen op het ijs.
      12. Het bewaren van de monsters bij-80 ° C na het experiment tot HPLC analyse.
      13. Herhaal dat de microdialysis experimenteren gedurende 3 opeenvolgende dagen, met uitzondering van de acute (24 h) en de kopgroep van beslaglegging, waarin slechts één microdialysis sessie plaats 24 h na SE of binnen de 24 uur na de eerste spontane inbeslagneming (Figuur 3 vindt).
      14. Na afloop van elk experiment, euthanaseren van het dier met een verdoving overdosis en verwijder de hersenen voor de controle van de sonde en elektrode plaatsing.
  3. Post-microdialysis procedures
    1. Spoel de gebruikte microdialysis-sondes met gedestilleerd water en bewaar ze in een flesje gevuld met zuiver gedestilleerd water tot volgend gebruik.
      Opmerking: De hergebruikte membranen kunnen zijn toegenomen permeabiliteit; Controleer voor het herstel van de sonde voor het herhaalde gebruik.
    2. Spoel de hele microdialysis instellen (buizen, connectoren en spuiten) met gedestilleerd water gevolgd door 70% ethanol. Ethanol vervangen door lucht en de set up worden opgeslagen in een steriele omgeving.
    3. De basale dialysate monsters gesplitst 20 µL breuken en gebruik slechts één 20 µL breuk voor aminozuur basale concentratie analyse. Opslaan van de resterende monstervolume voor verdere of bevestigende analyse bij-80 ° C.
    4. Los van de hersenen in 10% formaline en behouden ze door paraffine-insluiting1. Coronally deel van de hersenen in plakjes en vlekken hen met haematoxyline en eosine. Onderzoeken van de hersenen voor juiste sonde en elektrode plaatsing1,2.
      Opmerking: Bevestigen van de hersenen in gekoelde 2-methylbutane en bewaar ze bij-80 ° C. Gebruik andere bewezen kleuring op het zenuwweefsel secties die het mogelijk maakt om te visualiseren van de sonde en elektrode tractus.

6. de chromatografische analyse van glutamaat en aspartaat

  1. Voorbereiding van de Derivatiserings van agent
    1. Meng de respectieve hoeveelheden 20:1 (v/v) orthophthaldialdehyde-reagens (OPA) en 2-mercaptoethanol (5-ME) in het flesje. Sluit de flacon met behulp van het GLB en de lucht strakke septum.
      Let op: Werken onder de chemische motorkap.
    2. Vortex de bereide oplossing en zet het in de autosampler in de positie voor het Derivatiserings van de agent.
  2. Bereiding van de monsters dialysate
    1. Zet de Glasfront met onderste veer in de flacon van 2 mL bruin autosampler. De flesjes voorbereiden op alle monsters gemeten in één batch.
    2. De 20 µL dialyse monsters nemen uit de diepvries-80 ° C en laten smelten. Verwijder 1 µL van de oplossing en voeg 1 µL van interne standaard (IS) L-Homoserine (50 µM) naar 19 µL van het monster, dus het monster bevat 2,5 µM van IS. Pipetteer 20 µL van het monster dialyse in de Glasfront in flesje en verzegel het met een luchtdicht tussenschot.
    3. Plaats de flesjes met de monsters in de autosampler met behulp van de chromatografische software aan het label van de monsters in hun standpunten.
  3. Chromatografische analyse van monsters om te bepalen van glutamaat en aspartaat concentratie
    1. De analyses uitvoeren op het systeem van de vloeibare chromatograaf met spectrofluorometric detectie. De aminozuren worden gedetecteerd nadat 2 min pre kolom bewerking met 20 μL van orthophthaldialdehyde/5-mercaptoethanol 20:1 (v/v) toegevoegd aan 20 μL van monster.
    2. Het systeem voorbereiden op aminozuren analyse. Zet de autosampler, de pomp, de degasser, de detector en controle eenheid samen met de computer.
    3. De sifonen onderdompelen in de flessen met de mobiele fase en wissen van de kanalen van de chromatografische pomp moet worden gebruikt voor de analyse.
    4. Beginnen met het verhogen van de stroom van de mobiele fase controle van de druk op de kolom (bijvoorbeeld, beginnen bij 0,2 mL/min en verhoog de flow voor extra 0,2 mL/min elke 5 minuten tot het bereiken van de werken-stroom). Laat het systeem uitgevoerd werken flow 0.8 mL/min gedurende ten minste 1 uur te equilibreer van de kolom.
      Let op: Unstable druk duidt op de aanwezigheid van de lucht in het systeem. De druk mag niet meer dan 25 MPa.
    5. Stel de winst, hoge gevoeligheid en de excitatie en emissie golflengten op de detector naar 345/455 nm respectievelijk. Reset het signaal van de detector (AUTOZERO).
    6. Met de chromatografische software, wordt de methode verzenden door het instrument. Nu, de chromatograaf moet bereid zijn te meten.
    7. Scheiden van de dialysate monsters, standaard spiked dialysate monsters, alsook de normen (0,25 µM – 2,5 µM aspartaat en glutamaat in Ringer's oplossing) op de geschikte chromatografische kolom. Kalibreer de chromatografische methode en vaststellen van de grenzen van de detectie en kwantificering vóór elke analyse van de monsters dialyse.
    8. Activeren van de interne analyse of maak de volgorde van de monsters worden geanalyseerd met behulp van de software van de chromatografie en de volgorde worden uitgevoerd.
      Let op: Meer dan één blancomonster en verschillende standaard monsters binnen de volgorde van dialysate monsters uitvoeren om te controleren van de nauwkeurigheid van de methode.
    9. Zodra de chromatogrammen worden overgenomen, ze analyseren met de software van de chromatografie. Controleer de integratie van de pieken van het belang in de plot van de kalibratie. Gebruik piekoppervlakte hoogte of piek voor kwantificering.
    10. Zodra de monster-opname klaar is Vul de kolom en het systeem met een organisch oplosmiddel (b.v., 50% acetonitril in ultrazuiver water) om te voorkomen dat de veroudering en schimmel groei in het.
    11. Het systeem afsluiten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sonde herstel

De gemiddelde terugvinding (dat wil zeggen, de inhoud van de gemiddelde aminozuur in het perfusaat als een percentage van de inhoud in een gelijk volume van de oplossing van vial) was 15.49 ± 0,42% op een debiet van 2 l/min en 6.32 ± 0.64 op 3 l/min voor glutamaat en 14.89 ± 0.36% op een debiet van 2 L/min en 10.13 ± 0.51 op 3 l/min voor aspartaat bij het gebruik van de cuprophane membraan sonde. Als de polyacrylonitryl membraan sonde gebruikt, de gemiddelde terugvinding was 13.67 ± 0,42% op een debiet van 2 l/min en 6.55 ± 1.07 op 3 l/min voor glutamaat en 14.29 ± 0.62% op een debiet van 2 l/min en 8.49 ± 0,15 op 3 l/min voor aspartaataminotransferase (figuur 4A-4B). Als het duidelijk kan worden gezien in figuur 4A, verbetert het lagere debiet (2 l/min) de dialyzing prestaties van beide sondes. Voor de volgende de cuprophane membraan begiftigd sonde geperfundeerd om een stroom tarief 2 μL/min experimenten werd gekozen, omdat de gemiddelde terugvinding hoger (zelfs als niet significant) aan deze stroomtarief voor beide analyten en vanwege de experimentele continuïteit (deze sondes was werden gebruikt voor het analyseren van GABA in prioriteit1).

Ontwikkeling van de vangsten en de progressie van de ziekte na status epilepticus

De gedrags- en EEG monitoring van vangsten, de evaluatie daarvan, werd gedaan in alle werkzaamheden in loondienst in deze studie bevestigen de ontwikkeling en de progressie van TLE ziekte in deze dieren.

Er is door de robuuste convulsive SE, dat werd onderbroken na 3 h met gebruikmaking van diazepam, 25±5 min na de injectie pilocarpine opgetreden. Vervolgens alle dieren een latency-staat waarin zij werden blijkbaar goed en zij waren voortdurend video-EEG gecontroleerd om te verifiëren dat geen spontane aanvallen in de eerste 9 dagen plaatsgevonden of identificeren van de eerste spontane inbeslagneming, respectievelijk voor ingevoerd de latentie en de eerste groep van de inbeslagneming. De eerste spontane inbeslagname vond 11.3 ± 0,6 dagen na SE (bedoel ± SEM, n = 21). Daarna, vangsten plaatsgevonden in clusters en verergerd in tijd. In de late chronische fase (dagen 55-62 na SE) ervaren de epileptische rats 3.3±1.2 (bedoel ± SEM, n = 12) gegeneraliseerde aanvallen per dag. Er was een duidelijke progressie van de ziekte. Veel, maar niet alle aanvallen van de EEG, correspondeerde met gedrags inbeslagneming activiteit. Figuur 5B toont de opgenomen paroxismale epileptiform activiteit die werd waargenomen ongeveer 500 ms voor en tijdens de gedrags vangsten. Figuur 5A toont controle sporen in niet-epileptische ratten.

Representatieve basale waarden van aminozuren gevonden in microdialysis perfusaat en kalium gestimuleerd release van glutamaat

Basale glutamaat concentratie gevonden bij chronische epileptische ratten (0.87 ± 0,06 µM) was aanzienlijk hoger dan in de controledieren (0.59 ± 0,03 µM; p < 0.05 vs. besturingselementen; one-way ANOVA en post hoc Dunnett het testen). Was er geen statistisch significant verschil tussen chronische epileptisch (0.31 ± 0,04 µM) en niet-epileptische dieren (0,30 ± 0,05 µM) in basale of hoog K+ opgeroepen aspartaat concentraties. Zie het originele artikel voor details2. De gerapporteerde basale niveaus van glutamaat in besturingselement ratten in overeenstemming met die gevonden door anderen in soortgelijke zijn studies (dat wil zeggen, over 0,75 µM bij gebruik van een 2 µL/min stroom en membranen van 2 mm effectieve lengte)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Echter kunnen veel verschillende factoren invloed hebben op de resultaten van microdialysis, bijvoorbeeld de nuttige lengte van de sonde en het membraan afgesneden.

Hoge K+-opgeroepen een extra vrijlating van glutamaat gedurende ongeveer 30 min. in controle ratten en voor ongeveer 60 min bij chronische epileptische ratten (Figuur 6). Zie het originele artikel voor details2. Zoals kan worden gezien van de afgebeelde tijdsverloop, was de resolutie van de 10 min tijd van microdialysis voldoende om de varianties van glutamaat release gevonden in beide groepen van dieren vangen.

HPLC kalibratie en grenzen

De gegevens werden berekend op basis van de kalibratiekrommen verkregen met standaardoplossingen van glutamaat en aspartaat en de interne standaard L-homoserine. De concentratie van de neurotransmitters glutamaat en aspartaat in de perfusates werd uitgedrukt in absolute waarden (µmol/L). Ieder waarnemingspunt kalibratie werd gebouwd door analyse van oplossingen van glutamaat en aspartaat op vier concentratieniveaus (vijf wordt gerepliceerd op elk niveau). Regressiecoëfficiënten werden berekend voor kalibratie percelen: y = kx + q, waar x was de verhouding van de concentratie van aspartaat of glutamaat naar L-homoserine (IS) en y was de overeenkomstige piekoppervlakte verhouding van aspartaat of glutamaat naar L-homoserine () IS). De determinatiecoëfficiënt (r2) werd berekend. De toepasselijkheid van de HPLC-methode werd binnen de grenzen; de onderste bepalingsgrens werd bepaald als de laagste concentratie in de standaard kalibratiekromme en de bovengrens van kwantificering als de hoogste gebruikte concentratie van aminozuur analyten voor kalibratie, respectievelijk. Aantoonbaarheidsgrens (LOD) werd ook berekend. Sommige van deze waarden zijn afgebakend in tabel 1. Een model chromatogram van blancomonster, normen monster en verzamelde dialyse monster met hierboven beschreven methode verkregen worden weergegeven in Figuur 7.

Sonde lokalisatie

Microdialysis sonde en opname-elektrode werden geïmplanteerd in de rechts ventrale hippocampus en hun juiste plaatsing werd gecontroleerd. Alleen dieren waar de innesteling maximaal in 500 micrometer verre van gestabiliseerde coördinaten was (Zie Figuur 8) werden opgenomen in de analyse.

Figure 1
Figuur 1. Stapsgewijze voorbereiding van het apparaat om te worden ingeplant. (A) 3-kanaals elektrode met 10 cm lang aarding elektrode in de beschermende folie op de canule links en gids voor microdialysis aan de rechterkant nodig om het apparaat te monteren. (B). de kale elektrode en gids canule in detail. De eerste stap is het verwijderen van (C) en (D) de metalen gids canule uit en in de plastic dummy paar keer naar gemak invoegen de release eenmaal ingeplant hoofd van het dier. De tweede stap is om te buigen van twee keer de gedraaide registreren elektrode worden uitgelijnd naar dialyse gids canule (E, F). (G) de tip van de elektrode moet worden gesneden te 0.5 mm langer zijn dan het uiteinde van de canule metalen gids. (H) Controleer de precisie van de snede met behulp van de digitale remklauw. Daarna, ongeveer 1 mm lange silicium circlet moet worden gebruikt om de uitlijning van de elektrode te begeleiden van de canule voet (I) vast te stellen. (J) de foto toont hoe ring van de elektrode en begeleiden van de canule schacht. De laatste stap is om een daling van hars of lijm op de gids canule sokkel tot vaststelling van de silicium circlet aan het (K). (L) geassembleerde apparaat klaar om te worden gesteriliseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Foto's van verschillende soorten apparaten voor microdialysis-EEG bij ratten gebruikt (A) en de foto van de sonde clip houder (B) gebruikt om deze apparaten implantaat. (A) de gids canule (in groen) is vervangen door een microdialysis canule meestal 24 uur voordat het experiment. De elektrische aansluiting van het apparaat (de eerste straat links werd gebruikt voor de opnames die worden beschreven in dit manuscript) vergunningen van de bevestiging van de draden die elektrisch signaal versterker en data collectie apparatuur voeren. Het apparaat is operatief gekoppeld aan de schedel van narcose ratten en opnamen kunnen later worden verkregen zonder pijn of ongemak in de ratten vrij te gedragen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Proefopzet. De week vóór status epilepticus (SE) inductie, de ratten zijn geïmplanteerde met het apparaat. SE wordt geïnduceerd door pilocarpine en dieren (als niet dialyzed en gedood bij 24 h na SE; de ratten uit acute groep) video gecontroleerd voor 5 dagen (blauwe lijn), dan video-EEG gecontroleerd om te beoordelen van de inbeslagneming frequentie en duur in hun huis kooien (groene lijn). Voor de microdialysis experiment, het besturingselement van epileptische en respectieve niet-epileptische ratten worden overgebracht naar een ander EEG opgericht uitgerust met cilinder kooien in 24 uur voordat de sessie microdialysis en nog steeds video-EEG gecontroleerd (licht groene lijn). De verticale rode lijnen geven de dialyse-sessies op verschillende tijdstippen van de epileptische ziekte ontwikkeling. De horizontale rode lijnen vertegenwoordigen de verschillende groepen van epileptische dieren (en respectieve niet-epileptische dieren), waar de pijl de laatste dag van de microdialysis en de dag van het dier dood geeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. In vitro herstel van twee dialyse sondes. Betekenen in vitro herstel (%) aspartaat of glutamaat met behulp van twee verschillende verkrijgbare microdialysis sondes (beide begiftigd met 1 mm lang dialyzing membraan) op (A) 2 μL/min en (B) 3 µL/min debiet. Gegevens zijn de gemiddelde ± SEM van 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in triplicates. Er zijn niet statistisch significante verschillen tussen de efficiëntie van verschillende sondes (Student t-test, p de ongepaarde < 0,05). Met behulp van een stroom tarief 2 μL/min die de glutamaat-herstel ongeveer 5 toegenomen % in vergelijking met 3 µL/min debiet, werd dus het lagere debiet gebruikt voor microdialysis experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Illustratieve EEG opnames uit ventrale hippocampus van paraoxystic activiteiten zoals kan worden gezien in de chronische fase bij controle en epileptische ratten. (A) twee representatieve sporen opgenomen in twee zoute behandelde niet-epileptische ratten. (B) sporen opgenomen in twee epileptische ratten. Epileptiform lozingen komen overeen met klasse 3 gedrags aanvallen in deze ratten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. Tijdsverloop van het effect van kalium stimulatie op glutamaat vrijlating uit de rat hippocampus. Representatief resultaat van de microdialysis experiment uitgevoerd in 6 controle (open cirkels) en 6 chronische epileptische ratten (zwarte cirkels). De grafiek toont de temporele veranderingen van dialysate glutamaat concentratie in de loop van microdialysis experimenten en tijdens hoge 100 mM K+ stimulatie. De tijd van hoge K+ stimulus (10 min) is aangegeven met de zwarte balk onder aan de grafiek. De gegevens zijn de middelen ± SEM van 6 dieren per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7. Illustratie van chromatogrammen. Bekende pieken worden aangeduid. Roze trace: chromatogram van Ringer's oplossing zonder opzettelijk toegevoegd aminen na OPA/5-ME bewerking (blancomonster). Blauwe trace: chromatogram van dialysate monster na bewerking weergegeven: de pieken van aminozuren: aspartaat (tR 4.80 min), glutamaat (tR 6.75 min) en glutamine (tR 9,19 min) en de piek van IS L-homoserine (2,5 µM, retentietijd, t R 9.83 min). Rode trace: Chromatogram van standaard (2,5 µM) aspartaat of glutamaat (2,5 µM) in Ringer's oplossing. Azure en gele achtergrond van de afbeelding staat voor mobiele fase A (azure) en mobiele fase B (geel) gedeelte gebruikt voor analyten elutie. Een rode rechthoek aangegeven gebied (tR 10.41 min en verder) toont de pieken van onbekende stoffen en OPA afbraakproducten. Alle injectie volumes werden 20 µL. De derivaten werden gescheiden op een debiet van 0,8 mL/min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8. Representatief beeld van gecombineerde elektrode-sonde plaatsing binnen de ventrale hippocampus. (A) foto toont de schrikken achtergelaten door de tip voor het apparaat in detail (zwarte pijl). (B) Schematische illustratie van de elektrode-sonde tip standpunten binnen de geïmplanteerde ventrale hippocampus van 12 ratten. De solide pleinen (enkele overlappende) geven juist gelokaliseerde sonde-elektrode tips. Open pleinen geven onjuist gelokaliseerde sonde-elektrode tips bij dieren uitgesloten van de studie (n = 3). Coronale hersenen segmenten met sondes en opname van sites werden na de experimenten histologische p.a. verwerkt. De getallen hierboven in de afbeelding geven de afstand van Bregma (volgens Pellegrino et al. 1979 atlas van rat hersenen; neus bar + 5.0 mm, coördineert gebruikt: een-3.4 mm, L + 5.4 mm; P + 7,5 mm van dura). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Analyt c (μmol/l) k q r-2 LOD (pmol/l)
Glutamaat 0,25-2.5 5.215 1043.79 0.999 19.4
Aspartaat 0,25-2.5 2.258 1994.72 0.998 31,7

Tabel 1. De kenmerken van de kwantificering van de HPLC-methode gebruikt voor de bepaling van aminozuren. Concentratie bereik van normen (c), de helling (k), de snijpunt (q), de determinatiecoëfficiënt (r2) en aantoonbaarheidsgrens (LOD) beschrijven de kalibratie percelen verkregen met standaardoplossingen aspartaat of glutamaat (0,25, 0.5, 1.0 en 2,5 µM ) en interne standaard L-homoserine (2,5 µM) met behulp van de beschreven methode HPLC met spectrofluorometric detectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk, laten we zien hoe een ononderbroken video-EEG-registratie, in combinatie met microdialysis kan worden uitgevoerd in een experimenteel model van TLE. Video-EEG opname technieken worden gebruikt voor de verschillende fasen van de progressie van de ziekte bij dieren correct te diagnosticeren en de microdialysis-techniek wordt gebruikt om te beschrijven van de veranderingen in glutamaat release die zich in de tijd voordoen (geen wijzigingen gevonden voor aspartaat in een eerder gepubliceerde studie2). Wij raden het gebruik van een enkel apparaat/implantaat te voeren ze beide in elk dier om de redenen besproken in de inleiding.

Indien beschikbaar, radiotelemetry de voorkeur verdient om vastgebonden systemen voor chronische EEG opname vermindert storingen met gedrag en vermindert risico op schade en leed voor de dieren54. De vastgebonden EEG opname is echter veel minder duur dan telemetrie.

In ons laboratorium gebruiken we de verbindingslijnen naar de EEG registratie systeem en microdialysis buizen parallel, zodanig dat de draden en tubings zijn aangesloten op twee verschillende wartels. Dit is de meest kritieke kwestie voor deze experimenten: de draden en slangen hebben de neiging te steken vaak te wijten aan bewegingen van het dier. Daarom gebruiken we connectoren en slang lang genoeg te laten de dieren jagen haar eigen staart (een gedrag dat meestal met kalium stimulatie waargenomen wordt) of naar beneden vallen en rollen tijdens veralgemeende epileptische aanvallen. Het is raadzaam om het bedrijf verder de cannulas van de microdialysis ingevoegd in hun gids door het modelleren van klei, ter versterking van hun contact met de gids (soms microdialysis cannulas tegen de muren van de kooi zijn gestoten tijdens gegeneraliseerde aanvallen en kan SLIP af). Aan de andere kant, is het raadzaam om te houden van de slang zo kort mogelijk te maken, tot een minimum beperken van de vertraging tussen neurochemical tijdstip en afhaaltijd. Dit is vooral belangrijk wanneer collectie perioden kort zijn. In het algemeen, de slang van de microdialysis moeten van voldoende lengte en capaciteit om ervoor te zorgen dat het bemonsteringstijdstip niet hoger is dan de tijd tussen dialyse outlet en collectie. Er werd opgemerkt dat de opgeloste stoffen de neiging om meer diffuus tussen sommige stekkers als de buis dode tijd superieur aan de bemonstering tarief55 is. Daarom moeten de experimentele dode tijd/volume van microdialysis buizen worden zoveel mogelijk beperkt en zeer nauwkeurig bepaald om de gegevens van de neurochemie correleren met gedrag van het dier. Tenslotte is het belangrijk op te merken dat zowel wartels en elektroden in combinatie met canule voor gecombineerde EEG en microdialysis studies commercieel verkrijgbaar zijn. Daarom, indien mogelijk, de EEG systeem opgezet met de optie om uit te voeren van de experimenten van microdialysis.

De kleine aanbevelingen zijn: (i) voor het begin van elke proef, Controleer dat de EEG opname systeem en/of microdialysis ingesteld naar behoren functioneren en oplossen van een probleem; Wij stellen voor dat het hebben van een reserve klaar (een andere pomp met spuiten gemonteerd op en voltooide buis gevuld met werkoplossingen) wanneer instellen uitvoeren van het experiment, alsook een voldoende aantal klaar voor gebruik microdialysis sondes voor het wijzigen van de gebroken degenen; (ii) bij het overbrengen van dieren in de kooi van de werkende EEG-microdialysis is het handig om een tweede persoon bijstaan en het starten van de overnames; (iii) Zorg ervoor dat de kolom en autosampler de juiste temperaturen voor chromatografie bereikt; Bovendien gebruik van normen en de kalibratie percelen bouwen voordat dialysate monsters worden geïnjecteerd in de chromatografische kolom; (v) indien nodig, proberen te ontwikkelen de chromatografische of andere analytische methode voor het meten van meerdere analyten tegelijkertijd.

Wijzigingen in de transmissie gevolgen hebben in veel CNS aandoeningen (waaronder epilepsie) en is er een grote belangstelling in de afgelopen decennia te kwantificeren van deze veranderingen tijdens de overgang van een gezonde naar een zieke fenotype. Vandaag, laten alleen een paar technieken de meting van veranderingen in de neurotransmitter niveaus over dagen of maanden. Microdialysis is een van deze technieken. In een groot aantal gevallen, zoals die beschreven hier, het is uitgevoerd in vrij bewegende dieren en wordt gekoppeld aan conventionele off line analytische testen zoals hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) of capillaire elektroforese (CE), die het bereikt 5-30 min temporele resolutie31,56. Duidelijk, deze bemonstering intervallen weerspiegelen niet de snelle neurotransmitter dynamiek in de nabijheid van synapses, maar kan handig voor sommige lange termijn microdialysis toepassingen (bijvoorbeeld, ziekte ontwikkeling of drug effect studies) waarvoor koppeling neurochemical, EEG en gedrags-gegevens. Echter, andere studies zich voornamelijk bezig met het meten van real-time of bijna real-time wijzigingen in neurotransmitter vrijgeven. Voor deze, moet de microdialysis-techniek worden verfijnd om het verhogen van de snelheid van monsterneming (daarom verminderend monster volumes). Inderdaad, de klassieke microdialysis-techniek is vaak bekritiseerd om haar arme temporele (minuten) en de ruimtelijke resolutie (de conventionele sonde is veel groter dan de synaptische gespleten)9,21,56, 57. het is echter de grote gevoeligheid van de analysemethode gekoppeld aan microdialysis wat bepaalt de resolutie van de tijd van de microdialysis (d.w.z., zijn resolutie is gelijk aan de tijd die nodig is om te hebben genoeg monster worden gedetecteerd door een analytische techniek56). Dus, wanneer de microdialysis kleine hoeveelheden van monsters produceert, de gevoeligheid van kwantificering technieken moet worden verhoogd. Tot op heden hebben gevolgd die verbeteringen in temporele resolutie van de microdialysis-techniek 3 verschillende lijnen. Een van deze wordt vertegenwoordigd door de miniaturisering van de kolommen en/of detectie cellen van klassieke HPLC methoden; Deze heten UHPLC (ultra-performant HPLC) technieken en laat 1-10 min tijd resolutie58,59,60te bereiken. Een andere aanpak is om een klassieke HPLC koppelen aan massaspectrometrie (MS) of tandem (MS/MS) multiplex p.a. van neurotransmitters in de hersenen dialysates. Gecombineerde HPLC-MS testen hebben een uitstekende gevoeligheid en bereiken over 1-5 min tijd resolutie56,61,62,,63. Een derde lijn van verbetering bestaat in wijzigingen van capillaire elektroforese (CE). Als CE gebruik laser geïnduceerde fluorescentie detectie (CE-LIFD), hierdoor bepaling van de concentratie van de submicromolar van verschillende neurotransmitters in nanoliter breuken verkregen elke 5 min55,64,65 of zelfs op 10 s intervallen56. Een duidelijk voordeel dat naar voren uit UHPLCs of geavanceerde analytische benaderingen van de CEs komt is dat de bemonstering kan worden gedaan in vrij bewegende dieren, niet in gevaar te brengen experimenten waarin spontane gedrag moet worden waargenomen en geanalyseerd. Aan de andere kant, er zijn methoden waarmee de hersenen dialysate bemonstering op zelfs honderd milliseconden temporele resolutie (bijvoorbeeld enzym reactor gebaseerd on-line testen of druppel collectie van dialysate gekoppeld aan MS technieken), maar deze zijn meestal gebruikt in ingetogen dieren66 of onder narcose67,68,69, niet toe te staan om de paar microdialysis met behavioral studies.

Bij het overwegen van de tweede belangrijkste zwakte van microdialysis, dat wil zeggen, relatief lage ruimtelijke resolutie als gevolg van de afmetingen van het membraan (vaak ongeveer 0,5 mm in diameter en 1-4 mm lang), een alternatief kan de microprobes ontwikkeld worden met low-flow push-pull bemonstering. Deze sondes bestaan uit twee silica haarvaten (van 20 µm ID en OD 200 µm) gesmolten side-by-side en ommanteld met een polymere buis. Tijdens het experiment zijn deze haarvaten geperfundeerd op zeer laag debiet, zodat de vloeistof wordt getrokken uit een capillair en een steekproef wordt opgehaald uit de andere op de dezelfde stroomsnelheid. Omdat de bemonstering alleen aan het uiteinde van de sonde plaatsvindt, is de ruimtelijke resolutie groter dan die van de sonde voor microdialysis70. Een andere mogelijkheid is het overstappen van verkleinde sondes naar micro-elektrode arrays (biosensoren) voor real-time neurotransmitter evaluatie. Verschillende elektrochemische technieken (hoofdzakelijk berust op voltammetrie of amperometry) toestaan analyt bemonstering zeer dicht bij de synaps (micron schaal) en in minder dan 1 s31,-70,71. Deze apparaten kunnen het meten van de concentratie van meerdere analyten uit meerdere hersengebieden. Ze vereisen echter ook enkele verfijningen, bijvoorbeeld om te voorkomen dat artefacten en een relatief snelle verslechtering.

Gezien de laatste ontwikkelingen bij de in vivo neurochemical controle, lijkt het waarschijnlijk dat de bemonsteringsmethoden voor andere zender worden samengevoegd in een sensor in de nabije toekomst. Het werk op microfabricated bemonsteringssondes is al begonnen, en wij zijn van mening dat verdere vooruitgang in microfabrication technologieën samen met analytische voorschotten in vivo neurochemical controle onderzoek zal verder te vergemakkelijken. De conventionele microdialysis gecorreleerd aan EEG blijft echter op dit moment een geldige methode voor veel toepassingen van de neurowetenschappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank Anna Binaschi, Paolo Roncon en Eleonora Palma voor hun bijdrage aan manuscripten gepubliceerd in voorrang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 141 microdialysis glutamaat aspartaat epilepsie pilocarpine model stereotaxic chirurgie kalium stimulatie elektro-encefalografie vloeibare chromatografie
Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Falcicchia, C.,… More

Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter