Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Samenvatting

Microdialysis is een gevestigde neurowetenschappen techniek die correleert de veranderingen van neurologisch werkzame stoffen verspreiden in de interstitiële ruimte van de hersenen met het gedrag en/of de specifieke resultaten van een pathologie (bijvoorbeeld aanvallen voor epilepsie). Bij de studie van epilepsie, wordt de microdialysis-techniek vaak gecombineerd met korte of zelfs lange termijn video-elektro-encefalografie (EEG) toezicht om spontane inbeslagneming frequentie, Ernst, progressie en clustering te beoordelen. De gecombineerde microdialysis-EEG is gebaseerd op het gebruik van verschillende methoden en instrumenten. Hier, we uitgevoerd in vivo microdialysis en continue video-EEG opnemen op glutamaat en aspartaat uitstroom van de monitor na verloop van tijd in verschillende fasen van de natuurlijke geschiedenis van epilepsie in een rat-model. Deze gecombineerde aanpak maakt het mogelijk de koppeling van veranderingen in de release neurotransmitter met specifieke stadia van de ontwikkeling van de ziekte en de progressie. De concentratie van het aminozuur in de dialysate werd bepaald door vloeistofchromatografie. Hier beschrijven we de methoden en het overzicht van de belangrijkste bewarende maatregelen één tijdens in vivo microdialysis moet-EEG, met bijzondere aandacht voor de stereotaxic operatie, basale en hoge kalium stimulatie tijdens microdialysis, diepte elektrode EEG opname en krachtige vloeibare chromatografie analyse aspartaat of glutamaat in het dialysate. Deze aanpak kan worden aangepast voor het testen van een scala aan drugs of ziekte veroorzaakte wijzigingen van de fysiologische concentraties aspartaat of glutamaat in de hersenen. Afhankelijk van de beschikbaarheid van een passende analytische bepaling, kan het verder worden gebruikt voor het testen van verschillende oplosbare moleculen als EEG opname tegelijkertijd in dienst.

Inleiding

Als u wilt bieden inzicht in de functionele aantasting van glutamaat-gemedieerde excitatory en remmende transmissie GABAergic resulterend in spontane aanvallen in de temporale kwab epilepsie (TLE), we systematisch worden gecontroleerd extracellulair concentraties van GABA¹ en later de niveaus van glutamaat en aspartaat² door microdialysis in de ventrale hippocampus van ratten op verschillende tijdstippen van de natuurlijke ziekte cursus, dat wil zeggen, tijdens de ontwikkeling en de vooruitgang van epilepsie. We profiteerde van de TLE pilocarpine model bij ratten, die de ziekte zeer nauwkeurig op het gebied van ....

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Ferrara institutionele Animal Care en gebruik Comité en door het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (vergunning: D.M. 246/2012-B) overeenkomstig de richtsnoeren in de EUROPESEGEMEENSCHAPPEN Richtlijn van de Raad van 24 November 1986 (86/609/EEG). Dit protocol is speciaal aangepast voor glutamaat en aspartaat bepaling in de rat hersenen dialysates verkregen onder controle van de EEG van microdialysis sessies bij epileptische en niet-epileptische ratten. Veel van de hier beschreven materialen kunnen gemakkelijk vervangen worden die men in zijn laboratorium voor EEG opnamen of microdialysis ge....

Resultaten

Sonde herstel

De gemiddelde terugvinding (dat wil zeggen, de inhoud van de gemiddelde aminozuur in het perfusaat als een percentage van de inhoud in een gelijk volume van de oplossing van vial) was 15.49 ± 0,42% op een debiet van 2 l/min en 6.32 ± 0.64 op 3 l/min voor glutamaat en 14.89 ± 0.36% op een debiet van 2 L/min en 10.13 ± 0.51 op 3 l/min voor aspartaat bij het gebruik van de cuprophane membraan sonde. Als de poly.......

Discussie

In dit werk, laten we zien hoe een ononderbroken video-EEG-registratie, in combinatie met microdialysis kan worden uitgevoerd in een experimenteel model van TLE. Video-EEG opname technieken worden gebruikt voor de verschillende fasen van de progressie van de ziekte bij dieren correct te diagnosticeren en de microdialysis-techniek wordt gebruikt om te beschrijven van de veranderingen in glutamaat release die zich in de tijd voordoen (geen wijzigingen gevonden voor aspartaat in een eerder gepubliceerde studie

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-kanaals twee-gedraaide elektrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Materiaal
geleider cannula	Agn Tho's, Lindigö, Zweden	MAB 4.15.IC	Materiaal
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italië	KK2	Materiaal
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milaan, Italië	2047420_71941	Materiaal
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, Frankrijk	221300288 (AIC)	Oplossing
Xylazine	Sigma, Milaan, Italië	X1251	Materiaal
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, Frankrijk	103120022 (AIC)	Oplossing
Altadol 50 mg/ ml - tramadol	Formevet, Milaan, Italië	103703017 (AIC)	Oplossing
Gentalyn 0,1% crm - gentamicine	MSD Italia, Rome, Italië	20891077 (AIC)	Materiaal
simplex snelle dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Verenigd Koninkrijk	ACR811	Materiaal
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Materiaal
probe clip houder	Agn Tho's, Lindigö, Zweden	p/n 100 5001	Uitrusting
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Materiaal
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Italië	019995063 (AIC)	Materiaal
1 mL spuit met 25G naald	Vetrotecnica, Padua, Italië	11.3500.05	Materiaal
buigzame voedingsnaald voor ratten 17G	Agn Tho's, Lindigö Zweden	7206	Materiaal
Grass Technology apparaat	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Uitrusting (AS40 versterker, head box, verbindingskabels, telefactor model RPSA S40)
modulair dataverzameling en analyse systeem MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Uitrusting
digitaal videobewakingssysteem	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Uitrusting
microdialyse sonde	Agn Tho's, Lindigö Zweden	MAB 4.15.1.Cu	Materiaal
microdialyse sonde	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Materiaal
blok verwarming	Grant Instruments, Cambridge, Engeland	QBD2	Uitrusting
roerder	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italië	711	Uitrusting
infusiepomp	Univentor, Zejtun, Malta	864	Uitrusting
fijn geboord polyethyleen buis	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Materiaal
blauwe buisadapters	Agn Tho's, Lindigö Zweden	1002	Materiaal
rode buisadapters	Agn Tho's, Lindigö Zweden	1003	Materiaal
2,5 mL spuit met 22G naald	Chemil, Padua, Italië	S02G22	Materiaal
flesdop	Cronus, Labicom, Olomouc, Tsjechië	VCA-1004TB-100	Materiaal
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Materiaal
glas inzet met bodemveer	Supelco, Sigma, Milaan, Italië	27400-U	Materiaal
autosampler flesetje	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italië	C4013-2	Materiaal
Smartline manager 5000 systeemcontroller en ontgassereenheid	Knauer, Berlijn, Duitsland	V7602	Uitrusting
Smartline 1000 quaternaire gradiëntpomp	Knauer, Berlijn, Duitsland	V7603	Uitrusting
spectrofluorometrische detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Uitrusting
chromatografische kolom	Knauer, Berlijn, Duitsland	25EK181EBJ	Materiaal
chromatografische pre-kolom	Knauer, Berlijn, Duitsland	P5DK181EBJ	Materiaal
mobiele fase oplossing A	0,1 M natriumfosfaat buffer, pH 6,0		Oplossing
mobiele fase oplossing B	40% 0,1 M natriumfosfaat buffer, 30% methanol, 30% acetonitril, pH 6,5		Oplossing
Ringer oplossing	samenstelling in mM: MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3% BSA		Oplossing
gewijzigde Ringer oplossing	samenstelling in mM: MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50,7, CaCl2 1,2, 0,3% BSA		Oplossing
zoutoplossing	0,9% NaCl, ph aangepast tot 7,0		Oplossing
sucrose oplossing	10% sucrose in gedistilleerd water		Oplossing