Summary
Här, beskriver vi en metod för in-vivo mikrodialys att analysera aspartat och glutamat release i ventrala hippocampus epileptiska och icke-epileptiska råttor, i kombination med EEG inspelningar. Extracellulära koncentrationer av aspartat och glutamat kan vara korrelerade med de olika faserna av sjukdomen.
Abstract
Mikrodialys är en väletablerad neurovetenskap-teknik som korrelerar ändringarna av neurologiskt verksamma ämnen sprida in i hjärnan interstitiell utrymme med beteendet och/eller specifika resultatet av en patologi (t.ex. beslag mot epilepsi). När man studerar epilepsi, kombineras mikrodialysteknik ofta med ens långfristiga video-elektroencefalografi (EEG övervakning för att bedöma frekvensen av spontana kramper, svårighetsgrad, progression och klustring). Kombinerade mikrodialys-EEGEN baseras på användning av flera metoder och instrument. Här, utfört vi i vivo mikrodialys och kontinuerlig video-EEG inspelning till monitor glutamat och aspartat utflöde över tid, i olika faser av den naturliga historien om epilepsi i en råtta modell. Detta kombinerat tillvägagångssätt tillåter hopkoppling av förändringar i neurotransmitterfrigöraren med specifika stadier av sjukdomsutveckling och progression. Koncentrationen av aminosyror i dialysatet bestämdes genom vätskekromatografi. Här, vi beskriver metoder och skissera de viktigaste förebyggande åtgärderna en bör ta under i vivo mikrodialys-EEG, med särskild uppmärksamhet till stereotaxic kirurgi, basal och hög kalium stimulering under mikrodialys, djup elektroden EEG inspelning och högpresterande vätskekromatografi analys av aspartat och glutamat i dialysatet. Detta tillvägagångssätt kan anpassas att testa en mängd olika läkemedel eller sjukdom inducerade förändringar av de fysiologiska koncentrationerna av aspartat och glutamat i hjärnan. Beroende på tillgängligheten av en lämplig analytisk analys, kan det vidare användas för att testa olika lösliga molekyler när anställa EEG inspelning samtidigt.
Introduction
För att ge insikt funktionsnedsättning av glutamat-medierad retande och GABAergic hämmande neurotransmissionen resulterar i spontana kramper i tinningloben epilepsi (TLE), övervakas vi systematiskt extracellulära koncentrationer av GABA1 och senare nivåerna av glutamat och aspartat2 av mikrodialys i ventrala hippocampus hos råttor vid olika tidpunkter sjukdomens naturliga kurs, dvsunder utveckling och progression av epilepsi. Vi drog fördel av TLE pilokarpin modellen hos råttor som härmar sjukdomen mycket noggrant när det gäller beteende, elektrofysiologiska och histopatologiska förändringar3,4 och vi korrelerade dialysatet koncentrationen av aminosyror syror och dess olika faser: den akuta fasen efter epileptogena förolämpningen, fasen latens, tiden av det första spontana beslaget och kronisk phass5,6,7. Framing sjukdom faserna aktiverades av långsiktig video-EEG övervakning och precisa EEG och kliniska karakterisering av spontana kramper. Tillämpningen av mikrodialysteknik associerade med långsiktig video-EEG övervakning tillät oss att föreslå mekanistiska hypoteser för TLE neuropatologi. Sammanfattningsvis kan den teknik som beskrivs i detta manuskript hopkoppling av neurokemiska förändringar inom en definierad hjärnområde med utvecklingen och utvecklingen av epilepsi i en djurmodell.
Ihopkopplade enheter, består av en djup elektrod kontrasteras till en mikrodialys kanyl, är ofta anställda i epilepsi forskningsstudier där förändringar i signalsubstanser, deras metaboliter eller energisubstrat bör vara korrelerade till neuronal aktivitet. I de allra flesta fall, det används i fritt beter djur, men den kan också utföras på liknande sätt med människor, t.ex., farmako-resistenta epileptiska patienter som genomgår djup elektrod undersökningen före kirurgi8. Både EEG inspelning och dialysatet samling kan utföras separat (t.ex., implantera elektroden i ena hjärnhalvan och mikrodialys sond i det andra halvklotet eller ens utföra mikrodialys i en grupp av djur medan du utför enda EEGEN i en annan grupp av djur). Koppling elektroderna till sonder kan dock ha flera fördelar: det förenklar stereotaxic kirurgi, begränsar vävnadsskada enda halvklotet (medan andra intakt, som en kontroll för histologiska studier), och homogenizes resultaten eftersom dessa erhålls från samma hjärnregionen och samma djur.
Däremot, kräver beredning av kopplade mikrodialys sond-elektrod enheten kunskaper och tid om det är hemgjorda. Man kunde spendera relativt höga summor pengar om köpt från marknaden. Dessutom när mikrodialys sonder (sondspetsar är normalt 200-400 µm i diameter och 7-12 mm lång)9och EEG-elektroder (elektrod tips är vanligen 300-500 µm i diameter, och tillräckligt länge för att nå hjärnans struktur av intresse10) är den monterade enheten tillsammans, och representerar en skrymmande och relativt tunga föremål på ena sidan av huvudet, som är besvärande för djur och benägna att gå förlorad särskilt när den är ansluten till dialys pumpen och det hårda-wire EEG inspelningssystemet. Denna aspekt är mer relevant i epileptiska djur som är svåra att hantera och mindre anpassningsbar till mikrodialys sessioner. Lämplig kirurgisk teknik och lämpliga postoperativ vård kan resultera i långvariga implantat som orsakar minimal djur obehag och bör eftersträvas för combinatory mikrodialys-EEG experiment10,11, 12.
Fördelar och begränsningar av mikrodialysteknik har granskats i detalj av många neuroforskare. Dess främsta fördel över andra i vivo perfusion tekniker (t.ex., snabbt flöde push-pull eller kortikal cup perfusion) är en liten diameter av sonden som täcker en relativt exakt område av intresse13,14, 15. Andra, mikrodialys membranet skapar en fysisk barriär mellan vävnaden och perfusatet; Därför högmolekylära vikt ämnen korsa inte och stör inte analys16,17. Dessutom skyddas vävnaden från turbulent flöde av perfusatet18. En annan viktig fördel är möjligheten att ändra perfusatet flödet för att maximera perfusatet Analytens koncentration (dvs.processen med mikrodialys kan definieras väl matematiskt och kan ändras för att ge hög koncentrationer av analyten i provet)19. Slutligen kan tekniken användas att ingjuta de droger eller farmakologiskt verksamma ämnen i vävnaden i intresse och bestämma deras effekt på platsen för intervention20. Däremot, har mikrodialys en begränsad upplösning tid (vanligtvis mer än 1 min på grund av den tid som krävs för insamling av prov) i jämförelse med elektrokemisk eller biologiska sensorer; Det är en invasiv teknik som orsakar vävnadsskada; det äventyrar den neurokemiska balansen inom utrymmet runt membranet på grund av kontinuerlig koncentrationsgradient av alla lösliga ämnen som träder perfusatet tillsammans med analyten sevärdheter. Slutligen påverkas mikrodialysteknik starkt av gränserna för de analytiska tekniker som används för kvantifiering av ämnen i perfusatet9,21,22,23 . Den högpresterande vätskekromatografi (HPLC) efter derivatisering med orthophthaldialdehyde för glutamat och aspartat analys i biologiska prover har varit väl validerade24,25,26 , 27 och dess omfattande diskussion är av omfattningen av detta manuskript, men de data som produceras med hjälp av denna metod kommer att beskrivas i detalj.
När de utförs korrekt och utan ändringar perfusatet sammansättning, kan mikrodialys ge tillförlitlig information om de basala nivåerna av neurotransmitterfrigöraren. De största portionr av de basala nivåerna är sannolikt resultatet av den sändaren spridningseffekter från de synapser9. Eftersom i många fall enkel provtagning av signalsubstansen i det extra synaptiska utrymmet inte är tillräckligt att fullfölja målen för en utredning, kan mikrodialysteknik också användas att stimulera nervceller eller att beröva dem viktiga fysiologiska joner som K+ eller Ca2 +, för att framkalla eller förhindra frisättningen av signalsubstansen.
Hög K+ stimulering används ofta i neurobiologi för att stimulera neuronal aktivitet inte bara i vaket djur, men också i primär- och organotypic kulturer. En hälsosam centrala nervsystemet exponering för lösningar med höga koncentrationer av K+ (40-100 mM) väcker utflödet av signalsubstanser28. Denna förmåga av nervceller att tillhandahålla en ytterligare version svar på hög K+ kan äventyras i epileptiska djur1 och andra neurodegenerativa sjukdomar29,30. Likaså Ca2 + deprivation (erhålls av startas Ca2 + gratis lösningar) används för att upprätta kalcium-beroende frisättning av de flesta signalsubstanser mätt med mikrodialys. Det anses allmänt att Ca2 + beroende release är av neuronala ursprung, medan Ca2 + oberoende release påbörjar från glia, men många studier upp kontroversen över menande av Ca2 +-känsliga mätningar av t.ex. glutamat eller GABA9: således, om möjligt, är det lämpligt att stödja mikrodialys studier med mikrogivare studier, som de senare har högre spatial upplösning och elektroderna tillåter för att komma närmare synapser31.
Beträffande mikrodialys djurstudier epileptiska är det viktigt att understryka att de uppgifter som erhållits från de flesta av dem lita på video eller video-EEG övervakning av kramper, dvsav övergående händelsen av tecken eller symtom på grund av onormal överdriven eller synkron neuronal aktivitet i hjärnan32. Det finns några specifika electrographic anfall i pilokarpin behandlade djur som bör beaktas vid utarbetandet av experimentet. Spontana kramper följs av deprimerad aktivitet med täta EEG interictal spikar3 och uppstå i kluster33,34. Simulerade manövrerade icke-epileptiska djur kan uppvisa beslag-liknande aktivitet35 och därför parametrarna för EEG inspelningar utvärdering bör vara standardiserade36 och, om möjligt, tidsplanen för mikrodialys sessioner bör vara väldefinierade. Slutligen rekommenderar vi att följa principerna och metodologiska normerna för video-EEG övervakning i kontroll vuxen gnagare beskrivs av experter från internationella ligan mot epilepsi och epilepsi amerikansamhället i sina senaste rapporter37 ,38.
Här beskriver vi mikrodialys av glutamat och aspartat parallellt med den långsiktiga video-EEG inspelningar i epileptiska djur och deras analys i dialysatet genom HPLC. Vi kommer att betona de kritiska steg i protokollet som man bör ta hand om för bästa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner har godkänts av universitetet i Ferrara institutionella djur vård och användning kommittén och italienska hälsoministeriet (auktorisering: D.M. 246/2012-B) i enlighet med riktlinjerna i Europeiskagemenskapernas Rådets direktiv av den 24 November 1986 (86/609/EEG). Detta protokoll justeras specifikt för glutamat och aspartat bestämning i råtta hjärnan dialysates erhållits enligt EEG kontroll av mikrodialys sessioner i epileptiska och icke-epileptiska råttor. Många av de material som beskrivs här kan lätt ersättas med dem som använder en i hans laboratorium för EEG inspelningar eller mikrodialys.
1. montering av enhetens mikrodialys Probe-elektrod
- Använd en 3-kanals två-twisted elektrod (med minst en 20 mm kapad längd om registrering elektroden och en 10 cm lång jordning elektroden) och par den till en guide kanyl att förbereda enheten. Se exempel på 3-kanals elektrod och guide kanyl för dialys i figur 1A-1B.
- Ta bort (figur 1 c) och infoga (figur 1 d), metall guide kanylen i dummy plast kanylen några gånger innan användning för att underlätta dess avlägsnande vid tidpunkten för dess switch för mikrodialys probe i djur.
- Böja tvinnade trådar av registrering elektrod två gånger (figur 1E-1F) för att justera trådarna med dummy kanylen av guide och skär elektrod spetsen (figur 1 g) för att vara 0,5 mm längre än spetsen på guide kanylen (figur 1 H) använder den digitala skjutmått.
- Har redo den 1 mm långa kisel diadem (utvändig diameter 2 mm, tjocklek 0,3 mm; Figur 1I) och sätt in spetsen av guide kanylen och spetsen av tvinnade elektroderna i den kisel diadem med hjälp av pincetten (figur 1J). Fixa det på foten av guiden kanyl piedestal med polymer lim av snabba åtgärder eller harts (figur 1 K). Se exempel på de färdiga enheterna i figur 1 L och figur 2A.
- Sterilisera enheten under bakteriedödande UV-ljus för 4 h. Vänd enheten fyra gånger så som varje av dess sidor är utsatt för ljuset för 1 h.
Obs: Många hemlagade elektroder och mikrodialys sonder kan monteras på ett liknande sätt. Chefen för ovan beskrivna implantat för råttor har följande mått: bredd 7 mm x 5 mm djup x 10 mm längd uppifrån piedestal tå; implantatet spetsen är ca 11 mm långa, 600 µm i diameter och alla enheten väger ca 330-360 mg. Enheten kan återanvändas som två eller tre gånger om (i) en tillräckligt lång marken elektroden är kvar på skallen under operationen för nästa användning och (ii) När djuret dödas, och enheten återvinnas tillsammans med dentala cement det lämnas i aceton overnigh t, sådan som cement kan uppdelas mekaniskt, och enheten tvättas och steriliseras igen.
2. stereotaxic kirurgi
- Använd en stereotaxic apparat och sond clip hållare (figur 2B) för enhet implantation efter de samtida normerna för aseptisk och smärtfria operationer39,40,41.
- Söva de vuxna Sprague-Dawley-råttorna med ketamin/xylazin blandning (43 mg/kg och 7 mg/kg, i.p.) och fixa det på stereotaxic ramen. Lägga till isofluran anestesi (1,4% i luft, 1,2 mL/min) initial ketamin/xylazin injektion eftersom det tillåter för att kontrollera djupet av anestesi i tid. Raka pälsen på djurets huvud.
- Svabba huvud hudytan av jod-baserad lösning följt av 70% etanol att förbereda den för aseptisk kirurgi39.
- Implantatet guide kanyl-elektrod enheten beredd i prioritet (1,1-1,5) i höger ventrala hippocampus med hjälp av följande koordinater: näsa bar + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm till bregma1,2. Följ standard tekniker för stereotaxic operationer10,11,12.
- Se till att det inte täcker ankring skruvar. När montera den på stereotaxic apparaten, tag enheten för chefen guide kanyl som detta enkelt kan anpassas till sondhållaren.
- Förankra enheten till skallen med minst fyra rostfria skruvar skruva dem i skallbenet (1 skruv till vänster och 1 skruven in i det rätt pannbenet plåtarna, 1 skruv i vänster parietala och 1 skruv plattorna interparietal ben). Lägg en droppe av vävnad lim fixar ytterligare varje skruv till skallbenet.
- Täcka hälften av skruvgängor med metakrylsyra cement. Främja bindningen av cement genom att grunda spår i benet att öka efterlevnaden.
- När spetsen på enheten är placerad i hjärnvävnaden, tvinna tråd av marken elektroden runt 3 ankring skruvar. Täcka alla monterade skruvar och enheten med dentala cement12,42,43.
- Övervaka djuren under operationen och för ca 1 h därefter till upprätt och flytta runt buren. Hålla dem på en värmande pad för att undvika hypotermi. Låt råttorna att återhämta sig i minst 7 dagar efter enhet implantation.
- Övervaka djuren minst en gång dagligen i 3 dagar efter operationen för tecken på smärta eller ångest. Ge djuren med antibiotika grädde (gentamycin 0,1%) nära webbplatsen anskäras att förhindra infektionen och ett analgetikum (tramadol 5 mg/kg, i.p.) i 3 dagar för att förhindra postoperativa smärtan.
3. tinningloben epilepsi induktion av pilokarpin och tilldelning av djur till experimentella grupper
- Efter en vecka av postoperativ återhämtning, tilldela djuren slumpmässigt till grupper: (i) kontroll djur får fordonet och (ii) epilepsi djur som får pilokarpin. Använd ett proportionellt högre antal djur för epileptiska grupp eftersom inte alla av pilokarpin administreras råttor kommer att utveckla sjukdomen.
- Injicera en dos av methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) och 30 min efter en injektion av pilokarpin (350 mg/kg, i.p.) inducera den status epilepticus (SE). Injicera methylscopolamine och fordonet (koksaltlösning) till kontroll råttor. Använd 1 mL spruta med 25G nål för alla i.p. förvaltningar.
- Kontrollera visuellt att börja ha beteendemässiga anfall (rörliga vibrissa inom 5 min, nickande huvudet, kloning i extremiteterna) djur och inom 25 min att klona kontinuerligt alla kropp (SE).
- Gripande att SE 2 h efter debuten ha en dödlighet ca 25% och en genomsnittlig latent period på cirka 10 dagar genom administrering av diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observera och registrera varje beslag beteende börjar omedelbart efter pilokarpin injektionen och fortsätta i minst 6 tim därefter.
- Ge de djur koksaltlösning (1 mL, i.p.) med 1 mL spruta med 25G nål och sackaros lösning (1 mL, p.o.) med 1 mL doseringsspruta och flexibla utfodring 17G nål för 2-3 dagar efter SE för att återvinning av viktminskning.
- Utesluta djur som inte uppnår den ursprungliga kroppsvikten inom den första veckan efter pilokarpin SE från studien (utom gruppen akut dödade 24 h efter SE, där kroppen vikt uppföljning inte är möjligt).
- Tilldela post-SE djur slumpmässigt till olika experimentella grupper (figur 3): akut fas (där den mikrodialys sker 24 h efter SE), latens (7-9 dagar efter SE), första spontana beslag (ungefär 11 dagar efter SE) och kronisk perioden () börjar ca 22-24 dagar efter SE, dvs ca 10 dagar efter första beslag). Övervaka djuren för uppkomsten av spontana kramper.
Obs: Använd följande inklusion/exklusion kriterier för ytterligare experiment epileptiska råttor: utveckling av krampaktig SE inom 1 h efter pilokarpin administrering; viktökning under första veckan efter SE och den korrekta positioneringen av mikrodialys sonden och elektrod.
4. epileptiska beteendeövervakning och analys
- Långsiktig övervakning av epileptiska beteende
- Ungefär 6 h efter pilokarpin administrering (dvs.i slutet av direkt observation av forskare), placera djuren i rent hem burar och starta 24 h video övervakning.
- Fortsätta den 24 h video övervakning tills dag 5, med hjälp av en digital videoövervakningssystem.
- Början på dag 5, Anslut råttorna i sina hem rektangulära burar till uppbundna EEG inspelningssystem och fortsätt 24 h video övervakning.
- Ställ in parametrarna på förstärkaren placeras utanför Faradays bur (set förstärkningsfaktor på varje kanal enligt EEG signalen för varje enskilt djur specificitet) och start EEGEN förvärv observerar EEG signalen produceras av osammanhängande kablar. Användning provtagning Betygsätt 200 Hz och passera lågt filtret set till 0,5 Hz.
- Anslut djuret till kablar håller ett djurs huvud mellan två utsträckta fingrar på ena handen och skruva ner kontakterna till elektroden piedestal med den andra fria handen. Starta förvärvet.
Varning: Se till att signalen är gratis av artefakter. Gemensamma artefakter är spikar kraftigt överstiger skalan. - En dag innan mikrodialys experimentera, överföra djuren in i uppbundna EEG systemet utrustat med plexiglas cylindrar för mikrodialys. Koppla bort djuren från EEGEN tjudra system i buren skruva upp kontakterna från elektroden utan att hindra djuret. Placera djuret in i hög plexiglas cylindrarna.
- Övervakning av epileptiska beteende en dag före och under mikrodialys session
- Slå på förstärkaren placeras utanför Faradays bur. Öppna programvaran EEG. Start EEG förvärvet observerar EEG signalen produceras av osammanhängande kablar.
- Anslut djuret till uppbundna EEG inspelningssystemet håller ett djurs huvud mellan två utsträckta fingrar på ena handen och skruva ner kontakterna till elektroden piedestal med den andra fria handen. Ställ in en förstärkningsfaktor (vinst) på varje kanal förstärkare enligt elektrod signal om enskilt djur så EEG signalen är i skala. Låt djuret utforska nya buren (cylindern) för minst 1 h under direkt observation av forskaren.
- Obs: 24 h innan mikrodialys experiment, råttorna är kort bedövas med isofluran för växeln av guide kanyler till mikrodialys sonden. Dra nytta av det ögonblick när de bedövas för att ansluta dem till EEG inspelningssystemet.
- Förkorta eller förlänga hängande kabel enligt djurets handelsvara. Kontrollera att kablarna inte stör djurens rörelser och liggande ställning.
- Kontrollera för den bilden rätt inramningen videokameror. Starta inspelningen video-EEG.
- Identifiering av beslag och EEG aktivitet
- Använda en programvara spelare för att titta på videor. Rulla filmen 8 gånger snabbare än realtid uppspelning och individualisera de generaliserade krampanfall (se djur till bak med forelimb Klonus eller djur, uppfödning och faller med forelimb Klonus). Sakta ner videon och notera den exakta tidpunkten för början och slutet av beteendemässiga beslag.
- Processen data genom att räkna antalet generaliserade anfall hos 24 h video poster och uttrycka dem i form av anfallsfrekvens och varaktighet som medelvärden av alla kramper observerats i 24 h.
- Definiera de EEG beslag som perioderna av paroxysmal aktivitet av hög frekvens (> 5 Hz) kännetecknas av en > 3-faldig amplitud increment över baslinjen med progression av spike frekvensen som varar minst 3 s2,44 eller liknande28. Använda EEG programvara för att bearbeta raw EEG inspelningarna. Dela upp EEG spår i 1 h fraktioner. Kopiera de EEG spårning fraktionerna till fil för automatisk spike-programvara analys.
- Analysera EEG aktivitetsdata med EEG programvara och fördefinierade parametrar (4.3.3.). Genomföra alla video analyser i två oberoende utredare som är blinda för gruppen av analyserade djur. Vid avvikelser, göra dem åter granska data tillsammans för att nå ett samförstånd45.
5. mikrodialys
- In vitro sonden återhämtning
- Förbered proben för dess första användning enligt tillverkarens instruktioner, hantera det i dess skyddande hylsa.
- Köra experimentet i tre exemplar: förbereda tre 1,5 mL provrör laddar dem med 1 mL lösning som innehåller blandningen av standarder (2,5 µM av glutamat) och 2,5 µM av aspartat. Lägg tre laddade 1,5 mL provrör i block värmare uppsättningen till 37 ° C och placera den på omröraren.
Obs: Använda de samma standardlösningarna för kromatografi kalibreringar. - Försegla de 1,5 mL provrör med paraffin film och punktera det genom sharp pincett att göra ett hål ca 1 mm i diameter.
- Ta sonden och infoga den i hålet gjorde paraffin i filmen. Sänk ner membranet på minst 2 mm under nivån som lösning. Fixa ytterligare sonden till 1,5 mL provrör av paraffin film.
Varning: Se till att spetsen inte vidrör väggarna i 1,5 mL provröret. - Anslut sondens mynning till sprutan monterad på infusionspumpen använder FEP-slangar och slangen adaptrar. Alternativt bore Använd fina polyeten slangen 0,28 mm ID och 0,61 mm OD och färgade slangar adaptrar (röd och blå slangar adaptrar) för anslutningar.
- Starta pumpen 2 µL/min och låt vätskan visas på outlet spetsen. Anslut utloppet sond till 0,2 mL samlande provrör som använder FEP-slangar och slangen adaptrar.
Obs: Använda FEP-slangar för alla anslutningar. Skär till önskad längd på slang med hjälp av ett rakblad. Använd slangen adaptrar av olika färg för in- och utlopp av sonden. Låt pumpen kör för 60 min. Kontrollera efter läckor och luftbubblor. Dessa bör inte vara närvarande. - Ställ pumpen till flödet klassar 2 µL/min och börja samla in proverna på utloppssidan av slangen.
- Samla tre 30 min perfusatet prover och tre lika stor mängd prover av lösningen i 1,5 mL provröret. Ta lika stor volym proverna från 1,5 mL provröret varje 30 min med den mikrosprutan nedsänkt i standardlösningen i 1,5 mL provröret.
- Upprepa experimentet (5.1.1-5.1.8) ställa in pumpen för att flödet klassar 3 µL/min (5.1.7) att ha en jämförelse med sonden i återhämtning när du använder två olika perfusion flöden.
- När du är klar, stoppa pumpen och skölj slangen med destillerat vatten, 70% etanol och tryck ut luften in i den. Förvara sonden i en flaska fylld med rent destillerat vatten. Skölj sonden av startas det 2 µL/min av destillerat vatten före lagring.
- Analysera koncentrationen av glutamat och aspartat i prover av kromatografi (se information nedan; 6,3).
- Beräkna återhämtningen med hjälp av följande ekvation:
Återhämtning (%) = (Cperfusatet /Cdialysed lösning) x 100.
- Mikrodialys sessioner i fritt rörliga råttor
- Förberedande förfaranden: sond införande och testning, infusion pump inställningen och börja
- Förbereda mikrodialys sonderna för första användning enligt tillverkaren användarhandboken och fylla dem med Ringers lösning. Skär ca 10 cm långa bitar av FEP-slangen och Anslut dem till inlopp och utlopp kanyler av sonden med hjälp av de slangar adaptrarna av olika färger.
- Kontrollera att slangen vidrör adaptrarna med inga döda utrymme i alla anslutningar.
- 5.2.1.3. 24 h innan mikrodialys experimentet, söva kort djuret med isofluran (5% i luft) i en induktion kammare tills recumbent. Ta bort dummy kanylen från sin guide med pincetten och hålla djurets huvud stadigt. Sätt i mikrodialys sonden, begåvad med ett dialyzing membran, in guide kanylen och företaget ytterligare mikrodialys kanyler införas i deras guide av modellera.
Varning: Låt inte sonden vidrör väggarna i skyddande sonden hylsan när utvinna. - Lägga djuret in i plexiglas cylindern och låt det utforska den ny atmosfären. Anslut djuret till det uppbundna EEG inspelningssystemet som beskrivs ovan (följ punkterna 4.2.2 och 4.2.3).
- Följ den vaken och fritt rörliga råtta rörelser och Anslut inloppet av sonden till 2,5 mL sprutan med trubbiga 22G nål som innehåller Ringers lösning använder slangar adaptrarna. Tryck Ringers lösning inuti sonden mata ut 1 mL Ringers lösning i 10 s driver kontinuerligt pistongen av 2,5 mL spruta. Kontrollera för släpp av vätskan som förekommer på utlopp. Sonden är nu klar för användning.
- Fyll upp 2,5 mL sprutor ansluten till FEP-slangar genom slangar adaptrar med Ringers lösning och montera dem på infusionspumpen. Starta pumpen 2 µL/min. Låt det rinna över natten.
Obs: Använd önskad längd på alla FEP-slangar men beräkna slangar döda volymen att veta när hög K+ stimulering bör inledas och att korrelera kvantifiering data med neurokemiska förändringar i djurens hjärna. Använda luftbubblan skapade i slangen under arbetande flödet för att beräkna denna gång.
- Insamling av prover vid EEG inspelning och kalium stimulering
- Kontrollera frånvaron av kramper i 3 h före uppkomsten av provsamling (video-EEG inspelningar) och fortsätta att övervaka krampaktivitet under mikrodialys.
- Stoppa pumpen transporterar FEP-slangar kanylerade sprutorna fylls upp med Ringers lösning. Montera på pumpen en annan uppsättning av 2,5 mL sprutor ansluten till FEP-slangar med rör adaptrar fylld med en modifierad Ringers lösning innehållande 100 mM K+ lösning.
- Starta pumpen 2 µL/min och låt den köra. För snabb fyllning av slangen, ställa in pumpen på 5 µL/min för tiden av fyllning. Kontrollera om frånvaro av luftbubblor i systemet. Se till att slangen berör adaptrarna med inga döda utrymme i alla anslutningar.
- Testa sonden om redo för användning i djur som beskrivits ovan (5.2.1.5).
Obs: Om av någon anledning inte fungerar sonden, ändra den. För dessa fall hålla några förberedda mikrodialys sonder redo att använda nära mikrodialys-EEG arbetsstationen. Koppla bort djuret från EEG kablar och söva det kort med isofluran vid behov att förverkliga förändringen. - Anslut FEP-slangen med sprutor fyllda med Ringers lösning till inlopp kanylen av sonden i varje djur och vänta för uppkomsten av den flytande droppe på spetsen av utloppet.
- Anslut uttaget av sonden till FEP-slangen, vilket leder till samling i provröret. Infoga FEP-slangen i det stängda 0,2 mL provröret med ett perforerat lock. Se till att röret hålls på plats genom att fixera med en bit av modellering lera.
- Fortsätta att köra pumpen 2 µL/min för 60 min utan att samla in prover för att temperera systemet (noll-prov).
- Samla 5 på varandra följande 30 min dialysatet prover (60 µL respektive volym) under baslinjen förhållanden (perfusion med normala Ringers lösning). Lagra prover på is.
- Beräkna tiden det tar flytande att passera från pumpen i djurets huvud (det beror på dödvolym slangar, dvs, luft bubbla tid) och växla FEP-slangen som går från sprutor som innehåller normala Ringers lösning till sprutor med den här gången (100 mM K+) Ringers lösning utan att stoppa pumpen. Kontrollera om frånvaro av luftbubblor i systemet. Låt pumpen kör i 10 min.
Varning: I 10 min av hög K+ stimulering, djuren tenderar att flytta sig frenetiskt och brukar presentera ett stort antal blöt hund skakar (kontroll och ur beslag kluster djur) eller beteendemässiga anfall (epileptiska djur), så var redo att ingripa för att skydda slangar och kablar från vridning. - Efter 10 min, växla slangen från sprutor innehållande 100 mM K+ Ringers lösning till normala Ringers lösning och låt pumpen kör. Stäng inte av pumpen under lösning ändringarna så att att det finns en vätskedroppe slutet av slangen ska anslutas i linje.
- Från det ögonblick som dialysatet innehåller höga kalium, dvsefter insamling av den femte efter Jämviktstiden dialysatet, samla dialysatet fraktioner varje 10 min (20 µL) för 1 h. samla 3 ytterligare 30 min dialysatet prover och stoppa den pump. Lagra proverna på is.
- Förvara proverna vid-80 ° C efter experimentet tills HPLC-analysen.
- Upprepa mikrodialys experimentera 3 dagar, med undantag för akut (24 h) och första beslag gruppen, där endast en mikrodialys session äger rum 24 h efter SE eller inom 24 h efter första spontana beslag (figur 3).
- Efter varje experiment, avliva djuret med en narkos överdos och ta bort hjärnan för verifiering av sonden och elektrod placering.
- Förberedande förfaranden: sond införande och testning, infusion pump inställningen och börja
- Post-mikrodialys förfaranden
- Skölj använda mikrodialys sonder med destillerat vatten och lagra dem i en flaska fylld med rent destillerat vatten tills nästa användning.
Obs: Återanvända membranen kan ha ökat permeabilitet; Kontrollera för sonden återhämtning innan dess upprepad användning. - Skölj den hela mikrodialys ställa in (slangar, kopplingar och sprutor) med destillerat vatten följt av 70% etanol. Ersätta etanol med luft och lagra uppsättningen upp i en steril miljö.
- Dela de basala dialysatet proverna till 20 µL fraktioner och använda endast en 20 µL bråkdel för aminosyra basala koncentration analys. Lagra den återstående provvolymen för ytterligare eller bekräftande analys vid-80 ° C.
- Fixa hjärnor i 10% formalin och bevara dem genom paraffin-inbäddning1. Coronally avsnitt hjärnor i skivor och färga dem med hematoxylin och eosin. Undersöka hjärnor för rätt sond och elektrod placering1,2.
Obs: Fixa hjärnor i luftkylda 2-methylbutane och lagra dem vid-80 ° C. Använda några andra beprövade färgning på avsnitten nervvävnad som tillåter för att visualisera den sond och elektroden tarmkanalen.
- Skölj använda mikrodialys sonder med destillerat vatten och lagra dem i en flaska fylld med rent destillerat vatten tills nästa användning.
6. kromatografisk analys av glutamat och aspartat
- Beredning av derivatizing ombud
- Blanda de respektiva volymerna 20:1 (v/v) av orthophthaldialdehyde reagens (OPA) och 2-merkaptoetanol (5-ME) i injektionsflaskan. Stäng injektionsflaskan med mössa och air tight septum.
Varning: Arbeta under kemiska huven. - Vortex den beredda lösningen och Lägg den i autosampler in i placera för derivatizing agent.
- Blanda de respektiva volymerna 20:1 (v/v) av orthophthaldialdehyde reagens (OPA) och 2-merkaptoetanol (5-ME) i injektionsflaskan. Stäng injektionsflaskan med mössa och air tight septum.
- Beredning av dialysatet prover
- Sätt glas insatsen med botten våren i injektionsflaskan 2 mL brun autosampler. Förbereda injektionsflaskorna för alla prover mätt i en batch.
- Ta 20 µL dialys proverna från-80 ° C frys och låt dem smälta. Ta bort 1 µL av lösningen och tillsätt 1 µL av intern standard (IS) L-Homoserine (50 µM) till 19 µL av provet, således provet innehåller 2,5 µM is. Överför med pipett 20 µL av dialys provet till infoga i injektionsflaska och försegla det med en lufttät septum.
- Placera de injektionsflaskor innehållande proverna i den autosampler med hjälp av kromatografiska programvara för att märka proverna i sina positioner.
- Gaskromatografisk analys av prover för att avgöra koncentrationen glutamat och aspartat
- Köra analyser på Vätskekromatograf systemet med spectrofluorometric upptäckt. Identifiera de amino syrorna efter 2 min före kolumn derivatisering med 20 μL av orthophthaldialdehyde/5-merkaptoetanol 20:1 (v/v) tillsätts 20 μL av provet.
- Förbereda systemet för aminosyror analys. Slå på autosampler, pumpen, degasser, detektor och kontrollerande enhet tillsammans med datorn.
- Fördjupa Sifoner i flaskorna innehåller den mobila fasen och rensa kanalerna för kromatografiska pumpen används för analys.
- Börja öka flödet av den mobila fasen som kontroll av trycket på kolumnen (t.ex., börja på 0,2 mL/min och öka flödet för ytterligare 0,2 mL/min varje 5 min tills att uppnå fungerande flödet). Låt systemet kör arbetar flöde 0,8 mL/min för minst 1 h temperera kolumnen.
Varning: Instabil tryck anger förekomsten av luft i systemet. Trycket bör inte överstiga 25 MPa. - Ställa in känsligheten, hög känslighet och excitation och utsläpp våglängder på detektorn till 345/455 nm respektive. Återställa detektorsignalen (AUTOZERO).
- Med hjälp av kromatografiska programvaran, skicka metoden till instrumentet. Kolonnen bör nu vara redo att mäta.
- Separat dialysatet proverna, standard spetsade dialysatet prover samt standarder (0,25 µM – 2,5 µM aspartat och glutamat i Ringers lösning) på lämplig kromatografisk kolumn. Kalibrera den kromatografiska metoden och fastställa de detektering och kvantifiering gränserna innan någon dialys prover analys.
- Aktivera den enda analysen eller skapa sekvensen av proverna som ska analyseras med hjälp av kromatografi programvara och kör sekvensen.
Varning: Kör fler än ett blindprov och olika standardproven i sekvensen av dialysatet prover för att kontrollera metod är korrekta. - När kromatogram förvärvas, analysera dem med kromatografi programvara. Kontrollera integrationen av topparna av intresse i kalibreringskurva. Använd höjd eller topp topparea för kvantifiering.
- När provet inspelningen är klar Fyll kolonnen och systemet med ett organiskt lösningsmedel (t.ex., 50% acetonitril i ultrarent vatten) för att förhindra dess åldrande och mögel tillväxt i den.
- Stänga av systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonden återhämtning
Den genomsnittliga återhämtningen (dvs. medelvärdet aminosyran innehållet i perfusatet som en procentandel av innehållet i en lika stor volym av injektionsflaskan lösningen) var 15.49 ± 0,42% med en flödeshastighet av 2 μL/min och 6.32 ± 0,64 3 μL/min för glutamat och 14.89 ± 0,36% med en flödeshastighet av 2 ΜL/min och 10,13 ± 0,51 3 μL/min för aspartat när du använder cuprophane membran sonden. Om du använder polyakrylnitril membran sonden, den genomsnittliga återhämtningen var 13.67 ± 0,42% med en flödeshastighet av 2 μL/min och 6,55 ± 1,07 3 μL/min för glutamat och 14,29 ± 0,62% med en flödeshastighet av 2 μL/min och 8,49 ± 0,15 3 μL/min för aspartat (figur 4A-4B). Som det syns tydligt i figur 4A, förbättrar långsammare flödet (2 μL/min) både sonder dialyzing prestanda. För följande experiment cuprophane membran begåvad sonden perfusion vid ett flöde klassar 2 μL/min valdes, eftersom dess genomsnittliga återhämtningen var högre (även om inte signifikant) vid denna flödeshastighet för båda analyterna och på grund av experimentella kontinuitet (dessa sonder användes för att analysera GABA i prioritet1).
Kramper utveckling och progression av sjukdomen efter status epilepticus
Den beteendemässiga och EEG övervakning av kramper, deras utvärdering, skedde i alla de djur som används i denna studie bekräftar utvecklingen och utvecklingen av TLE sjukdom i dessa.
Robust krampaktig se-bolaget, som avbröts efter 3 h med diazepam, inträffade 25±5 min efter pilokarpin injektionen. Sedan, alla djur angett ett latens tillstånd där de var tydligen väl och de var kontinuerligt video-EEG övervakas för att kontrollera att inga spontana kramper inträffade under de första 9 dagarna eller att identifiera första spontana beslag, respektive för latens och den första beslag-gruppen. Det första spontana beslaget inträffade 11,3 ± 0,6 dagar efter SE (menar ± SEM, n = 21). Därefter kramper inträffade i kluster och förvärras i tid. I sena kronisk fas (dagar 55-62 efter SE) epileptiska råttorna upplevde 3.3±1.2 (menar ± SEM, n = 12) generaliserade anfall dagligen. Det fanns en tydlig progression av sjukdomen. Många, men inte alla EEG krampanfall, korresponderade med beteendemässiga krampaktivitet. Figur 5B visar den inspelade paroxysmal epileptiform aktivitet som observerades ca 500 ms före och under beteendemässiga anfall. Figur 5A visar kontroll spår i icke-epileptiska råttor.
Representativa basala värden av aminosyror finns i mikrodialys perfusatet och kalium stimuleras frisättning av glutamat
Basala glutamat koncentrationen i kronisk epileptiska råttor (0,87 ± 0,06 µM) var betydligt högre än i kontrolldjur (0,59 ± 0,03 µM; p < 0,05 vs. kontroller; envägs ANOVA och post hoc-Dunnetts testa). Fanns ingen statistiskt signifikant skillnad mellan kronisk epilepsi (0,31 ± 0,04 µM) och icke-epileptiska djur (0.30 ± 0,05 µM) i basala eller hög K+ framkallat aspartat koncentrationer. Se den ursprungliga artikeln för detaljer2. De rapporterade basala nivåerna av glutamat i kontroll råttor är i linje med de som finns av andra i liknande studier (dvs.om 0,75 µM när du använder en 2 µL/min flöde och membran av 2 mm effektiv längd)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Dock kan många olika faktorer påverka resultaten av mikrodialys, till exempel effektiva längden av sonden och membranet avskurna.
Hög K+-framkallat en ytterligare frisättning av glutamat i ca 30 min i kontroll råttor och i ca 60 min kroniska epileptiska råttor (figur 6). Se den ursprungliga artikeln för detaljer2. Som kan ses från det avbildade tidsförloppet, var 10 min tidsupplösning mikrodialys tillräcklig för att fånga varianser glutamat release hittas i båda grupper av djur.
HPLC kalibrering och gränser
Data var beräknas baserat på kalibreringskurvor erhållna med standardlösningar av glutamat och aspartat och den interna standarden L-homoserine. Koncentrationen av signalsubstanserna glutamat och aspartat i perfusates uttrycktes i absoluta värden (µmol/L). Varje kalibreringskurva konstruerades genom analys av lösningar av glutamat och aspartat på fyra koncentrationsnivåer (fem replikat på varje nivå). Regressionskoefficienter beräknades för kalibrering tomter: y = kx + q, där x var koncentrationsförhållandet aspartat eller glutamat till L-homoserine (IS) och y var motsvarande topparea förhållandet mellan aspartat eller glutamat till L-homoserine ( ÄR). Determinationskoefficienten (r2) beräknades. Tillämpligheten av HPLC-metoden var inom gränserna; den nedre gränsen för kvantifiering fastställdes som den lägsta koncentrationen i standard kalibreringskurvan och den övre gränsen för kvantifiering som högsta används koncentration av aminosyran analyter för kalibrering. Detektionsgränsen (LOD) beräknades också. Några av dessa värden är avgränsad i tabell 1. En modell kromatogram av blindprov standarder prov och insamlade dialys provet erhålls med ovan beskrivna metoden visas i figur 7.
Sonden lokalisering
Mikrodialys sond och inspelning elektrod var implanteras i just ventrala hippocampus och deras korrekta placeringen verifierades. Endast dessa djur där implantation var maximally i 500 μm avlägsen från stabiliserad koordinater (se figur 8) inkluderades i analysen.
Figur 1. Stegvisa beredning av enheten att implanteras. (A) 3-kanals elektrod med 10 cm långa grundstötning elektrod i dess skyddande hylsa på vänster och guide kanylen för mikrodialys till höger som behövs för att montera enheten. (B). kala elektrod och guide kanylen i detalj. Det första steget är att ta bort (C) och infoga (D) metall guide kanylen från och in i sin plast dummy några gånger för att underlätta dess release en gång implanteras i djurets huvud. Det andra steget är att böja två gånger vridna registrera elektroden anpassas till dialys guide kanyl (E, F). (G) elektrod spetsen bör klippas för att vara 0,5 mm längre än spetsen av metall guide kanylen. (H) kontrollera om precisionen i snittet med hjälp av den digitala skjutmått. Därefter ca 1 mm lång kisel diadem bör användas fixar anpassningen av elektroden att vägleda kanyl fot (I). (J) fotografi visar hur ringa elektroden och vägleda kanyl skaft. Det sista steget är att sätta en droppe harts eller lim på guide kanyl piedestal fastställande av kisel diadem till det (K). (L) monterade enheten redo att steriliseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fotografier av olika typer av enheter för mikrodialys-EEG hos råttor används (A) och ett fotografi av klippet sondhållaren (B) brukade dessa implantatanordningar. A guide kanyl (i grönt) ersätts av en mikrodialys kanyl vanligtvis 24 h innan experimentet. Den elektriska kontakten på enheten (första vänster användes för de inspelningar som beskrivs i detta manuskript) möjliggör fastsättning av kablar som bedriver elektrisk signal förstärkare och data insamling utrustning. Enheten är oskiljaktlig skallen av sövda råttor och inspelningar kan erhållas senare utan att orsaka smärta eller obehag i fritt bete råtta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Experimentell design. Veckan innan status epilepticus (SE) induktion, råttorna är implanterade med enheten. SE framkallas av pilokarpin och djur (om inte dialyseras och dödade på 24 h efter SE; råttor från akut grupp) är video övervakas i 5 dagar (blå linje), då video-EEG övervakas för att bedöma beslag frekvens och varaktighet i sina hem burar (gröna linjen). För mikrodialys experimentet övervakas den epileptiska och respektive icke-epileptiska kontroll råttor överförs till en annan EEG ställa in utrustat med cylinder burar i 24 h innan mikrodialys sessionen och fortfarande video-EEG (ljus gröna linjen). De vertikala röda linjerna representerar dialys sessionerna vid olika tidpunkter av epileptiska sjukdomsutvecklingen. De horisontella röda linjerna representerar de olika grupperna av epileptiska djur (och respektive icke-epileptiska djur), där pilen anger den sista dagen i mikrodialys och djurets dödsdag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. In vitro återvinning av två dialys sonder. Medelvärdet i vitro återhämtning (%) av aspartat och glutamat som använder två olika kommersiellt tillgängliga mikrodialys sonder (både begåvad med 1 mm långa dialyzing membran) på (A) 2 μL/min och (B) 3 µL/min flöde. Data är den medelvärde ± SEM 3 oberoende experiment kör i exemplar. Finns det inte statistiskt signifikanta skillnader mellan effektiviteten i olika sonder (Student är oparade t-test, p < 0,05). Använder ett flöde klassar 2 μL/min glutamat återhämtning ökade cirka 5% jämfört med 3 µL/min-flöde, således är långsammare flöde användes för mikrodialys experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Belysande EEG inspelningar från ventrala hippocampus paraoxystic aktiviteter som kan ses vid kronisk fas i kontroll och epilepsi råttor. (A) två representativa spår inspelade i två saltlösning behandlade icke-epileptiska råttor. (B) spår inspelade i två epileptiska råttor. Epileptiform utsläpp motsvarar klass 3 beteendemässiga anfall hos dessa råttor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Tid-jaga av effekten av kalium stimulering på glutamat release från råtta hippocampus. Representativa resultat av mikrodialys experimentet utförs i 6 kontroll (öppna cirklar) och 6 kronisk epileptiska råttor (svarta cirklar). Diagrammet visar de tidsmässiga förändringarna av dialysatet glutamat koncentration under mikrodialys experiment och vid hög 100 mM K+ stimulering. Tidpunkten för hög K+ stimulans (10 min) indikeras av det svarta fältet längst ner i diagrammet. Uppgifterna är den medel ± SEM 6 djur per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Illustration av kromatogram. Kända toppar är märkta. Rosa trace: kromatogrammet för Ringers lösning utan tillförts avsiktligt aminer efter OPA/5-ME derivatisering (blindprov). Blått spår: kromatogram av dialysatet provet efter derivatisering visar topparna av aminosyror: aspartat (tR 4.80 min), glutamat (tR 6,75 min) och glutamin (tR 9,19 min) och den topp av IS L-homoserine (2,5 µM, retentionstid, t R 9.83 min). Rött spår: kromatogrammet aspartat (2,5 µM) och glutamat (2,5 µM) i Ringers lösning. Azure och gul bakgrund av bilden står för mobil fas A (azure) och mobil fas B (gul) del som används för analyter eluering. En röd rektangel anges området (tR 10.41 min och ytterligare) visar topparna av okända ämnen och OPA nedbrytningsprodukter. Alla injektionsvolymer var 20 µL. Derivaten var separerade med en flödeshastighet av 0,8 mL/min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8. Representativ bild av kombinerad elektrod-probe placering inom ventrala hippocampus. (A) fotografi visar skrämma kvar av enheten spetsen i detalj (svart pil). (B) Schematisk illustration av elektrod-probe tip positioner inom implanterade ventrala hippocampus 12 råttor. Solid kvadraterna (vissa överlappande) ange korrekt lokaliserade sond-elektrod tips. Öppna rutor anger felaktigt lokaliserade sond-elektrod tips hos djur utesluts från studien (n = 3). Koronalt hjärnan skivor som innehåller sonder och inspelning webbplatser bearbetades efter experiment för histologisk analys. Siffrorna ovan bilden visar avståndet från Bregma (enligt Pellegrino et al. 1979 atlas råtthjärna; näsa bar + 5,0 mm, samordnar används: en -3,4 mm, L + 5,4 mm; P + 7,5 mm från dura). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Analyt | c (μmol/l) | Karlsson | q | r2 | LOD (pmol/l) |
| Glutamat | 0,25-2,5 | 5.215 | 1043.79 | 0,999 | 19,4 |
| Aspartat | 0,25-2,5 | 2,258 | 1994.72 | 0.998 | 31,7 |
Tabell 1. Rapporteringsgräns kännetecken för HPLC-metod som används vid bestämning av aminosyror. Koncentration utbud av standarder (c), lutning (k), avlyssna (q), determinationskoefficienten (r2) och detektionsgräns (LOD) som beskriver kalibreringen tomter erhålls med standardlösningar av glutamat och aspartat (0,25, 0,5, 1,0 och 2,5 µM ) och intern standard L-homoserine (2,5 µM) med den beskrivna HPLC-metoden med spectrofluorometric upptäckt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete visar vi hur en kontinuerlig video-EEG registrering tillsammans med mikrodialys kan utföras i en experimentell modell av TLE. Video-EEG inspelning tekniker används för att korrekt diagnostisera de olika faserna i sjukdomsförloppet hos djur och mikrodialys tekniken används för att beskriva de förändringar i glutamat release som uppstår i tid (inga ändringar har hittats för (aspartat i en tidigare publicerad studie2). Vi rekommenderar användning av en enda enhet/implantat att utföra dem både i varje djur för de skäl som diskuterats i inledningen.
När det finns tillgängligt, att radiotelemetry föredra till uppbundna system för kronisk EEG inspelning eftersom det minimerar störningar med beteende och minskar risken för skada och lidande för de djur54. Uppbundna EEG inspelningen är dock mycket billigare än telemetri.
I vårt laboratorium använder vi kontakterna till EEGEN inspelning system och mikrodialys slang parallellt, så att sladdar och slangar kopplas till två olika lekare. Detta är den mest kritiska frågan för dessa experiment: den sladdar och slangar tenderar att korsa ofta på grund av djurens rörelser. Därför använder vi kopplingar och slangar tillräckligt länge för att låta djuret jaga sin egen svans (ett beteende som vanligtvis observeras med kalium stimulering) eller falla ner och rulla under generaliserade epileptiska anfall. Det är tillrådligt att bekräfta ytterligare mikrodialys kanyler införas i deras guide av modellera, för att stärka deras kontakt med guide (ibland, mikrodialys kanyler är stötte mot väggarna i buren under generaliserade anfall och kan SLIP av). Däremot, är det lämpligt att hålla slangen så kort som möjligt, för att minimera fördröjningen mellan neurokemiska tid och samling. Detta är särskilt viktigt när samling perioderna är korta. I allmänhet mikrodialys slangen ska vara av tillräcklig längd och kapacitet att säkerställa att provtagningstiden överstiger inte tiden mellan dialys utlopp och samling. Det observerades att de lösta ämnen tenderar att sprida mer mellan vissa pluggar om slangen dödtiden är överlägsen den sampling rate55. Den experimentella döda tid/volymen av mikrodialys slangar bör därför minskas så mycket som möjligt och mycket exakt fast för att korrelera neurokemi data med djurets beteende. Slutligen är det viktigt att notera att både lekande och elektroder som tillsammans med kanyl för kombinerade EEG och mikrodialys studier är kommersiellt tillgängliga. Därför, om möjligt, ställa in EEG systemet med möjlighet att utföra mikrodialys experimenten.
Mindre rekommendationer är: (i) innan du börjar något experiment, kontrollera att EEGEN inspelning system eller mikrodialys ställa in fungerar korrekt och felsöka eventuella problem; Vi föreslår att ha en reserv ställa in redo (en annan pump med sprutor monterad på och avslutat av slangar fyllda med fungerande lösningar) när utför experimentet, samt ett tillräckligt antal redo att använda mikrodialys sonder för att ändra bruten Kära; (ii) när du överför djur in i fungerande EEG-mikrodialys buren är det bra att ha en andra person bistå och börjar förvärven; (iii) att göra säker på att den kolumn och autosampler nått lämpligt temperaturerna innan kromatografi; Dessutom använder standarder och konstruera kalibrering tomterna innan någon dialysatet prover injiceras på kolumnen kromatografiska; (v) när det behövs, försöka utveckla den kromatografiska eller annan analytisk metod för att mäta flera analyter på samma gång.
Förändringar i neurotransmission har konsekvenserna i många CNS sjukdomar (inklusive epilepsi) och det har varit ett stort intresse under årtionden att kvantifiera dessa förändringar under progression från en hälsosam till en sjuka fenotyp. Idag, tillåter bara några tekniker mätning av förändringar i signalsubstansen nivåer över dagar eller månader. Mikrodialys är en av dessa tekniker. I ett stort antal fall, som det beskrivs här, det är utfört i fritt rörliga djur och kopplad till konventionell offline analytiska analyser såsom högtrycksvätskekromatografi (HPLC) eller kapillärelektrofores (CE), med som det når 5-30 min temporal upplösning31,56. Klart, dessa provtagning intervall inte återspeglar den snabba signalsubstansen dynamics i närheten av synapser, men kan vara praktiskt för vissa långsiktiga mikrodialys program(t exsjukdomsutveckling eller drogen effekt studier) som kräver koppling neurokemiska, EEG och beteendemässiga data. Dock andra studier är främst rör mätning i realtid eller nära realtid förändringar i signalsubstansen övergång. För dessa, måste mikrodialysteknik förfinas att öka hastigheten på provtagning (därför minska provvolymer). Faktiskt, den klassiska mikrodialysteknik kritiseras ofta för sina fattiga temporal (minuter) och rumslig upplösning (konventionella sonden är mycket större än den synaptiska spalten)9,21,56, 57. men det är massa känslighet för analysmetoden kopplat till mikrodialys Vad avgör mikrodialys tidsupplösningen (dvs.dess upplösning är lika med den tid som krävs för att ha tillräckligt prov att upptäckas av en analytisk teknik56). Således, när mikrodialys producerar små mängder av prover, känsligheten för kvantifiering tekniker måste ökas. Hittills har följt sådana förbättringar i temporal upplösning av mikrodialysteknik 3 olika linjer. En av dessa representeras av miniatyrisering av kolumnerna och/eller detektion celler av klassiska HPLC-metoder; Dessa kallas UHPLC (ultra-hög prestanda HPLC) tekniker och tillåta för att uppnå 1-10 min tid resolution58,59,60. En annan metod är att en klassisk HPLC till masspektrometri (MS) eller tandemcykel (MS/MS) för multiplex analys av signalsubstanser i hjärnan dialysates. Kombinerade HPLC-MS analyser har en utmärkt känslighet och nå cirka 1-5 min tid resolution56,61,62,63. En tredje rad förbättringar finns i ändringar av kapillärelektrofores (CE). Om CE använder laser inducerad fluorescens upptäckt (CE-LIFD), gör det möjligt att bestämma submicromolar koncentrationer av olika signalsubstanser i nliter fraktioner erhålls varje 5 min55,64,65 eller ens på 10 s intervall56. En klar fördel som framträder ur UHPLCs eller avancerade CEs analytiska metoder är att provtagningen kan göras i fritt rörliga djur, att inte äventyra experiment där spontana beteende måste observeras och analyseras. Däremot, finns det metoder som tillåter hjärnan dialysatet provtagning på ens hundra millisekunder temporal upplösning (t.ex. enzymet reaktorn baserat on-line analyser eller droplet samling av dialysatet kopplat till MS tekniker), men dessa är vanligtvis används i återhållsam djur66 eller under narkos67,68,69, inte tillåter att par mikrodialys med beteendemässiga studier.
När man överväger den näst viktigaste svagheten i mikrodialys, dvs relativt låg spatial upplösning på grund av membran dimensioner (ofta ca 0,5 mm i diameter och 1-4 mm lång), ett alternativ kan vara microprobes utvecklat med lågt flöde push-pull-provtagning. Dessa sonder består av två silica kapillärer (av 20 µm ID och 200 µm OD) smält side-by-side och mantlade med en polymera slangar. Under experimentet, är dessa kapillärer perfusion vid mycket låga flöden, så att vätskan dras ut ur en kapillär och ett prov är Hämtad från den andra av samma flöde. Eftersom provtagning sker endast vid sondens spets, är den rumsliga upplösningen större än med sond för mikrodialys70. En annan möjlighet är att byta från miniatyriserade sonder till mikroelektrod arrayer (biosensorer) för realtid signalsubstansen utvärdering. Olika elektrokemiska tekniker (baserat huvudsakligen på voltametri eller amperometry) tillåta analyten provtagning mycket nära synapsen (micron skala) och i mindre än 1 s31,70,71. Dessa enheter kan mäta koncentrationen av flera analyter från flera regioner i hjärnan. De kräver dock även vissa förbättringar, till exempel att undvika artefakter och en relativt snabb försämring.
Med tanke på de senaste framstegen inom i vivo neurokemiska övervakning, det verkar troligt att olika sändare provtagnings kombineras i en sensor i en nära framtid. Arbetet på biochips provtagningssonder har redan börjat, och vi tror att ytterligare framsteg i mikrofabrikation teknik tillsammans med analytiska förskott ytterligare kommer att underlätta i vivo neurokemiska övervakning utredning. Vid denna tid förblir den konventionella mikrodialys korrelerad till EEG dock en giltig metod för många neurovetenskap tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Anna Binaschi, Paolo Roncon och Eleonora Palma för deras bidrag till manuskript publicerades i prioritet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml - tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml - diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
References
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
- Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
- Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
- Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
- Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
- Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
- Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
- Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
- Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
- Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
- Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
- Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
- Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
- Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
- Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
- Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
- Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
- Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
- Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
- Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
- Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
- Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
- Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
- Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
- Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
- Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
- Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
- Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
- Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
- Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
- Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
- Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
- Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
- Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
- Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
- Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
- Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
- Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
- Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
- Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
- Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
- Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
- Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
- Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
- Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
- Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
- Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
- Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
- Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
- Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
- Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
- Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
- Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).
