Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Microdialysis fareler serbestçe hareket EEG kayıtları sırasında eksitatör Amino asit

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

Burada, in vivo microdialysis EEG kayıtları ile birlikte epileptik ve sigara-epileptik sıçan ventral hipokampus glutamat ve aspartat sürümde analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ekstraselüler glutamat ve aspartat konsantrasyonu hastalık farklı aşamalarında ile ilişkili.

Abstract

Microdialysis nörolojik aktif maddeler içine belgili tanımlık beyin interstisyel yer davranışı ile ve/veya belirli bir patoloji (Örneğin, nöbetler sonucu ile difüzyon değişiklikler ilişkili olan bir iyi kurulmuş nörolojik tekniktir Epilepsi için). Epilepsi okurken, microdialysis teknik genellikle kısa vadeli veya uzun vadeli bile video-spontan nöbet sıklığını, önem, ilerleme ve kümeleme değerlendirmek için izleme elektroansefalografi ile (EEG) birleştirilir. Kombine microdialysis EEG birkaç yöntem ve araçları kullanımına dayanır. Burada, vivo içinde microdialysis ve sürekli video-EEG zaman içinde epilepsi bir sıçan modelinde Doğal Tarih, farklı aşamalarını monitör glutamat ve aspartat çıkış için kayıt yapılır. Bu kombine yaklaşım nörotransmitter sürümde değişiklikler eşleştirme belirli aşamaları hastalığı gelişme ve ilerleme sağlar. Amino asit konsantrasyon diyalizat sıvı kromatografi tarafından tespit edilmiştir. Burada, asıl önlem bir in vivo microdialysis sırasında almalı anahat ve yöntemleri açıklayan-EEG, stereotaksik cerrahi özellikle dikkat edin, Bazal ve yüksek potasyum uyarı sırasında microdialysis, derinliği ile Elektrot EEG kaydı ve yüksek performanslı sıvı kromatografi Analizi içinde diyalizat glutamat ve aspartat. Bu yaklaşım adapte olabilir uyuşturucu ya da hastalık çeşitli test etmek için değişiklikleri, aspartat ve glutamat beyin fizyolojik konsantrasyonları indüklenen. Uygun bir analitik tahlil durumu bağlı olarak, daha fazla istihdam EEG kaydı aynı anda farklı çözünen molekülleri test etmek için kullanılabilir.

Introduction

Biz sistematik olarak ekstrasellüler konsantrasyonları işlev bozukluğu glutamat aracılı eksitatör ve inhibitör neurotransmission temporal lob epilepsi (TLE) içinde spontan nöbetler sonuçlanan GABAergic içgörü sağlamak için izlenen GABA1 ve daha sonra glutamat ve aspartat2 fareler çeşitli noktalarda zaman-doğal hastalığının ventral hippocampus microdialysis tarafından düzeyde tabii ki, yani, gelişme ve ilerleme epilepsi sırasında. Biz çok doğru davranış, elektrofizyolojik ve histopatolojik değişiklikleri3,4 açısından hastalığı taklit eden TLE pilokarpin modeli içinde rats, avantaj aldı ve biz amino diyalizat konsantrasyonu korelasyon onun farklı aşamalarında asitler: akut faz epileptogenic hakaret, gecikme süresi faz, ilk spontan nöbet ve kronik phass5,6,7saat sonra. Hastalık aşama çerçeveleme uzun süreli video-EEG izleme ve hassas EEG ve spontan nöbetler klinik karakterizasyonu tarafından etkinleştirildi. Microdialysis teknik uygulama uzun süreli video-EEG bize TLE nevropatoloji için mekanik hipotezler evlenme izin izleme ile ilgili. Özet olarak, bu el yazması açıklanan teknik gelişme ve ilerleme hayvan modelinde epilepsi ile tanımlanmış beyin alanı içinde nörokimyasal değişiklikler eşleştirme sağlar.

Eþleþtirilmiþ cihazlar, microdialysis kanül için bitişik bir derinlik elektrot oluşan kez nerede nörotransmiterler, metabolitleri veya enerji yüzeylerde değişiklikleri için nöronal aktivite ilişkili olması epilepsi araştırma çalışmaları ve istihdam edilmektedir. Vakaların büyük çoğunluğu, serbestçe hayvanlar davranmak kullanılır ama benzer bir şekilde insanlar için Örneğin, derinlik elektrot soruşturma cerrahi8önce uygulanan pharmaco dayanıklı epileptik hastalarda da yapılabilir. EEG kaydı hem diyalizat toplama yapılabilir ayrı ayrı (bir yarımküre ve microdialysis elektrot yerleştirilmesiÖrneğin, yoklama diğer Yarımküre veya bile microdialysis yerine getirirken hayvanların bir grupta gerçekleştirme tek EEG hayvanların başka bir grupta). Ancak, elektrotlar probları için kaplin birden çok avantajları olabilir: stereotaksik cerrahi basitleştirir, doku hasarı sadece bir yarımküre için sınırlar (diğer bırakarak sağlam, histolojik araştırmalar denetimi olarak) ve bu sonuçları homogenizes aynı beyin bölgesi ve aynı hayvan--dan elde edilir.

Öte yandan, ev yapımı ise eşleşmiş microdialysis sonda-elektrot aygıt hazırlanması beceri ve zaman gerektirir. Bir piyasadan satın aldıysanız nispeten yüksek miktarlarda para harcayabilirsiniz. Ayrıca, ne zaman probları microdialysis (sonda ipuçları vardır genellikle 200-400 µm çapı ve 7-12 mm uzunluğunda)9ve EEG elektrotlar (elektrot ipuçları vardır genellikle faiz10beyin yapısını ulaşmak için 300-500 µm çapı ve yeterince uzun) birleştiğinde, takılı aygıt hayvanlar için zahmetli ve özellikle ne zaman o diyaliz pompa ve zor telli EEG kayıt sistemi ile bağlantılı olan kayıp olacak açıktır başın bir tarafında nispeten ağır ve hantal bir nesne temsil eder. Bu yönü daha zordur ve daha az microdialysis oturumları edinilmiş epileptik hayvanlarda alakalı. Uygun cerrahi teknik ve uygun ameliyat sonrası bakım birleşimsel microdialysis-EEG10,11, deneyleri için takip edilmelidir ve çok az hayvan rahatsızlık neden uzun süreli komponentlerde neden olur 12.

Avantajları ve microdialysis teknik sınırlamaları ayrıntılı olarak birçok nörologlar tarafından gözden geçirildi. Asıl avantaj diğer vivo içinde perfüzyon teknikleri (Örneğin, hızlı akış itme-çekme veya kortikal Kupası perfüzyon) üzerinden faiz13,14nispeten kesin bir alanı kapsayan sonda küçük çaplı olduğunu, 15. İkinci olarak, microdialysis membran doku ve perfusate arasında fiziksel bir bariyer oluşturur; Bu nedenle, yüksek moleküler ağırlık maddelerin değil çapraz ve analiz16,17ile müdahale değil. Ayrıca, doku perfusate18türbülanslı akış korunmaktadır. Başka bir önemli avantaj analit konsantrasyon perfusate maksimize etmek için perfusate akışını değiştirmek için olasılık var (yani, microdialysis süreci matematiksel olarak tanımlanabilir ve yüksek verim için değiştirilebilir örnekteki analit konsantrasyonları)19. Son olarak, teknik uyuşturucu veya farmakolojik aktif maddeler faiz dokusu içine demleyin ve müdahale20yerinde etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Öte yandan, microdialysis elektrokimyasal veya biyolojik sensörleri ile karşılaştırıldığında sınırlı çözünürlük vakit (genellikle daha fazla zaman örnekleri toplamak için gerekli nedeniyle 1 dk) vardır; doku hasarına neden olan invaziv bir tekniktir; sürekli konsantrasyon gradyanı nedeniyle membran perfusate faiz analit ile birlikte girer boşluk tüm çözünür maddelerin içinde nörokimyasal dengesini ödün vermez. Son olarak, microdialysis teknik son derece perfusate9,21,22,23 maddelerin miktar için istihdam analitik teknikler sınırlarını etkilenir . Yüksek performanslı sıvı kromatografi (derivatization orthophthaldialdehyde biyolojik örnekler glutamat ve aspartat analizi ile de doğrulanmış24,25,26 edildikten sonra HPLC) , 27 ve onun kapsamlı tartışma bu yazının kapsamı dışında ancak bu yöntem kullanılarak üretilen veri ayrıntılı olarak açıklanacaktır.

Düzgün ve perfusate bileşimi değişiklik yapmadan gerçekleştirildiğinde microdialysis nörotransmitter yayın bazal düzeyleri hakkında güvenilir bilgi sağlar. Bazal düzeyleri en büyük bölümünü büyük olasılıkla verici yayılma sinapslarda9sonucudur. Birçok durumda ekstra sinaptik alanda nörotransmitter basit örnekleme bir soruşturma hedefleri takip için yeterli olmadığı için microdialysis tekniği de sinir hücreleri uyarmak için ya da onları önemli mahrum için istihdam edilebilir fizyolojik iyonları K+ veya Ca2 +, uyandırmak veya nörotransmitter sürümü önlemek için gibi.

Yüksek K+ stimülasyon kez Nörobiyoloji nöronal aktivite uyanık hayvanlarda hem de birincil ve organotypic kültürlerde uyarmak için kullanılır. Sağlıklı bir merkezi sinir sistemi K+ (40-100 mM) yüksek konsantrasyonları ile pozlama çözümlere nörotransmitter28sızma çağrıştırır. Yanıt-e doğru yüksek K+ ek bir sürümde sağlama yeteneği bu nöronların epileptik hayvanlar1 ve diğer nörodejeneratif hastalıkları29,30tehlikeye olabilir. Benzer şekilde, Ca (Ca2 + ücretsiz çözümleri ventriküler tarafından elde edilen)2 + yoksunluğu kalsiyum-bağımlı kurmak için kullanılan çoğu nörotransmitter microdialysis tarafından ölçülen piyasaya. Bu genellikle Ca2 + bağımlı yayın nöronal kökeni ise Ca2 + bağımsız yayın kaynaklanan glia ama birçok çalışma tartışmalara Ca2 +anlamı üzerinde yükseltilmiş olduğunu inanılıyor-hassas ölçümleri Örneğin glutamat veya GABA9: böylece, olanak varsa, bu ikinci yüksek uzaysal çözünürlük ve elektrotlar sağlar sinapslarda31olarak yakın almak için microsensor çalışmalar, microdialysis çalışmaları desteklemek için tavsiye edilir.

Epileptik hayvanlarda Microdialysis çalışmaları ile ilgili çoğu elde edilen veriler video veya video-EEG nöbetler, yani, işaretler ve/veya belirtiler nedeniyle anormal geçici oluşumunun izleme üzerine itimat stres önemlidir aşırı büyük ve zaman uyumlu nöronal faaliyette beyin32. Deneme hazırlarken dikkate alınması gereken tedavi pilokarpin hayvanlarda electrographic vakalarının bazı özellikleri vardır. Spontan nöbetler sık EEG interictal sivri3 depresyonda etkinlik tarafından takip edilmektedir ve kümeleri33,34oluşur. Sahte işletilen epileptik olmayan hayvanlar nöbet benzeri aktivite35 sergileyebilirler ve bu nedenle EEG kayıtları değerlendirme için parametreler standart36 olmalı ve, eğer olanaklı, microdialysis oturumları zamanlaması iyi tanımlanmış olmalıdır. Son olarak, çok son raporlarında37 Uluslararası lig karşı epilepsi ve Amerikan epilepsi Derneği uzmanları tarafından özetlenen ilkeleri ve video-EEG denetim yetişkin kemirgen izlemek için metodolojik standartları takip önerilir ,38.

Burada, microdialysis glutamat ve aspartat epileptik hayvanlarda uzun süreli video-EEG kayıtları ve HPLC göre diyalizat onların analizi ile paralel olarak açıklayın. Bir en iyi sonuç için halletmem protokol kritik adımları vurgulamak olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler Ferrara kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Üniversitesi ve İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmış olan (yetkilendirme: DM 246/2012-B) Avrupa toplumlarında özetlenen yönergelere uygun olarak Konsey Yönergesi 24 Kasım 1986 (86/609/EEC). Bu iletişim kuralı özellikle sıçan beyin dialysates microdialysis oturumlarının epileptik ve epileptik olmayan sıçanlarda EEG denetimi altında elde glutamat ve aspartat tayini için ayarlanır. Burada açıklanan malzemelerin çoğunu kolayca bir laboratuvarında EEG kayıtları veya kullanan microdialysis için bu ile değiştirilebilir.

1. Microdialysis sonda-elektrot cihaz montajı

  1. 3-kanal iki bükülmüş elektrot (en az 20 kayıt elektrot boy kesme mm ve 10 cm uzun Topraklama elektrot ile) kullanın ve cihazın hazırlamak için bir rehber kanül çift. 3-kanal elektrot ve Kılavuzu kanül diyaliz 1A şekiliçinde için örnekler bkz:-1B.
  2. (Şekil 1 c) çıkarıp onun anahtarı an microdialysis sonda hayvan için (Şekil 1 d) metal Kılavuzu kanül kukla plastik kanül onun kaldırma hafifletmek için bir kaç kez kullanım öncesinde içine yerleştirin.
  3. Elektrot iki kez kayıt bükülmüş teller viraj (Şekil 1E-1F) Kılavuzu kukla kanül ile tel hizalayın ve elektrot uç (0,5 mm Kılavuzu kanül (şekil ipucu uzun olmak,rakam 1G) kesmek için 1 H) kullanarak dijital kumpas.
  4. 1 mm uzun silikon halkahalka hazır (OD 2 mm, kalınlık 0.3 mm; Şekil 1I) ve rehber kanül ucu ve bükülmüş elektrotlar ucu (Şekil 1J) Cımbız kullanarak silikon halkahalka yerleştirin. Hızlı hareket veya reçine (Şekil 1 K) polimer yapıştırıcı ile kanül Kaide rehber ayak düzeltebilirim. Şekil 1 L ve Şekil 2Atamamlanan aygıtları örneği bkz:.
  5. 4 h Turn cihazın üzerinde dört kat olarak her kenarlarından 1 h için ışığa maruz için antiseptik UV ışık altında Aygıt sterilize.
    Not: Birçok ev yapımı elektrotlar ve microdialysis sondalar benzer bir şekilde monte edilebilir. Yukarıda açıklanan implant için rats Başkanı aşağıdaki boyutları vardır: 7 mm genişlik x 5 mm Derinlik x 10 mm uzunluk üst ayaklı ayak; implant 11 mm uzunluğunda, çapı 600 µm ve tüm aygıt yaklaşık 330-360 mg ağırlık yolgösterendir. Zemin elektrot (i) bir yeterli uzunlukta kafatasında ameliyat sırasında sonraki kullanım için ve (ii) ne zaman hayvan öldürülür ve aseton içinde kalan diş çimento ile birlikte yeniden elde etmek belgili tanımlık aygıt overnigh bırakılırsa cihazın iki veya üç kez tekrar kullanılabilir t, öyle ki çimento mekanik olarak ayrıştırılmış ve aygıt yıkanmış ve tekrar sterilize.

2. stereotaksik cerrahi

  1. Stereotaksik aparatı ve yoklama klip sahibi (Şekil 2B) aseptik ve ağrısız ameliyat39,40,41çağdaş standartları takip cihazı implantasyon için kullanın.
    1. Yetişkin Sprague-Dawley rat ketamin/xylazine karışımı (43 mg/kg ve 7 mg/kg, IP) ile anestezi ve stereotaksik çerçeve düzeltebilirim. Anestezi derinliği zamanında kontrol etmek için izin verdiği için ilk ketamin/xylazine enjeksiyon isoflurane anestezi (Hava % 1.4; 1.2 mL/dk) ekleyin. Kürk hayvanın kafasında tıraş.
  2. İyot tabanlı çözüm aseptik cerrahi39için hazırlamak için % 70 etanol ve ardından tarafından baş cilt yüzeyi temizleyin.
    1. Öncelik (1.1-1.5) hazırlanan rehber kanül-elektrot aygıt aşağıdaki koordinatları kullanarak şu ventral hipokampus implant: burun bar + 5.0 mm, A-3, 4 mm, L + 4,5 mm, P + 6.5 mm bregma1,2. Stereotaksik cerrahi10,11,12standart teknikleri uygulayın.
    2. Ankraj vidaları kapsamaz sağlamak. Bu kolayca sonda sahibine hizalı olarak ne zaman stereotaksik aparatı montaj, aygıt için Kılavuzu kanül başından kavramak.
  3. Onları kafatası kemik (sol ve 1 vida sağ frontal kemik plakaları, Sol parietal içine 1 Vidalı ve interparietal kemik plakaları içine 1 Vidalı içine içine 1 Vidalı) içine vidalama en az dört Paslanmaz vidalar ile kafatası aygıta demir. Daha fazla her vida kafatası kemikleri düzeltmek için doku tutkal bir damla ekleyin.
    1. Yarım vidaların metakrilik çimento ile kapak. Bağlama çimento uyumu artırmak için kemik sığ oluklar yaparak teşvik.
  4. Cihazın ucunu beyin dokusu içine yerleştirilmiş bir kez yere elektrot tel vida veya uygun 3 twist. Tüm takılı vida ve diş çimento12,42,43cihazın kapağı.
  5. Hayvanlar ameliyat sırasında ve yaklaşık 1 h için bundan sonra kadar dik ve kafes hareket sınıf başkanı. Hipotermi önlemek için ısınma bir yastık üzerinde tutun. Yeniden elde etmek için en az 7 gün aygıt implantasyonu sonrası farelerin izin.
  6. Hayvanların en az bir kez her gün ağrı veya acı belirtileri için ameliyattan sonra 3 gün boyunca izlemek. Antibiyotik krem (viomisin %0,1) hayvanlarla vermek bir analjezik ve enfeksiyonu önlemek için kazıma yer yakın (tramadol 5 mg/kg, IP) ameliyat sonrası ağrı önlemek 3 gündür.

3. Temporal lob epilepsi indüksiyon pilokarpin ve hayvan deney gruplarına atama

  1. Ameliyat sonrası kurtarma bir hafta sonra hayvanlar rasgele gruplara atamak: (i) denetim hayvanlar pilokarpin alacaksınız araç ve (ii) epileptik hayvan alma. Kullanım hayvanlar nispeten yüksek bir dizi tüm pilokarpin fareler yönetilen bu yana epileptik grup için hastalık geliştirecektir.
  2. Methylscopolamine (1 mg/kg, SC) ve 30 dk bir doz pilokarpin (350 mg/kg, IP) durumu epileptikus (SE) ikna etmek için tek bir enjeksiyon sonra enjekte. Methylscopolamine ve kontrol fareler ve aracın (serum) enjekte et. Tüm IP idareleri için 25 G iğne ile 1 mL şırınga kullanın.
    1. Hayvan davranış nöbetler (vibrissa bacaklarda klonlama baş başını sallayarak 5 dk içinde hareketli) başlaması için görsel olarak kontrol ve sürekli olarak tüm vücut (SE) klon için 25 dakika içinde.
  3. Bir ölüm oranı yaklaşık % 25 ve yaklaşık 10 gün ortalama gizli döneminde diazepam (20 mg/kg, IP) yönetimi tarafından için başlangıç sonra SE 2 s tutuklayın. Gözlemlemek ve herhangi bir nöbet davranış başlangıç hemen sonra pilokarpin enjeksiyon kayıt ve en az 6 h için bundan sonra devam.
  4. Vermek hayvan tuz (1 mL, IP) 1 mL şırınga 25 G iğne ve sukroz çözüm ile (1 mL, PO) kullanarak 1 mL şırınga ve esnek beslenme 17 G iğne 2-3 gün sonra SE için kurtarma vücut kilo kaybı tanıtmak için kullanarak.
    1. İlk vücut ağırlığı pilokarpin SE (akut grubu 24 h nerede vücut ağırlık takibi mümkün değil SE sonra geldi) dışında çalışma sonraki ilk hafta içinde elde yapmak hayvanlar hariç.
  5. Post-SE hayvanlar rastgele farklı deneysel grupları (Şekil 3) atama: akut faz gecikme süresi (7-9 gün sonra SE), ilk spontan nöbet (yaklaşık 11 gün sonra SE) ve kronik dönem ((nerede microdialysis 24 saat sonra SE yer alır), «««başlar) yaklaşık 22-24 gün sonra SE, yani yaklaşık 10 gün sonra ilk nöbet. Spontan nöbetler oluşumu için hayvanları izlemek.
    Not: Epileptik sıçanlarda daha fazla deneyler için aşağıdaki içerme/dışlama ölçütleri kullanın: 1s içinde kasılan SE geliştirme sonra pilokarpin yönetim; SE ve doğru konumlandırma microdialysis sonda ve elektrot sonra da ilk hafta kilo.

4. epileptik davranışı izleme ve analiz

  1. Uzun vadeli epileptik davranışını izleme
    1. Yaklaşık 6 h pilokarpin Yönetim (yani, araştırmacılar tarafından doğrudan gözlem sonunda), hayvanlar temiz ev kafesler yerleştirin ve 24 saat video izleme başla.
    2. 5 gün kadar izleme, bir dijital video gözetim sistemi kullanarak 24 h video devam.
    3. 5. gün başlayan, fareler içinde onların ev dikdörtgen kafes hayvan zinciri EEG kayıt sistemine bağlanmak ve 24 saat video izleme devam edin.
    4. Küme parametreleri üzerinde Faraday kafesi (EEG sinyal her tek hayvan özgüllük göre her kanalda set güçlendirme faktörü) ve EEG sinyal gözlemleyerek başlangıç EEG satın alma dışında konumlandırılmış amplifikatör bağlanmamış tarafından üretilen kabloları. Kullanım örnekleme 200 Hz oranı ve düşük filtre kümesi için 0.5 Hz geçirin.
    5. Hayvan bir elin iki gergin parmaklarını arasında bir hayvanın kafa tutan ve diğer serbest el kullanarak elektrot Kaide bağlayıcılara aşağı vidalama kabloları bağlayın. Satın alma başlatın.
      Uyarı: Sinyal eserleri ücretsiz olduğundan emin olun. Ortak eserler büyük ölçüde ölçeğin aşan sivri vardır.
    6. Bir gün önce microdialysis deneme, hayvanları microdialysis için Pleksiglas silindir ile donatılmış gergin EEG sistemi içine aktarın. Hayvanlar ev kafes elektrot dizginlemek olmadan gelen bağlayıcılar kadar hayvan vidalama sistemi hayvan zinciri EEG bağlantısını kesin. Hayvan yüksek Pleksiglas silindir yerleştirin.
  2. Bir gün önce ve microdialysis oturumu sırasında epileptik davranışının izleme
    1. Faraday kafesi dışında konumlandırılmış amplifikatör geçiş. EEG yazılımını açın. EEG sinyal gözlemleyerek EEG edinme bağlanmamış kabloları ile üretilen Başlat.
    2. Hayvan bir elin iki gergin parmaklarını arasında bir hayvanın kafa tutan ve diğer serbest el kullanarak elektrot Kaide bağlayıcılara aşağı vidalama gergin EEG kayıt sistemi bağlayın. Yani EEG sinyal ölçeğinde bir büyütme faktörü (kazanç) her kanal amplifikatör elektrot sinyal tek hayvan göre ayarlayın. Yeni kafes (silindir) keşfetmek hayvan için en az 1 h araştırmacının doğrudan gözlem altında izin.
    3. Not: 24 microdialysis önce s deneme, fareler kısaca isoflurane Kılavuzu kanüller microdialysis sonda için geçiş için ile anestezi. Ne zaman onları EEG kayıt sistemine bağlanmak için anestezi an yararlanın.
    4. Kısaltmak veya hayvanın emtia göre sarkık kablo uzatmak. Kabloları hayvan hareketleri ve yalancı duruş ile karışmayın emin olun.
    5. Video kameralar doğru görüntü çerçeveleme için kontrol edin. Video-EEG kaydını Başlat seçimini yapın.
  3. Nöbetler ve EEG faaliyet tanımlaması
    1. Bir yazılım oyuncu video izlemek için kullanın. Film 8 kere gerçek zamanlı oyun daha hızlı ilerlemek ve (bkz: arka forelimb clonus ile hayvan veya hayvan yetiştirme ve forelimb clonus ile düşen) jeneralize nöbet individuate. Belgili tanımlık video yavaş ve hassas zaman başlangıç ve davranışsal nöbet sonuna unutmayın.
    2. İşlem jeneralize nöbetler sayılması tarafından veri video kayıtları 24 h içinde gözlenen ve onları nöbet sıklığı ve ele geçirme vakalarının 24 h içinde gözlenen tüm değerler anlamına süresi açısından ifade eder.
    3. EEG nöbetler yüksek frekans paroksismal etkinlik dönemleri tanımlamak (> 5 Hz) ile karakterize bir > 3 kat genlik artışı üzerinde temel ilerleme için en az 3 s2,44 sürer spike frekans ile veya benzer28. EEG yazılımı ham EEG kayıtları işlemek için kullanın. EEG izlemeler 1s kesirler bölünmüş. EEG izleme kesirler yazılım otomatik spike analiz için dosyaya kopyalayın.
    4. EEG yazılım ve önceden tanımlanmış parametreleri (4.3.3.) kullanarak EEG etkinliği verilerini analiz. Analiz hayvanlar grubu için görme engelli iki bağımsız araştırmacılar tüm video analizler yapmak. Sapma durumunda, onları birlikte bir fikir birliği45ulaşmak için verileri yeniden gözden olun.

5. Microdialysis

  1. Vitro sonda kurtarma
    1. Sonda onun koruyucu kol işleme üretici yönergelerine göre ilk kullanım için hazır olun.
    2. Deneme nüsha çalıştırın: 1 mL standartları (2.5 µM, glutamat) ve aspartat 2.5 µM karışımı içeren zil'ın çözeltisi ile yükleme üç 1,5 mL test tüpleri hazırlayın. Üç dolu 1.5 mL test tüpleri 37 ° C Blok ısıtıcı kümesine içine koymak ve karıştırıcı üzerinde konumlandırın.
      Not: Aynı standart çözümler Kromatografi kalibrasyonlar için kullanın.
    3. 1.5 mL test tüpleri parafin film ile mühür ve çapı yaklaşık 1 mm bir delik açmak için keskin cımbız tarafından ponksiyon.
    4. Sondayı almak ve parafin filmde yapılan delik takın. Membran en az 2 mm çözüm düzeyinin altında bırakın. Daha fazla sonda için 1,5 mL tüp tarafından parafin film düzeltmek.
      Uyarı: İpucu 1,5 mL tüp duvarlarını dokunmatik değil emin olun.
    5. Sonda giriş FEP-boru ve Borulama bağdaştırıcıları kullanarak infüzyon pompa monte şırıngayı takın. İsteğe bağlı olarak, kullanım iyi polietilenler boru 0,28 mm ID ve 0,61 mm OD ve renkli boru bağdaştırıcıları (kırmızı ve mavi boru bağdaştırıcıları) bağlantıları için delik.
    6. Pompa 2 µL/dk başlangıç ve çıkış ucunda görünür sıvı sağlar. Sonda çıkış 0.2 mL tüp FEP-boru ve Borulama bağdaştırıcıları kullanarak toplama bağlayın.
      Not: FEP-boru için tüm bağlantıları kullanın. İstenilen uzunlukta boru jilet kullanarak kesmek. Boru bağdaştırıcıları farklı renk giriş ve çıkış inceleyebilirsek için kullanın. 60 dk. onay kaçakları için çalıştırmak ve kabarcıklar hava pompası izin. Bunlar mevcut olmamalıdır.
    7. Pompa akış hızı 2 µL/dak için ayarla ve Boru çıkış tarafında örnekleri toplamaya başlar.
    8. Üç 30 dk perfusate örnekleri ve çözüm 1.5 mL tüp içinde üç eşit ses örnekleri toplamak. 1.5 mL test tüp her 30 min 1,5 mL tüp standart çözüm içine dalmış microsyringe kullanarak eşit birim numune al.
    9. Bir sonda kurtarma karşılaştırma iki farklı perfüzyon akış oranları kullanırken için pompa akış oranı 3 µL/dk (5.1.7) kurma (5.1.1-5.1.8) denemeyi tekrarlamak.
    10. Ne zaman tamamlanmak, pompa durdurmak ve boru distile su, % 70 etanol ile durulayın ve hava içine itin. Sonda temiz distile su ile dolu bir şişe saklayın. Soruşturma bu 2 µL/dk distile su önceki depolama ventriküler tarafından iyice yıkayın.
    11. Glutamat ve aspartat örneklerde konsantrasyonu Kromatografi tarafından analiz (detaylar aşağıda; 6.3).
    12. Kurtarma aşağıdaki eşitliği kullanarak hesaplar:
      Kurtarma (%) = (Cçözüm dialysedperfusate /C) x 100.
  2. Fareler serbestçe hareket Microdialysis oturumları
    1. Partiye hazırlık işlemleri: yoklama ekleme ve test, infüzyon pompası ayarı ve başlar
      1. Microdialysis sondalar üretici kullanım kılavuzuna göre ilk kullanım için hazırlamak ve onları zil'ın çözüm ile doldurun. Yaklaşık 10 cm FEP-boru uzun parçalar koparıp ve onları farklı renk boru bağdaştırıcıları kullanarak sonda giriş ve çıkış kanüller için bağlayın.
      2. Tüp tüm bağlantıları'nda ölü boşluk bağdaştırıcıları dokunduğundan emin olun.
      3. 5.2.1.3. microdialysis deneme önce 24 h kısaca isoflurane (havada % 5) hayvanla bir indüksiyon odasında yaslanmış kadar anestezi. Kukla kanül Cımbız kullanarak ve hayvanın kafası sıkıca tutarak onun Rehber'den kaldırın. Kılavuzu kanül dialyzing bir membran ile donatılmış microdialysis sonda eklemek ve firma daha fazla onların kılavuzda kil modelleme tarafından eklenen microdialysis kanüller.
        Uyarı: Ayıklanan koruyucu sonda kol duvarlar dokunmak sonda izin vermeyin.
      4. Hayvan Pleksiglas silindir içine koymak ve yeni ortam keşfetmek sağlar. Yukarıda açıklandığı gibi hayvan hayvan zinciri EEG kaydı sisteme bağlayın (4.2.2 ve 4.2.3 puan izleyin).
      5. Uyanık izleyin ve serbestçe hareket fare hareketleri ve sonda giriş 2.5 mL şırınga boru bağdaştırıcıları kullanarak zil'ın solüsyon içeren körelmenin 22 G iğne ile bağlayın. Zil'ın çözüm içinde zil'ın çözüm 10 1 mL çıkarma sonda itmek sürekli 2.5 mL şırınga pistonu iterek s. Çıkış üzerinde görünen sıvı damla olup olmadığını denetleyin. Sonda artık kullanıma hazırdır.
      6. FEP-boru için zil'ın çözüm bağdaştırıcılarla Tüp bağlı 2.5 mL şırınga doldurmak ve infüzyon pompa mount. Pompa 2 µL/dk başlatın. Gecede çalışmasına izin.
        Not: İstenen tüm FEP boru uzunluğu kullanın ama boru ölü hacim yüksek K+ stimülasyon başladığında bilmek ve miktar veri hayvan beynin nörokimyasal değişimler ile ilişkilendirmek için hesaplamak. Boru çalışma akışı altında oluşturulan hava kabarcığı bu sefer hesaplamak için kullanın.
    2. EEG kaydı ve potasyum stimülasyon sırasında örneklerinin koleksiyonu
      1. 3 h örnek koleksiyon (video-EEG kayıtları) başlangıcı önceki ele geçirme vakaları yokluğu doğrulayın ve microdialysis sırasında nöbet etkinliği izlemeye devam edin.
      2. Zil'ın çözüm ile doldurdu FEP-boru cannulated şırınga taşıyan pompa durdurun. Mount başka 2.5 mL şırınga ayarla pompa üzerine FEP-boru için 100 mM içeren bir değiştirilmiş zil'ın çözüm ile doldurdu bağdaştırıcıları boru ile K+ çözüm bağlı.
      3. Pompa 2 µL/dk başlatın ve izin vermek o koşmak. İçin daha hızlı dolum hortumunun pompa 5 µL/dk dolum zamanı için ayarlayın. Hava kabarcıkları olmaması için kontrol belgili tanımlık sistem. Tüp tüm bağlantıları'nda ölü boşluk bağdaştırıcıları dokunduğundan emin olun.
      4. Sonda Eğer kullanmak için hazır (5.2.1.5) açıklandığı gibi hayvan test.
        Not: Nedense prob çalışmıyor, değiştirin. Bu durumlar için birkaç hazır microdialysis sondalar microdialysis-EEG iş istasyonu kullanıma hazır tutun. Hayvan EEG kablolarını ayırın ve o kısa bir süre değişikliği gerçekleştirmek gerekirse isoflurane ile anestezi.
      5. Her hayvan ve çıkış ucunda sıvı damla görünümünü için beklemek soruşturma giriş kanül zil'ın çözüm ile dolu şırınga FEP tüp takın.
      6. Sonda çıkış koleksiyonunda test tüpüne yol açar FEP-boru takın. Delikli bir kap ile kapalı 0.2 mL tüp FEP tüp takın. Tüp bir parça modelleme kil ile sabitleme tarafından yerinde kalır emin olun.
      7. Örnekleri (sıfır örnek) sistem equilibrate toplamadan 2 µL/dk 60dk için pompa çalışmaya devam.
      8. Temel koşullar (normal zil'ın çözüm ile perfüzyon) altında 5 ardışık 30 dk diyalizat örnekleri (60 µL ilgili birim) toplamak. Örnekleri buza saklayın.
      9. Sıvı pompası (Tüp, yani, hava kabarcık zaman ölü hacmi bağlıdır) hayvanın kafası içine geçmek için gereken süreyi hesaplamak ve normal zil'ın solüsyon içeren şırıngalar için içeren şırıngalar gider FEP-tüp geçiş (100 mM K+) zil'ın çözüm şu anda pompa durdurmadan değiştiren. Hava kabarcıkları olmaması için kontrol belgili tanımlık sistem. 10 dakikadır çalıştırmak pompa izin.
        Uyarı: Yüksek K+ stimülasyon 10 dk içinde hayvanlar kendilerini frenetically taşımak ve genellikle çok sayıda ıslak köpek sallar mevcut eğilimindedir (denetim ve nöbet küme hayvanların) veya davranışsal nöbetler (epileptik hayvanlar), bu yüzden için müdahale için hazır kablolar ve boru büküm üzerinden korumak.
      10. 10 dk sonra tüp 100 mM K+ zil 's eriyik-e doğru normal zil'ın çözüm içeren şırıngalar üzerinden geçin ve çalıştırın pompa izin. Bu orada bir damla sıvı boru hattında bağlı sonunda olacak böylece pompa kapatmak çözüm değişiklikleri sırasında kapatmayın.
      11. Şu andan itibaren diyalizat içeren yüksek potasyum, yani, beşinci sonrası denge diyalizat toplandıktan sonra her 10 min (20 µL) diyalizat kesirler 1 h. toplamak 3 ek 30 dk diyalizat örnekleri için toplamak ve durdurmak pompa. Örnekleri buza saklayın.
      12. -80 ° C'de örnekleri deneyden sonra HPLC analiz kadar saklayın.
      13. Deneme microdialysis 3 gün üst üste akut (24 saat) ve tek bir microdialysis oturum 24 h SE sonra veya 24 saat içinde ilk spontan nöbet (Şekil 3) sonra gerçekleştiği ilk nöbet grup dışında için yineleyin.
      14. Her denemenin tamamlanması, anestezik aşırı doz hayvanla ötenazi ve beyin sonda ve elektrot yerleştirme doğrulanması için kaldırın.
  3. Post-microdialysis yordamları
    1. Kullanılan microdialysis sondalar distile su ile durulayın ve sonraki kullanım kadar temiz distile su ile dolu bir şişe içinde depolayabilirsiniz.
      Not: Yeniden kullanılan membran geçirgenliği artmış; sonda kurtarma tekrarlanan kullanımı önce kontrol edin.
    2. (Boru, konektörler ve şırınga) % 70 etanol tarafından takip distile su ile ayarlamak bütün microdialysis yıkayın. Etanol ile hava yerini ve steril bir ortamda küme depolama yapar.
    3. Bazal diyalizat örnekleri 20 µL kesirler bölmek ve tek bir 20 µL kesir amino asit bazal konsantrasyon analizi için kullanın. Mağaza-80 ° C'de kullanılıyorsa veya doğrulama analizi için kalan numune hacmi
    4. % 10 formalin beyinlerinde saptamak ve bunları parafin gömme1tarafından korumak. Coronally beyin dilimler halinde bölüm ve Hematoksilen ve eozin ile leke. Doğru prob ve elektrot yerleştirme1,2beynim inceleyin.
      Not: Soğutmalı 2-methylbutane beyni tamir ve-80 ° C'de saklamak Herhangi bir diğer kanıtlanmış sonda ve elektrot yolu görselleştirmek için izin veren sinir doku bölümleri boyama kullanın.

6. kromatografik analiz glutamat ve aspartat

  1. Ajan saptırma, hazırlık
    1. İlgili birimleri 20:1 (v/v) orthophthaldialdehyde reaktifi (OPA) ve 2-mercaptoethanol (5-ME) şişe içinde karıştırın. Şişeyi kap ve hava sıkı septum kullanarak kapatın.
      Uyarı: Kimyasal başlık altında çalışır.
    2. Girdap hazır çözüm ve pozisyona Ajan saptırma için Otomatik Örnekleyici içine koy.
  2. Diyalizat örnekleri hazırlanması
    1. Cam INSERT alt bahar ile 2 mL kahverengi Otomatik Örnekleyici şişe koymak. Bir toplu iş iş işlemde ölçülen tüm örnekleri için tüpleri hazırlayın.
    2. -80 ° C dondurucudan 20 µL diyaliz örnekleri almak ve bunları eritmek bildirin. Çözüm 1 µL kaldırmak ve iç standart (IS) 1 µL Ekle L-Homoserine (50 µM) için 19 µL örnek böylece örnek IS 2.5 µM içerir.. Diyaliz örnek 20 µL şişe cam INSERT içine pipet ve bir hava sıkı septum ile kapatın.
    3. Konumlarını örneklerinde etiketlemek için kromatografik yazılımını kullanarak Otomatik Örnekleyici içine örnekleri içeren şişeleri yerleştirin.
  3. Kromatografik analiz örnekleri glutamat ve aspartat konsantrasyonu belirlemek için
    1. Analizler spectrofluorometric algılama sıvı Kromatograf sistemiyle çalıştırın. Sonra 2 dk öncesi sütun derivatization 20 μL ile orthophthaldialdehyde/5-mercaptoethanol 20:1, (v/v) örnek 20 μL için ekledi amino asitler algılamak.
    2. Sistem amino asit analizi için hazırlayın. Otomatik örnekleyici, pompa, degasser, dedektörü ve kontrol birimi ile birlikte bilgisayar geçiş.
    3. Siphons mobil faz içeren şişelerde sokmak ve çözümleme için kullanılacak kromatografik pompa Kanal Temizleme.
    4. Sütun üzerinde baskı kontrol mobil faz akışını artırmak için başlatın (Örneğin, 0.2 mL/dk başlatmak ve çalışma akışı elde kadar ek 0.2 mL/dk her 5 dk akışını artırmak). Let çalışma çalıştırmak sistem akış 0.8 mL/dk'ya sütun equilibrate en az 1 h.
      Uyarı: Dengesiz basınç sistemdeki hava varlığını gösterir. Basınç 25 MPa aşmaması gerekir.
    5. Kazanç, yüksek hassasiyet ve uyarma ve emisyon dalga boylarında bulmak-e doğru 345/455 ayarlamak nm anılan sıraya göre. Dedektör sinyal (AUTOZERO) sıfırlayın.
    6. Kromatografik yazılımını kullanarak, yöntem araç olarak gönderin. Şimdi, Kromatograf ölçmek hazır olmalıdır.
    7. Diyalizat örnekleri ayrı, diyalizat örnekleri yanı sıra standartlarına uygun kromatografik sütun (0.25 µM – 2.5 µM aspartat ve glutamat zil'ın çözümünde) standart çivili. Kromatografik yöntemi kalibre ve herhangi bir diyaliz örnekleri analiz önce algılama ve miktar sınırları kurmak.
    8. Tek analiz etkinleştirmek veya Kromatografi yazılım kullanılarak analiz örnekleri dizisini oluşturmak ve sırası çalıştırın.
      Uyarı: Birden fazla boş örnek ve diyalizat örnekler dizisi içinde farklı standart örnekleri yöntemi doğruluğu kontrol edebilmek için çalıştırın.
    9. Bir kez chromatograms iktisap, kromatografi yazılımı ile çözümlemek. Faiz doruklarına entegrasyon kalibrasyon Arsa denetleyin. En yüksek yükseklik veya en yüksek alan miktar için kullanın.
    10. Örnek kayıt işlemi bittiğinde sütun ve sistem ile organik bir çözücü (Örneğin, % 50 Asetonitril Ultrasaf Su) içindeki yaşlanma ve kalıp büyümesini önlemek için doldurun.
    11. Sistemi kapat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sonda kurtarma

(Yani, eşit bir şişe çözüm hacmi içeriğinde yüzdesi olarak perfusate ortalama amino asit içeriği) ortalama kurtarma 15.49 ± %0,42 2 μL/dk ve glutamat için 3 μL/dk 6,32 ± 0.64 akış hızında ve bir akış hızında 2 %0,36 14.89 ± oldu μl/dak ve 10.13 ± 0,51 3 μL/dk cuprophane membran sonda kullanırken aspartat için. Poliakrilonitril membran prob kullanılıyorsa, kötü kurtarma 13.67 ± %0,42 2 μL/dk ve glutamat için 3 μL/dk 6,55 ± 1,07 akış hızında ve 14.29 ± %0.62 2 μL/dk ve aspartat için 3 μL/dk 8.49 ± 0,15 akış hızında idi (Şekil 4A-4B). Şekil 4Aaçıkça görüldüğü gibi yavaş akış hızı (2 μL/dk) her iki prob dialyzing performansını artırır. Birini bir akış hızı 2 μL/dak derin cuprophane donatılmış membran sonda deneyler için kötü kurtarma (bile yoksa önemli ölçüde) bu akışı oran her iki analitler için ve deneysel süreklilik (Bu sondalar nedeniyle daha yüksek olduğu için seçilen GABA öncelik1' analiz etmek için kullanılmıştır).

Nöbetler geliştirme ve hastalık ilerleme durumu epileptikus sonra

Davranışsal ve EEG ele geçirme vakaları, kendi değerlendirme, izleme tüm hayvanlarda gelişme ve ilerleme bu TLE hastalığının onaylamak için bu çalışmada istihdam yapıldı.

3 diazepam kullanarak h sonra kesildi, sağlam kasılan SE, 25±5 dk sonra pilokarpin enjeksiyon oluştu. O zaman, bütün hayvanlar onlar Görünüşe göre iyi idi ve sürekli video-EEG yok spontan nöbetler ilk 9 gün içinde oluştuğunu doğrulamak için ya da ilk spontan nöbet için sırasıyla belirlemek için izlenen olduklarını bir gecikme süresi durumuna girdi gecikme süresi ve ilk nöbet grubu. İlk spontan nöbet 11.3 ± SE sonra 0.6 gün oluştu (± SEM, yani n = 21). Bundan sonra nöbetler kümelerde oluştu ve zamanında ağırlaştırılmış. Geç kronik faz (gün SE sonra 55-62) epileptik fareler 3.3±1.2 tecrübeli (± SEM, yani n = 12) her gün nöbetler jeneralize. Hastalığın net bir ilerleme oldu. Çok, ama tüm EEG nöbetler, davranışsal nöbet aktivitesi ile denk. Şekil 5B yaklaşık 500 ms öncesi ve davranışsal nöbetler sırasında gözlendi kaydedilen paroksismal epileptiform aktivite göstermektedir. Şekil 5A de, Sigara-epileptik fareler denetim izlerini gösterir.

Amino asitlerin microdialysis perfusate ve potasyum bulunan temsilcisi bazal değerlerini glutamat sürümü uyarılmış

Kronik epileptik Rat (0,87 ± 0,06 µM) bulundu bazal glutamat konsantrasyonu kontrolü hayvanlarda (0,59 ± 0,03 µM; denetimler; tek yönlü ANOVA ve öğleden hoc Dunnett'ın vs p < 0,05 test) önemli ölçüde daha yüksektir. Kronik Sara (0.31 ± 0,04 µM) ve uyarılmış epileptik olmayan hayvanlarda (0.30 ± 0,05 µM) Bazal veya yüksek K+ aspartat konsantrasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı. Ayrıntılar2için orijinal makalesine bakın. Glutamat fareler doğrultusunda diğerleri tarafından benzer bulundu bunlar denetiminde bildirilen bazal düzeyde çalışmalar (yani, hakkında 2 µL/dk akış ve 2 mm etkili uzunlukta membranlarda kullanırken 0,75 µM)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Ancak, birçok farklı faktöre microdialysis, örneğin etkili uzunluğu sonda ve kesilmiş membran sonuçlarını etkileyebilir.

Yüksek K+-glutamat yaklaşık 60 dakika içinde kronik epileptik rats (Şekil 6) ve yaklaşık 30 dk içinde kontrol fareler için ek bir sürümü uyarılmış. Ayrıntılar2için orijinal makalesine bakın. Görülen saat dersten görüldüğü gibi microdialysis 10 dk zaman çözünürlüğü hayvan her iki gruplar halinde bulunan glutamat sürümdeki farklarını yakalamak için yeterli idi.

HPLC kalibrasyon ve sınırları

Verileri kalibrasyon eğrileri glutamat ve aspartat ve iç Standart L-homoserine standart çözümler elde edilen temel alınarak hesaplanmıştır. Nörotransmitter glutamat ve aspartat perfusates konsantrasyonu mutlak değerler (µmol/L) ifade edildi. Her kalibrasyon komplo çözümler glutamat ve aspartat dört toplama düzeyleri (her düzeyde beş çoğaltır) Analizi tarafından inşa edilmiştir. Regresyon katsayıları kalibrasyon araziler için hesaplanan: y k= x + nerede x L-homoserine (IS) için glutamat ve aspartat konsantrasyonu oranı ve y L-homoserine () için glutamat ve aspartat karşılık gelen en yüksek alan oranı q, IS). Katsayısı (r2) hesaplanır. HPLC Yöntem uygulanabilirliği sınırları içinde vardı; miktar alt sınırı Standart kalibrasyon eğrisi ve miktar amino asit analitler için kalibrasyon, en kullanılan yoğun olarak üst sınırı en düşük konsantrasyon olarak sırasıyla belirlendi. Algılama (LOD olarak) sınırını da hesaplanır. Bu değerlerden bazıları Tablo 1' de belirlenen. Bir modeli kromatografik boş örneği, örnek ve toplanan diyaliz örnek yukarıda açıklanan yöntem ile elde edilen standartları Şekil 7' de gösterilir.

Sonda yerelleştirme

Doğru ventral hippocampus Microdialysis sonda ve kayıt elektrot implante edildi ve doğru yerleştirme doğrulandı. Sadece nerede implantasyon sonuna kadar 500 mikron (bkz. Şekil 8) stabilize koordinatlarından uzak olduğunu hayvanların Analize dahil edilmiştir.

Figure 1
Şekil 1. Adım adım hazırlık cihazın implante olması. (A) 3-Kanal 10 cm kadar microdialysis cihaz montajı için gerekli sağ sol ve Kılavuzu kanül onun koruyucu kol içinde elektrot Topraklama elektrot. (B). çıplak elektrot ve Kılavuzu kanül ayrıntılı. Kaldırmak (C) ve (D)--dan ve içine birkaç kez için kukla onun plastik metal Kılavuzu kanül kolaylığı çıkışından bir kez hayvanın beynine implante eklemek için ilk adımdır bakın. İkinci adım diyaliz Kılavuzu kanül (E, F) için uyumlu hale getirilmesi için iki kez bükülmüş kayıt elektrot viraj etmektir. (G) elektrot ucunu 0,5 mm metal Kılavuzu kanül ucu uzun olmak kesmek gerekir. (H) hassas dijital kumpas kullanarak kesme için kontrol edin. Daha sonra yaklaşık 1 mm uzun silikon halkahalka kanül ayak (I) Kılavuzu için elektrot hizalamasını düzeltmek için kullanılmalıdır. (J) elektrot halka ve kanül şaft rehber nasıl gösteren fotoğrafı. Son adım bunu (K) Silikon halkahalka tamir kılavuzu kanül kaide üzerine reçine veya tutkal bir damla koymaktır. (L) monte aygıt sterilize edilecek hazır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Fotoğrafları için microdialysis-EEG sıçanlarda kullanılan cihazların farklı türlerde (A) ve (B) bu cihazlar implant için kullanılan sonda klip sahibi fotoğrafı. (A) Kılavuzu kanül (yeşil içinde) microdialysis kanül tarafından genellikle deneme önce 24 saat değiştirilir. Cihazın elektrik bağlantısı (ilk sol bu el yazması açıklanan kayıtları için kullanıldı) amplifikatör ve veri toplama ekipman için elektrik sinyali kuralları kablo eki verir. Aygıtın ameliyatla imzalat fareler kafatası için bağlı ve kayıtları daha sonra ağrı veya rahatsızlık neden olmadan serbestçe fareler davranıyor temin edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Deneysel tasarım. Bir hafta önce durum epileptikus (SE) indüksiyon, fareler cihazın implante. SE indüklenen pilokarpin ve hayvanlar tarafından (değilse diyaliz ve 24 h sonra SE; geldi akut grubundan fareler) 5 gün (mavi çizgi) izlenen video, daha sonra video-EEG nöbet sıklığı ve süresi içinde onların ev kafes (yeşil hat) değerlendirmek için izlenen vardır. Microdialysis deneme için fareler microdialysis oturum önce 24 h kafeslerde silindir ile donatılmıştır ve hala video-EEG kurmak başka bir EEG aktarılır epileptik ve ilgili olmayan-epileptik kontrolü (ışık yeşil hat) izlenir. Dikey kırmızı çizgiler diyaliz seans farklı noktalarda zaman-epileptik hastalık gelişimi temsil eder. Yatay kırmızı çizgiler burada oku microdialysis son gün ve gün hayvanın ölüm gösterir farklı grupları epileptik hayvanlar (ve ilgili olmayan-epileptik hayvanlar) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. İki diyaliz problar kurtarılması vitro . Vitro kurtarma (%) iki farklı piyasada bulunan microdialysis problar (her ikisi de 1 mm uzun dialyzing membran ile donatılmış) kullanarak glutamat ve aspartat (A) 2 μL/dak ve (B) 3 µL/dk akış hızı demek. SEM 3 bağımsız deneyler çalıştırmak triplicates içinde ortalama ± verilerdir. Çeşitli probları verimliliğini arasında istatistiksel olarak anlamlı farklar değildir (öğrenci unpaired t-testi, p < 0,05). Bir akış hızı 2 μL/dak glutamat kurtarma pompalama 3 µL/dk'ya göre %5 oranında artış kullanarak, böylece daha yavaş akış hızı microdialysis deneyler için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Kronik faz kontrolü ve epileptik sıçanlarda görüldüğü gibi paraoxystic faaliyetlerinin ventral hipokampus açıklayıcı EEG kayıtları. (A) iki temsilcisi izlemeler iki serum fizyolojik tedavi sigara-epileptik Rat kaydetti. (B) izleri de, iki epileptik fareler kaydetti. Bu sıçanlarda sınıf 3 davranış Konvülziyonlu epileptiform deşarj karşılık. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Zaman-ders potasyum stimülasyon farenin hipokampus glutamat sürümü üzerinde etkisi. Temsilcisi microdialysis deney 6 kontrol (açık dairelerden) ve 6 kronik epileptik fareler (siyah daireler) gerçekleştirilir ve. Grafik diyalizat glutamat konsantrasyonu microdialysis deneyleri esnasında ve yüksek 100 mM K+ stimülasyon sırasında geçici değişiklikler gösterir. Yüksek K+ uyarıcı (10 dakika) zaman grafiğin alt siyah çubuğunda belirtilir. Veri grubu başına 6 hayvanların anlamına gelir ± SEM vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7. Çizimi chromatograms. Bilinen doruklarına etiketlenir. Pembe izleme: kromatografik zil'ın çözüm OPA/5-ME derivatization (boş örnek) sonra kasıtlı olarak eklenen aminler olmadan. Mavi izleme: kromatografik amino asitler doruklarına gösterilen derivatization sonra diyalizat örneği: aspartat (tR 4.80 dk), glutamat (tR 6.75 dakika) ve glutamin (tR 9,19 dk) ve en yüksek IS L-homoserine (2.5 µM, tutma zamanı, t R 9.83 dk). Kırmızı izleme: kromatografik Standart zil'ın çözüm (2.5 µM) glutamat ve aspartat (2.5 µM). Masmavi ve sarı arka plan resim standları için mobil faz A (azure) ve mobil analitler elüsyon için kullanılan B (sarı) bölümü faz. Kırmızı bir dikdörtgen alan belirtilen (tR 10.41 min ve daha fazla) bilinmeyen maddeler ve OPA bozulma ürünleri doruklarına gösterir. Tüm enjeksiyon birimleri 20 µL vardı. Türevleri 0.8 mL/dak debi ayrı kaldık Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8. Temsili resim ventral hipokampus içinde kombine elektrot-sonda bulma. (A) fotoğraf ayrıntılı (siyah ok) aygıt ipucu bıraktığı korkutmak gösterir. (B) 12 fareler implante ventral hipokampus içinde elektrot-sonda uç konumları şematik gösterimi. (Bazı çakışan) katı kareler doğru yerelleştirilmiş sonda-elektrot ipuçları gösterir. Açık kareler göstermek yanlış yerelleştirilmiş sonda-elektrot ipuçları çalışma hariç hayvanlarda (n = 3). Probları içeren ve siteleri kaydetmeye koronal Beyin dilimleri histolojik analizler için deney sonrası işlendi. Yukarıdaki resimde sayıların mesafe Bregma göster (koordinatları göre Pellegrino vd. 1979 atlas sıçan beyin; burun bar + 5.0 mm kullanılan: bir-3.4 mm, L + 5.4 mm; P + dura üzerinden 7.5 mm). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Analit c (μmol/m) k q r2 LOD (pmol/m)
Glutamat 0.25-2,5 5.215 1043.79 0.999 19,4
Aspartat 0.25-2,5 2.258 1994.72 0.998 31.7

Tablo 1. HPLC yöntemi amino asitler belirlenmesi için kullanılan miktar özellikleri. Kalibrasyon açıklayan çeşitli standartları (c), yamaç (k), kesme noktası (q), katsayısı (r2) ve sınır algılama (LOD olarak) olan araziler konsantrasyonu elde glutamat ve aspartat standart çözümlerle (0.25, 0,5, 1,0 ve 2.5 µM ) ve iç Standart L-homoserine (2.5 µM) spectrofluorometric algılama ile açıklanan HPLC yöntemiyle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, gösterdiğimiz microdialysis ile birleştiğinde sürekli video-EEG kaydı TLE deneysel bir model içinde nasıl gerçekleştirilebilir. Video-EEG kayıt teknikleri farklı aşamalarında hayvanlarda hastalık progresyon doğru olarak tanınabilmesi için kullanılır ve microdialysis tekniği (herhangi bir değişiklik için bulunmuştur sürede oluşan değişiklikleri glutamat sürümdeki açıklamak için kullanılır aspartat daha önce yayımlanmış çalışma2). Bunları gerçekleştirmek için tek bir aygıt/implant kullanımı her hayvan ikisinde giriş bölümünde açıklanan nedenlerle önerilir.

Bu davranışı ile etkileşimler en aza indirir ve zarar riski ve sıkıntı hayvanlar54için azaltır zaman kullanılabilir, radiotelemetry kronik EEG kaydı için hayvan zinciri sistemleri için tercih edilmelidir. Ancak, hayvan zinciri EEG kaydı telemetri çok daha ucuz.

Bizim Laboratuvar EEG öyle ki teller ve makaronlar iki farklı swivels için eklenen kayıt sistemi ve microdialysis paralel olarak, boru bağlayıcılara kullanın. Bu bu deneyler için en kritik durum: tel ve kablo kanalları hayvan hareketleri nedeniyle sık sık çapraz eğilimindedir. Bu nedenle, konektörler ve boru yeterince kendi kuyruğunu (genellikle potasyum stimülasyon ile gözlenen bir davranış) takip veya aşağı düşer ve jeneralize epileptik nöbetler sırasında rulo hayvanın izin için kullanın. Bu daha da onların rehber Rehberi (kanüller kafes duvarlara karşı jeneralize nöbetler sırasında çarpmış ve olabilir bazen, microdialysis ile temas güçlendirmek için kil, modelleme tarafından eklenen microdialysis kanüller firma tavsiye edilir SLIP kapalı). Öte yandan, boru nörokimyasal saat koleksiyonu saat arasındaki gecikme en aza indirmek mümkün olduğunca kısa tutmak için tavsiye edilir. Toplama süreleri kısa olduğunda bu özellikle önemlidir. Genel olarak, microdialysis boru yeterli uzunluk olmalıdır ve örnekleme zaman emin olmak için kapasite diyaliz çıkış ve koleksiyon arasındaki süreyi fazla olamaz. Solutes boru ölü süre için örnekleme hızı55üstün ise tıkacı arasında daha yaygın eğilimi gözlenmiştir. Bu nedenle, deneysel ölü zaman/hacim microdialysis boru mümkün olduğunca azaltılmış ve çok hassas nörokimyasal veri hayvanın davranış ile ilişkilendirmek için belirlenen. Son olarak, swivels ve elektrotlar kombine EEG ve microdialysis çalışmaları için kanül ile birleştiğinde ticari olarak mevcut olduğunu unutmamak gerekir. Bu nedenle, mümkün olduğunda, EEG sistemi ile microdialysis deneyler gerçekleştirmek için seçeneğini ayarlayın.

Küçük öneriler vardır: (i) herhangi bir deneme başlamadan önce sistem ve/veya kurmak microdialysis kayıt EEG çalışıp ki düzgün denetleyin ve herhangi bir sorun; sorun giderme Biz bu öneririz bir rezerv hazır (başka bir pompa monte edilmiş ve çalışma çözümleri ile doldurdu hortumunun tamamlandı şırınga ile) ayarlandığında deneme gerçekleştirme yeterli sayıda microdialysis kullanıma hazır yanı sıra probları kırık değiştirmek için olanlar; (ii) hayvan çalışma EEG-microdialysis kafesin içine transfer ederken yardım ve satın almalar başlayan ikinci biri olduğu yararlıdır; (iii) yapmak emin sütun ve Otomatik Örnekleyici Kromatografi önce; uygun sıcaklıklarda ulaştı Ayrıca, standartlar kullanır ve herhangi bir diyalizat örnekleri kromatografik sütunu enjekte önce kalibrasyon araziler oluşturmak; (v) gerektiğinde, kromatografik veya aynı anda birden fazla analitler ölçmek için diğer analitik yöntem geliştirmeye çalışın.

Neurotransmission değişiklikler (epilepsi dahil olmak üzere) birçok CNS bozukluklarında vardır ve hastalıklı bir fenotip için sağlıklı bir ilerleme sırasında bu değişiklikleri ölçmek için on yıl boyunca büyük bir ilgi olmuştur. Bugün, sadece birkaç teknik değişiklikler nörotransmitter düzeyleri ölçüm gün veya ay üzerinde izin verir. Microdialysis bu teknikleri biridir. Burada, açıklanan benzer vakalar çok sayıda içinde bu hayvanlar serbestçe hareket gerçekleştirilen ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) veya kapiller Elektroforez (CE), gibi geleneksel çevrimdışı analitik deneyleri için hangi ulaşır ile birleştiğinde 5-30 Min zamansal çözünürlük31,56. Açıkça, bu örnekleme aralığı dinamikleri çevresinde synapses, ama gerektiren bazı uzun vadeli microdialysis uygulamaları için (Örneğin, hastalığı geliştirme veya ilaç etkisi Araştırmaları) uygun olabilir hızlı nörotransmitter yansıtmıyor kaplin nörokimyasal, EEG ve davranışsal veri. Ancak, diğer çalışmalar öncelikle gerçek zamanlı ölçme ile ilgili veya gerçek zamanlı nörotransmitter değişimler yakın serbest bırakmak. Bunlar için microdialysis tekniği (Bu nedenle örnek birimleri azalan) örnekleme hızını artırmak için rafine olması gerekir. Gerçekten de, klasik microdialysis tekniği kez zavallı zamansal (dakika) ve uzaysal çözünürlük (geleneksel sonda Sinaptik yarık çok daha büyük) eleştirdi9,21,56, 57. ancak, öyle analitik yöntem kitle duyarlılığını birleştiğinde microdialysis için ne microdialysis zaman çözünürlüğü belirler (yani, çözünürlüğü bir analitik tarafından algılanması için yeterli örnek olması için gereken süreye eşit Teknik56). Böylece, microdialysis örnekleri küçük miktarlarda ürettiği zaman miktar teknikleri duyarlılığını artırılması gerekiyor. Bugüne kadar 3 farklı çizgiler microdialysis teknik zamansal çözünürlük böyle gelişmeler izledi. Bunlardan birini minyatür sütun ve/veya klasik HPLC yöntemleri algılama hücreleri tarafından temsil edilir; Bunlar UHPLC (ultra-performansı HPLC) teknikleri olarak adlandırılır ve 1-10 dk zaman çözünürlük58,59,60ulaşmak için sağlar. Kütle spektrometresi (MS) veya tandem (MS/MS) beyin dialysates nörotransmitter multiplex çözümlenmesi için bir klasik HPLC çift başka bir yaklaşımdır. Kombine HPLC-MS deneyleri ve mükemmel bir hassasiyet var hakkında 1-5 dk zaman çözünürlük56,61,62,63ulaşmak. Üçüncü bir satır iyileştirme kapiler Elektroforez (CE) değişiklikler bulunmaktadır. CE kullanır lazer floresans algılama (CE-LIFD) indüklenen, her 5 dk55,64,65 elde nanoliter kesirler çeşitli nörotransmitter konsantrasyonları submicromolar tayini sağlar hatta ' 10 s aralıkları56. UHPLCs veya gelişmiş CEs analitik yaklaşımlar ortaya açık bir avantaj örnekleme serbestçe hayvanlar içinde spontan davranış gözlenen analiz yapılmalı ve deneyler ödün değil, hareket yapılabilir olduğunu. Öte yandan, beyin diyalizat örnekleme bile yüz milisaniye, zamansal çözünürlük (Örneğin, enzim reaktör on-line deneyleri veya damlacık topluluğu diyalizat MS teknikleri için birleştiğinde dayalı) izin veren yöntem vardır, ama bunlar. genellikle ölçülü hayvanlar66 veya davranışsal çalışmaları ile çift microdialysis için izin vermiyor genel anestezi67,68,69altında kullanılır.

Microdialysis, Yani, nispeten düşük uzamsal çözünürlük (genellikle yaklaşık 0.5 mm çapında ve 1-4 mm uzunluğunda) membran boyutları nedeniyle, alternatif ikinci önemli zayıflığı göz önünde bulundurarak microprobes düşük akım ile geliştirilebilir itme-çekme örnekleme. Bu sonda kılcal (Toplam 20 µm kimliği ve 200 µm OD) yan yana erimiş ve polimerik bir boru ile kaplanmış iki silis oluşur. Deneme sırasında bu kılcal damarlar çok düşük akış oranları, öyle ki sıvı dışında bir kılcal çekilir ve bir örnek aynı akış hızı diğer alınır periosteum. Örnekleme sadece sonda ucunda oluştuğundan, uzaysal çözünürlük microdialysis70için sonda ile büyüktür. Kırılan probları elektrot dizilerin (biyosensörler) gerçek zamanlı nörotransmitter değerlendirme için geçiş yapmak için başka bir olasılık olabilir. (Esas voltammetry veya amperometry göre) farklı elektrokimyasal teknikler analit örnekleme synapse (mikron ölçek) çok yakın ve daha az--dan 1 s31,70,71izin. Bu aygıtlar birden fazla beyin bölgesi üzerinden birden çok analitler konsantrasyonu ölçebilirsiniz. Ancak, ayrıca örneğin eserler ve nispeten hızlı bir bozulma önlemek bazı iyileştirmeler gerektirir.

Vivo nörokimyasal izleme en son gelişmeler göz önüne alındığında, bu büyük olasılıkla farklı verici örnekleme yöntemleri bir sensör yakın gelecekte birleştirilir gibi görünüyor. Microfabricated örnekleme probları çalışmalarına başladı ve inanıyoruz microfabrication teknolojileri analitik gelişmeler ile birlikte daha fazla ilerleme içinde vivo nörokimyasal izleme soruşturma daha da kolaylaştıracaktır. Şu anda, ancak, birçok nörolojik uygulama için geçerli bir yöntem için EEG korelasyon geleneksel microdialysis kalır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Anna Binaschi, Paolo Roncon ve Eleonora Palma öncelik sırasında yayınlanan el yazmaları katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

Tags

Nörolojik sayı: 141 microdialysis glutamat aspartat epilepsi pilokarpin modeli stereotaksik cerrahi potasyum stimülasyon elektroansefalografi sıvı kromatografi
Microdialysis fareler serbestçe hareket EEG kayıtları sırasında eksitatör Amino asit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Falcicchia, C.,… More

Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter