Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Микродиализом возбуждающих аминокислот во время записи ЭЭГ в свободно перемещающихся крысы

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

Здесь мы описываем метод для в vivo микродиализом для анализа аспартата и глутамата релиз в вентральной гиппокампе эпилептические и не эпилептический крыс, в сочетании с записи ЭЭГ. Внеклеточной концентрации и глутамата, аспартата могут быть соотнесены с различных стадиях болезни.

Abstract

Микродиализом представляет собой метод устоявшихся нейробиологии, который коррелирует с изменениями неврологически активных веществ, распространение в мозг интерстициального пространства с поведением или с конкретным результатом патологии (например, изъятия для лечения эпилепсии). При изучении эпилепсии, микродиализом техника часто сочетается с краткосрочной или даже долгосрочные видео электроэнцефалография (ЭЭГ мониторинг оценить спонтанное захват частоты, тяжести, прогрессирование и кластеризации). Комбинированные микродиализом ЭЭГ основана на использовании нескольких методов и инструментов. Здесь мы провели в vivo микродиализом и непрерывной видео ЭЭГ запись монитора глутамата и аспартат отток со временем, на различных этапах естественной истории эпилепсии в мышиной модели. Этот комбинированный подход позволяет сопряжения изменения в версии нейромедиатора с конкретными этапами развития болезни и прогрессии. Амино кислоты концентрации в диализате определяется жидкостной хроматографии. Здесь мы описываем методы и структура, основные меры предосторожности один следует принимать во время микродиализом в vivo -ЭЭГ, особое внимание стереотаксической хирургии, базальную и высокой калия стимуляции во время микродиализом, глубина запись электрода ЭЭГ и высокой производительности жидкостной хроматографии анализ аспартата и глутамата в диализате. Этот подход может быть адаптирована для тестирования различных болезней или наркотиков индуцированной изменения физиологической концентрации аспартата и глутамата в головном мозге. В зависимости от наличия соответствующих аналитических assay он может далее использоваться для тестирования различных растворимых молекул при найме запись ЭЭГ в то же время.

Introduction

Чтобы обеспечить понимание функциональных обесценение глутамат опосредованной возбуждающих и ГАМК ингибирующее синапсах, что приводит к спонтанной изъятий в височной эпилепсии (TLE), мы систематически контролироваться внеклеточной концентрации ГАМК1 и позже уровнях глутамата и аспартат2 микродиализом брюшной гиппокампа крысы в различное время естественной болезни курса, т.е., во время развития и прогрессирования эпилепсии. Мы воспользовались TLE пилокарпин модели крыс, которая имитирует болезни очень точно с точки зрения поведения, электрофизиологических и гистопатологические изменения3,4 и мы коррелированных диализате концентрацию аминокислот кислоты на его различных этапах: острой фазы после эпилептогенных оскорбление, задержка фазы, время первой спонтанной захват и хронический phass5,6,7. Обрамление фазы заболевания был включен в долгосрочный видео ЭЭГ-мониторинг и точные ЭЭГ и клиническая характеристика спонтанные судороги. Применение методики микродиализом, связанные с долгосрочной видео ЭЭГ-мониторинг позволил нам предложить механистический гипотезы для TLE невропатологии. Таким образом метод, описанный в этой рукописи позволяет сопряжения нейрохимических изменений в области определенных мозга с развития и прогрессирования эпилепсии в животной модели.

Спаренных устройств, состоящий из глубины электрода, сопоставленные к микродиализом канюлю, часто используются в научных исследований эпилепсии, где изменения нейротрансмиттеров, их метаболитов или энергетических субстратов должна быть соотнесена активности нейронов. В подавляющем большинстве случаев он используется в свободно поведение животных, но он может также проводиться в Аналогичным образом людьми, например, в Фармако стойкие эпилептические больных, перенесших глубина электрода расследование до хирургии8. Как запись ЭЭГ, так и диализате коллекция может быть выполнена отдельно (например, имплантировать электроды в одном полушарии и микродиализом зонда в другом полушарии или даже выполнение микродиализом в одной группе животных во время выполнения единственной ЭЭГ в другой группе животных). Однако, сцепка электроды зондов может иметь несколько преимуществ: Это упрощает стереотаксической хирургии, ограничивает повреждения тканей только одно полушарие (с другой стороны, оставляя нетронутыми, как элемент управления для гистологического исследования) и homogenizes результаты как эти получены из того же региона мозга и то же самое животное.

С другой стороны подготовка спаренных микродиализом зонд электрод устройства требует навыков и время если это домашнее. Один может потратить относительно большие суммы денег, если приобретен на рынке. Кроме того, когда микродиализом зонды (пробники, как правило 200-400 мкм в диаметре и длиной 7-12 мм)9и ЭЭГ электродов (электродов советы, как правило, 300-500 мкм в диаметре и достаточно долго, чтобы достичь структуры мозга интерес10) в сочетании, навесные устройства представляет объект относительно тяжелые и громоздкие на одной стороне головы, которая является неприятной для животных и склонны быть потеряно, особенно когда он подключен к диализа насос и система записи ЭЭГ-проволоки. Этот аспект является более актуальным в эпилептические животных, которые трудно справиться и менее адаптивный микродиализом сессий. Надлежащих хирургических методов и соответствующих послеоперационный уход может привести длительное имплантатов, которые вызывают минимальный дискомфорт животных и должно осуществляться для комбинаторной микродиализом ЭЭГ экспериментов10,11, 12.

В деталях были рассмотрены преимущества и ограничения метода микродиализом многие неврологи. Его основное преимущество над другими в vivo перфузии методов (например, быстрый поток двухтактный или корковые Кубок перфузии) является небольшой диаметр зонда, которая охватывает относительно точной области интереса13,14, 15. Во-вторых микродиализом мембрана создает физический барьер между ткани и perfusate; Таким образом высокомолекулярный вес вещества не пересекаются и не мешают анализу16,17. Кроме того ткань защищен от турбулентного потока perfusate18. Другим важным преимуществом является возможность изменить поток perfusate для максимальной концентрации аналита в perfusate (т.е., процесс микродиализом может быть также определена математически и может быть изменен приносить высоко концентрации аналита в образце)19. Наконец метод может использоваться на настаиваться наркотиков или фармакологически активных веществ в ткани интерес и определить их воздействие на сайте вмешательства20. С другой стороны микродиализом имеет ограниченное разрешение время (обычно более 1 мин из-за времени, необходимого для сбора проб) по сравнению с электрохимическими или биологические датчики; это инвазивный метод, который вызывает повреждение тканей; это компрометирует нейрохимических баланс в пространстве вокруг мембраны из-за непрерывного градиент концентрации всех растворимых веществ который входит perfusate вместе с аналита интерес. Наконец метод микродиализом во многом зависит от ограничений аналитических методов, используемых для количественной оценки веществ в perfusate9,21,22,23 . Высокая производительность жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после деривации с orthophthaldialdehyde для анализа глутамата и аспартат в биологических образцах был хорошо проверенных24,25,26 , 27 и его широкое обсуждение выходит за рамки этой рукописи, однако данные, полученные с помощью этого метода будут описаны подробно.

При выполнении должным образом и без изменений состава perfusate, микродиализом может обеспечить надежную информацию о базальный уровень нейромедиатора релиз. Самая большая часть базальных уровней скорее всего является результатом распространения передатчика от синапсы9. Потому, что во многих случаях простой выборки нейромедиатора в загородный синаптического пространства не является достаточным для достижения целей расследования, метод микродиализом также могут быть использованы для стимулирования нейронов или лишить их важных физиологические ионов K+ или Ca2 +, для того чтобы вызвать или предотвратить освобождение нейромедиатора.

Высокий K+ стимуляция часто используется в нейробиологии стимулировать активность нейронов не только спать животных, но и в начальных и organotypic культур. Экспозиции здоровой центральной нервной системы для решения с высокой концентрацией K+ (40-100 мм) вызывает измеряем нейротрансмиттеров28. Эта способность нейронов для предоставления дополнительного выпуска в ответ на высокий K+ может быть нарушена в эпилептические животных1 и в других нейродегенеративных заболеваний29,30. Аналогично Ca2 + лишения (получено perfusing Ca2 + бесплатные решения) используется для установления кальций зависимых выпуск большинства нейротрансмиттеров, измеряется микродиализом. Считается, что Ca2 + зависимых релиз является нейрональных происхождения, тогда как Ca2 + независимого релиза исходит от глии, но многие исследования подняли споры над смыслью Ca2 +-чувствительных измерения например глутамата или ГАМК9: таким образом, если это возможно, рекомендуется для поддержки микродиализом исследования с микропроцессоров исследований, поскольку эти последние имеют более высоким пространственным разрешением и электродов позволяет получить ближе к синапсы31.

Что касается микродиализом исследований в эпилептические животных важно подчеркнуть, что данные, полученные от большинства из них полагаются на видео или видео ЭЭГ мониторинг судорог, то есть, переходных вхождения признаки или симптомы из-за ненормального чрезмерное или синхронной активность нейронов в мозге32. Есть некоторые особенности электрографические изъятий в пилокарпин лечить животных, которые следует учитывать при подготовке эксперимента. Спонтанные судороги следуют депрессии активности с частыми ЭЭГ межприступная шипы3 и происходят в кластеры33,34. Шам эксплуатируемых животных не эпилептическими припадками, могут демонстрировать захват как деятельность35 и поэтому параметры для записи ЭЭГ оценки должны быть стандартные36 , и, если возможно, должны быть четко определены сроки проведения сессий микродиализом. Наконец мы настоятельно рекомендуем следующие принципы и методологических стандартов для видео ЭЭГ-мониторинг управления взрослых грызунов изложенные экспертами Международная лига против эпилепсии и американского общества эпилепсии в своих последних докладах37 ,38.

Здесь мы описываем микродиализом глутамата и аспартат параллельно с долгосрочной записи видео ЭЭГ в эпилептические животных и их анализ в диализате ВЭЖХ. Мы будем делать упор критические шаги протокола, один должен заботиться о для наилучшего результата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены Университетом Феррара институциональный уход животных и использование Комитета и итальянским министерством здравоохранения (авторизация: д.м. 246/2012-B) в соответствии с руководящими принципами, изложенными в европейских сообществ Директива Совета от 24 ноября 1986 (86/609/ЕЕС). Этот протокол специально приспособлен для определения глутамата и аспартат в dialysates мозга крысы, полученные под контролем ЭЭГ микродиализом сессий в эпилептические и не эпилептический крыс. Многие из описанных здесь материалы могут быть легко заменены которые одно использует в своей лаборатории для записи ЭЭГ или микродиализом.

1. Ассамблея микродиализом зонд электрод прибора

  1. Использование 3-канальный витой два электрода (с по крайней мере 20 мм, Длина электрода, регистрирующий реза и 10 см, длиной электродом) и пара его руководство канюля для подготовки устройства. Смотрите примеры 3-канальный электрода и руководство канюля для диализа в Рисунок 1A-1В.
  2. Удалить (рис. 1 c) и вставить (рис. 1 d) металла руководство канюли в Макетные пластиковую канюлю несколько раз перед использованием для того, чтобы облегчить ее удаление в момент его выключатель для микродиализом зонд в животное.
  3. Согнуть скрученные провода регистрации электрода в два раза (Рисунок 1E-1F) с целью выравнивания провода с Макетные канюля руководства и вырезать электрода (Рисунок 1 g), чтобы быть 0,5 мм больше, чем кончик руководство канюля (Рисунок 1 H) с помощью цифровой штангенциркуль.
  4. Подготовьте кружочком кремния длиной 1 мм (диаметр 2 мм, толщина 0,3 мм; 1I рисунок) и вставьте кончик руководство канюлю и кончик витой электродов в кремний кружочком с помощью пинцета (Рисунок 1J). Это исправить на подножия руководства канюля пьедестал с полимерным клеем быстрых действий или смолы (рис. 1 K). Смотрите пример завершенных устройств на рисунке 1 Л и рисунок 2A.
  5. Стерилизуйте устройство под бактерицидной УФ света за 4 ч. перевернуть прибор четыре раза так как каждый из ее сторон подвергается воздействию света на 1 ч.
    Примечание: Многие домашние электродов и микродиализом зонды могут быть собраны подобным образом. Руководитель выше описанных имплантат для крыс имеет следующие размеры: ширина 7 мм x 5 мм глубина x длиной 10 мм от верхней пьедестал мыс; кончик имплантата составляет около 11 мм в длину, 600 мкм в диаметре и все устройства весит около 330-360 мг. Устройство может использоваться два или три раза, если (i) достаточную длину электрода земли остается на череп во время операции для последующего использования и (ii) когда животное погибает, и Чапдаркуль устройства, восстановленные вместе с стоматологического цемента, которую он оставил в ацетоне t, такой, что цемент могут быть механически дезагрегированные, и устройство мыть и стерилизовать снова.

2. стереотаксической хирургии

  1. Используйте стереотаксического аппарата и зонд клип держатель (рис. 2B) для имплантации устройства после современных стандартов для асептических и безболезненной операции39,40,41.
    1. Анестезировать взрослых крыс Sprague-Dawley кетамин/Ксилазина смесью (43 мг/кг и 7 мг/кг, и.п.) и исправить ее на Стереотаксическая рама. Добавьте изофлюрановая анестезии (1,4% в воздухе; 1,2 мл/мин) первоначальный кетамин/Ксилазина инъекции как позволяет контролировать глубину анестезии во времени. Брить шерсть на голова животного.
  2. Тампоном поверхности кожи головы, йод-решения на основе следуют подготовить его для асептических хирургии39на 70% спирте.
    1. Имплантировать устройство канюля электрод руководство, подготовленный в приоритет (1.1-1.5) в правом вентральной гиппокампа, используя следующие координаты: нос бар + 5.0 мм, A – 3,4 мм, L + 4,5 мм, P + 6,5 мм для bregma1,2. Выполните стандартные методы стереотаксической хирургии10,,1112.
    2. Убедитесь, что она не распространяется на анкерные болты. При монтаже на стереотаксического аппарата, понять устройство для головы канюля руководство, как это может быть легко выровнены держателю зонд.
  3. Якорь устройство черепа с по крайней мере четыре нержавеющие винты, завинчивания их в кости черепа (1 винт в левом и 1 винт в правой лобной кости пластины, 1 винт в левой теменной и 1 завинтите инков костных пластин). Добавьте каплю клея ткани для дальнейшего исправления каждый винт на кости черепа.
    1. Покрывают половину резьбы с метакриловой цемента. Содействие связывание цемента, делая мелкие канавки в кости увеличить присоединения.
  4. После того, как кончик устройства располагается в ткани мозга, твист проволока земли электрода около 3 анкерные болты. Охватывать все подключенные винты и устройства с стоматологического цемента12,42,43.
  5. Мониторинг животных во время операции и около 1 h после до вертикально и передвигаться в клетку. Держите их на площадку потепления избежать гипотермии. Разрешить крыс для восстановления для по крайней мере 7 дней после имплантации устройства.
  6. Мониторинг животных по крайней мере один раз в сутки 3 дня после операции для признаков боли или страданий. Дать животных с антибиотик крем (0,1% гентамицином) недалеко от резаная сайт для предотвращения инфекции и болеутоляющие (трамадол 5 мг/кг, и.п.) для 3 дней, чтобы предотвратить послеоперационные боли.

3. височная эпилепсия индукции пилокарпин и назначение животных экспериментальных групп

  1. Через неделю после операции восстановления, животных случайным образом назначать группы: (i) контроля животных, получение транспортного средства и (ii) эпилептического животных, которые будут получать пилокарпин. Использование пропорционально большее количество животных для эпилептического группы, поскольку не все из пилокарпин крыс разработает болезни.
  2. Вводить дозу methylscopolamine (1 мг/кг, s.c.) и 30 мин после однократного введения пилокарпин (350 мг/кг, и.п.), чтобы вызвать эпилептический статус (SE). Придать methylscopolamine и для управления крыс транспортного средства (физиологического раствора). Используйте 1 мл шприц с иглой 25G для всех администраций и.п.
    1. Визуально проверить животных, чтобы начать поведенческих судороги (перемещение пришла в течение 5 мин, кивая головой, клонирование конечностей) и в течение 25 минут, чтобы клонировать непрерывно все тело (SE).
  3. Арест SE 2 ч после начала иметь смертности примерно на 25% и средний латентный период приблизительно 10 дней администрацией диазепама (20 мг/кг, и.п.). Наблюдать и записывать любой захват поведение начиная сразу после инъекции пилокарпин и продолжаться по крайней мере 6 часов после этого.
  4. Дать животных солевой раствор (1 мл, и.п.) с использованием 1 мл шприц с иглой и сахароза решения 25G (1 мл, ЗЗ) с использованием 1 мл шприц и гибкие кормления 17G иглы для 2-3 дня после SE для содействия восстановлению потери веса тела.
    1. Исключите животные, которые не достигают первоначального веса в течение первой недели после пилокарпин SE от исследования (за исключением острой группы убили 24 ч после SE, где вес тела следить не возможно).
  5. Назначить пост SE животных случайно в различных экспериментальных групп (рис. 3): острая фаза (где микродиализом проходит 24 ч после SE), задержка (7-9 дней после SE), первый спонтанное захват (приблизительно через 11 дней после SE) и хронические периода ( начинается около 22-24 дней после SE, т.е. приблизительно через 10 дней после первого захвата). Мониторинг животных для возникновения спонтанных изъятий.
    Примечание: Используйте следующие критерии включения/исключения для дальнейших экспериментов в эпилептические крыс: развитие судорожных SE в течение 1 ч после приема пилокарпин; увеличение веса в первую неделю после SE и правильное позиционирование электрода и микродиализом зонда.

4. эпилептические поведение мониторинг и анализ

  1. Долгосрочный мониторинг эпилептические поведения
    1. Примерно в 6 ч после приема пилокарпин (то есть, в конце прямого наблюдения исследователей), место животных в чистый дом клетки и начать мониторинг видео 24 h.
    2. Продолжить мониторинг до 5 день, с использованием системы цифрового видеонаблюдения видео 24 h.
    3. Начало в день 5, подключите в их дома прямоугольные клетки крыс привязной системе записи ЭЭГ и продолжить мониторинг видео 24 h.
    4. Параметры усилителя, расположены за пределами клетки Фарадея (набор коэфф на каждом канале в зависимости от специфики ЭЭГ сигнала каждого одиночного животного) и начало ЭЭГ приобретение наблюдения ЭЭГ сигнал производства несвязанных набор кабели. Использование выборки частота 200 Гц и фильтр низких частот набор фильтров до 0,5 Гц.
    5. Соединить кабели, держа голову животного между двумя вытянутыми пальцами одной руки и завинчивания вниз разъемы на постаменте электрода, используя другой свободной животного. Начните приобретение.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Убедитесь, что сигнал бесплатно артефактов. Общие артефакты являются шипы, значительно превышает масштаб.
    6. За день до микродиализом эксперимент, перевести животных в привязанный система ЭЭГ с оргстекла баллоны для микродиализом. Отсоедините от ЭЭГ, привязывая систему дома клетке, щуря разъемы от электрода без удержать животное животных. Поместите животное в цилиндры высокого оргстекла.
  2. Мониторинг эпилептические поведения в день до и в ходе сессии микродиализом
    1. Включите усилитель, расположены вне клетки Фарадея. Откройте программное обеспечение ЭЭГ. Начало, приобретение ЭЭГ, наблюдая ЭЭГ сигнала производится несвязанных кабелей.
    2. Подключение к системе привязанный ЭЭГ записи, держа голову животного между двумя вытянутыми пальцами одной руки и завинчивания вниз разъемы на постаменте электрода, используя другой свободной животного. Установите коэффициент усиления (прибыль) на каждый канал усилителя согласно электрода сигнал одного животного, таким образом сигнал ЭЭГ в масштабе. Пусть животное исследовать новые клетки (цилиндр) для по крайней мере 1 час под прямым наблюдением исследователя.
    3. Примечание: 24 ч до микродиализом эксперимент, крысы кратко под наркозом с изофлюрановая для переключения руководство канюли для микродиализом зонда. Воспользуйтесь преимуществами момент, когда они находятся под наркозом, чтобы подключить их к системе записи ЭЭГ.
    4. Сократить или продлить поникающие кабеля согласно товарной животного. Убедитесь, что кабели не мешают животного движения и позы лежа.
    5. Проверьте наличие правильного образа обрамлять видеокамер. Начните запись видео ЭЭГ.
  3. Идентификация изъятий и ЭЭГ активности
    1. Использование программного обеспечения игрок смотреть видео. Выделите фильм 8 раз быстрее, чем игра в реальном времени и индивидуализация обобщенных изъятий (см. животное задней с Клонус передних конечностей или животных воспитания и падения с Клонус передних конечностей). Замедлить видео и запишите точное время начала и окончания поведенческих захвата.
    2. Процесс данные путем подсчета числа обобщенных изъятий в 24 h видео записей и выразить их захват частоты и длительности как средние значения всех изъятий, наблюдается в 24 ч.
    3. Определить объем изъятий ЭЭГ как периоды пароксизмальной активности высокой частоты (> 5 Гц) характеризуется > вывозимому увеличение амплитуды над базовой с прогрессированием всплеска частоты, который длится минимум 3 s2,44 или Подобные28. Используйте программное обеспечение ЭЭГ для обработки raw записи ЭЭГ. Разделить ЭЭГ следы на 1 ч фракций. Скопируйте ЭЭГ фракций трассировки в файл для программного обеспечения автоматического Спайк анализа.
    4. Анализ данных о деятельности ЭЭГ, используя предопределенные параметры (4.3.3.) и ЭЭГ программного обеспечения. Осуществлять все видео анализ в двух независимых следователей, слепым для группы анализируемого животных. В случае расхождения сделать их пересмотреть данные вместе, чтобы достичь консенсуса45.

5. микродиализом

  1. В vitro восстановления зонд
    1. Подготовьте зонд для его первого использования согласно инструкциям производителя, обработка в свои защитные рукава.
    2. Запуск эксперимента в трех экземплярах: подготовить три 1,5 мл пробирок, их загрузки с 1 мл раствора Рингера, содержащие смесь стандартов (2,5 мкм глутамата) и 2,5 мкм аспартат. Помещается три загрузки 1,5 мл пробирок в блок отопителя набор до 37 ° C и поместите его на мешалки.
      Примечание: Используйте те же стандартные решения для хроматографии калибровок.
    3. Печать 1,5 мл пробирок с парафином фильм и проколам, острые щипчики сделать отверстие около 1 мм в диаметре.
    4. Возьмите зонда и вставьте его в отверстие в фильме парафина. Погружайте мембраны по меньшей мере 2 мм под уровень раствора. Исправьте далее зонд до 1,5 мл пробирку, парафин фильм.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Убедитесь, что кончик не касайтесь стен 1,5 мл пробирку.
    5. Подключите зонд входе к шприцу, установленный на инфузионный насос, с помощью адаптеров FEP-трубы и трубки. При необходимости использование тонкой родила полиэтиленовые трубы ID и 0,61 мм OD 0,28 мм и цветных трубок адаптеры (красный и синий шланги адаптеры) для подключений.
    6. Запустить насос 2 мкл/мин и пусть появляются на кончике выход жидкости. Подключите выход зонд к 0,2 мл, собирая пробирку с помощью адаптеров FEP-трубы и трубки.
      Примечание: FEP-труб используйте для всех соединений. Вырежьте нужную длину труб с помощью лезвия бритвы. Использование адаптеров труб разного цвета на входе и выходе зонда. Пусть насос для 60 минут проверить на наличие утечек и пузырьков воздуха. Они не должны присутствовать.
    7. Насос установите как для потока скорость 2 мкл/мин и начать собирать образцы на выходе трубы.
    8. Соберите три пробы 30 мин perfusate и три равный объем раствора в 1,5 мл пробирку. Брать пробы равный объем от 1,5 мл пробирку каждые 30 мин, с использованием microsyringe, погружается в стандартное решение в 1,5 мл пробирку.
    9. Повторите эксперимент (5.1.1-5.1.8) Настройка насос для потока скорость 3 мкл/мин (5.1.7) иметь сравнение зонд восстановления при использовании двух различных перфузии скорости потока.
    10. Когда закончите, остановите насос и промойте трубы с дистиллированной водой, этанол 70% и подтолкнуть воздуха в нем. Храните зонд в пробирку с чистой дистиллированной водой. Тщательно ополосните зонд, perfusing его в 2 мкл/мин дистиллированной водой до хранения.
    11. Анализ концентрации глутамата и аспартат в пробах методом хроматографии (см. детали ниже; 6,3).
    12. Вычислите восстановления, используя следующее уравнение:
      Восстановление (%) = (C perfusate/cдиализ решение) x 100.
  2. Микродиализом сессий в свободно перемещающихся крысы
    1. Препаративные процедуры: зонд вставки и тестирования, инфузионный насос установки и начать
      1. Подготовка микродиализом зонды для первого использования согласно производителя в руководстве пользователя и заполнить их с раствор Рингера. Вырезать около 10 см длинные куски FEP-труб и подключить их к входным и выходным отверстием канюли зонд, с помощью адаптеров трубки разных цветов.
      2. Убедитесь, что трубы затрагивает адаптеры с не Мертвое пространство всех соединений.
      3. 5.2.1.3. 24 ч до микродиализом эксперимент, анестезировать кратко животное с изофлюрановая (5% в воздухе) в камеру всасывание пока лежачие. Удалите Макетные канюля от руководства его с помощью пинцета и твердо удерживая голову животного. Щуп микродиализом, наделенных dialyzing мембраны, в руководстве канюлю и фирма далее микродиализом канюли, вставленный в их руководстве глина моделирования.
        ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяйте коснуться стены рукав защитный зонд при извлечении зонд.
      4. Положить животное в цилиндр оргстекла и дайте ему исследовать новую атмосферу. Подключите животного к системе привязанный записи ЭЭГ, как описано выше (следовать точек 4.2.2 и 4.2.3).
      5. Следуйте awake и свободно перемещающихся крыса движений и подключите подвод зонда к 2,5 мл шприц с затупленными иглой 22G содержащих раствор Рингера, используя адаптеры трубопровода. Нажмите раствор Рингера внутри зонда, изгнание 1 мл раствора Рингера в 10 s, постоянно толкает поршень шприца 2,5 мл. Проверьте каплю жидкости, появляясь на выходе. Зонд теперь готов для использования.
      6. Заполните вверх по 2,5 мл-шприцы, подключен к FEP-труб НКТ адаптерами с раствор Рингера и смонтировать их на инфузионный насос. Запустите насос 2 мкл/мин. Дайте ему поработать на ночь.
        Примечание: Использовать необходимую длину всех FEP-трубки, но рассчитать объем трубы мертвых знать когда высокий K+ стимуляция должна быть запущена и корреляции данных количественного определения с нейрохимических изменений в мозге животных. Используйте воздушный пузырь, созданный в трубах под рабочий поток для вычисления на этот раз.
    2. Коллекция образцов во время записи и калия стимуляции ЭЭГ
      1. Проверьте отсутствие судорог в 3 h перед наступлением проб (видео ЭЭГ записей) и продолжать контролировать захват активность во время микродиализом.
      2. Остановите насос, перевозящих FEP-трубки канюлированной шприцы, заполнены раствором Рингера. Гора на другой набор 2,5 мл шприцов насоса подключен к FEP-труб с трубки адаптеры, наполненный модифицированных Рингера раствор, содержащий 100 мм K+ решение.
      3. Запустить насос 2 мкл/мин и дайте ему поработать. Для более быстрого заполнения трубы, установите насос в 5 мкл/мин для время наполнения. Проверка на отсутствие пузырьков воздуха в системе. Убедитесь, что трубы затрагивает адаптеры с не Мертвое пространство всех соединений.
      4. Пробник Если готов к использованию в животных, как описано выше (5.2.1.5).
        Примечание: Если по некоторым причинам зонд не работает, измените его. Для этих случаев Держите несколько подготовленных микродиализом зонды, готовый к использованию возле станции микродиализом ЭЭГ. Отсоедините кабели ЭЭГ животного и анестезировать он кратко с изофлюрановая, если необходимо реализовать изменения.
      5. Соедините FEP-трубы заполнены раствором Рингера для впуска канюля зонда в каждого животного и ждать появления жидкой капли на кончике розетки шприцев.
      6. Подключите выход датчика к FEP-труб, что приводит к коллекции в пробирке. FEP-трубки вставьте закрытых 0,2 мл пробирку с перфорированной крышкой. Убедитесь, что трубка остается на месте путем фиксации с куском глины моделирования.
      7. Продолжать работать насос 2 мкл/мин 60 мин без сбора образцов, чтобы сбалансировать системы (нулевой образец).
      8. Соберите 5 подряд 30 мин диализате образцов (60 мкл соответствующего тома) в исходных условиях (перфузии с нормальной Рингера раствор). Хранить образцы на льду.
      9. Рассчитать время, которое уходит жидкость пройти от насоса в голову животного (это зависит от мертвого объема трубы, т.е., воздушный пузырь время) и переключение FEP-трубки, которая идет от шприцы, содержащих раствор Рингера-нормальный шприцы содержащие изменение раствор Рингера (100 мм K+) в настоящее время без остановки насоса. Проверка на отсутствие пузырьков воздуха в системе. Пусть насос баллотироваться на 10 мин.
        ОСТОРОЖНОСТЬЮ: В 10 мин высокой K+ стимуляции, животные, как правило, двигаться сами ударными и обычно представляют большое количество влажных собака трясет (управления и из захвата кластера животных) или поведенческих изъятий (эпилептические животных), так что будьте готовы вмешаться Защитите трубы и кабели от скручивания.
      10. После 10 минут переключение труб от шприцы, содержащий 100 мм K+ Рингер решение раствор Рингера-нормальный и пусть работы насоса. Не выключайте насос во время решения изменения так, что будет существовать капля жидкости в конце трубки подключены в линии.
      11. С того момента, на котором диализате содержит высоким содержанием калия, т.е., после сбора пятый после уравновешивания диализатом, собирать диализате фракций каждые 10 мин (20 мкл) за 1 ч. 3, собирать дополнительные 30 мин диализате образцов и остановить насоса. Храните образцы на льду.
      12. Хранение образцов-80 ° C после эксперимента до анализа ВЭЖХ.
      13. Повторите микродиализом эксперимент 3 дней подряд, за исключением острого (24 h) и первой группой захвата, в котором только один микродиализом сессия проходит 24 ч после SE или в течение 24 ч после первой спонтанной захват (рис. 3).
      14. По завершении каждого эксперимента усыпить животных с передозировки анестетика и удалить мозга для проверки размещения зонд и электрода.
  3. Пост микродиализом процедуры
    1. Промойте используется микродиализом зонды с дистиллированной водой и хранить их в флаконе, наполненный чистой дистиллированной водой до следующего использования.
      Примечание: Повторно используемые мембраны, возможно, увеличение проницаемости; Проверка восстановления зонда перед его повторным использованием.
    2. Промойте весь микродиализом, Настройка (трубы, разъемы и шприцы) с дистиллированной водой, следуют на 70% спирте. Заменить этанол с воздухом и хранить набор в стерильных условиях.
    3. Разделить базальной диализате образцы на 20 мкл фракций и использовать только один 20 мкл дроби для анализа базальной концентрации аминокислот. Магазин оставшийся объем образца для дальнейшего или подтверждающего анализа-80 ° c.
    4. Сберечь их парафин встраивание1и исправить мозги в формалина 10%. Coronally раздел мозги ломтиками и пачкает их с гематоксилином и эозином. Изучите мозги для правильного зонд и электрода размещение1,2.
      Примечание: Исправить мозги в охлажденный 2-methylbutane и хранить их в-80 ° C. Используйте любые другие проверенные окрашивания на участках нервной ткани, которые позволяет визуализировать урочище зонд и электродом.

6. хроматографический анализ глутамата и аспартата

  1. Подготовка derivatizing агент
    1. Смешайте соответствующих томов 20:1 (v/v) orthophthaldialdehyde реагента (OPA) и 2-меркаптоэтанол (5-ME) во флаконе. Закройте флакон с помощью Кап и воздух плотный перегородки.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Работа под химические вытяжки.
    2. Вихревой приготовленный раствор и положил его в автоматический пробоотборник в позицию для derivatizing агента.
  2. Подготовка диализате образцов
    1. Положите вставки стекла с нижней весной в 2 мл флаконе коричневого Автоматический пробоотборник. Подготовьте флаконы для всех образцов, измеряется в одном пакете.
    2. Возьмите 20 мкл диализа образцов из морозильной камеры-80 ° C и пусть они расплава. Удаление 1 мкл раствора и 1 мкл внутреннего стандарта (IS) L-гомосерин (50 мкм) для 19 мкл пример, таким образом пример содержит 2,5 мкм IS. Пипетка 20 мкл пример диализа в стекла вставляют во флаконе и запечатать его с герметичной перегородки.
    3. Место флаконы, содержащие образцы в автоматический пробоотборник, используя хроматографического программного обеспечения для обозначения образцы в их позициях.
  3. Хроматографический анализ образцов для определения концентрации глутамата и аспартата
    1. Запустите анализ на системе жидкостный хроматограф с spectrofluorometric обнаружения. Определять аминокислоты после 2 мин до столбца деривации с 20 мкл из orthophthaldialdehyde/5-меркаптоэтанол 20:1 (v/v) добавляется 20 мкл пример.
    2. Подготовка системы для анализа аминокислот. Включите автоматический пробоотборник, насос, дегазатор, детектор и контрольный блок вместе с компьютером.
    3. Погрузите Сифоны в бутылки, содержащие этапа мобильных и очищать каналы хроматографического насос, чтобы использоваться для анализа.
    4. Начать увеличить поток мобильных этапа проверки давления на столбце (например, начало в 0,2 мл/мин и увеличить поток для дополнительных 0,2 мл/мин каждые 5 мин до достижения рабочего потока). Пусть системы, запустить на рабочих потока 0,8 мл/мин для по крайней мере 1 h сбалансировать столбца.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Нестабильные давление указывает на присутствие воздуха в системе. Давление не должно превышать 25 МПа.
    5. Установить коэффициент усиления, высокая чувствительность и длины волны возбуждения и выбросов на детектор с 345/455 Нм соответственно. Сброс сигнала детектора (AUTOZERO).
    6. С помощью хроматографических программного обеспечения, отправьте метод инструмент. Теперь хроматограф должны быть готовы к измерению.
    7. Отдельные диализате образцы, стандарт шипами диализате образцов, а также стандартов (0,25 мкм – 2,5 мкм аспартата и глутамата в раствор Рингера) на соответствующей Хроматографические колонки. Хроматографический метод калибровки и установить пределы обнаружения и количественного определения перед любой анализ образцов диализа.
    8. Активировать единого анализа или создать последовательность образцов для анализа с использованием хроматографии программного обеспечения и запуска последовательности.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Запуск более одной пустой выборки и различных стандартных образцов в пределах последовательности диализате образцов для того чтобы контролировать точность метода.
    9. После того, как приобрел хроматограм, анализировать их с программным обеспечением хроматографии. Проверка интеграции пики интерес в сюжет калибровки. Используйте область высоты или пик пик для количественной оценки.
    10. По окончании записи образец заполните столбец и системы с органическим растворителем (например, 50% Ацетонитрил в ультрачистая вода) для предотвращения ее старения и плесени роста в нем.
    11. Завершите работу системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Зонд восстановления

Среднее восстановление (т.е., среднее аминокислоты содержание в perfusate как процент содержания в равный объем раствора во флаконе) было 15.49 ± 0,42% при скорости потока 2 мкл/мин и 6.32 ± 0,64 3 мкл/мин для глутамата и 14.89 ± 0,36% при скорости потока 2 Мкл/мин и 10.13 ± 0,51 в 3 мкл/мин для аспартат при использовании cuprophane мембраны датчика. Если используется зонд мембраны полиакрилонитрил, означает восстановление было 13.67 ± 0,42% при скорости потока 2 мкл/мин и 6.55 ± 1.07 в 3 мкл/мин для глутамата и 14.29 ± 0,62% при скорости потока 2 мкл/мин и 8.49 ± 0,15 3 мкл/мин для аспартат (рис. 4A-4B). Как это ясно видно в рисунке 4A, медленнее скорость потока (2 мкл/мин) повышает dialyzing производительность обоих зондов. Для следующих экспериментов cuprophane мембраны наделены зонд увлажненную потока скорость 2 мкл/мин был выбран, потому что его среднее восстановление была выше (даже если не значительно) на этой скорости потока для обоих аналитов и из-за экспериментальной непрерывности (Эти зонды были использованы для анализа ГАМК в приоритет1).

Припадки развитие и прогрессирование болезни после эпилептический статус

Поведенческие и ЭЭГ-мониторинг изъятий, их оценку, было сделано в всех занятых в этом исследовании для подтверждения развития и прогрессирования заболевания TLE в этих животных.

Надежные судорожными SE, который был прерван после 3 h использование диазепамом, произошла 25±5 мин после инъекции пилокарпин. Затем все животные вступил задержки государство, в котором они видимо хорошо, и они были непрерывно контролировать для того, чтобы убедиться, что не спонтанные судороги произошло в течение первых 9 дней или определить первый спонтанное захват, соответственно для видео ЭЭГ задержка и первой группой захвата. Первый захват спонтанное произошло 11.3 ± 0,6 дней после SE (означает ± SEM, n = 21). После этого судороги произошли в кластерах и усугубляется во времени. В конце хронической фазе (55-62 дней после SE) эпилептического крыс опытных 3.3±1.2 (означает ± SEM, n = 12) ежедневно обобщенной изъятий. Там был ясно прогрессирование болезни. Многие, но не все ЭЭГ припадки, переписывался с поведенческой захват активность. Рисунок 5B показывает записанные пароксизмальная эпилептиформный активность, что было отмечено около 500 мс до и во время поведенческих изъятий. Рисунок 5A показывает следы управления в не эпилептический крыс.

Представитель базальной значения аминокислоты найдены в микродиализом perfusate и калия стимулирует релиз глутамата

Базальные глутамата концентрация в хронические эпилептические крыс (0.87 ± 0,06 мкм) был значительно выше, чем в контрольных животных (0,59 ± 0,03 мкм; p < 0,05 против контроля; одностороннюю ANOVA и post hoc Дуннетт тест). Там был без статистически значимой разницы между хронической эпилептический (0.31 ± 0,04 мкм) и не эпилептический животных (0.30 ± 0,05 мкм) в базальной или высокий K+ вызывали аспартат концентрации. Посмотреть оригинал статьи на детали2. Сообщил Базальные уровни глутамата в элементе управления, когда крысы созвучны нашли другие в аналогичных исследований (то есть, о 0,75 мкм при использовании поток 2 мкл/мин и мембраны эффективной длиной 2 мм)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Однако многие различные факторы могут повлиять на результаты микродиализом, например Эффективная Длина зонда и мембраны, отрезали.

Высокий K+-вызвали дополнительный выпуск глутамата для управления крыс около 30 минут и около 60 мин в хронические эпилептические крыс (рис. 6). Посмотреть оригинал статьи на детали2. Как можно увидеть из изображенных время курс, 10 мин время резолюции микродиализом было достаточно, чтобы захватить разницы в выпуске глутамата в обеих группах животных.

ВЭЖХ калибровки и ограничения

Данные были рассчитываются на основе калибровочных кривых, полученных со стандартными решениями глутамата, аспартата и внутреннего стандарта L-гомосерин. Концентрация нейротрансмиттеров глутамата и аспартат в перфузатов была выражена в абсолютных величинах (мкмоль/Л). Каждый участок калибровки был построен на анализе решений глутамата и аспартат на четырех уровнях концентрации (пять реплицирует на каждом уровне). Для калибровки участков были рассчитаны коэффициенты регрессии: y = kx + q, где x является коэффициент концентрации аспартат или глутамата к L-гомосерин (IS) и y было соответствующее соотношение площади пика аспартат или глутамата (L-гомосерин ЭТО). Был рассчитан коэффициент детерминации (2r). Применимость метода ВЭЖХ был в пределах; Нижний предел квантификации было определено как низкая концентрация в стандартной тарировочной кривой и верхний предел квантификации как самая высокая концентрация используется аналитов аминокислоты для калибровки, соответственно. Предел обнаружения (LOD) также была рассчитана. Некоторые из этих значений определены в таблице 1. Хроматограмма модель пустых образца, стандартов, образец образец и собранных диализа, полученные с выше описывается метод показано на рисунке 7.

Зонд локализация

Микродиализом зонд и записи электрода были имплантированы в право вентральной гиппокампа и их правильное размещение было проверено. В анализ были включены только те животные, где имплантация была максимально в 500 мкм, далеких от стабилизированного координат (см. рис. 8).

Figure 1
Рисунок 1. Шаг за шагом подготовки устройства к быть имплантированы. (A) 3-канальный электрод с 10 см, длиной электродом в ее защитный рукав на левой и руководство канюли для микродиализом на правом, необходимо собрать устройство. (B). голые электрода и руководство канюли в деталях. Первым шагом является удаление (C) и вставить (D) металла руководство канюли из и в пластиковой Макетные несколько раз для простоты его выпуска, имплантируется однажды в голова животного. Второй шаг заключается в том, чтобы согнуть два раза витой языковые электрода быть выровнены для диализа руководство канюля (E, F). (G) электрода должны быть сокращены на 0,5 мм больше, чем кончик канюля металла руководство. (H) проверить точность резки с помощью цифровой штангенциркуль. Впоследствии около 1 мм длиной кремния венец должен использоваться для исправить выравнивание электрода для руководства канюля фут (I). (J фотография, показывая, как кольцо электрода и направлять канюля вала. Последний шаг заключается в том, чтобы поместить каплю смолы или клей на пьедестал канюля руководство, фиксации кружочком кремния к нему (K). (L) собрал устройство готово для стерилизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. (A) и фотографию зонда клип держатель (B) используется для имплантата эти устройства фотографии различных типов устройств для микродиализом ЭЭГ в крыс используется. (A Руководство канюля (в зеленом) заменяется на микродиализом канюлю обычно 24 часа до эксперимента. Электрический разъем устройства (первый слева используется для записи, описанные в этой рукописи) разрешает крепления проводов, которые проводят электрического сигнала усилителя и данных сбора оборудования. Хирургически подключено устройство к черепу наркотизированных крыс и записи могут быть получены позднее, не вызывая боли или дискомфорта в свободно себя крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Экспериментальный дизайн. За неделю до статуса эпилептический (SE) индукции, крысы имплантированным устройством. SE индуцируется пилокарпин и животных (если не dialyzed и убит 24 ч после SE; крысы от острой группы) видео контроль за 5 дней (синяя линия), то видео ЭЭГ мониторинг оценить захват частоты и продолжительности их дома клетки (зеленая линия). Для эксперимента, микродиализом эпилепсии и соответствующие номера эпилептический крыс передаются в другой ЭЭГ, оборудован цилиндр клетки в 24 ч до начала сессии микродиализом и до сих пор видео ЭЭГ контроль (светло-зеленая линия). Вертикальные красные линии показывают Сеансы диализа в различное время развития эпилептической болезни. Горизонтальной красной линией представляют различные группы эпилептических животных (и соответствующие номера эпилептический животных), где стрелка указывает последний день микродиализом и день смерти животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. В vitro восстановление двух зондов диализа. Значит в vitro восстановления (%) аспартата и глутамата, с использованием двух разных коммерчески доступных микродиализом зонды (наделены 1 мм длиной dialyzing мембрана) на (A) 2 мкл/мин и (B) 3 мкл/мин скорость потока. Данные являются среднее ± SEM 3 независимых экспериментов запустить в triplicates. Существует не статистически значимых различий между эффективностью различных датчиков (студент непарные t теста, p < 0,05). С помощью потока скорость 2 мкл/мин глутамата восстановления увеличена примерно на 5% по сравнению с 3 мкл/мин скорость потока, тем самым медленнее скорость потока был использован для микродиализом экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Иллюстративный записи ЭЭГ от брюшной гиппокампа paraoxystic деятельности, как можно увидеть в хронической фазе управления и эпилептическими припадками крыс. (A) два представителя следы записал два соленых лечение не эпилептический крыс. (B) следы записал два эпилептических крыс. Эпилептиформный сбросов соответствуют 3 класса поведенческих изъятий в этих крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Время курс эффект стимуляции калия на выпуске глутамата из гиппокампа крысы. Представитель результат эксперимента микродиализом выступал в 6 управления (кружков) и 6 хронические эпилептические крыс (черные круги). На графике показаны временные изменения концентрации диализате глутамата в ходе экспериментов микродиализом и во время стимуляции K+ высота 100 мм. Черная полоса в нижней части графика указывается время высокий стимул K+ (10 мин). Данные являются средства ± SEM 6 животных для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7. Иллюстрация хроматограммы. Известные пики помечены. Розовый след: Хроматограмма раствор Рингера без преднамеренно добавленных амины после деривации OPA/5-ME (пустой образец). Синий след: Хроматограмма диализате образца после деривации, показаны на вершины аминокислот: аспартат (tR 4.80 мин), глютамат (tR 6.75 мин) и глютамин (tR 9.19 мин) и пик IS L-гомосерин (2,5 мкм, время удержания, t R 9.83 мин). Красный след: Хроматограмма стандарта аспартат (2,5 мкм) и глутамата (2,5 мкм) в растворе Рингера. Лазурное и желтый фон изображения стендов для мобильных этапа A (azure) и мобильные фаза B (желтый) часть используется для элюции аналитов. Красный прямоугольник указали области (tR 10.41 мин и далее) показывает пики неизвестных веществ и продуктов разложения опа. Все тома инъекции были 20 мкл. Производные были разделены со скоростью потока 0,8 мл/мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8. Представитель изображение комбинированного электрода зонд Размещение внутри брюшной гиппокампа. (A) фотография показывает напугать оставленные кончик устройства в деталях (черная стрелка). (B) схематическая иллюстрация электрод зонд кончик позиций в пределах имплантированных вентральной гиппокампа 12 крыс. Твердых квадратов (некоторые перекрывающиеся) указывают правильно локализованное зонд электрод советы. Открытые площади указывают неправильно локализованных зонд электрод советы в животных, исключены из сферы исследования (n = 3). Корональные мозга ломтиками содержащие датчики и записи сайтов были обработаны после экспериментов для гистологического анализа. Выше рисунке чисел показывают расстояние от Bregma (согласно Пеллегрино et al. 1979 Атлас мозга крысы; нос бар + 5,0 мм, используются координаты: A-3.4 мм, L + 5,4 мм; P + 7,5 мм из Дура). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Аналита c (мкмоль/л) k q r2 LOD (пмоль/л)
Глутамат 0,25-2,5 5.215 1043.79 0.999 19.4
Аспартат 0,25-2,5 2.258 1994.72 0,998 31,7

Таблицы 1. Количественной характеристики метода ВЭЖХ, используемого для определения аминокислоты. Спектр стандартов (c), наклон (k), перехвата (q), коэффициент детерминации (2r) и предел обнаружения (LOD) описывая калибровочных участков концентрации получены с стандартными решениями глутамата и аспартат (0.25, 0.5, 1.0 и 2,5 мкм ) и внутреннего стандарта L-гомосерин (2,5 мкм) с помощью описанных методом ВЭЖХ с spectrofluorometric обнаружения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой работе мы покажем, как непрерывной записи видео ЭЭГ, в сочетании с микродиализом может быть выполнена в экспериментальной модели TLE. Для правильно диагностировать различные этапы прогрессирования заболевания у животных, используются методы записи видео-ЭЭГ и микродиализом техника используется для описания изменения в версии глутамата, происходящие во времени (изменения не были найдены для аспартат в ранее опубликованном исследовании2). Мы настоятельно рекомендуем использовать одно устройство/имплантат для их выполнения в каждое животное по причинам, изложенным во введении.

Всякий раз, когда это доступно, манулами должны быть предпочтительнее тросовых систем для хронических записи ЭЭГ как это сводит к минимуму помехи с поведением и уменьшает риск вреда и бедствия для животных54. Однако привязанный запись ЭЭГ гораздо менее дорогостоящим, чем телеметрии.

В нашей лаборатории мы используем разъемы в ЭЭГ, записи системы и микродиализом труб параллельно, таким образом, что провода и трубы прилагаются для двух различных шарниров. Это наиболее важным вопросом для этих экспериментов: проводов и труб, как правило, часто крест из-за движения животного. Поэтому мы используем разъемы и трубки достаточно долго, чтобы животное погони свой собственный хвост (поведение, которое обычно наблюдается при стимуляции калия) или падать вниз и ролл во время обобщенных эпилептические припадки. Рекомендуется далее фирма микродиализом канюли, вставленный в их руководстве пластилин, с тем чтобы укрепить их контакты с руководством (иногда, микродиализом канюли наткнулся против стены клетки во время обобщенных изъятий и может соскользнуть). С другой стороны желательно держать труб, как возможно свести к минимуму задержку между нейрохимические и время сбора коротким. Это особенно важно, когда короткие периоды коллекции. В общем микродиализом труб должна быть надлежащей длины и потенциала для обеспечения того, чтобы время выборки не превышает время между отделение диализа и коллекции. Было отмечено, что растворенных веществ, как правило, более диффузный между некоторые вилки, если Мертвое время труб превосходит скорость выборки55. Таким образом следует сократить как можно больше экспериментальной мертвых время/объем микродиализом труб и очень точно определен для корреляции данных нейрохимия с поведение животных. Наконец важно отметить, что вертлюги и электродов, в сочетании с канюля для комбинированных ЭЭГ и микродиализом исследования являются коммерчески доступных. Поэтому когда это возможно, настроить ЭЭГ системы с возможностью выполнения экспериментов микродиализом.

Незначительные рекомендации являются: (i) перед началом любого эксперимента, проверить правильность работы ЭЭГ, записи системы и/или микродиализом, настроить и устранить любые проблемы; Мы предлагаем что один заповедник создан готовы (другой насос с шприцы монтируется на и завершено труб, наполненный рабочих растворов) при выполнении эксперимента, а также достаточное число готовых к использованию микродиализом зонды для изменения сломанной из них; (ii) при передаче животное в клетке рабочей ЭЭГ микродиализом это полезно иметь второй человек, оказание помощи и начиная с приобретения; (iii) убедитесь убедитесь, что столбец и автоматический пробоотборник достигли соответствующей температуры перед хроматографии; Кроме того использование стандартов и построить калибровочных участков, прежде чем любой диализате образцы вводятся на Хроматографическая колонка; (v) всякий раз, когда необходимо, попытаться развить хроматографического или других аналитического метода для измерения нескольких аналитов в то же время.

Изменения в синапсах имеют последствия многих заболеваниях ЦНС (в т.ч. эпилепсия), и там был большой интерес в течение десятилетий для количественной оценки этих изменений во время переход от здоровой в больной фенотип. Сегодня только несколько методов позволяют измерение изменений в нейротрансмиттера уровнях в течение дней или месяцев. Микродиализом является одним из этих методов. В большом числе случаев, как это описано здесь, оно выполняется в свободно перемещающихся животных и сочетании для обычных оффлайн аналитических анализов как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или капиллярного электрофореза (CE), с которой он достигает 5-30 Височное разрешение мин31,56. Очевидно эти интервалы выборки не отражают быстрое нейромедиатора динамика в непосредственной близости от синапсов, но может быть удобно для некоторых приложений долгосрочной перспективе микродиализом (например, развития болезни или исследования эффект препарата) которые требуют Муфта нейрохимических, ЭЭГ и поведенческих данных. Однако другие исследования главным образом связаны с измерения в реальном времени или почти реальном времени изменения в нейромедиатора релиз. Для них микродиализом техника должны быть усовершенствованы увеличить скорость выборки (таким образом уменьшением объемов выборки). Действительно, классический микродиализом техника часто критикуют за его плохое временной (минут) и пространственным разрешением (обычные зонд гораздо больше, чем синаптическую щель)9,21,56, 57. Однако это массовые чувствительность аналитического метода в сочетании с микродиализом определяет время резолюции микродиализом (т.е., ее резолюции равно времени, необходимо иметь достаточно образец, чтобы быть обнаружены аналитический 56техника). Таким образом когда микродиализом производит небольшое количество образцов, должна быть увеличена чувствительность методов количественной оценки. На сегодняшний день такие улучшения в временное разрешение метода микродиализом вслед за 3 разных линий. Один из них представлен миниатюризации столбцов и/или обнаружения клетки классические ВЭЖХ методов; они называются UHPLC (ультра производительность ВЭЖХ) методы и позволяют достичь 1-10 мин время резолюция58,,5960. Другой подход заключается в том, чтобы пара классический ВЭЖХ масс-спектрометрия (МС) или тандем (МС/МС) для мультиплекс анализа нейротрансмиттеров мозга dialysates. Комбинированные ВЭЖХ-МС имеют превосходную чувствительность и достичь о 1-5 мин время резолюция56,61,,6263. Третья линия улучшения существует в модификации капиллярного электрофореза (CE). Если CE использует лазерный индуцированной флуоресценции обнаружения (CE-НДНП), он позволяет определение концентраций различных нейромедиаторов в nanoliter фракции, полученные каждые 5 мин55,64,65 submicromolar или даже в интервалах 10 s56. Явное преимущество, которое вытекает из UHPLCs или расширенные аналитические подходы КЕС является, что выборки может быть сделано в свободно перемещающихся животных, без ущерба для экспериментов в которых спонтанного поведения должны наблюдается и проанализированы. С другой стороны есть методы, которые позволяет мозга диализате выборки на даже сотен миллисекунд временное разрешение (например, фермент реактор основе on-line анализов или капли коллекции диализате сочетании методов MS), но эти обычно используется в сдержанной животных66 или под общим наркозом67,68,69, не позволяя микродиализом пара с поведенческих исследований.

При рассмотрении второй наиболее важный слабость микродиализом, т.е. относительно низким пространственным разрешением благодаря размеры мембраны (часто около 0,5 мм в диаметре и длиной 1-4 мм), альтернативой может быть микрозонды, разработан с низким потоком Тяни Толкай выборки. Эти зонды состоят из двух кремнезема капилляров (из 20 мкм ID и 200 мкм OD) снаряжен бок о бок и обшивается с полимерных труб. В ходе эксперимента эти капилляры увлажненную скоростью очень низкого потока, что жидкость вытащил один капилляр и образец извлекается из другой с той же скоростью потока. Поскольку выборка происходит только на кончике зонда, пространственное разрешение больше, чем с зонда для микродиализом70. Другая возможность заключается в том, чтобы переключиться от миниатюрных датчиков микроэлектродные массивы (биосенсоры) для оценки реального времени нейромедиатора. Различных электрохимических методов (на основе главным образом вольтамперометрии или amperometry) позволяют аналита выборки очень близко к синапса (шкала микрон) и в менее чем 1 s31,,70-71. Эти устройства можно измерить концентрации нескольких аналитов из нескольких регионов мозга. Однако они также требуют некоторых уточнений, например избежать артефактов и относительно быстрое ухудшение.

Принимая во внимание последние достижения в vivo нейрохимических мониторинга представляется вероятным, что передатчик различных методов выборки будут объединены в один датчик в ближайшем будущем. Уже началась работа по microfabricated пробоотборника, и мы считаем, что дальнейший прогресс в микротехнологий технологий вместе с аналитической прогресс будет и далее содействовать в vivo нейрохимических мониторинга расследования. В это время однако, обычные микродиализом, коррелирует с ЭЭГ остается действительный метод для многих приложений, нейронауки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Анна Binaschi, Паоло Roncon и Элеонора Пальма за их вклад в рукописи, опубликованных в приоритет.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

Tags

Нейробиологии выпуск 141 микродиализом глутамата аспартата эпилепсии пилокарпин модель стереотаксической хирургии калия стимуляции электроэнцефалография жидкостной хроматографии
Микродиализом возбуждающих аминокислот во время записи ЭЭГ в свободно перемещающихся крысы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Falcicchia, C.,… More

Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter