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Neuroscience

आज़ादी से चलती चूहों में ईईजी रिकॉर्डिंग के दौरान उत्तेजक अमीनो अम्ल की Microdialysis

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

यहाँ, हम मिरगी रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में मिरगी और गैर ईईजी चूहों के ventral हिप्पोकैम्पस में aspartate और ग्लूटामेट रिहाई का विश्लेषण करने के लिए vivo microdialysis में के लिए एक विधि का वर्णन । aspartate और ग्लूटामेट की Extracellular सांद्रता रोग के विभिंन चरणों से संबंधित हो सकती है ।

Abstract

Microdialysis एक अच्छी तरह से स्थापित तंत्रिका विज्ञान तकनीक है कि स्नायविक सक्रिय व्यवहार के साथ मस्तिष्क मध्यवर्ती अंतरिक्ष में फैलाना पदार्थों के परिवर्तन को संबद्ध है और/या एक विकृति के विशिष्ट परिणाम के साथ (जैसे, बरामदगी मिरगी के लिए) । मिर्गी का अध्ययन करते समय, microdialysis तकनीक अक्सर अल्पकालिक या भी दीर्घकालिक वीडियो-electroencephalography (ईईजी) सहज जब्ती आवृत्ति, गंभीरता, प्रगति और क्लस्टरिंग का आकलन करने के लिए निगरानी के साथ संयुक्त है । संयुक्त microdialysis-ईईजी कई तरीकों और उपकरणों के उपयोग पर आधारित है । यहां, हम vivo microdialysis और निरंतर वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन के लिए समय के साथ ग्लूटामेट और aspartate बहिर्वाह की निगरानी, एक चूहे मॉडल में मिर्गी के प्राकृतिक इतिहास के विभिंन चरणों में । इस संयुक्त दृष्टिकोण रोग के विकास और प्रगति की विशिष्ट चरणों के साथ न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में परिवर्तन के बाँधना की अनुमति देता है. अपोहित में एमिनो एसिड एकाग्रता तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा निर्धारित किया गया था । यहां, हम तरीकों का वर्णन और प्रमुख एहतियाती उपाय एक के दौरान vivo microdialysis-ईईजी में ले जाना चाहिए रूपरेखा, stereotaxic सर्जरी, बेसल और उच्च पोटेशियम उत्तेजना microdialysis, गहराई के दौरान विशेष ध्यान के साथ इलेक्ट्रोड ईईजी रिकॉर्डिंग और अपोहित में aspartate और ग्लूटामेट के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण । इस दृष्टिकोण के लिए दवा या मस्तिष्क में aspartate और ग्लूटामेट की शारीरिक सांद्रता की बीमारी प्रेरित परिवर्तन की एक किस्म का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक उचित विश्लेषणात्मक परख की उपलब्धता पर निर्भर करता है, यह आगे के लिए अलग घुलनशील अणुओं जब एक ही समय में ईईजी रिकॉर्डिंग रोजगार परीक्षण किया जा सकता है ।

Introduction

ग्लूटामेट-मध्यस्थता उत्तेजक और GABAergic निरोधात्मक neurotransmission के कार्यात्मक हानि में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लौकिक पालि में सहज बरामदगी में जिसके परिणामस्वरूप मिर्गी (TLE), हम व्यवस्थित extracellular सांद्रता की निगरानी गाबा१ और बाद में microdialysis द्वारा ventral हिप्पोकैम्पस में चूहों के विभिन्न समय-बिन्दुओं पर रोग स्वाभाविक पाठयक्रम के दौरान, अर्थात, मिर्गी के विकास और प्रगति के दौरान, ग्लूटामेट तथा aspartate२ के स्तरों पर. हम चूहों में TLE pilocarpine मॉडल का लाभ लिया, जो रोग की नकल बहुत सही व्यवहार के मामले में, electrophysiological और histopathological परिवर्तन3,4 और हम एमिनो के अपोहित एकाग्रता को संबद्ध इसके विभिन्न चरणों के लिए एसिड: तीव्र चरण epileptogenic अपमान के बाद, विलंबता चरण, पहली सहज बरामदगी के समय और जीर्ण phases5,6,7. रोग के चरणों तैयार लंबी अवधि के वीडियो ईईजी निगरानी और सटीक ईईजी और सहज बरामदगी के नैदानिक लक्षण वर्णन द्वारा सक्षम किया गया था । लंबी अवधि के वीडियो-ईईजी मॉनिटरिंग से संबद्ध microdialysis तकनीक के अनुप्रयोग ने हमें TLE neuropathology के लिए यंत्रवत परिकल्पनाओं का प्रस्ताव करने की अनुमति दी । संक्षेप में, इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक एक पशु मॉडल में विकास और मिर्गी की प्रगति के साथ एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर neurochemical परिवर्तन के बाँधना की अनुमति देता है ।

युग्मित उपकरणों, एक microdialysis प्रवेशनी करने के लिए एक गहराई इलेक्ट्रोड झकझोरता से बना है, अक्सर मिर्गी अनुसंधान अध्ययन में कार्यरत हैं, जहां न्यूरोट्रांसमीटर में परिवर्तन, उनके चयापचयों, या ऊर्जा सब्सट्रेट न्यूरॉनल गतिविधि के लिए संबंधित होना चाहिए. मामलों के विशाल बहुमत में, यह स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों में प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी मानव में एक समान तरीके से आयोजित किया जा सकता, उदाहरणके लिए, pharmaco प्रतिरोधी मिरगी रोगियों में गहराई इलेक्ट्रोड जांच से पहले सर्जरी के दौर से गुजर रहा है8. दोनों ईईजी रिकॉर्डिंग, और अपोहित संग्रह अलग से किया जा सकता है (जैसे, एक गोलार्द्ध में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोप और अन्य गोलार्द्ध में microdialysis जांच या यहां तक कि प्रदर्शन करते हुए पशुओं के एक समूह में microdialysis प्रदर्शन पशुओं के एक अंय समूह में एकमात्र ईईजी) । हालांकि, एक से अधिक लाभ हो सकता है जांच करने के लिए इलेक्ट्रोड युग्मन: यह stereotaxic सर्जरी सरल, केवल एक गोलार्द्ध के लिए ऊतक क्षति को सीमित करता है (जबकि अन्य छोड़, बरकरार, ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन के लिए एक नियंत्रण के रूप में), और इन के रूप में परिणाम homogenizes एक ही मस्तिष्क क्षेत्र और एक ही जानवर से प्राप्त कर रहे हैं ।

दूसरी ओर, युग्मित microdialysis जांच की तैयारी-इलेक्ट्रोड डिवाइस कौशल और समय की आवश्यकता है अगर यह घर बनाया है । एक पैसे की अपेक्षाकृत अधिक मात्रा में खर्च अगर बाजार से खरीदा सकता है । इसके अलावा, जब microdialysis जांच (जांच युक्तियां आम तौर पर कर रहे है 200-400 µm व्यास में और 7-12 मिमी लंबी)9, और ईईजी इलेक्ट्रोड (इलेक्ट्रोड युक्तियां आम तौर पर 300-500 µm के व्यास में हैं, और काफी लंबे समय के लिए पर्याप्त ब्याज की मस्तिष्क संरचना तक पहुंचने10) युग्मित डिवाइस सिर के एक तरफ भारी और अपेक्षाकृत बड़ी वस्तु का प्रतिनिधित्व करता है, जो जानवरों के लिए परेशानी है और यह डायलिसिस पंप और हार्ड वायर ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली से जुड़ा हुआ है, खासकर जब खो जाने की संभावना है । यह पहलू मिरगी जानवरों है कि संभाल करने के लिए मुश्किल है और microdialysis सत्र के लिए कम अनुकूल में अधिक प्रासंगिक है । उचित शल्य चिकित्सा तकनीक और उचित पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल लंबे समय तक चलने प्रत्यारोपण में परिणाम कर सकते हैं कि न्यूनतम पशु असुविधा का कारण है और combinatory microdialysis के लिए पीछा किया जाना चाहिए-ईईजी प्रयोगों10,11, 12.

microdialysis तकनीक के फायदों और सीमाओं की कई neuroscientists द्वारा विस्तार से समीक्षा की गई है । vivo छिड़काव तकनीकों में अंय पर इसका प्राथमिक लाभ (जैसे, तेजी से प्रवाह पुश-पुल या cortical कप छिड़काव) जांच का एक छोटा सा व्यास है जो ब्याज13,14के एक अपेक्षाकृत सटीक क्षेत्र को शामिल किया गया है, 15. दूसरा, microdialysis झिल्ली ऊतक और perfusate के बीच एक शारीरिक बाधा पैदा करता है; इसलिए, उच्च आणविक वजन पदार्थों को पार नहीं करते और विश्लेषण16,17के साथ हस्तक्षेप नहीं करते । इसके अलावा, ऊतक perfusate18के अशांत प्रवाह से सुरक्षित है । एक अंय महत्वपूर्ण लाभ के लिए perfusate में analyte एकाग्रता अधिकतम के लिए perfusate प्रवाह को संशोधित करने की संभावना है (यानी, microdialysis की प्रक्रिया अच्छी तरह से गणितीय परिभाषित किया जा सकता है और उच्च उपज के लिए संशोधित किया जा सकता है नमूने में analyte की सांद्रता)19. अंत में, तकनीक दवाओं या औषधीय सक्रिय पदार्थों को ब्याज के ऊतकों में संचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और20हस्तक्षेप के स्थल पर अपने प्रभाव का निर्धारण । दूसरी ओर, microdialysis एक सीमित संकल्प समय (आमतौर पर अधिक से अधिक 1 मिनट के नमूनों का संग्रह करने के लिए आवश्यक समय के कारण) विद्युत या जैविक सेंसर की तुलना में; यह एक इनवेसिव तकनीक है कि ऊतकों को नुकसान का कारण बनता है; यह सभी घुलनशील पदार्थ है जो ब्याज की analyte के साथ perfusate में प्रवेश के सतत एकाग्रता ढाल के कारण झिल्ली के आसपास अंतरिक्ष के भीतर neurochemical संतुलन समझौता । अंत में, microdialysis तकनीक अत्यधिक विश्लेषणात्मक perfusate9,21,22,23 में पदार्थों के ठहराव के लिए कार्यरत तकनीकों की सीमा से प्रभावित है . जैविक नमूनों में ग्लूटामेट और aspartate विश्लेषण के लिए orthophthaldialdehyde के साथ derivatization के बाद उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) को अच्छी तरह से मान्य किया गया है24,25,26 , २७ और इसकी व्यापक चर्चा इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है, लेकिन इस विधि का उपयोग कर उत्पादित आंकड़ों को विस्तार से बताया जाएगा ।

जब ठीक से प्रदर्शन किया और perfusate संरचना के संशोधनों के बिना, microdialysis न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई के बेसल स्तर के बारे में विश्वसनीय जानकारी प्रदान कर सकते हैं. बेसल स्तर के सबसे बड़े हिस्से की संभावना synapses9से ट्रांसमीटर spillover का परिणाम है । क्योंकि कई उदाहरणों में न्यूरोट्रांसमीटर के सरल नमूना अतिरिक्त synaptic अंतरिक्ष में एक जांच के लक्ष्यों को आगे बढ़ाने के लिए पर्याप्त नहीं है, microdialysis तकनीक भी न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने के लिए या उन्हें महत्वपूर्ण से वंचित करने के लिए नियोजित किया जा सकता ऐसे K+ या Ca2 +के रूप में शारीरिक आयनों, आदेश आह्वान या न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को रोकने के लिए.

उच्च K+ उत्तेजना अक्सर तंत्रिका जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है न केवल जाग पशुओं में बल्कि प्राथमिक और organotypic संस्कृतियों में भी न्यूरॉन्स गतिविधि को उत्तेजित करने के लिए. एक स्वस्थ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कश्मीर के उच्च सांद्रता के साथ समाधान के लिए जोखिम+ (40-100 mM) न्यूरोट्रांसमीटर28के समाप्ति उदाहरण देकर । न्यूरॉन्स की यह क्षमता उच्च K+ के जवाब में एक अतिरिक्त रिहाई प्रदान करने के लिए मिरगी जानवरों में समझौता किया जा सकता है1 और अन्य neurodegenerative रोगों में29,30. इसी प्रकार, ca2 + अभाव (perfusing ca द्वारा प्राप्त+ मुक्त समाधान) सबसे न्यूरोट्रांसमीटर microdialysis द्वारा मापा के कैल्शियम निर्भर रिहाई स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह आम तौर पर माना जाता है कि ca2 + निर्भर रिलीज के ंयूरॉन मूल के है, जबकि ca2 + स्वतंत्र रिलीज glia से शुरू होता है, लेकिन कई अध्ययनों से 2 सीए के अर्थ पर विवाद उठाया+-उदाहरण के संवेदनशील माप ग्लूटामेट या गाबा9: इस प्रकार, यदि संभव हो तो, यह microsensor अध्ययन के साथ microdialysis अध्ययन का समर्थन करने के लिए सलाह दी जाती है, के रूप में इन उत्तरार्द्ध उच्च स्थानिक संकल्प किया है और इलेक्ट्रोड synapses के करीब पाने के लिए अनुमति देता है31.

मिरगी पशुओं में microdialysis अध्ययन के बारे में, यह तनाव है कि उनमें से ज्यादातर से प्राप्त डेटा वीडियो या वीडियो पर भरोसा करने के लिए महत्वपूर्ण है-दौरे के ईईजी निगरानी, यानी, लक्षण की क्षणिक घटना और/ ३२मस्तिष्क में अत्यधिक या तुल्यकालिक न्यूरॉन गतिविधि । वहां pilocarpine में electrographic बरामदगी के कुछ विशेष पशुओं का इलाज कर रहे है जो विचार किया जाना चाहिए जब प्रयोग की तैयारी । सहज बरामदगी लगातार ईईजी interictal spikes के साथ उदास गतिविधि के बाद कर रहे हैं3 और३३,३४क्लस्टर में होते हैं । अन्तर्वासना संचालित गैर-मिरगी जानवरों जब्ती की तरह गतिविधि प्रदर्शन कर सकते हैं३५ और इसलिए ईईजी रिकॉर्डिंग मूल्यांकन के लिए मापदंडों३६ मानकीकृत किया जाना चाहिए और, यदि संभव हो तो, microdialysis सत्र के समय अच्छी तरह से परिभाषित किया जाना चाहिए. अंत में, हम अत्यधिक के सिद्धांतों और methodological मानकों के बाद वीडियो-ईईजी निगरानी नियंत्रण वयस्क में मिर्गी और अमेरिकी मिर्गी सोसायटी के खिलाफ अंतरराष्ट्रीय लीग के विशेषज्ञों द्वारा रेखांकित उनके बहुत हाल ही में रिपोर्ट की सिफारिश३७ ,३८.

यहां, हम मिरगी पशुओं में दीर्घकालिक वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग और अपोहित द्वारा HPLC में उनके विश्लेषण के साथ microdialysis ग्लूटामेट और aspartate का वर्णन करते हैं । हम प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम पर जोर देंगे कि एक सबसे अच्छा परिणाम के लिए ध्यान रखना चाहिए ।

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Protocol

यूरोपीय समुदाय में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को विश्वविद्यालय के फेरारा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा (प्राधिकरण: जिलाधिकारी 246/2012-B) परिषद के निर्देश 24 नवंबर १९८६ (86/609/EEC) । इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से मिरगी और गैर मिरगी चूहों में microdialysis सत्र के ईईजी नियंत्रण के तहत प्राप्त चूहे मस्तिष्क dialysates में ग्लूटामेट और aspartate निर्धारण के लिए समायोजित किया गया है । यहां वर्णित सामग्री के कई आसानी से उन है कि एक ईईजी रिकॉर्डिंग या microdialysis के लिए अपनी प्रयोगशाला में उपयोग करता है के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

1. Microdialysis जांच के विधानसभा-इलेक्ट्रोड डिवाइस

  1. एक 3-चैनल दो मुड़ इलेक्ट्रोड का उपयोग करें (के साथ कम से कम एक 20 मिमी दर्ज इलेक्ट्रोड की लंबाई कटौती और एक 10 सेमी लंबी जमीन इलेक्ट्रोड) और डिवाइस तैयार करने के लिए एक गाइड प्रवेशनी के लिए यह जोड़ी. चित्रा 1a-1b में डायलिसिस के लिए 3 चैनल इलेक्ट्रोड और गाइड प्रवेशनी के उदाहरण देखें.
  2. निकालें (चित्रा 1C) और डालने (चित्र 1 डी) डमी प्लास्टिक में धातु गाइड प्रवेशनी कुछ समय प्रवेशनी उपयोग करने से पहले में आदेश पशु में microdialysis जांच के लिए अपने स्विच के समय को हटाने के लिए ।
  3. इलेक्ट्रोड दर्ज करने के मुड़े तारों को मोड़ दो बार (चित्रा 1E-1F) गाइड के डमी प्रवेशनी के साथ तारों को संरेखित करने के लिए और इलेक्ट्रोड टिप (चित्रा 1G) में कटौती करने के लिए ०.५ मिमी गाइड प्रवेशनी की नोक से अब (चित्रा एक ज) डिजिटल कैलिपर का उपयोग कर ।
  4. 1 मिमी लंबे सिलिकॉन circlet (ओडी 2 मिमी, मोटाई ०.३ mm तैयार है; चित्रा 1I) और गाइड प्रवेशनी की नोक डालें और चिमटी (चित्रा 1J) का उपयोग कर सिलिकॉन circlet में मुड़ इलेक्ट्रोड की नोक । यह तेजी से कार्रवाई या राल की बहुलक गोंद के साथ गाइड प्रवेशनी कुरसी के पैर पर फिक्स (आंकड़ा १-१). आरेख 1L और आरेख 2aमें पूर्ण डिवाइसेज़ का उदाहरण देखें.
  5. germicidal यूवी लाइट के तहत डिवाइस को निष्फल करें 4 h. डिवाइस पर चार बार बारी तो के रूप में अपने पक्ष के प्रत्येक के लिए प्रकाश के संपर्क में है 1 ज ।
    नोट: कई घरेलू इलेक्ट्रोड और microdialysis जांच एक समान तरीके से इकट्ठे किए जा सकते हैं । चूहों के लिए ऊपर वर्णित प्रत्यारोपण के सिर निम्नलिखित आयाम हैं: 7 मिमी चौड़ाई x 5 मिमी गहराई x 10 मिमी लंबाई ऊपर से कुरसी पैर की अंगुली करने के लिए; प्रत्यारोपण टिप के बारे में 11 मिमी लंबे, व्यास में ६०० µm और 330-360 मिलीग्राम के बारे में सभी डिवाइस वजन है । डिवाइस दो या तीन बार इस्तेमाल किया जा सकता है अगर (i) जमीन इलेक्ट्रोड की एक पर्याप्त लंबाई अगले उपयोग के लिए सर्जरी के दौरान खोपड़ी पर छोड़ दिया जाता है और (ii) जब पशु को मार डाला है, और इस उपकरण के साथ एक साथ बरामद दंत सीमेंट यह एसीटोन में छोड़ दिया है टी, ऐसे कि सीमेंट यांत्रिक रूप से विसमुच्चय हो सकता है, और उपकरण धोया और फिर से निष्फल ।

2. Stereotaxic सर्जरी

  1. अपूतित और दर्द से मुक्त सर्जरी३९,४०,४१के लिए समकालीन मानकों के बाद उपकरण आरोपण के लिए एक stereotaxic उपकरण और जांच क्लिप धारक (चित्रा बीसी) का प्रयोग करें ।
    1. Anesthetize वयस्क Sprague-Dawley चूहों के साथ ketamine/xylazine मिश्रण (४३ मिलीग्राम/किलो और 7 मिलीग्राम/kg, आईएफसआई) और इसे stereotaxic फ़्रेम पर ठीक करें । isoflurane संज्ञाहरण जोड़ें (हवा में १.४%; १.२ मिलीलीटर/प्रारंभिक ketamine/xylazine इंजेक्शन के रूप में यह समय में संज्ञाहरण की गहराई को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है । जानवर के सिर पर फर दाढ़ी ।
  2. झाड़ू आयोडीन आधारित समाधान द्वारा सिर त्वचा की सतह ७०% इथेनॉल के बाद यह अपूतित सर्जरी३९के लिए तैयार करने के लिए ।
    1. निंन निर्देशांकों का उपयोग करते हुए दाईं ventral हिप्पोकैम्पस में वरीयता (१.१ – १.५) में तैयार मार्गदर्शिका प्रवेशनी-इलेक्ट्रोड डिवाइस को समाविष्ट करें: नाक बार + ५.० mm, A – ३.४ mm, L + ४.५ mm, P + ६.५ mm to bregma1,2. stereotaxic सर्जरी के लिए मानक तकनीकों का पालन करें10,11,12.
    2. सुनिश्चित करें कि यह लंगर शिकंजा कवर नहीं करता है । जब यह stereotaxic तंत्र पर बढ़ते, गाइड प्रवेशनी सिर के लिए डिवाइस समझ के रूप में यह आसानी से जांच धारक के लिए गठबंधन किया जा सकता है ।
  3. खोपड़ी में खोपड़ी की हड्डी (1 पेंच में बाएं और 1 पेंच में सही ललाट हड्डी प्लेटों में पेंच, बाएं पार्श्विका में 1 पेंच और interparietal हड्डी प्लेटों में 1 पेंच) में उन्हें खराब करने के साथ इस डिवाइस के लिए लंगर । ऊतक गोंद की एक बूंद जोड़ने के लिए आगे खोपड़ी की हड्डी के लिए प्रत्येक पेंच तय ।
    1. methacrylic सीमेंट के साथ पेंच धागे के कवर आधा । पालन को बढ़ाने के लिए हड्डी में उथले खांचे बनाकर सीमेंट की बाइंडिंग को बढ़ावा दें ।
  4. डिवाइस के टिप मस्तिष्क ऊतक में तैनात है एक बार, 3 लंगर शिकंजा के आसपास जमीन इलेक्ट्रोड के तार मोड़. कवर सभी शिकंजा और दंत सीमेंट12,४२,४३के साथ उपकरण घुड़सवार ।
  5. सर्जरी के दौरान जानवरों की निगरानी और के बारे में 1 के लिए घंटे के बाद जब तक ईमानदार और पिंजरे के आसपास चलती । हाइपोथर्मिया से बचने के लिए उन्हें एक वार्मिंग पैड पर रखें । चूहों को डिवाइस आरोपण के बाद कम से 7 दिनों के लिए ठीक करने की अनुमति दें ।
  6. दर्द या संकट के लक्षण के लिए सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए एक बार दैनिक जानवरों की निगरानी करें । एंटीबायोटिक क्रीम के साथ जानवरों को दें (गेन्तमयसीं ०.१%) incised साइट के करीब संक्रमण को रोकने के लिए और एक एनाल्जेसिक (tramadol 5 मिलीग्राम/kg, आईएफसआई) 3 दिनों के लिए शल्य चिकित्सा के बाद दर्द को रोकने के लिए ।

3. Pilocarpine और प्रायोगिक समूहों के लिए पशुओं के असाइनमेंट द्वारा अस्थाई पालि मिर्गी प्रेरण

  1. शल्य चिकित्सा वसूली के बाद के एक सप्ताह के बाद, जानवरों को बेतरतीब ढंग से समूहों को आवंटित: (i) वाहन प्राप्त करने वाले पशुओं को नियंत्रित करना और (ii) मिरगी पशु जो pilocarpine प्राप्त करेंगे । मिरगी समूह के लिए पशुओं की एक आनुपातिक अधिक संख्या का प्रयोग करें pilocarpine प्रशासित चूहों के सभी रोग के विकास के बाद से नहीं होगा ।
  2. methylscopolamine की एक खुराक (1 मिलीग्राम/kg, एस॰सी॰) और 30 मिनट के बाद, pilocarpine का एक इंजेक्शन (३५० मिलीग्राम/kg, आईएफसआई) स्थिति एपिलेप्टिकस (SE) प्रेरित करने के लिए सुई । इंजेक्शन methylscopolamine और वाहन (खारा) चूहों को नियंत्रित करने के लिए । सभी आईएफसआई प्रशासनों के लिए 25G सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का प्रयोग करें ।
    1. नेत्रहीन जानवरों की जांच करने के लिए व्यवहार बरामदगी शुरू करने के लिए (5 मिनट के भीतर vibrissa चलती, सिर हिला, अंगों की क्लोनिंग) और 25 मिनट के भीतर लगातार क्लोन सभी शरीर (एसई) ।
  3. एसई 2 एच गिरफ्तारी के बाद शुरुआत के बारे में 25% और एक डायजेपाम के प्रशासन द्वारा लगभग 10 दिनों की अव्यक्त अवधि के बारे में एक नश्वरता है (20 मिलीग्राम/ निरीक्षण और तुरंत pilocarpine इंजेक्शन के बाद किसी भी जब्ती व्यवहार शुरू रिकॉर्ड और उसके बाद कम से 6 ज के लिए जारी है ।
  4. (1 मिलीलीटर, आईएफसआई) 25G सुई और सुक्रोज समाधान (1 मिलीलीटर, पीओ) 1 मिलीलीटर सिरिंज और 2-3 दिनों के लिए लचीला खिला 17G सुई का उपयोग कर के बाद एसई शरीर के वजन घटाने की वसूली को बढ़ावा देने के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर जानवरों को दे ।
    1. जानवरों है कि पहले सप्ताह के भीतर प्रारंभिक शरीर के वजन को प्राप्त नहीं है बाहर अध्ययन से pilocarpine एसई के बाद (एक्यूट समूह के अलावा एसई, के बाद 24 एच मारे गए जहां शरीर के वजन का पालन संभव नहीं है) ।
  5. पोस्ट-एसई जानवरों बेतरतीब ढंग से अलग प्रयोगात्मक समूहों (चित्रा 3) के लिए असाइन करें: तीव्र चरण (जहां microdialysis जगह लेता है 24 के बाद एसई), विलंबता (7-9 दिन एसई के बाद), पहले सहज बरामदगी (लगभग 11 दिनों के बाद एसई), और जीर्ण अवधि ( के बारे में 22-24 दिन एसई के बाद शुरू होता है, यानी के बारे में 10 दिन पहले जब्ती के बाद) । सहज बरामदगी की घटना के लिए जानवरों की निगरानी ।
    नोट: मिरगी चूहों में आगे के प्रयोगों के लिए निम्नलिखित समावेशन/बहिष्करण मापदंड का उपयोग करें: pilocarpine प्रशासन के बाद 1 ज के भीतर ऐंठन एसई का विकास; पहले सप्ताह में वजन के बाद एसई और microdialysis जांच और इलेक्ट्रोड की सही स्थिति ।

4. मिरगी व्यवहार की निगरानी और विश्लेषण

  1. मिरगी व्यवहार की दीर्घकालिक निगरानी
    1. लगभग 6 pilocarpine प्रशासन के बाद एच (यानी, शोधकर्ताओं ने प्रत्यक्ष अवलोकन के अंत में), साफ घर पिंजरों में पशुओं जगह और 24 एच वीडियो निगरानी शुरू करते हैं ।
    2. 5 दिन तक 24 एच वीडियो निगरानी जारी रखें, एक डिजिटल वीडियो निगरानी प्रणाली का उपयोग कर ।
    3. 5 दिन में शुरुआत, उनके घर आयताकार पिंजरों में चूहों को सीमित ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली को जोड़ने और 24 एच वीडियो निगरानी जारी है ।
    4. फैराडे पिंजरे के बाहर तैनात एम्पलीफायर पर मापदंडों सेट (प्रत्येक एक जानवर के ईईजी संकेत की विशिष्टता के अनुसार प्रत्येक चैनल पर प्रवर्धन कारक सेट) और ईईजी द्वारा उत्पादित ईईजी संकेत देख के अधिग्रहण शुरू करने के लिए केबल. का प्रयोग करें नमूना दर २०० हर्ट्ज और कम पास फ़िल्टर सेट करने के लिए ०.५ हर्ट्ज.
    5. एक हाथ के दो फैला उंगलियों के बीच एक जानवर का सिर पकड़े और अन्य मुक्त हाथ का उपयोग इलेक्ट्रोड कुरसी के लिए connectors नीचे पंगा लेना केबल के लिए पशु कनेक्ट. अर्जी सुरु करा.
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि संकेत कलाकृतियों से मुक्त है । आम कलाकृतियों बहुत बड़े पैमाने से अधिक spikes हैं ।
    6. microdialysis प्रयोग से एक दिन पहले, microdialysis के लिए सामिल सिलिंडरों से लैस tethered ईईजी प्रणाली में जानवरों का स्थानांतरण । पशु रोकना बिना इलेक्ट्रोड से connectors पंगा लेना घर पिंजरे में ईईजी tethering प्रणाली से जानवरों को डिस्कनेक्ट. पशु को उच्च सामिल सिलिंडर में रखें ।
  2. एक दिन पहले और microdialysis सत्र के दौरान मिरगी व्यवहार की निगरानी
    1. फैराडे पिंजरे के बाहर तैनात एम्पलीफायर पर स्विच. ईईजी सॉफ़्टवेयर खोलें । ईईजी अधिग्रहण ईईजी कनेक्ट केबल द्वारा उत्पादित संकेत देख शुरू करते हैं ।
    2. एक हाथ की दो फैला उंगलियों के बीच एक जानवर के सिर पकड़े और अन्य मुक्त हाथ का उपयोग इलेक्ट्रोड कुरसी के लिए connectors नीचे पंगा लेना सीमित ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली के लिए पशु कनेक्ट. ईईजी संकेत पैमाने में है तो एक जानवर के इलेक्ट्रोड संकेत के अनुसार एम्पलीफायर के प्रत्येक चैनल पर एक प्रवर्धन कारक (लाभ) सेट करें. पशु शोधकर्ता के प्रत्यक्ष अवलोकन के तहत कम से 1 ज के लिए नए पिंजरे (सिलेंडर) का पता लगाने दें ।
    3. नोट: 24 ज microdialysis प्रयोग से पहले, चूहों microdialysis जांच करने के लिए गाइड cannulas के स्विच के लिए isoflurane के साथ संक्षेप में anesthetized हैं । उस पल का लाभ उठाएं जब उन्हें ईईजी रिकॉर्डिंग सिस्टम से कनेक्ट करने के लिए anesthetized जाए ।
    4. छोटा या जानवर की वस्तु के अनुसार लटकता हुआ केबल लम्बा. सुनिश्चित करें कि केबल जानवर की गतिविधियों और झूठ बोल मुद्रा के साथ हस्तक्षेप नहीं करते ।
    5. वीडियो कैमरों की सही छवि तैयार करने के लिए जांच करें । वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें ।
  3. बरामदगी और ईईजी गतिविधि की पहचान
    1. वीडियो देखने के लिए एक सॉफ्टवेयर प्लेयर का उपयोग करें । फिल्म 8 बार वास्तविक समय खेल से अधिक तेजी से स्क्रॉल करें और सामान्यीकृत बरामदगी individuate (forelimb clonus या पशु पालन के साथ रियर के लिए पशु को देखने और forelimb clonus के साथ गिरने). वीडियो धीमा और व्यवहार जब्ती के अंत और शुरुआत का सटीक समय ध्यान दें ।
    2. वीडियो रिकॉर्ड के 24 ज में मनाया सामान्यीकृत बरामदगी की संख्या की गणना के द्वारा डेटा की प्रक्रिया और जब्ती आवृत्ति और अवधि के रूप में सभी बरामदगी के मतलब मूल्यों में मनाया 24 एच
    3. उच्च आवृत्ति के कंपकंपी गतिविधि की अवधि के रूप में ईईजी बरामदगी को परिभाषित (> 5 हर्ट्ज) 3 एस2,४४ की एक न्यूनतम के लिए रहता है कि कील आवृत्ति की प्रगति के साथ आधार रेखा से अधिक एक > 3-गुना आयाम वृद्धि की विशेषता है या इसी तरह28. कच्चे ईईजी रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया के लिए ईईजी सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । ईईजी अंश को 1 h अंशों में विभक्त करें । सॉफ्टवेयर स्वचालित स्पाइक विश्लेषण के लिए फ़ाइल के लिए ईईजी ट्रेसिंग अंशों की प्रतिलिपि बनाएँ ।
    4. ईईजी सॉफ़्टवेयर और पूर्वनिर्धारित पैरामीटर्स (4.3.3.) का उपयोग करके ईईजी गतिविधि डेटा का विश्लेषण करें । दो स्वतंत्र जांचकर्ताओं जो विश्लेषित पशुओं के समूह के लिए अंधा कर रहे है में सभी वीडियो विश्लेषण आचरण । फर्क के मामले में, उंहें फिर से एक साथ डेटा की जांच करने के लिए एक आम सहमति४५तक पहुंचने ।

5. Microdialysis

  1. इन विट्रो में जांच वसूली
    1. इसकी सुरक्षात्मक आस्तीन में हैंडलिंग, निर्माता के निर्देशों के अनुसार अपने पहले प्रयोग के लिए जांच की तैयारी करें ।
    2. तपसिल में प्रयोग चलाएं: तीन १.५ मिलीलीटर परीक्षण ट्यूबों के साथ उंहें लोड हो रहा है रिंगर के मानकों के मिश्रण युक्त समाधान के 1 मिलीलीटर (२.५ ग्लूटामेट की µ एम और २.५ µ एम के aspartate) । ब्लॉक हीटर में तीन भरी हुई १.५ मिलीलीटर परीक्षण ट्यूबों डाल ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट और यह सरगर्मी पर स्थिति ।
      नोट: क्रोमैटोग्राफी अंशांकन के लिए एक ही मानक समाधानों का उपयोग करें ।
    3. तेल फिल्म के साथ १.५ मिलीलीटर परीक्षण ट्यूबों सील और यह तेज चिमटी से पंचर व्यास में के बारे में 1 मिमी के एक छेद कर ।
    4. जांच लें और इसे आयल फिल्म में बने होल में डालें । झिल्ली में विसर्जित करने के लिए समाधान के स्तर के तहत कम से 2 मिमी । आगे तय जांच करने के लिए १.५ एमएल आयल फिल्म द्वारा टेस्ट ट्यूब ।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि टिप १.५ मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब की दीवारों को छूने नहीं है ।
    5. सिरिंज FEP-टयूबिंग और टयूबिंग एडाप्टर का उपयोग कर पंप पर घुड़सवार करने के लिए जांच प्रवेश कनेक्ट । वैकल्पिक, ०.२८ मिमी आईडी और ०.६१ मिमी आयुध डिपो और रंग टयूबिंग एडाप्टर (लाल और नीले टयूबिंग एडाप्टर) के कनेक्शन के लिए ठीक बोर पॉलीथिन टयूबिंग का उपयोग करें ।
    6. 2 µ l/मिनट पर पंप शुरू और तरल पदार्थ आउटलेट टिप पर दिखाई देते हैं । ०.२ मिलीलीटर संग्रह परीक्षण ट्यूब FEP-टयूबिंग और टयूबिंग एडाप्टर का उपयोग कर जांच आउटलेट कनेक्ट करें ।
      नोट: सभी कनेक्शन के लिए FEP-टयूबिंग का उपयोग करें । एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करके टयूबिंग की वांछित लंबाई में कटौती । प्रवेश और जांच के आउटलेट के लिए अलग रंग की टयूबिंग एडेप्टर का प्रयोग करें । ६० मिनट के लिए पंप चलाने चलो लीक और हवा के बुलबुले के लिए जांच करें । ये उपस्थित नहीं होना चाहिए.
    7. प्रवाह दर 2 µ l/मिनट के लिए पंप सेट और टयूबिंग के आउटलेट पक्ष पर नमूनों को इकट्ठा करने के लिए शुरू करते हैं ।
    8. ३ ३० मिन perfusate नमूने और १.५ मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में समाधान के तीन बराबर मात्रा नमूने ले लीजिए । १.५ मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब से बराबर मात्रा नमूने ले हर 30 मिनट १.५ मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में मानक समाधान में डूबे microsyringe का उपयोग कर ।
    9. प्रयोग को दोहराएँ (5.1.1-5.1.8) पंप की स्थापना के लिए प्रवाह की दर 3 µ l/मिनट (5.1.7) के लिए एक जांच वसूली तुलना जब दो अलग छिड़काव प्रवाह दरों का उपयोग कर ।
    10. जब समाप्त, पंप बंद करो और आसुत जल, ७०% इथेनॉल के साथ ट्यूबिंग कुल्ला और यह हवा में धक्का । साफ आसुत पानी से भरी शीशी में जांच की दुकान । यह 2 µ l/मिनट पर आसुत जल से पहले भंडारण perfusing द्वारा जांच अच्छी तरह से कुल्ला ।
    11. क्रोमैटोग्राफी द्वारा नमूनों में ग्लूटामेट और aspartate की एकाग्रता का विश्लेषण करें (नीचे दिए गए विवरण देखें; ६.३) ।
    12. निंन समीकरण का उपयोग कर पुनर्प्राप्ति परिकलित करें:
      वसूली (%) = (Cperfusate परिdialysed समाधान) x १००.
  2. स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में Microdialysis सत्र
    1. Preparative प्रक्रियाओं: जांच प्रविष्टि और परीक्षण, अर्क पंप की स्थापना और शुरू
      1. निर्माता उपयोगकर्ता के गाइड के अनुसार पहले प्रयोग के लिए microdialysis जांच तैयार है और उंहें घंटी समाधान के साथ भरें । FEP के बारे में 10 सेमी लंबे टुकड़े-टयूबिंग कटौती और उंहें प्रवेश और जांच के आउटलेट cannulas अलग रंग की टयूबिंग एडेप्टर का उपयोग कर कनेक्ट ।
      2. सुनिश्चित करें कि टयूबिंग सभी कनेक्शन में कोई मृत अंतरिक्ष के साथ एडेप्टर को छू लेती है ।
      3. 5.2.1.3 .24 एच microdialysis प्रयोग से पहले, anesthetize संक्षेप में isoflurane के साथ पशु (हवा में 5%) एक प्रेरण चैंबर में लेटा हुआ तक । चिमटी का उपयोग कर अपने गाइड से डमी प्रवेशनी निकालें और जानवर के सिर मजबूती से पकड़े । microdialysis जांच डालें, एक dialyzing झिल्ली के साथ संपंन, गाइड प्रवेशनी और फर्म में microdialysis क्ले मॉडलिंग से अपने गाइड में डाला cannulas आगे ।
        सावधानी: जांच करते समय सुरक्षात्मक जांच आस्तीन की दीवारों को छूने से न दें ।
      4. सामिल सिलेंडर में जानवर डाल दें और उसे नए माहौल का पता लगाएं । ऊपर वर्णित के रूप में सीमित ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली के लिए पशु कनेक्ट (अंक 4.2.2 और 4.2.3 का पालन करें).
      5. जाग और आज़ादी से चूहे आंदोलनों चलती का पालन करें और टयूबिंग एडाप्टर का उपयोग कर घंटी के समाधान युक्त कुंद 22G सुई के साथ २.५ मिलीलीटर सिरिंज के लिए जांच के प्रवेश कनेक्ट । जांच के अंदर है रिंगर समाधान पुश 10 में घंटी समाधान के 1 मिलीलीटर निकालने के लगातार २.५ मिलीलीटर सिरिंज के पिस्टन धक्का एस । आउटलेट पर दिखने तरल की बूंद के लिए जांच करें । जांच अब उपयोग के लिए तैयार है ।
      6. रिंगर समाधान के साथ टयूबिंग एडाप्टर द्वारा FEP-टयूबिंग से जुड़े २.५ मिलीलीटर सीरिंज भरें और अर्क पंप पर उन्हें माउंट । 2 µ l/मिनट पर पंप शुरू करो । इसे रात भर चलने दो ।
        नोट: सभी FEP-टयूबिंग की वांछित लंबाई का उपयोग करें, लेकिन जब उच्च K+ उत्तेजना शुरू किया जाना चाहिए और पशु मस्तिष्क में neurochemical परिवर्तन के साथ ठहराव डेटा सहसंबंधी करने के लिए पता लगाने के लिए टयूबिंग मृत मात्रा की गणना । इस समय की गणना करने के लिए कार्य प्रवाह के तहत टयूबिंग में बनाया हवा बुलबुला का उपयोग करें ।
    2. ईईजी रिकॉर्डिंग और पोटेशियम उत्तेजना के दौरान नमूनों का संग्रह
      1. नमूना संग्रह (वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग) की शुरुआत के पीछे 3 एच में बरामदगी के अभाव की पुष्टि करें और microdialysis के दौरान जब्ती गतिविधि की निगरानी करने के लिए जारी है ।
      2. FEP-टयूबिंग cannulated सीरिंज रिंगर समाधान के साथ भरा ले जाने पंप बंद करो । पंप पर माउंट २.५ एमएल सिरिंजों के एक और सेट FEP से जुड़े-टयूबिंग एडेप्टर १०० mM K+ समाधान युक्त एक संशोधित घंटी समाधान के साथ भरा ।
      3. 2 µ l/मिनट पर पंप शुरू और इसे चलाते हैं । टयूबिंग के और अधिक तेजी से भरने के लिए, भरने के समय के लिए 5 µ l/ प्रणाली में हवा के बुलबुले के अभाव के लिए जांच करें । यह सुनिश्चित करें कि टयूबिंग सभी कनेक्शन में कोई मृत अंतरिक्ष के साथ एडेप्टर को छू लेती है ।
      4. परीक्षण जांच अगर पशु में उपयोग के लिए तैयार के रूप में ऊपर वर्णित (5.2.1.5) ।
        नोट: अगर किसी कारण से जांच का काम नहीं होता है तो उसे बदल कर रखें । इन मामलों के लिए, कुछ तैयार microdialysis जांच microdialysis-ईईजी कार्य केंद्र के पास उपयोग करने के लिए तैयार रखें । ईईजी केबल से जानवर डिस्कनेक्ट और परिवर्तन का एहसास करने के लिए आवश्यक isoflurane के साथ इसे संक्षेप में anesthetize.
      5. प्रत्येक जानवर में जांच के प्रवेश प्रवेशनी के लिए घंटी है रिंगर समाधान के साथ भरा सीरिंज के FEP-टयूबिंग कनेक्ट और आउटलेट की नोक पर तरल ड्रॉप की उपस्थिति के लिए प्रतीक्षा करें ।
      6. जांच के आउटलेट FEP-टयूबिंग, जो परीक्षण ट्यूब में संग्रह करने के लिए सुराग के लिए कनेक्ट । एक छिद्रित टोपी के साथ बंद ०.२ मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में FEP-टयूबिंग डालें । सुनिश्चित करें कि ट्यूब क्ले मॉडलिंग का एक टुकड़ा के साथ फिक्सिंग से जगह में रहता है ।
      7. 2 µ एल पर पंप चलाने के लिए जारी रखें/६० मिनट के लिए नमूने इकट्ठा करने के लिए प्रणाली (शूंय नमूना) equilibrate बिना ।
      8. आधारभूत स्थितियों (सामान्य घंटी समाधान के साथ छिड़काव) के तहत 5 लगातार 30 मिनट अपोहित नमूने (६० µ l संबंधित मात्रा) लीजिए. बर्फ पर नमूनों की दुकान ।
      9. यह जानवर के सिर में पंप से पारित करने के लिए तरल लेता है समय की गणना (यह ट्यूबिंग, यानी, हवा बुलबुला समय की मृत मात्रा पर निर्भर करता है) और FEP-टयूबिंग है कि सिरिंजों से युक्त करने के लिए सामान्य घंटी समाधान युक्त सीरिंज से चला जाता है स्विच संशोधित (१०० mM K+) है घंटी समाधान पंप रोक के बिना इस समय । प्रणाली में हवा के बुलबुले के अभाव के लिए जांच करें । 10 मिनट के लिए पंप चलाने दो ।
        सावधानी: उच्च K+ उत्तेजना के 10 मिनट में, जानवरों के लिए खुद को भागमभाग और आम तौर पर गीले कुत्ते की एक बड़ी संख्या में मौजूद है (नियंत्रण और जब्ती क्लस्टर जानवरों के बाहर) या व्यवहार बरामदगी (मिरगी जानवरों), तो हस्तक्षेप करने के लिए तैयार हो जाते है घुमा से टयूबिंग और केबल की रक्षा करना ।
      10. 10 मिनट के बाद, सामांय है घंटी समाधान के लिए १०० mM K+ है घंटी समाधान युक्त सीरिंज से टयूबिंग स्विच और पंप चलाने दो । समाधान परिवर्तन के दौरान पंप बंद नहीं है कि इतना है कि वहां टयूबिंग के अंत में तरल की एक बूंद को लाइन में जुड़ा होगा ।
      11. जिस क्षण में अपोहित उच्च पोटेशियम, अर्थात्, पांचवें पोस्ट-equilibration अपोहित के संग्रह के बाद, 1 एच के लिए अपोहित अंश हर 10 मिनट (20 µ एल) इकट्ठा करने के लिए 3 अतिरिक्त 30 मिनट अपोहित नमूने ले लीजिए और बंद करो पंप. बर्फ पर नमूनों की दुकान ।
      12. नमूने पर-८० ° c प्रयोग के बाद HPLC विश्लेषण तक स्टोर ।
      13. दोहराएं लगातार 3 दिनों के लिए microdialysis प्रयोग, तीव्र (24 ज) और पहली जब्ती समूह है, जिसमें केवल एक microdialysis सत्र 24 घंटे के बाद एसई या 24 घंटे के भीतर पहली सहज बरामदगी (चित्रा 3) के बाद लेता है के अलावा ।
      14. प्रत्येक प्रयोग के पूरा होने पर, एक संवेदनाहारी अधिक मात्रा के साथ पशु euthanize और जांच और इलेक्ट्रोड स्थान के सत्यापन के लिए मस्तिष्क को दूर.
  3. पोस्ट-microdialysis कार्यविधियां
    1. आसुत जल के साथ इस्तेमाल किया microdialysis जांच कुल्ला और उंहें एक अगले प्रयोग जब तक साफ आसुत पानी से भरी शीशी में स्टोर ।
      नोट: reused झिल्ली पारगम्यता बढ़ सकता है; इसके दोहराया उपयोग से पहले जांच वसूली के लिए जांच करें ।
    2. पूरी microdialysis कुल्ला (टयूबिंग, connectors और सीरिंज) आसुत जल के साथ ७०% इथेनॉल के बाद की स्थापना की । हवा के साथ इथेनॉल बदलें और एक बाँझ वातावरण में स्थापित की दुकान ।
    3. बेसल अपोहित नमूनों को 20 µ l अंशों में विभक्त करें और एमिनो एसिड बेसल एकाग्रता विश्लेषण के लिए केवल १ २० µ l अंश का उपयोग करे । शेष नमूना वॉल्यूम को आगे या पुष्टि विश्लेषण के लिए-८० ° c पर संग्रहीत ।
    4. 10% formalin में दिमाग को ठीक करें और उंहें तेल-embedding द्वारा रक्षित1। कोरोनरी स्लाइस में दिमाग अनुभाग और उंहें hematoxylin और eosin के साथ दाग । सही जांच और इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट1,2के लिए दिमाग की जांच करें ।
      नोट: ठंडा 2 में दिमाग ठीक-methylbutane और उन पर दुकान-८० ° c । तंत्रिका ऊतक वर्गों जो जांच और इलेक्ट्रोड पथ कल्पना करने के लिए परमिट पर किसी भी अन्य सिद्ध धुंधला का उपयोग करें ।

6. ग्लूटामेट और Aspartate का क्रोमेटोग्राफिक विश्लेषण

  1. derivatizing एजेंट की तैयारी
    1. orthophthaldialdehyde रिएजेंट (OPA) और शीशी में 2-mercaptoethanol (5-ME) के संबंधित खंड 20:1 (v/v) को मिलाएं । कैप और एयर टाइट पट का प्रयोग करके शीशी को बंद करें ।
      सावधानी: रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं ।
    2. भंवर तैयार समाधान और derivatizing एजेंट के लिए स्थिति में यह नमूना में डाल दिया ।
  2. अपोहित के नमूने तैयार
    1. गिलास डाल दो मिलीलीटर भूरे रंग का नमूना शीशी में नीचे वसंत के साथ डालें । एक बैच में मापा सभी नमूनों के लिए शीशियों तैयार करते हैं ।
    2. -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से 20 µ एल डायलिसिस नमूनों ले लो और उन्हें पिघल जाने । समाधान के 1 µ l को निकालें और आंतरिक मानक के 1 µ l को जोड़ें (है) l-Homoserine (५० µ m) नमूने के 19 µ l के लिए, इस प्रकार के नमूने में २.५ µ m का है । पिपेट में डायलिसिस के नमूने की 20 µ एल शीशी में डालें और उसे एक एयर टाइट पट के साथ सील कर दीजिये.
    3. क्रोमेटोग्राफिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अपने पदों में नमूनों लेबल के लिए नमूना में नमूने युक्त शीशियों रखें.
  3. ग्लूटामेट और aspartate एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए नमूनों का क्रोमेटोग्राफिक विश्लेषण
    1. spectrofluorometric डिटेक्शन के साथ लिक्विड chromatograph सिस्टम पर विश्लेषण चलाएं । orthophthaldialdehyde/5 के 20 μL के साथ 2 मिनट पूर्व कॉलम derivatization के बाद अमीनो एसिड का पता लगाने-mercaptoethanol 20:1 (v/
    2. एमिनो एसिड विश्लेषण के लिए प्रणाली तैयार करते हैं । पारखी पर स्विच, पंप, degasser, डिटेक्टर और कंप्यूटर के साथ एक साथ यूनिट को नियंत्रित.
    3. मोबाइल चरण युक्त बोतलों में अपना खाना विसर्जित करें और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की जाने वाली क्रोमेटोग्राफिक पम्प के चैनलों को पर्ज करें ।
    4. शुरू कॉलम पर दबाव की जांच के लिए मोबाइल चरण के प्रवाह को बढ़ाने के लिए (जैसे, ०.२ मिलीलीटर/मिनट में शुरू और अतिरिक्त ०.२ एमएल के लिए प्रवाह को बढ़ाने के लिए हर 5 मिनट और कार्य प्रवाह को प्राप्त करने तक) । प्रणाली को काम पर चलाने के प्रवाह ०.८ एमएल/मिनट के लिए कम से 1 h के लिए कॉलम equilibrate ।
      सावधानी: अस्थिर दबाव प्रणाली में हवा की उपस्थिति को इंगित करता है । दबाव 25 MPa से अधिक नहीं होना चाहिए ।
    5. लाभ, उच्च संवेदनशीलता और उत्तेजना और 345/455 एनएम के लिए क्रमशः डिटेक्टर पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट करें । डिटेक्टर संकेत (शूंय) रीसेट करें ।
    6. क्रोमेटोग्राफिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, साधन के लिए विधि भेजें. अब chromatograph को नाप कर तैयार करना चाहिए ।
    7. अपोहित नमूनों, मानक नुकीला अपोहित नमूनों के साथ ही मानकों (०.२५ µ एम – २.५ µ m aspartate और रिंगर समाधान में ग्लूटामेट) को अलग-अगल उपयुक्त क्रोमेटोग्राफिक कॉलम पर पृथक करें । क्रोमेटोग्राफिक विधि जांचना और किसी भी डायलिसिस नमूनों विश्लेषण से पहले पता लगाने और ठहराव सीमा की स्थापना ।
    8. एकल विश्लेषण को सक्रिय या क्रोमैटोग्राफी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा करने के लिए नमूनों की अनुक्रम बनाने के लिए और अनुक्रम चलाते हैं ।
      सावधानी: विधि सटीकता को नियंत्रित करने के क्रम में अपोहित नमूनों के अनुक्रम के भीतर एक से अधिक रिक्त नमूना और विभिन्न मानक नमूने चलाएँ.
    9. एक बार chromatograms प्राप्त कर रहे हैं, उंहें क्रोमैटोग्राफी सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण । अंशांकन भूखंड में ब्याज की चोटियों के एकीकरण की जाँच करें । ठहराव के लिए पीक ऊंचाई या पीक क्षेत्र का उपयोग करें ।
    10. एक बार नमूना रिकॉर्डिंग समाप्त हो गया है कॉलम और एक कार्बनिक विलायक (जैसे, ultrapure पानी में ५०% acetonitrile) के साथ प्रणाली को भरने के लिए इसकी उंर बढ़ने और इसे में ढालना वृद्धि को रोकने के ।
    11. शट डाउन सिस्टम ।

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Representative Results

जांच वसूली

मतलब वसूली (यानी, शीशी समाधान की एक बराबर मात्रा में सामग्री के एक प्रतिशत के रूप में perfusate में एमिनो एसिड सामग्री का मतलब है) 2 μL/min और ६.३२ ± ०.६४ की एक प्रवाह दर पर १५.४९ ± ०.४२% ग्लूटामेट और १४.८९ ± ०.३६% के लिए 3 μL/ μL/min और १०.१३ ± ०.५१ पर 3 μL/aspartate के लिए cuprophane झिल्ली जांच का उपयोग करते समय । यदि polyacrylonitrile झिल्ली जांच का उपयोग कर, मतलब वसूली १३.६७ ± ०.४२% 2 μL/मिनट और ६.५५ ± १.०७ के प्रवाह की दर पर 3 μL/2 μL/min और ८.४९ ± ०.१५ की एक प्रवाह दर पर ग्लूटामेट और १४.२९ ± ०.६२% aspartate (चित्रा 4a-4B) के लिए 3 μL/ के रूप में यह स्पष्ट रूप से चित्रा 4aमें देखा जा सकता है, धीमी प्रवाह दर (2 μL/दोनों की जांच के dialyzing प्रदर्शन को बढ़ाता है । निंनलिखित प्रयोगों के लिए cuprophane झिल्ली संपंन जांच perfused एक प्रवाह दर 2 μL/मिनट में चुना गया था, क्योंकि इसका मतलब वसूली उच्च था (भले ही काफी नहीं) दोनों analytes के लिए इस प्रवाह की दर पर और प्रयोगात्मक निरंतरता की वजह से (इन जांच वरीयता में गाबा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया1).

बरामदगी विकास और स्थिति एपिलेप्टिकस के बाद रोग की प्रगति

बरामदगी के व्यवहार और ईईजी निगरानी, उनके मूल्यांकन, इन में TLE रोग के विकास और प्रगति की पुष्टि करने के लिए इस अध्ययन में कार्यरत सभी जानवरों में किया गया था ।

मजबूत ऐंठन एसई, कि 3 डायजेपाम के बाद एच का उपयोग कर बाधित किया गया था, pilocarpine इंजेक्शन के बाद 25 ± 5 मिनट हुई । फिर, सभी जानवरों को एक विलंबता राज्य जिसमें वे जाहिरा तौर पर अच्छी तरह से किया गया है और वे लगातार वीडियो-ईईजी निगरानी के क्रम में सत्यापित करने के लिए कि कोई सहज बरामदगी पहले 9 दिनों में हुई या पहले सहज जब्ती की पहचान करने के लिए, क्रमशः के लिए विलंबता और पहले जब्ती समूह । पहली सहज बरामदगी ११.३ ± ०.६ दिनों के बाद एसई (मतलब ± SEM, n = 21) हुई । इसके बाद, बरामदगी समूहों में हुई, और समय में बढ़ । देर जीर्ण चरण में (दिन 55-62 के बाद एसई) मिरगी चूहों 3.3 ± 1.2 अनुभव (± SEM मतलब, n = 12) सामान्यीकृत बरामदगी दैनिक । बीमारी की स्पष्ट प्रगति हुई । कई, लेकिन नहीं सभी ईईजी बरामदगी, व्यवहार जब्ती गतिविधि के साथ संगत । चित्रा 5B दर्ज की गई कंपकंपी epileptiform गतिविधि से पता चलता है कि के बारे में ५०० ms पहले और व्यवहार बरामदगी के दौरान मनाया गया था । आकृति 5 गैर-मिरगी चूहों में नियंत्रण निशान दिखाता है ।

microdialysis perfusate और पोटेशियम में पाया एमिनो एसिड के प्रतिनिधि बेसल मूल्यों ग्लूटामेट की रिहाई को प्रेरित

जीर्ण मिरगी चूहों में पाया बेसल ग्लूटामेट एकाग्रता (०.८७ ± ०.०६ µ मीटर) नियंत्रण पशुओं की तुलना में काफी अधिक था (०.५९ ± ०.०३ µ m; p < ०.०५ बनाम नियंत्रण; एक तरफ़ ANOVA और पोस्ट हॉक Dunnett का परीक्षण) । जीर्ण मिरगी के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था (०.३१ ± ०.०४ µ एम) और गैर मिरगी पशु (०.३० ± ०.०५ µ m) बेसल या उच्च K+ पैदा aspartate सांद्रता में. विवरण2के लिए मूल लेख देखें । नियंत्रण चूहों में ग्लूटामेट की रिपोर्ट बेसल स्तर समान अध्ययन में दूसरों के द्वारा पाया उन लोगों के साथ कतार में हैं (यानी, के बारे में ०.७५ µ एम जब एक 2 µ एल का उपयोग कर/न्यूनतम प्रवाह और 2 मिमी प्रभावी लंबाई की झिल्ली)४६,४७,४८ ,४९,५०,५१,५२,५३। हालांकि, कई विभिंन कारकों microdialysis के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, उदाहरण के लिए जांच की प्रभावी लंबाई और झिल्ली कट ।

उच्च K+-नियंत्रण चूहों में के बारे में 30 मिनट के लिए और क्रोनिक मिरगी चूहों में के बारे में ६० मिनट (चित्रा 6) के लिए ग्लूटामेट की एक अतिरिक्त रिलीज पैदा की । विवरण2के लिए मूल लेख देखें । के रूप में चित्रित समय पाठ्यक्रम से देखा जा सकता है, microdialysis के 10 मिनट का समय संकल्प पशुओं के दोनों समूहों में पाया ग्लूटामेट रिलीज में विचरण पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त था ।

HPLC अंशांकन और सीमाएं

डेटा की गणना ग्लूटामेट और aspartate के मानक समाधानों और आंतरिक मानक L-homoserine के साथ प्राप्त अंशांकन curves के आधार पर की गई थी । perfusates में न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट और aspartate की एकाग्रता निरपेक्ष मूल्यों में व्यक्त किया गया था (µmol/ प्रत्येक अंशांकन साजिश चार एकाग्रता के स्तर पर ग्लूटामेट और aspartate के समाधान के विश्लेषण के द्वारा निर्माण किया गया था (पांच प्रत्येक स्तर पर दोहराने) । प्रतीपगमन गुणांक के लिए अंशांकन भूखंडों की गणना की गई: y = kx + q, जहां x aspartate या ग्लूटामेट की एकाग्रता का अनुपात था l-homoserine (IS) और y aspartate या ग्लूटामेट का संगत पीक-क्षेत्र अनुपात था l-homoserine ( है) । निर्धारण (r2) के गुणांक की गणना की गई थी । HPLC विधि की प्रयोज्यता सीमाओं के भीतर थी; ठहराव की निचली सीमा मानक अंशांकन वक्र में सबसे कम एकाग्रता के रूप में निर्धारित किया गया था और अंशांकन के लिए एमिनो एसिड analytes के उच्चतम इस्तेमाल किया एकाग्रता के रूप में ठहराव की ऊपरी सीमा, क्रमशः । सीमा का पता लगाने (लोद) की भी गणना की गई. इनमें से कुछ मान तालिका 1में delineated हैं । एक मॉडल वर्णलेख खाली नमूना, मानक नमूना और एकत्र डायलिसिस नमूना वर्णित विधि से ऊपर के साथ प्राप्त की चित्रा 7में दिखाया गया है ।

जांच स्थानीयकरण

Microdialysis जांच और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सही ventral हिप्पोकैम्पस में प्रत्यारोपित किया गया और उनकी सही नियुक्ति सत्यापित किया गया था । केवल उन जानवरों जहां आरोपण स्थिर निर्देशांक से ५०० माइक्रोन दूर में अधिक से अधिक था ( चित्र देखें 8) विश्लेषण में शामिल थे.

Figure 1
चित्र 1. कदम दर कदम उपकरण प्रत्यारोपित करने की तैयारी । (A) 3-चैनल इलेक्ट्रोड के साथ 10 सेमी लंबे समय तक अपने सुरक्षात्मक आस्तीन में इलेक्ट्रोड के लिए छोड़ दिया और गाइड प्रवेशनी पर microdialysis के लिए सही डिवाइस को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक. (ख). नंगे इलेक्ट्रोड और गाइड प्रवेशनी विस्तार से । पहला कदम (सी) को हटाने और (घ) धातु गाइड प्रवेशनी से और इसके प्लास्टिक डमी कुछ समय में अपनी रिहाई को कम करने के लिए है एक बार जानवर के सिर में प्रत्यारोपित । दूसरे चरण के लिए दो बार मुड़ इलेक्ट्रोड पंजीकृत करने के लिए डायलिसिस गाइड प्रवेशनी (ई, एफ) के लिए गठबंधन किया है झुकना है । (छ) इलेक्ट्रोड टिप धातु गाइड प्रवेशनी की नोक से ०.५ मिमी लंबे समय तक कटौती की जानी चाहिए. (एच) डिजिटल कैलिपर का उपयोग कर कटौती की परिशुद्धता के लिए जांच करें । बाद में, के बारे में 1 मिमी लंबे सिलिकॉन circlet प्रवेशनी पैर गाइड करने के लिए इलेक्ट्रोड के संरेखण को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए (I). (ञ) कैसे इलेक्ट्रोड और गाइड प्रवेशनी शाफ्ट अंगूठी के लिए दिखा तस्वीर । अंतिम चरण के लिए यह (कश्मीर) सिलिकॉन circlet फिक्सिंग गाइड प्रवेशनी कुरसी पर राल या गोंद की एक बूंद डाल दिया है । (ठ) निष्फल होने के लिए तैयार किए गए उपकरण इकट्ठे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. इस्तेमाल चूहों में microdialysis-ईईजी के लिए उपकरणों के विभिन्न प्रकार के फोटोग्राफ (ए) और जांच क्लिप धारक की तस्वीर (ख) इन उपकरणों प्रत्यारोपण करने के लिए इस्तेमाल किया. (a) मार्गदर्शिका प्रवेशनी (in green) प्रयोग से पहले एक microdialysis प्रवेशनी सामान्यतया 24 h द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है. उपकरण के विद्युत संबंधक (पहले छोड़ दिया इस पांडुलिपि में वर्णित रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था) तारों के लगाव है कि एम्पलीफायर और डेटा संग्रह उपकरणों के लिए बिजली के संकेत का संचालन परमिट । डिवाइस शल्य चिकित्सा anesthetized चूहों की खोपड़ी से जुड़ा हुआ है और रिकॉर्डिंग स्वतंत्र रूप से चूहों व्यवहार में दर्द या परेशानी के कारण के बिना बाद में प्राप्त किया जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. प्रायोगिक डिजाइन । सप्ताह के पहले स्थिति एपिलेप्टिकस (एसई) प्रेरण, चूहों डिवाइस के साथ प्रत्यारोपित कर रहे हैं । एसई pilocarpine और जानवरों से प्रेरित है (यदि dialyzed नहीं और के बाद एसई 24 में मारे गए; एक्यूट समूह से चूहों) वीडियो 5 दिनों के लिए निगरानी कर रहे हैं (ब्लू लाइन), तो वीडियो-जब्ती आवृत्ति और उनके घर पिंजरों में अवधि का आकलन करने के लिए निगरानी ईईजी (ग्रीन लाइन). microdialysis प्रयोग के लिए, मिरगी और संबंधित गैर मिरगी नियंत्रण चूहों एक और ईईजी स्थापित करने के लिए स्थानांतरित कर रहे है 24 में सिलेंडर पिंजरों से सुसज्जित microdialysis सत्र से पहले एच और अभी भी वीडियो-ईईजी (लाइट ग्रीन लाइन) पर नजर रखी । ऊर्ध्वाधर लाल लाइनों अलग समय पर डायलिसिस सत्र प्रतिनिधित्व मिरगी रोग के विकास के अंक । क्षैतिज लाल रेखाएं मिरगी पशुओं (और संबंधित गैर-मिरगी पशुओं) के विभिंन समूहों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जहां तीर microdialysis के अंतिम दिन और पशु की मृत्यु के दिन को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. इन विट्रो में दो डायलिसिस जांच की वसूली । इन इन विट्रो वसूली (%) aspartate और ग्लूटामेट के दो अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microdialysis जांच का उपयोग (दोनों 1 मिमी लंबी dialyzing झिल्ली के साथ संपंन) पर (A) 2 μL/min और (B) 3 µ l/मिनट प्रवाह दर । डेटा triplicates में चलाने के 3 स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± SEM हैं । विभिंन जांचों (छात्र के ख़राब t-परीक्षण, p < 0.05) की कुशलता के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है । एक प्रवाह दर 2 μL/मिनट का उपयोग ग्लूटामेट वसूली के बारे में 5% की तुलना में वृद्धि 3 µ l/ंयूनतम प्रवाह दर, इस प्रकार धीमी प्रवाह दर microdialysis प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. paraoxystic गतिविधियों के ventral हिप्पोकैम्पस से गाये ईईजी रिकॉर्डिंग के रूप में नियंत्रण और मिरगी चूहों में जीर्ण चरण में देखा जा सकता है । (क) दो के प्रतिनिधि दो खारा इलाज गैर मिरगी चूहों में दर्ज निशान । (ख) दो मिरगी चूहों में दर्ज किए गए निशान. Epileptiform फर्ज इन चूहों में वर्ग 3 व्यवहार बरामदगी के साथ मेल खाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. समय-चूहे हिप्पोकैम्पस से ग्लूटामेट रिहाई पर पोटेशियम उत्तेजना के प्रभाव के पाठ्यक्रम । microdialysis प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम 6 नियंत्रण (खुले हलकों) और 6 जीर्ण मिरगी चूहों (काले घेरे) में प्रदर्शन किया । ग्राफ microdialysis प्रयोगों के पाठ्यक्रम में और उच्च १०० mM K उत्तेजना के दौरान अपोहित ग्लूटामेट एकाग्रता के लौकिक परिवर्तन से पता चलता है । उच्च K+ उत्तेजना (10 मिनट) के समय ग्राफ के नीचे काली पट्टी द्वारा संकेत दिया है । डेटा समूह प्रति 6 पशुओं के अर्थ ± SEM हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. chromatograms का चित्रण. ज्ञात चोटियों लेबल हैं । पिंक स्ट्रेस: OPA/5-ME derivatization (खाली नमूना) के बाद जानबूझकर जोड़े गए अमीन के बिना घंटी के समाधान का वर्णलेख । ब्लू ट्रेस: एमिनो एसिड की चोटियों दिखा derivatization के बाद अपोहित नमूना के वर्णलेख: aspartate (टीआर ४.८० मिनट), ग्लूटामेट (टीआर ६.७५ मिनट) और glutamine (टीआर ९.१९ मिनट) और के शिखर है L-homoserine (२.५ µ मीटर, प्रतिधारण समय, टी आर ९.८३ मिनट) । लाल ट्रेस: रिंगर समाधान में aspartate (२.५ µ m) और ग्लूटामेट (२.५ µ मी) के मानक का वर्णलेख । चित्र का नीला और पीला पृष्ठभूमि मोबाइल चरण A (azure) और मोबाइल चरण B (पीला) भाग analytes रेफरेंस के लिए उपयोग के लिए खड़ा है । एक लाल आयत संकेत क्षेत्र (टीआर १०.४१ मिनट और आगे) अज्ञात पदार्थों और OPA गिरावट उत्पादों की चोटियों से पता चलता है । सभी इंजेक्शन वॉल्यूम 20 µ एल थे । डेरिवेटिव ०.८ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर अलग किया गया/ इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8. संयुक्त इलेक्ट्रोड के प्रतिनिधि छवि-ventral हिप्पोकैम्पस के भीतर जांच प्लेसमेंट. (क) तस्वीर विस्तार में डिवाइस टिप द्वारा छोड़ दिया डराने (काला तीर) से पता चलता है. (ख) इलेक्ट्रोड के योजनाबद्ध चित्रण-12 चूहों के प्रत्यारोपित ventral हिप्पोकैम्पस के भीतर जांच टिप पदों । ठोस चौकों (कुछ अतिव्यापी) सही स्थानीयकृत जांच-इलेक्ट्रोड युक्तियां संकेत मिलता है । खुला वर्ग गलत तरीके से स्थानीयकृत जांच-इलेक्ट्रोड युक्तियाँ (n = 3) अध्ययन से बाहर रखा गया जानवरों में इंगित करता है । कोरोनरी मस्तिष्क स्लाइसें युक्त जांच और रिकॉर्डिंग साइटों ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए प्रयोगों के बाद कार्रवाई की गई । चित्रण के ऊपर की संख्या Bregma से दूरी दिखाने के लिए (Pellegrino एट अल के अनुसार । १९७९ चूहे मस्तिष्क का एटलस; नाक बार + ५.० mm, co-ordinates उपयोग किया गया: A-३.४ mm, L + 5.4 mm; P + बाडी से ७.५ mm). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Analyte ग (μmol/ कश्मीर Q आर2 लोद (pmol/
ग्लूटामेट 0.25-2.5 ५.२१५ १०४३.७९ ०.९९९ १९.४
Aspartate 0.25-2.5 २.२५८ १९९४.७२ ०.९९८ ३१.७

तालिका 1. अमीनो अम्ल निर्धारण के लिए प्रयुक्त HPLC विधि की ठहराव विशेषताएँ. एकाग्रता मानकों की सीमा (c), ढलान (कश्मीर), अवरोधन (q), निर्धारण का गुणांक (r2) और (लोद) ग्लूटामेट और aspartate के मानक समाधानों के साथ प्राप्त अंशांकन भूखंडों का वर्णन (०.२५, ०.५, १.० और २.५ µ m का पता लगाने की सीमा ) और आंतरिक मानक L-homoserine (२.५ µ m) spectrofluorometric डिटेक्शन के साथ वर्णित HPLC विधि का उपयोग कर ।

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Discussion

इस काम में, हम बताते है कि कैसे एक सतत वीडियो ईईजी microdialysis के साथ युग्मित रिकॉर्डिंग TLE के एक प्रयोगात्मक मॉडल में प्रदर्शन किया जा सकता है । वीडियो ईईजी रिकॉर्डिंग तकनीक सही ढंग से पशुओं में रोग प्रगति के विभिन्न चरणों का निदान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और microdialysis तकनीक समय में होने वाले ग्लूटामेट रिलीज में परिवर्तन का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है (कोई परिवर्तन के लिए पाया गया है एक पहले प्रकाशित अध्ययन2में aspartate) । हम दृढ़ता से एक ही उपकरण के उपयोग की सिफारिश/समाविष्ट उन दोनों परिचय में चर्चा के कारणों के लिए प्रत्येक जानवर में प्रदर्शन ।

जब भी उपलब्ध, radiotelemetry पुरानी ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए सीमित प्रणालियों के लिए पसंद किया जाना चाहिए क्योंकि यह व्यवहार के साथ हस्तक्षेप को कम करता है और५४पशुओं के लिए नुकसान जोखिम और संकट को कम कर देता है । हालांकि, सीमित ईईजी रिकॉर्डिंग बहुत कम टेलीमेट्री की तुलना में महंगा है ।

हमारी प्रयोगशाला में, हम ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली और समानांतर में microdialysis टयूबिंग के लिए connectors का उपयोग करें, ऐसी है कि तारों और टयूबिंग दो अलग कुंडा से जुड़े हैं । यह इन प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा है: तारों और टयूबिंग जानवर की गतिविधियों के कारण अक्सर पार करने के लिए करते हैं । इसलिए, हम कनेक्टर्स और ट्यूबिंग का उपयोग करने के लिए पर्याप्त पशु अपनी पूंछ का पीछा (एक व्यवहार है कि आम तौर पर पोटेशियम उत्तेजना के साथ मनाया जाता है) या नीचे गिर और सामान्यीकृत मिरगी बरामदगी के दौरान रोल । यह फर्म को आगे microdialysis क्ले मॉडलिंग द्वारा अपने गाइड में डाला cannulas सलाह दी जाती है, ताकि गाइड के साथ अपने संपर्क को मजबूत बनाने के लिए (कई बार, microdialysis cannulas सामान्यीकृत बरामदगी के दौरान पिंजरे की दीवारों के खिलाफ टकरा रहे है और हो सकता है पर्ची बंद) । दूसरी ओर, यह ट्यूबिंग के रूप में संभव के रूप में कम रखने के लिए सलाह दी जाती है, neurochemical समय और संग्रह समय के बीच देरी को कम करने के लिए. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब संग्रह अवधि कम कर रहे हैं । सामांय में, microdialysis टयूबिंग पर्याप्त लंबाई और क्षमता का होना सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना समय डायलिसिस आउटलेट और संग्रह के बीच समय से अधिक नहीं है होना चाहिए । यह देखा गया कि solutes कुछ प्लग के बीच और अधिक फैलाना अगर टयूबिंग मृत समय नमूना दर५५करने के लिए बेहतर है करते हैं । इसलिए, प्रयोगात्मक मृत समय/microdialysis टयूबिंग की मात्रा जितना संभव हो कम किया जाना चाहिए और बहुत ठीक निर्धारित क्रम में पशुओं के व्यवहार के साथ ंयूरोकेमेस्ट्री डेटा सहसंबंधी बनाना । अंत में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि दोनों कुंडा और संयुक्त ईईजी और microdialysis अध्ययन के लिए प्रवेशनी के साथ मिलकर इलेक्ट्रोड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । इसलिए, जब भी संभव हो, microdialysis प्रयोगों को करने के विकल्प के साथ ईईजी प्रणाली की स्थापना की ।

मामूली सिफारिशें हैं: (i) किसी भी प्रयोग की शुरुआत करने से पहले, जांच लें कि ईईजी रिकॉर्डिंग सिस्टम और/या microdialysis सेट ठीक से काम कर रहे है और किसी भी समस्या का निवारण; हमारा सुझाव है कि एक आरक्षित होने के लिए तैयार (सीरिंज के साथ एक और पंप पर घुड़सवार और काम कर रहे समाधान के साथ भरा टयूबिंग के पूरा) जब प्रयोग प्रदर्शन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तैयार की एक पर्याप्त संख्या के रूप में microdialysis का उपयोग करने के लिए टूटी हुई बदलने के लिए जांच वालों (ii) जब काम ईईजी-microdialysis पिंजरे में पशु स्थानांतरित यह एक दूसरे व्यक्ति की सहायता और अधिग्रहण शुरू करने के लिए उपयोगी है; (iii) यह सुनिश्चित करें कि क्रोमैटोग्राफी से पहले स्तंभ और नमूना उपयुक्त तापमान पर पहुँच गया हो; इसके अलावा, मानकों का उपयोग करें और अंशांकन भूखंडों का निर्माण करने से पहले किसी भी अपोहित नमूने क्रोमेटोग्राफिक स्तंभ पर इंजेक्ट कर रहे हैं; (v) जब भी जरूरत हो, क्रोमेटोग्राफिक या अन्य विश्लेषणात्मक विधि को एक ही समय में एकाधिक analytes को मापने के लिए विकसित करने का प्रयास करें.

neurotransmission में परिवर्तन (मिर्गी सहित) कई सीएनएस विकारों में निहितार्थ है और वहां एक स्वस्थ से एक रोगग्रस्त phenotype के लिए प्रगति के दौरान इन परिवर्तनों को यों तो दशकों में एक महान ब्याज गया है । आज, केवल कुछ तकनीकों दिन या महीनों में न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में परिवर्तन की माप की अनुमति देते हैं. Microdialysis इन तकनीकों में से एक है । मामलों की एक बड़ी संख्या में, जैसे कि यहां वर्णित है, यह स्वतंत्र रूप से चलती पशुओं में प्रदर्शन किया और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) या केशिका ट्रो (CE), जिसके साथ यह पहुंचता है जैसे पारंपरिक ऑफ़लाइन विश्लेषणात्मक परख के लिए युग्मित है 5-30 न्यूनतम लौकिक संकल्प31,५६। जाहिर है, इन नमूना अंतराल synapses के आसपास के क्षेत्र में तेजी से न्यूरोट्रांसमीटर गतिशीलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, लेकिन कुछ दीर्घकालिक microdialysis अनुप्रयोगों के लिए सुविधाजनक हो सकता है (जैसे, रोग विकास या दवा प्रभाव अध्ययन) जो की आवश्यकता युग्मन neurochemical, ईईजी और व्यवहार डेटा । हालांकि, अंय अध्ययनों मुख्यतः वास्तविक समय को मापने या न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में वास्तविक समय परिवर्तन के करीब के साथ संबंध हैं । इन के लिए, microdialysis तकनीक (इसलिए नमूना मात्रा कम) नमूना की गति को बढ़ाने के लिए परिष्कृत किया जाना चाहिए. दरअसल, क्लासिक microdialysis तकनीक अक्सर अपने गरीब लौकिक (मिनट) और स्थानिक संकल्प के लिए आलोचना की है (पारंपरिक जांच बहुत synaptic फांक से बड़ा है)9,21,५६, ५७. तथापि, यह विश्लेषणात्मक विधि microdialysis क्या microdialysis समय संकल्प निर्धारित करता है की सामूहिक संवेदनशीलता है (यानी, अपने संकल्प के लिए पर्याप्त नमूना एक विश्लेषणात्मक द्वारा पता लगाया जा करने के लिए आवश्यक समय के बराबर है तकनीक५६) । इस प्रकार, जब microdialysis नमूनों की छोटी मात्रा का उत्पादन, ठहराव तकनीकों की संवेदनशीलता को बढ़ाया जाना चाहिए । तिथि करने के लिए, microdialysis तकनीक के लौकिक संकल्प में इस तरह के सुधार 3 अलग लाइनों पीछा किया । इनमें से एक miniaturization के स्तंभों और/या क्लासिक HPLC तरीकों की पहचान कोशिकाओं के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है; इन UHPLC कहा जाता है (अल्ट्रा-प्रदर्शन HPLC) तकनीक और 1-10 मिनट का समय संकल्प५८,५९,६०को प्राप्त करने की अनुमति । एक अंय दृष्टिकोण को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) या मिलकर (एमएस/एम एस के लिए एक क्लासिक HPLC है) न्यूरोट्रांसमीटर के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए मस्तिष्क dialysates में । संयुक्त HPLC-एमएस परख एक उत्कृष्ट संवेदनशीलता है और 1-5 मिनट के बारे में समय संकल्प५६,६१,६२,६३तक पहुंचने । सुधार की एक तीसरी पंक्ति केशिका ट्रो (CE) के संशोधनों में मौजूद है । यदि ce लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति डिटेक्शन (ce-LIFD) का उपयोग करता है, यह nanoliter अंशों में विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर के submicromolar सांद्रता का निर्धारण सक्षम बनाता है हर 5 मिनट५५,६४,६५ प्राप्त या यहां तक कि 10 एस अंतराल५६पर । एक स्पष्ट लाभ है कि UHPLCs या उंनत CEs विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण से उभर रहा है कि नमूना स्वतंत्र रूप से चलती पशुओं में किया जा सकता है, जो प्रयोग में सहज व्यवहार और देखा जाना चाहिए विश्लेषण समझौता नहीं है । दूसरी ओर, वहां तरीकों कि भी सौ मिसे लौकिक संकल्प पर मस्तिष्क अपोहित नमूना परमिट कर रहे है (जैसे, एंजाइम रिएक्टर पर आधारित लाइन परख या छोटी बूंद अपोहित की एमएस तकनीक को युग्मित संग्रह), लेकिन ये कर रहे है आमतौर पर नियंत्रित पशुओं में इस्तेमाल किया६६ या सामांय संज्ञाहरण के तहत६७,६८,६९, व्यवहार अध्ययन के साथ जोड़े microdialysis के लिए अनुमति नहीं है ।

जब microdialysis की दूसरी सबसे महत्वपूर्ण कमजोरी पर विचार, अर्थात्, झिल्ली आयामों के कारण अपेक्षाकृत कम स्थानिक संकल्प (अक्सर के बारे में ०.५ मिमी व्यास में और 1-4 मिमी लंबे), एक विकल्प कम प्रवाह के साथ विकसित microprobes हो सकता है पुश-पुल नमूना । इन जांचों से मिलकर दो सिलिका केशिकाओं (20 µm आईडी और २०० µm आयुध डिपो) साथ-साथ से जुड़े और एक बहुलक टयूबिंग के साथ खोल । प्रयोग के दौरान, इन केशिकाओं बहुत कम प्रवाह दर पर perfused हैं, इस तरह कि द्रव एक केशिका से बाहर निकाला जाता है और एक नमूना एक ही प्रवाह दर पर दूसरे से प्राप्त की है । नमूना जांच टिप पर ही होता है, क्योंकि स्थानिक समाधान microdialysis७०के लिए जांच के साथ से अधिक है । एक और संभावना को लघुकृत जांच से microelectrode arrays (के लिए स्विच है) वास्तविक समय न्यूरोट्रांसमीटर मूल्यांकन के लिए । अलग विद्युत तकनीक (voltammetry या amperometry पर आधारित) analyte नमूना बहुत synapse (माइक्रोन स्केल) के बहुत करीब है और कम 1 एस31,७०,७१में अनुमति देते हैं । इन उपकरणों के कई मस्तिष्क क्षेत्रों से कई analytes की एकाग्रता उपाय कर सकते हैं । हालांकि, वे भी कुछ शोधन की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए कलाकृतियों से बचने के लिए और एक अपेक्षाकृत तेजी से गिरावट ।

vivo neurochemical निगरानी में में नवीनतम अग्रिमों को ध्यान में रखते हुए, यह संभावना है कि विभिन्न ट्रांसमीटर नमूना तरीकों निकट भविष्य में एक सेंसर में संयुक्त किया जाएगा लगता है. microfabricated नमूना जांच पर काम पहले ही शुरू कर दिया है, और हमें विश्वास है कि विश्लेषणात्मक अग्रिमों के साथ microfabrication प्रौद्योगिकियों में आगे प्रगति और vivo neurochemical निगरानी जांच में सुविधा होगी । इस समय, तथापि, पारंपरिक microdialysis ईईजी करने के लिए संबंधित कई तंत्रिका विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक वैध विधि बनी हुई है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को वरीयता में प्रकाशित पांडुलिपियों के लिए उनके योगदान के लिए अंना Binaschi, पाओलो Roncon और Eleonora पाल्मा शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

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Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

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