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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Abstract

Microdiálisis es una técnica bien establecida de la neurociencia que correlaciona los cambios de sustancias neurológicamente activas que difunde en el espacio intersticial del cerebro con el comportamiento o con el resultado específico de una patología (por ejemplo, convulsiones para la epilepsia). Al estudiar la epilepsia, la técnica de microdiálisis se suele combinar con a corto plazo o a largo plazo incluso video-electroencefalografía (EEG de monitoreo para evaluar la frecuencia de las crisis espontáneas, severidad, progresión y agrupamiento). El EEG de microdialysis combinado se basa en el uso de varios métodos e instrumentos. Aquí realizamos la microdiálisis en vivo y vídeo-EEG continuo grabando para monitor salida de glutamato y aspartato en el tiempo, en diferentes fases de la historia natural de la epilepsia en un modelo de rata. Este enfoque combinado permite el emparejamiento de los cambios en la liberación de neurotransmisor con etapas específicas del desarrollo de la enfermedad y progresión. La concentración del aminoácido en el dializado se determinó por cromatografía líquida. Aquí, describimos los métodos y el contorno de las principales medidas cautelares se deben tomar durante la microdiálisis en vivo -EEG, con especial atención a la cirugía estereotáctica, potasio basal y alta estimulación durante microdialysis, profundidad grabación de electrodo EEG y análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de aspartato y glutamato en el dializado. Este enfoque puede ser adaptado probar una variedad de drogas o enfermedad inducida por cambios de las concentraciones fisiológicas de aspartato y glutamato en el cerebro. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico apropiado, puede utilizarse además para poner a prueba diferentes moléculas solubles al utilizar grabación de EEG al mismo tiempo.

Introduction

Para proporcionar la penetración en la debilitación funcional de mediada por glutamato excitatoria y la neurotransmisión inhibitoria GABAérgica resultando en convulsiones espontáneas en epilepsia de lóbulo temporal (ELT), supervisamos sistemáticamente las concentraciones extracelulares de GABA1 y más adelante los niveles de glutamato y aspartato2 por microdiálisis en el hipocampo ventral de ratas en varios momentos de la enfermedad natural curso, es decir, durante el desarrollo y progresión de la epilepsia. Tomamos ventaja del TLE pilocarpina modelo en ratas, que imita la enfermedad con mucha precisión en términos de cambios conductuales, electrofisiológico e histopatológico3,4 y correlacionamos la concentración del dializado de amino ácidos a sus diferentes fases: la fase aguda tras el insulto epileptogénica, la fase de latencia, el tiempo de la primera convulsión espontánea y la crónica phass5,6,7. Enmarcando las fases de la enfermedad fue habilitado por la supervisión del vídeo-EEG a largo plazo y la precisa EEG y caracterización clínica de las convulsiones espontáneas. Aplicación de la técnica de microdiálisis asociada a monitoreo video-EEG a largo plazo nos permitió proponer hipótesis mecanicistas de neuropatología TLE. En Resumen, la técnica descrita en este manuscrito permite el apareamiento de alteraciones neuroquímicas dentro de un área definida del cerebro con el desarrollo y progresión de la epilepsia en un modelo animal.

Dispositivos emparejados, formados por un electrodo de profundidad yuxtapuesto con una cánula de microdiálisis, a menudo se emplean en estudios de investigación de epilepsia donde cambios en los neurotransmisores y sus metabolitos, sustratos de energía deben ser correlacionados con la actividad neuronal. En la mayoría de los casos, se utiliza en comportarse libremente los animales, pero puede realizarse también de forma similar en los seres humanos, por ejemplo, en pacientes epilépticos fármaco-resistentes sometidos a investigación de electrodos de profundidad antes de la cirugía8. Grabación de EEG y recogida del dializado pueden realizarse por separado (por ejemplo, implantar el electrodo en un hemisferio y la microdiálisis la sonda en el otro hemisferio o incluso realizar el microdialysis en un grupo de animales mientras se realiza el EEG único en otro grupo de animales). Sin embargo, los electrodos de acoplamiento a las sondas puede tener múltiples ventajas: simplifica la cirugía estereotáctica, limita el daño a los tejidos a un sólo hemisferio (dejando la otra intacta, como un control para los estudios histológicos) y homogeneiza los resultados como estos se obtienen de la misma región del cerebro y el mismo animal.

Por otro lado, la preparación del dispositivo juntado microdialysis sonda electrodo requiere habilidades y tiempo si es hecho en casa. Uno podría pasar relativamente altas cantidades de dinero si comprado en el mercado. Por otra parte, cuando sondas de microdiálisis (puntas de prueba son típicamente 200-400 μm de diámetro y 7-12 mm de largo)9y los electrodos de EEG (puntas de los electrodos suelen ser de 300-500 μm de diámetro y el tiempo suficiente para llegar a la estructura cerebral de interés10) son junto, el dispositivo montado representa un objeto relativamente pesado y voluminoso en un lado de la cabeza, que es molesto para los animales y propensa a perder sobre todo cuando está conectado a la bomba de diálisis y el sistema de grabación de EEG de alambre duro. Este aspecto es más relevante en animales epilépticos que son difíciles de manejar y menos adaptables a las sesiones de microdiálisis. Las técnicas quirúrgicas adecuadas y cuidados postoperatorios adecuados pueden resultar en implantes de larga duración que causan mínimas molestias animales y deben ser perseguidos para experimentos de microdiálisis combinatoria-EEG10,11, 12.

Las ventajas y limitaciones de la técnica de microdiálisis han sido revisados en detalle por muchos neurocientíficos. Su principal ventaja sobre otras en vivo perfusión técnicas (p. ej., flujo rápido de vaivén o perfusión cortical Copa) es un pequeño diámetro de la sonda que cubre un área relativamente preciso de interés13,14, 15. En segundo lugar, la membrana de microdiálisis crea una barrera física entre el tejido y la solución; por lo tanto, sustancias de molecularidad elevada del peso no se cruzan y no interfieren con el análisis de16,17. Por otra parte, el tejido está protegido por el flujo turbulento de la solución18. Otra ventaja importante es la posibilidad de modificar el flujo de la solución para maximizar la concentración de analito en la solución (es decir, el proceso de microdiálisis pueden ser definido matemáticamente y puede ser modificado para alto rendimiento concentraciones del analito en la muestra)19. Por último, la técnica puede usarse para infundir los fármacos o sustancias farmacológicamente activas en los tejidos de interés y determinar su efecto en el sitio de intervención20. Por otro lado, microdiálisis tiene un tiempo de resolución limitada (típicamente más de 1 minuto por el tiempo necesario para recoger muestras) en comparación con los sensores electroquímicos o biológicos; es una técnica invasiva que causa daño a los tejidos; compromete el equilibrio neuroquímico en el espacio alrededor de la membrana debido al gradiente de concentración continua de todas las sustancias solubles que entra en la solución con el analito de interés. Por último, la técnica de microdiálisis está altamente influenciada por los límites de las técnicas analíticas empleadas para la cuantificación de sustancias en la solución9,21,22,23 . La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) después de la derivatización con orthophthaldialdehyde para el análisis de glutamato y aspartato en muestras biológicas ha sido bien validado24,25,26 , 27 y su amplia discusión está fuera del alcance de este manuscrito, pero los datos producidos mediante este método se describirá en detalle.

Cuando se realiza correctamente y sin modificaciones de la composición de la solución, microdialysis puede proporcionar información confiable sobre los niveles basales de la liberación de neurotransmisor. La mayor parte de los niveles básicos es probablemente el resultado del derrame de transmisor de la sinapsis9. Porque en muchos casos el muestreo simple del neurotransmisor en el espacio sináptico extra no es suficiente para perseguir los objetivos de la investigación, la técnica de microdiálisis se puede emplear también para estimular las neuronas o a privarlos de importantes fisiológicos iones como K+ o Ca2 +, con el fin de evocar o evitar la liberación del neurotransmisor.

Alta estimulación de K+ se utiliza a menudo en Neurobiología para estimular la actividad neuronal en animales despiertos, pero también en culturas primarias y organotypic. La exposición de un saludable del sistema nervioso central a las soluciones con altas concentraciones de K+ (40-100 mM) evoca la emanación de neurotransmisores28. Esta capacidad de las neuronas para proporcionar una versión adicional en respuesta a la alta K+ puede verse comprometida en animales epilépticos1 y en otras neurodegenerativas enfermedades29,30. Asimismo, el Ca2 + privación (obtenida por perfundiendo soluciones libres de Ca2 + ) se utiliza para establecer dependiente de calcio liberación de más neurotransmisores medidos por microdiálisis. Generalmente se cree que el comunicado dependiente de Ca2 + es de origen neuronal, mientras que sala independiente de Ca2 + origina de glia, pero muchos estudios levantado controversia sobre el significado de Ca2 +-medidas sensibles de p. ej. glutamato o GABA9: así, si es posible, es recomendable para apoyar estudios de microdiálisis microsensor estudios, ya que estos últimos tienen mayor resolución espacial y los electrodos permite acercarse a las sinapsis31.

Con respecto a los estudios de microdiálisis en animales epilépticos, es importante destacar que los datos obtenidos de la mayoría de ellos dependen de video o video-EEG monitoreo de asimientos, es decir, de la ocurrencia transitoria de signos o síntomas debido a la anormal excesiva o sincrónica actividad neuronal en el cerebro de32. Hay algunos detalles de asimientos electrográficos en animales de pilocarpina tratado que deben considerarse al preparar el experimento. Convulsiones espontáneas son seguidas por la deprimida actividad con frecuentes puntos interictales de EEG3 y ocurren en racimos33,34. Sham operados no epilépticos animales pueden exhibir actividad de asimiento-como35 y por lo tanto los parámetros para la evaluación de las grabaciones de EEG deben ser estandarizado36 y, si es posible, debe ser bien definido el calendario de sesiones de microdiálisis. Por último, le recomendamos siguiendo los principios y normas metodológicas para la supervisión del vídeo-EEG en roedores adultos control descrito por los expertos de la Liga Internacional contra la epilepsia y sociedad americana de la epilepsia en sus recientes informes37 ,38.

Aquí, describimos la microdiálisis de glutamato y aspartato en paralelo con las grabaciones de vídeo-EEG a largo plazo en animales epilépticos y su análisis en el dializado por HPLC. Haremos hincapié en los pasos críticos del protocolo que se debe cuidar para mejor resultado.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por la Universidad de Ferrara institucional Animal Care y Comité de uso y por el Ministerio italiano de salud (autorización: D.M. 246/2012-B) según las directrices esbozadas en las comunidades europeas Directiva del Consejo de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo está ajustado específicamente para la determinación de glutamato y aspartato en cerebro de rata dialysates obtenido bajo control EEG de microdialysis sesiones en ratas epilépticas y no epilépticas. Muchos de los materiales aquí descritos pueden reemplazarse fácilmente por las que uno utiliza en su laboratorio para las grabaciones de EEG o microdiálisis.

1. montaje del dispositivo de electrodos sonda de microdiálisis

  1. Utilizar un electrodo de 3 canales retorcidos de dos (con al menos un 20 mm corte largo del electrodo de registro y un 10 cm de largo de tierra electrodo) y acoplarla a una cánula guía para preparar el dispositivo. Ver ejemplos de cánula guía y electrodo de 3 canales para diálisis en figura 1A-1B.
  2. Quitar (figura 1) e introducir (figura 1) la cánula guía de metal en la cánula de plástico simulada un par de veces antes del uso para facilitar su remoción en el momento de su interruptor para sonda de microdiálisis en el animal.
  3. Doblar los cables trenzados de registrar electrodo dos veces (Figura 1E-1F) con el fin de alinear los cables con la cánula de maniquí de la guía y corte la punta del electrodo (figura 1) a ser 0,5 mm más largo que la punta de la cánula de la guía (figura 1 H) utilizando la pinza digital.
  4. Tenga a mano el anillo de silicona largo 1 mm (diámetro 2 m m, grueso de 0.3 mm; Figura 1I) e inserte la punta de la cánula de la guía y la punta de los electrodos torcidos en el anillo de silicona con las pinzas (Figura 1J). Arreglarlo en el pie de la guía de pedestal de cánula con adhesivo de polímero de resina (figura 1 K) o de acción rápida. Vea el ejemplo de los dispositivos terminados en 1 L de la figura y figura 2A.
  5. Esterilizar el dispositivo bajo la luz UV germicida para 4 h. vuelta el dispositivo cuatro veces así como cada uno de sus lados está expuesto a la luz durante 1 hora.
    Nota: Muchas sondas electrodos y microdiálisis caseros pueden ensamblarse en una manera similar. La cabeza de arriba descrito implantes para las ratas tiene las siguientes dimensiones: ancho 7 mm x 5 mm profundidad x 10 mm de longitud de la tapa al pedestal del dedo del pie; la punta del implante es aproximadamente 11 mm de largo, 600 μm de diámetro y el dispositivo pesa unos 330-360 mg. El dispositivo puede ser reutilizado dos o tres veces si (i) una suficiente longitud del electrodo de tierra se deja en el cráneo durante la cirugía para el siguiente uso y (ii) cuando el animal es sacrificado, y el dispositivo recuperado junto con el cemento dental se deja en acetona overnigh t, tal que el cemento puede desglosarse mecánicamente, y el dispositivo de lavado y esterilizado nuevamente.

2. cirugía estereotáctica

  1. Utilice un estereotáxicas aparatos y sonda clip soporte (figura 2B) para la implantación de dispositivo siguiendo los estándares contemporáneos para cirugías asépticas y sin dolor39,40,41.
    1. Anestesiar el ratas Sprague-Dawley adultas con mezcla de ketamina/xilacina (43 mg/kg y 7 mg/kg, i.p.) y fijarla en el chasis estereotáxicas. Añadir anestesia isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min) a inyección de ketamina/xilacina inicial ya que permite controlar la profundidad de la anestesia en tiempo. Afeitar el pelo en la cabeza del animal.
  2. Torunda la superficie de la piel cabeza por solución de yodo seguido de etanol al 70% para prepararse para la cirugía aséptica39.
    1. Implante el dispositivo de electrodos cánula guía preparado en precedencia (1.1 – 1.5) en el hipocampo ventral derecho utilizando las coordenadas siguientes: barra de nariz + 5,0 mm, A-3,4 mm, L 4,5 mm, P + 6,5 mm a bregma1,2. Siga las técnicas estándar para cirugías estereotáxicas10,11,12.
    2. Asegúrese de que no cubre los tornillos de anclajes. Al montar en el aparato estereotáxicas, sujete el dispositivo para la cabeza de la cánula guía como esto puede alinear fácilmente con el porta sondas.
  3. Anclar el aparato a la calavera con al menos cuatro tornillos de acero inoxidable en el hueso del cráneo (1 tornillo en el tornillo izquierdo y 1 en las placas del hueso frontal derecho, 1 tornillo en el parietal izquierdo y 1 tornillo en las placas de hueso interparietal). Añadir una gota de pegamento de tejido más fijar los tornillos en el hueso del cráneo.
    1. Cubrir la mitad de la rosca con el cemento de metacrilato. Promover a la Unión del cemento haciendo surcos poco profundos en el hueso para aumentar la adherencia.
  4. Una vez que la punta del dispositivo se coloca en el tejido cerebral, tuerza el alambre del electrodo de tierra de alrededor de 3 tornillos de anclaje. Cubre tornillos todo montados y el dispositivo con el cemento dental12,42,43.
  5. Monitorear los animales durante la cirugía y durante aproximadamente 1 hora después de eso hasta en posición vertical y moviéndose alrededor de la jaula. Mantenerlos en una cubierta térmica de colchón para evitar la hipotermia. Permitir que las ratas recuperar por lo menos 7 días después de la implantación del dispositivo.
  6. Monitorear los animales al menos una vez al día durante 3 días después de la cirugía para detectar signos de dolor o angustia. Proporcionan los animales con la crema antibiótica (gentamicina 0,1%) cerca del sitio Incisa para prevenir la infección y un analgésico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) por 3 días prevenir el dolor post-surgical.

3. Lóbulo Temporal epilepsia inducción por pilocarpina y cesión de animales a los grupos experimentales

  1. Después de una semana de recuperación post-quirúrgica, asignar al azar los animales a grupos: (i) control animales recibiendo vehículo y (ii) epilépticos animales que recibirán pilocarpina. Uso un número proporcionalmente mayor de animales epilépticos Grupo puesto que no todos los de la pilocarpina administraron a ratas desarrollarán la enfermedad.
  2. Inyectar una dosis de methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) y 30 minutos después, una sola inyección de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para inducir el estado epiléptico (SE). Inyectar methylscopolamine y el vehículo (solución salina) a las ratas control. Utilice jeringa de 1 mL con aguja 25G para todas las administraciones de i.p..
    1. Comprobar visualmente los animales para comenzar a tener convulsiones conductuales (vibrisas dentro de 5 min, asintiendo con la cabeza, las extremidades de la clonación en movimiento) y dentro de 25 min para clonar continuamente todo el cuerpo (SE).
  3. Detener la SE 2 h después del inicio que tienen una mortalidad alrededor del 25% y un período de latencia promedio de aproximadamente 10 días por la administración de diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observar y registrar cualquier principio de comportamiento de ataque inmediatamente después de la inyección de pilocarpina y continuar durante al menos 6 h después de eso.
  4. Dan la animales una solución salina (1 mL, i.p.) con jeringa de 1 mL de solución con aguja y sacarosa de 25G (1 mL, p.o.) usando jeringa de 1 mL y aguja de 17G alimentación flexible para 2-3 días después SE para promover la recuperación de la pérdida de peso corporal.
    1. Excluir a los animales que no alcanzan el peso inicial en la primera semana después de pilocarpina SE del estudio (excepto el grupo aguda matado a 24 h después de SE, donde no es posible el peso corporal de seguimiento).
  5. Asignar animales post-SE al azar a diferentes grupos experimentales (figura 3): aguda fase (donde el microdialysis ocurre 24 horas después de SE), latencia (7-9 días después de SE), primera crisis espontánea (aproximadamente 11 días después de SE) y crónica (período se inicia cerca de 22 a 24 días después de SE, es decir, 10 días después de la primera crisis convulsiva). Seguimiento de los animales para la ocurrencia de convulsiones espontáneas.
    Nota: Utilice los siguientes criterios de inclusión y exclusión para otros experimentos en ratas epilépticas: desarrollo de Convulsivo dentro de 1 h después de la administración de pilocarpina; el aumento de peso en la primera semana después de la SE y la correcta posición de la sonda de microdiálisis y electrodo.

4. epilepsia comportamiento monitoreo y análisis

  1. Monitoreo a largo plazo del comportamiento epiléptico
    1. Aproximadamente 6 h después de la administración de pilocarpina (es decir, al final de la observación directa de los investigadores), colocar los animales en las jaulas limpieza hogar y empezar la videovigilancia 24 h.
    2. Seguir el video 24 h seguimiento hasta el día 5, mediante un sistema de videovigilancia.
    3. Empezando por el día 5, conectar las ratas en sus casa jaulas rectangulares al sistema de grabación de EEG atada y continuar la videovigilancia 24 h.
    4. Conjunto de los parámetros del amplificador colocado fuera de la jaula de Faraday (factor de ajuste de la amplificación en cada canal de acuerdo a la especificidad de la señal EEG de cada animal individual) y la adquisición de inicio el EEG observar la señal de EEG producidos por cables. Uso el muestreo tasa de 200 Hz y baja pasar filtros de 0,5 Hz.
    5. Conectar el animal cables sosteniendo la cabeza de un animal entre dos dedos se extendía de un lado y atornillar abajo los conectores en el pedestal del electrodo con la otra mano libre. Empezar la adquisición.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la señal está libre de artefactos. Artefactos comunes son los picos muy superior a la escala.
    6. Un día antes de las microdiálisis experimentan, transferir los animales en el sistema EEG tethered equipado con cilindros de plexiglás de microdiálisis. Desconecte los animales del EEG tethering sistema en jaula casa atornillar para arriba de los conectores de los electrodos sin refrenar el animal. Coloque el animal en los cilindros de plexiglás alta.
  2. Monitoreo del comportamiento epiléptico un día antes y durante la sesión de microdiálisis
    1. Encienda el amplificador colocado fuera de la jaula de Faraday. Abra el software de EEG. Iniciar la adquisición de EEG observar la señal de EEG producida por cables no conectados.
    2. Conectar el animal con el sistema de grabación de EEG atado sosteniendo la cabeza de un animal entre dos dedos se extendía de un lado y atornillar abajo los conectores en el pedestal del electrodo con la otra mano libre. Establecer un factor de amplificación (ganancia) en cada canal de amplificador según la señal del electrodo de animal solo para que la señal de EEG es a escala. Deje que el animal explora la nueva jaula (cilindro) al menos 1 h bajo la observación directa del investigador.
    3. Nota: 24 h antes de la microdiálisis experimento, las ratas son brevemente anestesiadas con isoflurano para el cambio de cánulas guía con sonda de microdiálisis. Aprovechar el momento cuando están anestesiados para conectar el sistema de grabación de EEG.
    4. Acortar o prolongar cable pendular según la materia del animal. Asegúrese de que los cables no interfieran con los movimientos del animal y la postura de mentira.
    5. Compruebe que la estructura de la imagen correcta de las cámaras de vídeo. Iniciar la grabación de vídeo-EEG.
  3. Identificación de la actividad EEG y convulsiones
    1. Utilice un reproductor de software para ver los videos. Desplazarse la película 8 veces más rápido que el tiempo real jugando e individualiza las convulsiones generalizadas (véase animal hacia atrás con clonus del miembro anterior o animal cría y caer con clonus del miembro anterior). Ralentizar el video y anote la hora exacta del inicio y del final de la incautación de comportamiento.
    2. Proceso los datos contando el número de convulsiones generalizadas en 24 h de videos registros y expresarlos en términos de frecuencia de las crisis y la duración media de todas las convulsiones observadas en 24 h.
    3. Definir las convulsiones EEG como los períodos de actividad paroxística de alta frecuencia (> 5 Hz) caracterizado por un > 3-fold incremento de amplitud en referencia con la progresión de la frecuencia de pico que dura un mínimo de 3 s2,44 o similares28. Utilizar software de EEG para procesar el crudo grabaciones de EEG. Los rastros de EEG se dividió en fracciones de 1 h. Copiar las fracciones de trazo de EEG para software de análisis de punto automática.
    4. Analizar los datos de actividad EEG utilizando software de EEG y parámetros predefinidos (4.3.3.). Llevar a cabo todos los análisis de videos en dos investigadores independientes que son ciegos para el grupo de los animales analizados. En caso de divergencia, hacer que vuelva a examinar los datos para llegar a un consenso45.

5. Microdialysis

  1. Recuperación de punta de prueba in vitro
    1. Preparar la sonda para su primer uso según las instrucciones del fabricante, manejo en su funda protectora.
    2. Ejecutar el experimento por triplicado: preparar tres tubos de ensayo 1.5 mL carga con 1 mL de solución de Ringer, que contiene la mezcla de estándares (2,5 μm de glutamato) y 2,5 μm de aspartato. Poner tres tubos de ensayo de carga de 1,5 mL en el sistema de bloque calentador de 37 ° C y colocar en el agitador.
      Nota: Utilizar las mismas soluciones estándar para calibración de cromatografía.
    3. Sello de las probetas de 1,5 mL con la película de parafina y puntura por pinzas afiladas para hacer un agujero de aproximadamente 1 mm de diámetro.
    4. Tome la sonda y en el orificio hecho en la película de parafina. Sumergir la membrana en menos de 2 mm bajo el nivel de solución. Más fijar la sonda al tubo de ensayo 1.5 mL por la película de parafina.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la punta no toque las paredes del tubo de prueba de 1,5 mL.
    5. Conecte la entrada de la sonda con la jeringa montada en la bomba de infusión usando los adaptadores de la tubería de FEP y tubo. Opcionalmente, uso fino diámetro tubería de polietileno de 0,28 mm ID y 0,61 mm OD y adaptadores de tubo color (adaptadores de tubo rojo y azul) para las conexiones.
    6. Arrancar la bomba a 2 μl/min y deje que el líquido la punta del enchufe. Conecte la salida de la sonda a los 0,2 mL tubo de prueba usando los adaptadores de la tubería de FEP y tubo de recogida.
      Nota: Use tubería de FEP para todas las conexiones. Corte la longitud deseada de tubería mediante el uso de una cuchilla de afeitar. Utilizar adaptadores de tubería de diferente color para entrada y salida de la sonda. Deje que la bomba funcione durante 60 minutos Compruebe si hay fugas y burbujas de aire. Estos no deben estar presentes.
    7. Ajustar la bomba a la tasa 2 μl/min de flujo y comienzan a recolectar las muestras a la salida de la tubería.
    8. Recoger tres muestras de fluido para perfusión de 30 minutos y tres muestras de igual volumen de la solución en el tubo de prueba de 1,5 mL. Tomar las muestras de igual volumen de la probeta de 1.5 mL cada 30 minutos con la microjeringa inmerso en la solución estándar en el tubo de prueba de 1,5 mL.
    9. Repita el experimento (5.1.1-5.1.8) configuración de la bomba al flujo tipo 3 μl/minuto (5.1.7) para tener una comparación de recuperación de la sonda cuando se utiliza dos tipos de flujo de perfusión diferentes.
    10. Cuando termine, apague la bomba y enjuague el tubo con agua destilada, etanol al 70% y empuje el aire. Guarde la sonda en un frasco llenado de agua destilada. Enjuague la sonda por perfundiendo a 2 μl/min de agua destilada previo al almacenamiento.
    11. Analizar la concentración del glutamato y aspartato en las muestras por cromatografía (ver detalles abajo; 6.3).
    12. Calcular la recuperación mediante la siguiente ecuación:
      Recuperación (%) = (Csolución /Cdiálisis debido a solución) x 100.
  2. Sesiones de microdialysis en mover libremente las ratas
    1. Procedimientos preparatorias: inserción de la sonda y pruebas, infusión de ajuste de la bomba y comenzar
      1. Preparar las sondas de microdiálisis para el primer uso según las instrucciones del fabricante y rellenarlas con solución de Ringer. Cortar unos 10 cm. largo de la tubería de FEP y unirlos con cánulas de entrada y salida de la sonda con los adaptadores de tubería de diferentes colores.
      2. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.
      3. 5.2.1.3. 24 h antes del experimento de microdiálisis, anestesiar brevemente al animal con isoflurano (5% en aire) en una cámara de inducción hasta reclinada. Retire la cánula ficticia de su guía de uso de las pinzas y sujeta firmemente la cabeza del animal. Inserte la sonda de microdiálisis, dotada de una membrana de diálisis, en la cánula de guía y empresa más las cánulas de microdialysis insertadas en su guía de modelado en arcilla.
        PRECAUCIÓN: No permita que la sonda toque las paredes de la funda protectora sonda extracción.
      4. Poner el animal en el cilindro de plexiglás y se deja explorar el nuevo ambiente. Conectar el animal para el sistema de grabación de EEG anclado como se describió anteriormente (siga los puntos 4.2.2 y 4.2.3).
      5. Siga la despierto y moviéndose libremente movimientos de rata y conecte la entrada de la sonda con la jeringa de 2,5 mL con aguja de 22G blunted con solución de Ringer usando los adaptadores de la tubería. Empujar la solución de Ringer en la sonda de expulsión 1 mL de solución de Ringer en 10 s continuamente empujando el émbolo de la jeringa de 2,5 mL. Busque la gota de líquido que aparecen en la salida. La sonda está ahora lista para su uso.
      6. Llene las jeringas de 2,5 mL conectadas a la tubería de FEP por adaptadores de tubería con solución de Ringer y montarlos en la bomba de infusión. Arrancar la bomba a 2 μl/min. Déjela funcionar durante la noche.
        Nota: Utilizar la longitud deseada de tubería de FEP todo pero calcular el volumen muerto de la tubería para saber cuándo se debe iniciar la alta estimulación K+ y correlacionar los datos de cuantificación con cambios neuroquímicos en el cerebro animal. Utilice la burbuja de aire en la tubería bajo el flujo de trabajo para calcular este tiempo.
    2. Recogida de muestras durante la grabación y potasio la estimulación del EEG
      1. Verificar la ausencia de convulsiones en lo 3 h previo al inicio de la recogida de muestras (las grabaciones de video-EEG) y seguir vigilando la actividad de asimiento durante microdialysis.
      2. Parar la bomba con las jeringas de FEP-tubería canulada llenadas con solución de Ringer. Montaje en el otro juego de jeringas de 2,5 mL de la bomba conectado a tubería de FEP con adaptadores de llenado con la solución de un timbre modificado que contiene 100 mM de la tubería K+ solución.
      3. Arrancar la bomba a 2 μl/min y deje que se ejecute. Para llenado más rápido de la tubería, coloque la bomba en 5 μl/min para el tiempo de llenado. Comprobar la ausencia de burbujas de aire en el sistema. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.
      4. Prueba de la sonda si listo para su uso en animales como se describe anteriormente (5.2.1.5).
        Nota: Si por alguna razón la sonda no funciona, cámbialo. Para estos casos, mantener unos sondas de microdiálisis preparado listas para su uso cerca de la estación de trabajo de microdiálisis-EEG. Desconecte el animal de cables EEG y anestesiar brevemente con isoflurano si es necesario realizar el cambio.
      5. Conecte la tubería de FEP de jeringas de llenado con solución de Ringer a la cánula de entrada de la sonda en cada animal y esperar la aparición de la gota del líquido en la punta de la salida.
      6. Conecte la salida de la sonda en la tubería de FEP, que conduce a la colección en el tubo de ensayo. Inserte la tubería de FEP en el tubo de ensayo 0,2 mL cerrados con un tapón perforado. Asegúrese de que el tubo permanece en el lugar mediante la fijación con un pedazo de arcilla de modelado.
      7. Continuar a funcionar la bomba a 2 μl/min durante 60 min sin recoger muestras para equilibrar el sistema (cero muestra).
      8. Recoger las 5 muestras consecutivos 30 min del dializado (volumen respectivo de 60 μL) bajo las condiciones iniciales (perfusión con solución de Ringer normal). Almacenar las muestras en hielo.
      9. Calcular el tiempo que toma líquido para pasar de la bomba en la cabeza del animal (depende de volumen muerto de la tubería, es decir, tiempo de la burbuja de aire) y cambiar la tubería de FEP que va desde las jeringas con solución de Ringer normal a las jeringas que contienen modificado solución de Ringer (100 mM K+) en este momento sin detener la bomba. Comprobar la ausencia de las burbujas de aire en el sistema. Deje que la bomba funcione durante 10 minutos.
        PRECAUCIÓN: En 10 minutos de alta estimulación de K+ , los animales tienden a moverse frenéticamente y suelen presentar un gran número de perro mojado batidos (control de animales de cluster de incautación) o convulsiones conductuales (animales epilépticos), así que listos para intervenir a Proteja los tubos y los cables de torsión.
      10. Después de 10 minutos, cambiar el tubo de la jeringa que contiene 100 mM K+ Ringer solución a solución de Ringer normal y deje que la bomba funcione. No apague la bomba durante los cambios de la solución para que exista una gota del líquido en el extremo de la tubería a conectar en línea.
      11. Desde el momento en el que el dializado contiene potasio alto, es decir, después de la colección del Quinta tras conseguir el equilibrio del dializado, se recogerán las fracciones del dializado cada 10 minutos (20 μl) para las muestras del dializado de 1 h. 3 recoger de 30 min adicionales y detener la bomba. Almacenar las muestras en hielo.
      12. Almacenar las muestras a-80 ° C después del experimento hasta el análisis de HPLC.
      13. Repita el que experimentan de las microdiálisis durante 3 días consecutivos, excepción de la aguda (24 h) y el primer grupo de ataque, en que sola microdialysis sesión ocurre 24 horas después SE o dentro de 24 h después de la primera convulsión espontánea (figura 3).
      14. Al finalizar cada experimento, eutanasia al animal con una sobredosis de anestésico y quitar el cerebro para la verificación de la colocación de la sonda y el electrodo.
  3. Procedimientos post-microdialysis
    1. Enjuague las sondas de microdiálisis usado con agua destilada y guardar en un frasco llenado con agua destilada hasta el próximo uso.
      Nota: Las membranas reutilizadas pueden presentar una mayor permeabilidad; Compruebe que la recuperación de la sonda antes de su uso repetido.
    2. Enjuague el microdialysis todo configurado (tubería, conectores y jeringas) con agua destilada, seguido de etanol al 70%. Sustituir el etanol por aire y acumular el conjunto en un ambiente estéril.
    3. Dividir las muestras de dializado basals en 20 fracciones μl y fracción de solo 20 μl para análisis de la concentración basal de aminoácidos. Almacenar el volumen restante de la muestra para el análisis confirmatorio o más a-80 ° C.
    4. Fijar los cerebros en formol al 10% y preservarlos por inclusión en parafina1. Coronal, sección los cerebros en rodajas y tinción con hematoxilina y eosina. Examinar el cerebro para la sonda correcta y electrodo colocación1,2.
      Nota: Fijar los cerebros de 2-Metilbutano enfriado y almacenar a-80 ° C. Utilizar cualquier otra coloración probada en las secciones de tejido nervioso que permite visualizar la zona de punta de prueba y el electrodo.

6. Análisis de cromatografía de glutamato y aspartato

  1. Preparación de derivatizando agente
    1. Mezclar los volúmenes respectivos 20:1 (v/v) de reactivo de orthophthaldialdehyde (OPA) y 2-Mercaptoetanol (5-ME) en el frasco. Cerrar la cubeta con el tabique estrecha tapa y el aire.
      PRECAUCIÓN: Trabajar debajo de la campana química.
    2. Vórtice de la solución preparada y ponerlo en el inyector automático en la posición para derivatizando agente.
  2. Preparación de muestras de dializado
    1. Poner el inserto de vidrio con el resorte inferior en el frasco muestreador automático marrón de 2 mL. Preparar los frascos para las muestras en un lote.
    2. Tomar las muestras de diálisis 20 μl del congelador de-80 ° C y dejarlos derretir. Retirar 1 μl de la solución y añadir 1 μl de estándar interno (IS) L-Homoserina (50 μm) a 19 μl de la muestra, por lo tanto la muestra contiene 2.5 μm de es. Pipetear 20 μl de la muestra de diálisis en el inserto de vidrio en el frasco y sellarlo con un tabique hermético.
    3. Coloque los frascos que contienen las muestras en el muestreador automático, usando el software cromatográfico para etiquetar las muestras en sus posiciones.
  3. Análisis cromatográfico de las muestras para determinar la concentración de glutamato y aspartato
    1. Ejecutar los análisis en el sistema de cromatografía líquida con detección spectrofluorometric. Detectar los aminoácidos después de 2 min columna previa derivatización con 20 μL de orthophthaldialdehyde/5-mercaptoetanol 20:1 (v/v) agregado a 20 μL de muestra.
    2. Preparar el sistema para análisis de aminoácidos. Conecte el inyector automático, la bomba, el desgasificador, el detector y unidad de control junto con la computadora.
    3. Sumerja los sifones en las botellas que contienen la fase móvil y limpiar los canales de la bomba cromatográfica para el análisis.
    4. Empieza a aumentar el flujo de la fase móvil de control de la presión en la columna (por ejemplo, empezar a 0,2 mL/min y aumentar el flujo adicional 0,2 mL/min cada 5 min hasta alcanzar el flujo de trabajo). Deje el sistema en funcionamiento flujo de 0.8 mL/min durante al menos 1 h equilibrar la columna.
      PRECAUCIÓN: Presión inestable indica la presencia de aire en el sistema. La presión no debe exceder 25 MPa.
    5. Ajustar la ganancia, alta sensibilidad y las longitudes de onda de excitación y emisión en el detector a 345/455 nm respectivamente. Restablecer la señal del detector (AUTOZERO).
    6. Utilizando el software cromatográfico, envíe el método para el instrumento. Ahora, el cromatógrafo debe ser listo para medir.
    7. Separar las muestras de dializado, estándar tacon muestras de dializado como normas (0.25 μm – 2,5 μm aspartato y glutamato en solución de Ringer) en la columna cromatográfica apropiada. Calibrar el método cromatográfico y establecer los límites de detección y cuantificación antes de cualquier análisis de las muestras de la diálisis.
    8. Activar el análisis individual o crear la secuencia de las muestras a ser analizadas mediante el software de cromatografía y ejecutar la secuencia.
      PRECAUCIÓN: Ejecutar más de una muestra en blanco y diferentes muestras estándar dentro de la secuencia de muestras de dializado para controlar la exactitud del método.
    9. Una vez que se adquieren los cromatogramas, analizarlas con el software de cromatografía. Verificar la integración de los picos de interés en la trama de la calibración. Utilizar pico alto o pico para la cuantificación.
    10. Una vez terminada la grabación muestra llene la columna y el sistema con un disolvente orgánico (por ejemplo, 50% acetonitrilo en agua ultrapura) para evitar su envejecimiento y molde crecimiento en él.
    11. Apagar el sistema.

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Representative Results

Recuperación de la sonda

La recuperación media (es decir, el contenido medio del aminoácido en la solución como un porcentaje del contenido en un volumen igual de la solución vial) era 15.49 ± 0,42% a un caudal de 2 μL/min y 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min para glutamato y 14.89 ± 0,36% a un caudal de 2 ΜL/min y 10.13 ± 0,51 a 3 μL/min para aspartato cuando se usa la sonda de membrana cuprophane. Si se utiliza la sonda de membrana de poliacrilonitrilo, la recuperación media fue 13.67 ± 0,42% a un caudal de 2 μL/min y 6.55 ± 1,07 a 3 μL/min para glutamato y 14.29 ± 0,62% a un caudal de 2 μL/min y 8.49 ± 0.15 a 3 μL/min para aspartato (Figura 4A-4B). Como puede verse claramente en la Figura 4A, el flujo más lento (2 μL/min) mejora el rendimiento de diálisis de ambas puntas de prueba. Fue elegido para los siguientes experimentos de la sonda de membrana dotada cuprophane inundada en un flujo tipo 2 μL/min, porque su recuperación media fue mayor (aunque no significativamente) en este caudal para ambos analitos y por continuidad experimental (estas sondas se utilizaron para el análisis de GABA en prioridad1).

Desarrollo de asimientos y la progresión de la enfermedad después del epilepticus

El comportamiento y la supervisión de EEG de las crisis, su evaluación, se realizó en todos los animales empleados en este estudio para confirmar el desarrollo y progresión de la enfermedad TLE en estos.

El robusto Convulsivo, que se interrumpió después de 3 horas utilizando diazepam, ocurrió 25±5 min después de la inyección de pilocarpina. Entonces, todos los animales entraron en un estado de latencia en el que estaban aparentemente bien y estaban continuamente monitoreado para verificar que no convulsiones espontáneas se produjeron en los primeros 9 días o para identificar la primera crisis espontánea, respectivamente para el vídeo-EEG la latencia y el primer grupo de ataque. La primera crisis espontánea ocurrieron 11,3 ± 0,6 días después SE (media ± SEM, n = 21). Después de eso, ataques ocurrieron en racimos y agravaron en el tiempo. En fase crónica tardía (días 55-62 después de SE) las ratas epilépticas experimentaron 3.3±1.2 (media ± SEM, n = 12) convulsiones generalizadas diariamente. Hubo una clara progresión de la enfermedad. Muchos, pero no todas las convulsiones EEG, correspondieron con la actividad de asimiento conductual. La figura 5B muestra la actividad registrada paroxística epileptiforme que observó a unos 500 m antes y durante las convulsiones conductuales. Figura 5A muestra rastros de control en las ratas no epilépticos.

Valores representativos basals de aminoácidos encontrados en potasio y solución de microdialysis estimulan la liberación de glutamato

Concentración basal de glutamato encontrado en ratas epilépticas crónicas (0.87 ± 0,06 μm) fue significativamente mayor que en animales control (0.59 ± 0,03 μm; p < 0.05 vs controles; unidireccional ANOVA y post hoc de Dunnett prueba). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre epilépticos crónicos (0,31 ± 0,04 μm) y las concentraciones de aspartato de animales no epilépticos (0.30 ± 0.05 μm) en básico o alto K+ evocados. Ver el artículo original para detalles2. Los niveles basales divulgados de glutamato en el control de las ratas están en consonancia con los encontrados por otras personas en similares estudios (es decir, sobre 0.75 μm al usar membranas de 2 mm de longitud efectiva y un flujo de 2 μl/min)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Sin embargo, muchos factores diferentes pueden influir en los resultados de microdiálisis, por ejemplo la longitud efectiva de la sonda y el corte de la membrana.

Alto K+-evocado una adicional liberación de glutamato por unos 30 min en las ratas control y de unos 60 minutos en ratas epilépticas crónicas (figura 6). Ver el artículo original para detalles2. Como puede verse en el curso del tiempo representado, la resolución de tiempo de 10 min de microdialysis fue suficiente para captar las variaciones en la liberación de glutamato encontrado en ambos grupos de animales.

Límites y calibración de HPLC

Los datos fueron calculados en curvas de calibración obtenidas con soluciones estándar de glutamato y aspartato y la L-Homoserina estándar interno. La concentración de los neurotransmisores glutamato y aspartato en el perfusates se expresó en valores absolutos (μmol/L). Cada parcela de calibración se construyó mediante el análisis de soluciones de glutamato y aspartato en cuatro niveles de concentración (cinco repeticiones en cada nivel). Se calcularon los coeficientes de regresión para parcelas de calibración: y = kx + q, donde x es el cociente de la concentración de aspartato o glutamato a la L-Homoserina (IS) y y fue el correspondiente área de pico cociente de aspartato o glutamato a la L-Homoserina ( ES). Se calculó el coeficiente de determinación (r2). La aplicabilidad del método de HPLC fue dentro de los límites; el límite inferior de cuantificación se determinó como la menor concentración en la curva de calibración estándar y el límite de cuantificación como la mayor concentración utilizada de analitos del aminoácido para la calibración, respectivamente. También se calculó el límite de detección (LOD). Algunos de estos valores se delinean en la tabla 1. Cromatograma de un modelo de muestra en blanco, estándares de diálisis muestra y recogida de muestra obtenida con sobre el método descrito se muestran en la figura 7.

Localización de la sonda

Sonda de microdiálisis y electrodo de la grabación fueron implantados en el hipocampo ventral derecho y se verificó su correcta colocación. En análisis se incluyeron sólo aquellos animales donde la implantación fue máximo en 500 μm distante de coordenadas estabilizados (ver figura 8).

Figure 1
Figura 1. Paso a paso preparación del dispositivo que se implanta. (A) canal 3 electrodo con 10 cm de largo de tierra electrodo en su funda protectora en la izquierda y la guía de cánula de microdiálisis en el derecho necesario para montar el dispositivo. (B). la cánula guía y electrodo desnuda en detalle. El primer paso es extraer (C) e insertar fácilmente (D) la cánula guía de metal desde y hacia su plástico simulado varias veces a su liberación una vez implantado en la cabeza del animal. El segundo paso es doblar dos veces el registro electrodo trenzado alinearse a cánula guía de diálisis (E, F). (G) la punta del electrodo debe cortarse para ser 0,5 mm más largo que la punta de la cánula guía de metal. (H) Compruebe la precisión de la corte con la pinza digital. Posteriormente, alrededor de 1 mm anillo de silicona larga puede usarse para fijar la alineación del electrodo a pie de la cánula (I). (J) la fotografía que muestra cómo el electrodo de anillo y guía del eje de la cánula. El paso final es colocar una gota de resina o pegamento en el pedestal de cánula guía fijación del anillo de silicona que (K). (L) montado dispositivo listo para ser esterilizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Fotografías de diferentes tipos de dispositivos para microdiálisis-EEG en ratas utilizado (A) y la fotografía del sostenedor del clip de sonda (B) utilizado para implantar estos dispositivos. (A) la cánula guía (en verde) se sustituye por una cánula de microdiálisis típicamente 24 h antes del experimento. El conector eléctrico del dispositivo (primera a la izquierda fue utilizada para las grabaciones en este manuscrito) permite la sujeción de los cables que llevan a cabo una señal eléctrica a equipos de colección de datos y amplificador. El dispositivo quirúrgico se une al cráneo de ratas anestesiadas y grabaciones pueden obtenerse más adelante sin causar dolor o malestar en comportarse libremente las ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Diseño experimental de. La semana antes de la inducción de status epiléptico (SE), las ratas son implantadas con el dispositivo. SE es inducido por pilocarpina y los animales (si no la dializaron y mató a las 24 h después SE; las ratas del grupo agudo) son video por 5 días (línea azul), a continuación, el vídeo-EEG, seguimiento para evaluar la frecuencia de las crisis y la duración en sus jaulas hogar (línea verde). El experimento de microdiálisis, el control no epiléptico epiléptico y respectivo ratas se transfieren a otro EEG establecido equipadas con jaulas de cilindro en 24 h antes de la sesión de microdiálisis y todavía el vídeo-EEG vigilado (linea verde). Las líneas rojas verticales representan las sesiones de diálisis en diferentes momentos del desarrollo de la enfermedad epiléptica. Las líneas rojas representan los diferentes grupos de animales epilépticos (y respectivos animales no epiléptico), donde la flecha indica el último día de la microdiálisis y el día de la muerte del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. In vitro la recuperación de dos sondas de la diálisis. Significa en vitro recuperación (%) de aspartato y glutamato utilizando dos diferentes sondas de microdiálisis comercialmente disponibles (ambos dotados de membrana de diálisis de largo 1 mm) (A) 2 μL/min y (B) 3 μl/min de caudal. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos independientes que se ejecutan en triplicado. No hay diferencias estadísticamente significativas entre la eficacia de diversas sondas (estudiante de desapareado t-test, p < 0.05). Utilizando un flujo tipo 2 μL/min que la recuperación glutamato aumentó cerca de 5% en comparación con 3 μl/min de caudal, así el flujo más lento fue utilizado para los experimentos de microdiálisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Ilustrativas grabaciones de EEG del hipocampo ventral de actividades paraoxystic como puede verse en la fase crónica en las ratas control y epilépticos. (A) dos rastros representante registran en dos ratas de no epilépticos tratadas Salinas. (B) rastros registran en dos ratas epilépticas. Descargas epileptiformes corresponden con asimientos comportamiento clase 3 en estas ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Curso temporal del efecto de estimulación de potasio sobre la liberación de glutamato desde el hipocampo de la rata. Resultado representativo del experimento de microdiálisis realizados en 6 control (círculos abiertos) y 6 ratas epilépticas crónicas (círculos negros). El gráfico muestra los cambios temporales de la concentración de glutamato del dializado en el curso de los experimentos de microdiálisis y durante la estimulación de alta 100 mM K+ . El tiempo de alto estímulo K+ (10 min) está indicado por la barra negra en la parte inferior del gráfico. Los datos son los medios ± SEM de 6 animales por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Ilustración de cromatogramas. Están marcados picos conocidos. Rastro de color de rosa: Cromatograma de la solución de Ringer sin aminas intencionalmente añadidas después de la derivatización de OPA/5-ME (muestra en blanco). Azul trace: Cromatograma de la muestra del dializado después de derivatización que muestra los picos de los aminoácidos: aspartato (tR min 4,80), glutamato (tR 6,75 min) y glutamina (tR 9,19 min) y el pico de es L-Homoserina (2,5 μm, tiempo de retención, t R min 9,83). Huella roja: cromatograma del estándar de aspartato (2,5 μm) y glutamato (2,5 μm) en solución de Ringer. Fondo azul celeste y amarillo de la foto está parado para la fase móvil A (azul) y móvil fase parte B (amarillo) utilizada para la elución de los analitos. Un rectángulo rojo indica área (tR min 10,41 y otros) muestra los picos de sustancias desconocidas y productos de degradación de la OPA. Todos los volúmenes de inyección fueron de 20 μl. Los derivados se separaron a un flujo de 0.8 mL/min haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8. Imagen representativa de la colocación de la sonda de electrodo combinado dentro del hipocampo ventral. (A) fotografía muestra el temor a la izquierda por la punta del dispositivo en detalle (flecha negra). (B) Ilustración esquema de las posiciones de punta de sonda de electrodo dentro del hipocampo ventral implantado de 12 ratas. Los cuadrados sólidos (algunos superpuestos) indican consejos de sonda electrodo correctamente localizadas. Cuadrados abiertos indican consejos sonda electrodo incorrectamente localizado en animales excluidos del estudio (n = 3). Rebanadas de cerebro coronales que contiene sondas y sitios de grabación fueron procesados después de experimentos para análisis histológico. Los números encima de la ilustración muestran la distancia de vértice (según Pellegrino et al. 1979 atlas del cerebro de la rata; barra de la nariz + 5,0 mm, utilizaron coordenadas:-3,40 mm, L + 5,4 mm; P + 7,5 mm de dura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Analito c (μmol/l) k q r2 LOD (pmol/l)
Glutamato 0.25-2.5 5.215 1043.79 0.999 19.4
Aspartato de 0.25-2.5 2.258 1994.72 0.998 31.7

Tabla 1. Características de cuantificación del método HPLC para la determinación de los aminoácidos. Concentración de parcelas de la variedad de normas (c), talud (k), intercepción (q), coeficiente de determinación (r2) y límite de detección (LOD) que describe la calibración obtenidos con soluciones de glutamato y aspartato (0.25, 0.5, 1.0 y 2.5 μm ) y la L-Homoserina estándar interno (2,5 μm) usando el método HPLC descrito con spectrofluorometric detección.

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Discussion

En este trabajo mostramos cómo se puede realizar una grabación continua de vídeo-EEG juntada con microdiálisis en un modelo experimental de ELT. Técnicas de grabación de vídeo-EEG se utilizan para diagnosticar correctamente las distintas fases de la progresión de la enfermedad en los animales y la técnica de microdiálisis se utiliza para describir los cambios en la liberación de glutamato que ocurren en el tiempo (no hay cambios se han encontrado para aspartato en un estudio previamente publicado2). Recomendamos el uso de un solo dispositivo/implante para realizarlas en cada animal por las razones discutidas en la introducción.

Siempre disponible, radiotelemetría debe ser preferida a los sistemas de atado para la grabación de EEG crónica minimiza interferencias con el comportamiento y reduce el riesgo de daño y sufrimiento para los animales54. Sin embargo, la grabación de EEG atada es mucho menos costosa que la telemetría.

En nuestro laboratorio utilizamos los conectores en el EEG, registro de sistema y microdiálisis tubería en paralelo, que cables y tubos están conectados a dos diferentes eslabones giratorios. Esta es la cuestión más crítica para estos experimentos: los cables y la tubería tienden a cruzar con frecuencia debido a los movimientos del animal. Por lo tanto, utilizamos conectores y tubería lo suficientemente larga para que el animal perseguir su propia cola (un comportamiento que se observa normalmente con la estimulación de potasio) o caer y rodar durante ataques epilépticos generalizados. Es aconsejable que firme más las cánulas de microdialysis insertadas en su guía de modelado en arcilla, con el fin de fortalecer su contacto con la guía (a veces, microdiálisis cánulas se golpean contra las paredes de la jaula durante asimientos generalizados y pueden Slip off). Por otro lado, es aconsejable mantener el tubo lo más corto posible minimizar el retraso entre neuroquímicos y tiempo de colección. Esto es particularmente importante cuando son cortos períodos de colección. En general, la microdiálisis la tubería debe ser de longitud adecuada y capacidad para asegurar el tiempo de muestreo no supere el tiempo entre la salida de la diálisis y colección. Se observó que los solutos tienden a difundir más entre algunos tapones Si el tiempo muerto de la tubería es superior a la tasa de muestreo55. Por lo tanto, el tiempo/volumen muerto experimental de microdialysis tubería debe ser había reducido tanto como sea posible y determinó precisamente para correlacionar los datos de la neuroquímica con el comportamiento del animal. Finalmente, es importante tener en cuenta que gira sobre un eje y electrodos juntados con cánula para estudios EEG y microdiálisis están comercialmente disponibles. Por lo tanto, siempre que sea posible, configurar el sistema EEG con la opción de realizar los experimentos de microdiálisis.

Las recomendaciones de menor importancia son: (i) antes de realizar cualquier experimento, compruebe que el EEG grabación sistema o microdiálisis configurar funcionan correctamente y solucionar cualquier problema; Sugerimos que uno reserva configurada listo (otra bomba con jeringas montado sobre y completado de la tubería llenada de soluciones de trabajo) cuando realizar el experimento, así como de un número suficiente de listo para usar microdialysis sondas para cambiar roto unos; (ii) cuando la transferencia de animal a la jaula de trabajo microdialysis EEG es útil disponer de una segunda persona para ayudar y a partir de las adquisiciones; (iii) hacer seguro de que la columna y muestreadores alcanzaron las temperaturas adecuadas antes de cromatografía; Además, utilizan estándares y construir los diagramas de calibración antes de cualquier muestra del dializado se inyecta en la columna cromatográfica; (v) cuando sea necesario, tratar de desarrollar la cromatografía u otro método analítico para medir analitos múltiples al mismo tiempo.

Alteraciones en la neurotransmisión tienen implicaciones en muchos trastornos de CNS (como epilepsia) y ha habido un gran interés en las décadas para cuantificar estos cambios durante la progresión de un sano a un fenotipo enfermo. Hoy, sólo algunas técnicas permiten la medición de los cambios en niveles de neurotransmisores en días o meses. Microdiálisis es una de estas técnicas. En un gran número de casos, como el descrito aquí, se efectúa libremente mover animales y acompañada convencionales offline ensayos analíticos como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o electroforesis capilar (CE), que alcanza 5-30 mínima resolución temporal31,56. Claramente, estos intervalos de muestreo no reflejan el neurotransmisor rápido dinámica en el entorno de sinapsis, pero puede ser conveniente para algunas aplicaciones de la microdiálisis de largo plazo (por ejemplo, desarrollo de la enfermedad o estudios del efecto de medicamentos) que requieren acoplamiento neuroquímico, EEG y datos conductuales. Sin embargo, otros estudios están principalmente preocupados con medición en tiempo real o cerca en tiempo real cambios en neurotransmisor lanzamiento. Para éstos, la técnica de microdiálisis debe ser refinada para incrementar la velocidad de muestreo (por lo tanto disminución de volúmenes de muestra). De hecho, la técnica de microdiálisis clásico es a menudo criticada por su pobre temporales (minutos) y la resolución espacial (la sonda convencional es mucho mayor que la hendidura sináptica)9,21,56, 57. sin embargo, es la gran sensibilidad del método analítico junto a microdialysis lo determina la resolución de tiempo de microdiálisis (es decir, su resolución es igual al tiempo necesario para tener suficiente muestra para ser detectado por un análisis técnica56). Así, cuando el microdialysis produce pequeñas cantidades de muestras, se debe aumentar la sensibilidad de las técnicas de cuantificación. Hasta la fecha, dichas mejoras en la resolución temporal de la técnica de microdiálisis seguido 3 líneas diferentes. Uno de ellos está representado por la miniaturización de las columnas o las células de detección de los métodos HPLC clásicas; Estos se llaman técnicas UHPLC (ultra-alto rendimiento HPLC) y permiten para obtener 1-10 minutos tiempo de resolución58,59,60. Otro enfoque es par un clásico HPLC para espectrometría de masas (MS) o tándem (MS/MS) para el análisis multiplex de neurotransmisores en cerebro dialysates. Combinado análisis HPLC-MS tienen una excelente sensibilidad y alcanzan acerca de 1-5 min tiempo de resolución56,61,62,63. Una tercera línea de mejora existe en modificaciones de la electroforesis capilar (CE). Si CE utiliza láser inducida por detección de fluorescencia (CE-LIFD), permite la determinación de concentraciones submicromolar de varios neurotransmisores en nanoliter fracciones obtenidas cada 5 min55,64,65 o incluso en el de intervalos de 10 s56. Una clara ventaja que se desprende de UHPLCs o avanzados enfoques analíticos de la CEs es que el muestreo puede hacerse mover libremente los animales, sin comprometer los experimentos en que comportamiento espontáneo debe observado y analizado. Por otro lado, existen métodos que permita el muestreo del dializado cerebral en incluso centenas milisegundos resolución temporal (reactor de enzimasp. ej., basado en ensayos en línea o colección de gotas de dializado junto a técnicas de MS), pero estos son normalmente utilizados en animales restringida66 o bajo anestesia general67,68,69, no permitiendo par microdialysis con estudios de comportamiento.

Cuando se considera la segunda más importante debilidad de microdiálisis, es decir, relativamente baja resolución espacial debido a las dimensiones de la membrana (a menudo alrededor de 0,5 mm de diámetro y 1-4 mm de longitud), una alternativa pueden ser las microsondas desarrollado con bajo flujo toma de muestras push-pull. Estas puntas de prueba consisten en sílice dos tubos capilares (de 20 μm ID y OD 200 μm) fundieron side-by-side y forraron con un tubo polimérico. Durante el experimento, estos capilares son perfundidos a velocidades de flujo muy bajo, tal que el líquido es retirado de un capilar y una muestra es obtenida de la otra en el mismo caudal. Porque el muestreo ocurre solamente en la punta de la sonda, la resolución espacial es mayor que con la sonda de microdiálisis70. Otra posibilidad es pasar de sondas miniaturizadas a arreglos de microelectrodos (biosensores) para la evaluación del neurotransmisor en tiempo real. Diferentes técnicas electroquímicas (basadas principalmente en la voltametría o Amperometría) permiten muestreo analito muy cerca de la sinapsis (escala del micrón) y en menos de 1 s31,70,71. Estos dispositivos pueden medir la concentración de analitos múltiples de múltiples regiones del cerebro. Sin embargo, también necesitan algunas mejoras, por ejemplo, para evitar artefactos y un deterioro relativamente rápido.

Teniendo en cuenta los últimos avances en vivo la monitorización neuroquímica, es probable que los métodos de muestreo diferentes transmisor se combinarán en un sensor en un futuro cercano. Ya ha comenzado el trabajo sobre las sondas de muestreo recientemente, y creemos que nuevos avances en tecnologías de microfabricación junto con avances analíticos más facilitará en vivo neuroquímicos investigación seguimiento. En este momento, sin embargo, la microdiálisis convencionales correlacionados con EEG sigue siendo un método válido para muchas aplicaciones de la neurociencia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon y Eleonora Palma por su contribución a manuscritos publicados en precedencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

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References

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

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Neurociencia número 141 microdiálisis glutamato aspartato epilepsia modelo de pilocarpina cirugía estereotáctica estimulación de potasio electroencefalograma (EEG) cromatografía líquida
Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas
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Soukupová, M., Falcicchia, C.,… More

Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

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