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Neuroscience

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Abstract

Microdialysis é uma técnica bem estabelecida neurociência que correlaciona as alterações de substâncias neurologicamente activas difusão no espaço intersticial do cérebro com o comportamento e/ou com o resultado específico de uma patologia (por exemplo, convulsões para a epilepsia). Ao estudar a epilepsia, a técnica do microdialysis é frequentemente combinada com a curto prazo ou mesmo a longo prazo vídeo-Eletroencefalografia (EEG de monitoramento para avaliar a frequência de apreensão espontânea, severidade, progressão e clustering). O combinado microdialysis-EEG baseia-se na utilização de vários métodos e instrumentos. Aqui, realizamos na vivo microdialysis e contínua de vídeo-EEG gravação ao monitor glutamato e aspartato de vazão ao longo do tempo, em diferentes fases da história natural da epilepsia em um modelo do rato. Esta abordagem combinada permite o emparelhamento das mudanças na versão do neurotransmissor com estágios específicos do desenvolvimento da doença e da progressão. A concentração de aminoácidos do dialisato foi determinada por cromatografia líquida. Aqui, descrevemos os métodos e as principais medidas de precaução devem tomar durante no vivo microdialysis de estrutura de tópicos-EEG, com particular atenção para a cirurgia estereotáxica, estimulação basal e alto de potássio durante microdialysis, profundidade eletrodo de EEG gravação e análise de cromatografia líquida de alta eficiência de aspartato e glutamato no dialisato. Esta abordagem pode ser adaptada testar uma variedade de drogas ou doenças induzidas por alterações das concentrações fisiológicas de aspartato e glutamato no cérebro. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, pode ser ainda mais usado para testar diferentes moléculas solúveis quando empregando gravação de EEG, ao mesmo tempo.

Introduction

Para fornecer insights sobre o comprometimento funcional da mediada por glutamato excitatório e neurotransmissão inibitória gabaérgica, resultando em convulsões espontâneas em epilepsia do lobo temporal (TLE), nós sistematicamente monitorada concentrações extracelulares de GABA1 e depois do curso os níveis de glutamato e aspartato2 por microdialysis no hipocampo ventral de ratos nos vários pontos de tempo da doença natural, ou seja, durante o desenvolvimento e progressão da epilepsia. Aproveitamos o modelo TLE pilocarpina em ratos, que imita a doença com grande precisão em termos de mudanças comportamentais, eletrofisiológicos e histopatológico3,4 e nós correlacionada à concentração do fluído de amino ácidos para suas diferentes fases: fase aguda após o insulto eletrofisiolÃ, a fase de latência, o tempo da primeira convulsão espontânea e a crônica phass5,6,7. Emoldurando as fases da doença foi habilitado pelo acompanhamento a longo prazo de vídeo-EEG e EEG preciso e caracterização clínica de convulsões espontâneas. Aplicação da técnica microdialysis associado com monitoramento de vídeo-EEG a longo prazo permitiu-na propor hipóteses mecanicistas para neuropatologia TLE. Em resumo, a técnica descrita neste manuscrito permite o emparelhamento de alterações neuroquímicas dentro de uma área do cérebro definidos com o desenvolvimento e progressão da epilepsia em um modelo animal.

Dispositivos emparelhados, compostos de um eletrodo de profundidade justaposto a uma microdialysis cânula, muitas vezes são empregados em estudos de investigação de epilepsia onde alterações em neurotransmissores, seus metabólitos ou substratos de energia devem ser correlacionadas com a atividade neuronal. Na maioria dos casos, é utilizado em livremente, comportando-se os animais, mas também pode ser conduzida de forma semelhante em seres humanos, por exemplo, na categoria fármaco-resistente pacientes epilépticos submetidos a investigação de eletrodo de profundidade antes da cirurgia8. Gravação de EEG e coleção do fluído podem ser realizada separadamente (por exemplo, implantar o eletrodo em um hemisfério e o microdialysis sonda em outro hemisfério, ou mesmo realizando o microdialysis em um grupo de animais durante a execução o único EEG em outro grupo de animais). No entanto, os eletrodos de acoplamento para sondas pode ter múltiplas vantagens: simplifica a cirurgia estereotáxica, limita o dano tecidual para apenas um hemisfério (enquanto o outro, deixando intacto, como um controle para estudos histológicos) e homogeneiza os resultados como estes são obtidos a partir da mesma região do cérebro e o mesmo animal.

Por outro lado, a preparação do dispositivo acoplado microdialysis sonda-eletrodo requer habilidade e tempo se for feito em casa. Um podia passar quantidades relativamente elevadas de dinheiro se tiver comprado no mercado. Além disso, quando microdialysis sondas (sonda dicas são tipicamente 200-400 µm de diâmetro e 7 a 12 mm de comprimento)9e eletrodos de EEG (pontas de eletrodo são geralmente de 300 a 500 µm de diâmetro e o tempo suficiente para alcançar a estrutura cerebral de juros10) são acoplado, o dispositivo montado representa um objeto relativamente pesado e volumoso, de um lado da cabeça, que é problemático para animais e propenso a ser perdidos, especialmente quando está ligado a bomba de diálise e o sistema de gravação de EEG de arame duro. Este aspecto é mais relevante em animais epilépticos que são difíceis de lidar e menos adaptável para as sessões do microdialysis. Técnicas cirúrgicas adequadas e cuidados pós-operatórios adequados podem resultar em implantes de longa duração que causam desconforto animal mínimo e devem ser perseguidos por combinatória microdialysis-EEG experimentos10,11, 12.

As vantagens e limitações da técnica microdialysis foram examinadas em pormenor pelos muitos neurocientistas. Sua principal vantagem sobre outras na vivo perfusão técnicas (por exemplo, fluxo rápido push-pull ou perfusão cortical Copa) é um pequeno diâmetro da sonda que cobre uma área relativamente precisa de interesse13,14, 15. Em segundo lugar, a membrana do microdialysis cria uma barreira física entre o tecido e o perfusato; Portanto, substâncias de alto peso molecular não cruzar e não interfiram com a análise de16,17. Além disso, o tecido é protegido contra o fluxo turbulento do perfusato18. Outra vantagem importante é a possibilidade de modificar o fluxo de perfusato para maximizar a concentração do analito no perfusato (ou seja, o processo de microdialysis pode ser bem definido matematicamente e podem ser modificado para produzir alto concentração do analito na amostra)19. Finalmente, a técnica pode ser usada para infundir a drogas ou substâncias farmacologicamente activas no tecido de interesse e para determinar o seu efeito no local da intervenção20. Por outro lado, o microdialysis tem um tempo de resolução limitada (normalmente mais de 1 min devido ao tempo necessário para a coleta de amostras) em comparação com sensores eletroquímicos ou biológicos; é uma técnica invasiva que provoca danos nos tecidos; compromete o equilíbrio neuroquímico no espaço ao redor da membrana devido ao gradiente de concentração contínua de todas as substâncias solúveis que entra o perfusato juntamente com o analito de interesse. Finalmente, a técnica do microdialysis é altamente influenciada pelos limites das técnicas analíticas utilizadas para a quantificação de substâncias no perfusato9,21,22,23 . A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), após derivatização com orthophthaldialdehyde para análise de glutamato e aspartato em amostras biológicas tem sido bem validado24,25,26 , 27 e sua extensa discussão está fora do escopo deste manuscrito, mas os dados produzidos por meio desse método serão descritos em detalhes.

Quando realizado corretamente e sem modificações da composição perfusato, microdialysis pode fornecer informações confiáveis sobre os níveis basais de liberação do neurotransmissor. A maior parte dos níveis basais é provavelmente o resultado das repercussões de transmissor de sinapses9. Porque em muitos casos a simples amostragem do neurotransmissor no espaço extra sináptico não é suficiente para prosseguir os objectivos de uma investigação, a técnica do microdialysis pode ser empregada também para estimular os neurônios ou privá-los de importante íons fisiológicos como K+ ou Ca2 +, de evocar ou evitar a liberação do neurotransmissor.

Alta estimulação K+ é usada frequentemente em neurobiologia para estimular a atividade neuronal, não só em animais acordados, mas também em culturas primárias e organotypic. A exposição de um sistema nervoso saudável para soluções com concentrações elevadas de K+ (40-100 mM) evoca o efluxo de neurotransmissores28. Essa capacidade dos neurônios para fornecer uma liberação adicional em resposta à alta K+ pode ser comprometida em animais epilépticos1 e em outras de29,de doenças neurodegenerativas30. Da mesma forma, o Ca2 + privação (obtida por perfusing soluções livres Ca2 + ) é usada para estabelecer o cálcio-dependente liberação de neurotransmissores mais medidos pelo microdialysis. Geralmente acredita-se que a liberação de Ca2 + dependente é de origem neuronal, Considerando que a liberação de Ca2 + independente origina glia, mas muitos estudos levantarem controvérsia sobre o significado de Ca2 +-medições sensíveis de, por exemplo, glutamato ou GABA9: assim, se possível, é aconselhável apoiar estudos microdialysis com estudos de microsensor, como estes últimos têm maior resolução espacial e os eletrodos permite para se aproximar de sinapses31.

Sobre microdialysis estudos em animais epilépticos, é importante salientar que os dados obtidos da maioria deles dependem de vídeo ou vídeo-EEG, monitoramento de convulsões, ou seja, da ocorrência de sinais e/ou sintomas devido a anormal transitória síncrona ou excessiva atividade neuronal no cérebro32. Existem algumas especificidades de electrographic convulsões em animais de pilocarpina Tratado que devem ser considerados na preparação do experimento. Convulsões espontâneas são seguidas por atividade deprimida com frequentes EEG picos interictais3 e ocorrem em aglomerados33,34. Sham operados não-epiléptica animais podem apresentar convulsão, como atividade35 e, portanto os parâmetros para avaliação de gravações de EEG devem ser padronizada36 e, se possível, o calendário de sessões do microdialysis deve ser bem definido. Finalmente, é altamente recomendável seguir os princípios e normas metodológicas para monitoramento de vídeo-EEG em roedores adultos controle descrito por peritos da Liga Internacional contra epilepsia e sociedade americana de epilepsia em seus relatórios muito recentes37 ,38.

Aqui, descrevemos microdialysis de glutamato e aspartato em paralelo com as gravações de vídeo-EEG a longo prazo em animais epilépticos e sua análise no dialisato por HPLC. Nós enfatizará os passos críticos do protocolo que um deve cuidar para obter melhores resultados.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Ferrara institucional Animal cuidados e Comissão de uso e pelo Ministério da saúde italiano (autorização: D.M. 246/2012-B) em conformidade com as diretrizes descritas nas Comunidades Europeias Directiva do Conselho, de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de aspartato e glutamato no cérebro de rato dialysates obtidas sob controle de EEG do microdialysis sessões em ratos epilépticos e não-epiléptica. Muitos dos materiais descritos aqui podem ser facilmente substituídos com aqueles que usa em seu laboratório para gravações de EEG ou microdialysis.

1. montagem do dispositivo Microdialysis sonda-terra

  1. Usar um eletrodo de dois trançado 3 canais (pelo menos um 20 mm comprimento do eletrodo registo de corte e um tempo de aterramento eletrodo de 10 cm) e acoplar a uma cânula guia para preparar o dispositivo. Ver exemplos de cânula de eletrodo e guia de 3 canais para diálise na figura 1A-1B.
  2. Remover (Figura 1) e inserir (Figura 1), a cânula de metal guia dentro da cânula de plástico manequim algumas vezes antes do uso para facilitar sua remoção no momento de seu switch para microdialysis sonda no animal.
  3. Dobre os fios torcidos de registrar eletrodo duas vezes (Figura 1E-1F) a fim de alinhar os fios com a cânula de manequim do guia e corte a ponta do eletrodo (Figura 1) para ser mais do que a ponta da cânula guia (Figura 0.5 mm 1 H) usando o paquímetro digital.
  4. Tem pronto a argola de longa silicone 1mm (OD 2 mm, espessura 0,3 mm; Figura 1I) e insira a ponta da cânula guia e a ponta dos eletrodos torcidos na argola de silício usando uma pinça (Figura 1J). Corrigi-lo para o pé do guia de pedestal de cânula com cola de polímero de ação rápida ou resina (Figura 1 K). Consulte o exemplo dos dispositivos preenchidos na Figura 1 L e Figura 2A.
  5. Esterilize o dispositivo sob a luz UV germicida para 4 h. vire o dispositivo quatro vezes tão como cada um de seus lados é exposta à luz por 1h.
    Nota: Muitas sondas eletrodos e microdialysis caseiro podem ser montadas em uma maneira similar. A cabeça do acima descrito implante para ratos tem as seguintes dimensões: largura de 7 mm x 5 mm profundidade x comprimento 10 mm do topo até o pedestal do dedo do pé; a ponta do implante é cerca de 11 mm de comprimento, 600 µm de diâmetro e todo o dispositivo pesa cerca de 330-360 mg. O dispositivo pode ser reutilizado duas ou três vezes se (i) um comprimento suficiente do eléctrodo de terra é deixado no crânio durante a cirurgia para o próximo uso e (ii) quando o animal é morto, e o dispositivo recuperou junto com o cimento dental for deixado em acetona overnigh t, tal que o cimento pode ser mecanicamente desagregado, e o dispositivo lavados e esterilizados novamente.

2. estereotáxica cirurgia

  1. Use um estereotáxica aparelhos e sonda clipe titular (Figura 2B) para a implantação do dispositivo seguindo os padrões contemporâneos para cirurgias asséptica e indolor39,40,41.
    1. Anestesiar a ratos Sprague Dawley do adulto com mistura de xilazina/cetamina (43 mg/kg e 7 mg/kg, i.p.) e corrigi-lo sobre a armação estereotáxica. Adicione anestesia isoflurano (1,4% em ar; 1,2 mL/min) para injeção inicial de xilazina/cetamina como permite para controlar a profundidade da anestesia no tempo. Raspe o pelo na cabeça do animal.
  2. Limpe a superfície da pele cabeça pela solução à base de iodo, seguida por 70% de etanol para prepará-lo para cirurgia asséptica39.
    1. Implantar o dispositivo de cânula-eletrodo guia preparado em precedência (1.1 – 1.5) no hipocampo ventral bem usando as seguintes coordenadas: bar do nariz 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm para bregma1,2. Siga as técnicas padrão para cirurgias estereotáxica10,11,12.
    2. Certifique-se de que não abrange os parafusos de ancoragem. Quando montando-a em aparato estereotáxica, segure o dispositivo para a cabeça de cânula guia como isto pode ser facilmente alinhado ao titular da sonda.
  3. Ancore o dispositivo no crânio pelo menos quatro parafusos de aço inoxidáveis, aparafusando-os dentro do osso do crânio (1 parafuso no parafuso esquerdo e 1 para as placas de certo osso frontal, 1 parafuso para o parietal esquerdo e 1 parafuso para as placas de osso interparietal). Adicione uma gota de cola de tecido para fixar ainda mais cada parafuso no osso do crânio.
    1. Cobrir a metade de roscas do parafuso com cimento metacrílico. Promover a ligação do cimento, tornando superficiais sulcos no osso para aumentar a aderência.
  4. Uma vez que a ponta do dispositivo é posicionada no tecido cerebral, torce o fio do eléctrodo de terra em torno de 3 parafusos de ancoragem. Cobrir os parafusos todos montados e o dispositivo com o cimento dental12,42,43.
  5. Monitore os animais durante a cirurgia e para cerca de 1 h depois disso até ereto e movimentar a gaiola. Mantê-los em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Permitir que os ratos recuperar pelo menos 7 dias após a implantação do dispositivo.
  6. Monitore os animais pelo menos uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para sinais de dor ou sofrimento. Dar os animais com o creme antibiótico (gentamicina 0,1%) perto do local de incisão para prevenir a infecção e um analgésico (tramadol 5mg/kg, i.p.) por 3 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.

3. lobo Temporal epilepsia indução por pilocarpina e cessão de animais para grupos experimentais

  1. Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, atribuir os animais aleatoriamente para grupos: (i) o controle de animais recebendo animais veículo e (ii) epiléptico que receberão a pilocarpina. Uso um número proporcionalmente maior de animais para epiléptico grupo desde que nem todos a pilocarpina administrada a ratos irá desenvolver a doença.
  2. Injete uma dose de methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) e 30 min, após uma única injeção de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para induzir o estado de mal epiléptico (SE). Injete o methylscopolamine e o veículo (soro), aos ratos controle. Use seringa de 1 mL com agulha de 25G para todas as administrações do i.p..
    1. Verificar visualmente os animais para começar a ter convulsões comportamentais (movendo vibrissa dentro de 5 min, balançando a cabeça, os membros de clonagem) e dentro de 25 min para clonar continuamente todo o corpo (SE).
  3. Prenda a SE 2 h após o início para ter uma mortalidade de cerca de 25% e um período de latência médio de aproximadamente 10 dias pela administração de diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observar e registrar qualquer início de comportamento de ataque imediatamente após a injeção de pilocarpina e continuar pelo menos 6 h depois disso.
  4. Dê o soro de animais (1 mL, i.p.) usando a seringa de 1 mL com solução 25g agulha e sacarose (mL 1, p.o.) usando a seringa de 1 mL e agulha de 17G alimentação flexível para 2-3 dias após SE promover a recuperação da perda de peso de corpo.
    1. Exclua os animais que não atingir o peso inicial na primeira semana após a pilocarpina SE partir do estudo (exceto para o grupo agudo matado 24 h após SE, onde o acompanhamento de peso do corpo não é possível).
  5. Atribuir a animais post-SE aleatoriamente para diferentes grupos experimentais (Figura 3): aguda (onde o microdialysis ocorre 24h após SE), latência (7-9 dias após SE), primeira apreensão espontânea (aproximadamente 11 dias após SE) e fase crônica (período começa a cerca de 22 a 24 dias após SE, ou seja, cerca de 10 dias após a primeira convulsão). Monitore os animais para a ocorrência de convulsões espontâneas.
    Nota: Use os seguintes critérios de inclusão/exclusão para novas experiências em ratos epilépticos: desenvolvimento de convulsiva SE dentro de 1 h após a administração de pilocarpina; ganho de peso na primeira semana após SE e o correto posicionamento da sonda microdialysis e eletrodo.

4. epilepsia comportamento monitoramento e análise

  1. Acompanhamento a longo prazo do comportamento epiléptico
    1. Aproximadamente 6 h após a administração de pilocarpina (isto é, ao final da observação directa pelos pesquisadores), colocar os animais em gaiolas de limpar a casa e iniciar o monitoramento de vídeo 24 h.
    2. Continue o vídeo 24h monitorando até dia 5, usando um sistema de vigilância de vídeo digital.
    3. Começando no dia 5, conectar os ratos em jaulas em casa retangulares para sistema de gravação de EEG amarrados e continuar o monitoramento de vídeo 24 h.
    4. Conjunto de parâmetros do amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday (fator de amplificação definido em cada canal de acordo com a especificidade do sinal EEG de cada único animal) e iniciar o EEG aquisição observando o sinal de EEG produzidos pela desconectado cabos. Uso de amostragem taxa de 200 Hz e baixo passar o conjunto de filtro para 0,5 Hz.
    5. O animal Conecte cabos segurando a cabeça do animal entre dois dedos esticados de uma mão e a perna para baixo os conectores para o pedestal de eletrodo usando a outra mão livre. Inicie a aquisição.
      Atenção: Certifique-se de que o sinal é livre de artefatos. Artefatos comuns são os picos extremamente exceder a escala.
    6. Um dia antes de experimentar os microdialysis, transferi os animais para o sistema de EEG amarrado equipado com cilindros de plexiglás para microdialysis. Desconecte os animais do EEG amarrar sistema de gaiola em casa estragando os conectores do elétrodo sem conter o animal. Coloca o animal dentro dos cilindros de plexiglass de alta.
  2. Monitoramento do comportamento epilético, um dia antes e durante a sessão do microdialysis
    1. Ligue o amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday. Abra o software de EEG. Iniciar a aquisição do EEG observando o sinal de EEG produzida por cabos desconectados.
    2. Conecte o animal para o sistema de gravação de EEG amarrado segurando a cabeça do animal entre dois dedos esticados de uma mão e a perna para baixo os conectores para o pedestal de eletrodo usando a outra mão livre. Defina um fator de amplificação (ganho) em cada canal do amplificador de acordo com o sinal de eletrodo de único animal assim que o sinal de EEG está em escala. Deixe o animal explorar a nova gaiola (cilindro) pelo menos 1 h sob a observação direta do pesquisador.
    3. Nota: 24 h antes do microdialysis experimento, os ratos são brevemente anestesiados com isoflurano para o interruptor de cânulas de guia para microdialysis sonda. Aproveite o momento quando eles são anestesiados para conectá-los para o sistema de gravação de EEG.
    4. Encurtar ou prolongar penduloso cabo de acordo com o producto do animal. Certifique-se de que os cabos não interferir com os movimentos do animal e postura mentirosa.
    5. Verificar o enquadramento da imagem correta de câmeras de vídeo. Inicie a gravação de vídeo-EEG.
  3. Identificação de convulsões e atividade de EEG
    1. Use um leitor de software para assistir os vídeos. Rolar o filme 8 vezes mais rápido do que o tempo real de jogar e individualizar as convulsões generalizadas (ver animal à retaguarda e clonus membro anterior ou animal de criação e caindo com clonus membro anterior). Desacelerar o vídeo e anote a hora exacta do início e do fim da apreensão comportamental.
    2. Processo os dados contando o número de convulsões generalizadas observada em 24 h de registos vídeo e expressá-los em termos de apreensão de frequência e duração como valores médios de todas as convulsões observadas em 24 h.
    3. Definir as convulsões de EEG que os períodos de atividade paroxística de alta frequência (> 5 Hz) caracterizada por uma > 3 vezes incremento da amplitude ao longo da linha de base com a progressão da frequência da espiga que dura por um período mínimo de 3 s2,44 ou semelhante a28. Use software de EEG para processar as gravações de EEG crus. Dividi os vestígios de EEG em frações de 1 h. Copie as frações de rastreamento do EEG para o arquivo para o software de análise automática de spike.
    4. Analise os dados de atividade do EEG usando software de EEG e parâmetros predefinidos (4.3.3.). Realizar todas as análises de vídeo em dois investigadores independentes que são cegos para o grupo de animais analisados. Em caso de divergência, fazê-los voltar a analisar os dados para chegar a um consenso,45.

5. Microdialysis

  1. Em vitro recuperação de sonda
    1. Prepare a sonda para seu primeiro uso de acordo com as instruções do fabricante, lidando com isso na capa protetora.
    2. Realizar o experimento em triplicado: preparar três tubos de ensaio de 1,5 mL carregá-los com 1 mL de solução de Ringer contendo a mistura de padrões (2,5 µM de glutamato) e 2,5 µM de aspartato. Coloque três tubos de ensaio carregado 1,5 mL em conjunto bloco aquecedor a 37 ° C e posicioná-lo no agitador.
      Nota: Use as mesmas soluções padrão para calibração de cromatografia.
    3. Selar os tubos de ensaio de 1,5 mL com película de parafina e punção-lo por Pinças afiadas tornar-se um buraco de cerca de 1 mm de diâmetro.
    4. Levar a sonda e inseri-lo no buraco feito na película de parafina. Mergulhe a membrana de pelo menos 2 mm abaixo do nível da solução. Correção mais a sonda ao tubo de ensaio de 1,5 mL pela película de parafina.
      Atenção: Certifique-se de que a ponta não toque as paredes do tubo de ensaio de 1,5 mL.
    5. Conecte a entrada da sonda na seringa montado na bomba de infusão, usando adaptadores de FEP-tubos e tubagens. Opcionalmente, uso fino furo tubos de polietileno de 0,28 mm ID e 0,61 milímetros OD e tubos coloridos adaptadores (tubo vermelho e azul) para conexões.
    6. Ligue a bomba 2 µ l/min e deixe o líquido aparecer na ponta da tomada. Conecte a saída da sonda a 0,2 mL tubo de teste usando adaptadores de FEP-tubos e tubos de coleta.
      Nota: Use o FEP-tubulação para todas as conexões. Corte o comprimento desejado do tubo usando uma lâmina de barbear. Use adaptadores de tubos de cor diferente para a entrada e a saída da sonda. Deixe a bomba executada por 60 min. verificação de vazamentos e bolhas de ar. Estas não devem estar presentes.
    7. Conjunto da bomba para o fluxo taxa 2 µ l/min e começar a coletar as amostras no lado da descarga da tubulação.
    8. Colete três amostras de perfusato 30 min e três amostras de igual volume da solução num tubo de ensaio de 1,5 mL. Leve as amostras de igual volume do tubo de ensaio de 1,5 mL cada 30 min usando a micro-seringa imergida na solução-padrão em tubo de ensaio de 1,5 mL.
    9. Repeti a experiência (5.1.1-5.1.8) configurando a bomba para o fluxo taxa 3 µ l/min (5.1.7) para ter uma comparação de recuperação sonda quando usando duas taxas de fluxo diferentes da perfusão.
    10. Quando terminar, parar a bomba e enxaguar o tubo com água destilada, etanol 70% e empurrar o ar para ele. Loja da sonda em um frasco enchido com água destilada limpa. Enxague a sonda por perfusing-2 µ l/min por água destilada prévia do armazenamento.
    11. Analisar a concentração de glutamato e aspartato nas amostras por cromatografia (veja os detalhes abaixo; 6.3).
    12. Calcule a recuperação utilizando a seguinte equação:
      Recuperação (%) = (Cperfusato /Cdialysed solução) x 100.
  2. Microdialysis sessões em ratos movimentando-se livremente
    1. Preparativa procedimentos: sonda de inserção e testes, infusão bomba de configuração e iniciar
      1. Preparar as sondas microdialysis para o primeiro uso de acordo com o manual do fabricante e encha-os com solução de Ringer. Corte cerca de 10 cm longos pedaços de FEP-tubos e conectá-los a cânulas de entrada e saída da sonda usando adaptadores de tubos de cores diferentes.
      2. Certifique-se de que a tubagem toca os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.
      3. 5.2.1.3. 24 h antes do experimento microdialysis, brevemente anestesiar o animal com isoflurano (5% em ar) em uma câmara de indução até reclinada. Remova a cânula manequim de seu guia, usando a pinça e segurando a cabeça do animal com firmeza. Introduzir a sonda microdialysis, dotada de uma membrana dialyzing, dentro da cânula guia e firma mais as cânulas microdialysis inseridas em seu guia por argila de modelagem.
        Atenção: Não deixe que a sonda tocar as paredes da luva protetora sonda ao extrair.
      4. Colocar o animal dentro do cilindro de Plexiglas e deixá-lo a explorar o novo ambiente. Conectar o animal para o sistema de gravação de EEG amarrados, como descrito acima (siga os pontos 4.2.2 e 4.2.3).
      5. Siga o acordado e movimentando-se livremente os movimentos do rato e conectar a entrada da sonda na seringa de 2,5 mL com agulha de 22g embotadas contendo solução de Ringer usando adaptadores de tubos. Empurre a solução de Ringer no interior da sonda ejetando 1 mL de solução de Ringer em 10 s continuamente empurrando o êmbolo da seringa de 2,5 mL. Verifique se a gota do líquido aparecendo na saída. A sonda está agora pronta para uso.
      6. Encher as seringas de 2,5 mL ligadas ao FEP-tubulação por adaptadores de tubos com solução de Ringer e montá-los para a bomba de infusão. Ligue a bomba 2 µ l/min. Deixá-lo correr durante a noite.
        Nota: Use o comprimento desejado do FEP-tubo de tudo mas calcular o volume morto de tubulação para saber quando a estimulação de K+ a alta deve ser iniciada e correlacionar os dados de quantificação com mudanças neuroquímicas no cérebro de animais. Use a bolha de ar criada na tubulação de sob o fluxo de trabalho para calcular esse tempo.
    2. Coleta de amostras durante a estimulação de EEG gravação e potássio
      1. Verificar a ausência de convulsões no 3 h antes do início da coleta de amostra (gravações de vídeo-EEG) e continuar a monitorar a atividade de apreensão durante microdialysis.
      2. Pare a bomba carregando as seringas de FEP-tubulação canulado preenchidas com solução de Ringer. Montagem sobre a bomba de outro conjunto de seringas de 2,5 mL ligado ao FEP-tubulação com tubos adaptadores preenchidos com solução de Ringer modificados contendo 100 mM K+ solução.
      3. Ligue a bomba 2 µ l/min e deixá-lo correr. Para mais rápido enchimento da tubulação, defina a bomba por 5 µ l/min para o tempo de enchimento. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema. Certifique-se de que a tubagem toca os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.
      4. Teste a sonda se pronto para uso em animais como descrito acima (5.2.1.5).
        Nota: Se por algum motivo, a sonda não funciona, mudá-lo. Para esses casos, manter alguns sondas microdialysis preparado prontas para usar perto de estação de trabalho da microdialysis-EEG. Desconecte os cabos de EEG o animal e anestesiá-lo brevemente com isoflurano se necessário realizar a mudança.
      5. Conecte o FEP-tubo de seringas preenchidos com solução de Ringer para a cânula da entrada da sonda em cada animal e esperar pelo aparecimento da gota na ponta de saída do líquido.
      6. Conecte a saída da sonda o FEP-tubulação, que leva à coleção no tubo de teste. Inserir o tubo de FEP para o tubo de ensaio fechado 0,2 mL com tampa perfurada. Certifique-se de que o tubo fica no lugar por fixação com um pedaço de argila de modelagem.
      7. Continue a funcionar a bomba 2 µ l/min por 60 min sem coleta de amostras para equilibrar o sistema (zero amostra).
      8. Recolha 5 amostras de dialisato consecutivos 30 min (respectivo volume 60 µ l) em condições de linha de base (perfusão com solução de Ringer normal). Armazenar as amostras no gelo.
      9. Calcular o tempo que leva o líquido a passar da bomba na cabeça do animal (depende do volume morto da tubulação, ou seja, tempo de bolha de ar) e alternar o FEP-tubulação que vai desde as seringas contendo solução de Ringer normal para seringas contendo modificado a solução de Ringer (100 mM K+) neste momento sem parar a bomba. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema. Deixe a bomba funcionar por 10 min.
        Atenção: Em 10 min de alta estimulação K+ , os animais tendem a mover-se freneticamente e geralmente apresentam um número grande de cachorro molhado shakes (controle e sem animais de aglomerado de apreensão) ou convulsões comportamentais (animais epilépticos), para estar pronto para intervir para protege os cabos e tubos de torção.
      10. Depois de 10 min, alterne a tubagem das seringas contendo 100 mM K+ Ringer solução de solução de Ringer normal e deixe a bomba funcionar. Não desligue a bomba durante as mudanças de solução para que que vai haver uma gota do líquido na extremidade do tubo deve ser ligado em linha.
      11. Desde o momento em que o dialisato contém potássio alto, ou seja, após a coleta do quinto post-equilíbrio de dialisato, recolher as frações do fluído cada 10 min (20 µ l) para as amostras do fluído de 1 h. coletar 3 adicional de 30 min e parar a bomba. Armazene as amostras no gelo.
      12. Armazene as amostras a-80 ° C após a experiência, até análise HPLC.
      13. Repita que os microdialysis experimentar durante 3 dias consecutivos, exceto para a aguda (24 h) e o primeiro grupo de apreensão, em que microdialysis apenas uma sessão realiza 24 h após SE ou dentro de 24 h após a primeira convulsão espontânea (Figura 3).
      14. Após a conclusão de cada experimento, abater o animal com uma overdose de anestésico e remover o cérebro para verificação da colocação de sonda e o eléctrodo.
  3. Procedimentos pós-microdialysis
    1. Enxagúe as sondas microdialysis usado com água destilada e armazená-los em um frasco enchido com água destilada até à próxima utilização.
      Nota: As membranas reutilizadas podem ter aumentado a permeabilidade; seleção para a recuperação de sonda antes da sua utilização repetida.
    2. Enxágue o inteiro microdialysis configurar (tubos, conectores e seringas) com água destilada, seguida por 70% de etanol. Substituir o etanol com ar e armazenar o conjunto em um ambiente estéril.
    3. Dividir as amostras basais do fluído em 20 frações µ l e usar fração única 20 µ l para análise de concentração basal de ácido aminado. Armazenar o restante volume de amostra para análise posterior ou confirmação a-80 ° C.
    4. Consertar o cérebro em formol a 10% e preservá-los por incorporação de parafina1. No secção do cérebro em fatias e manchá-las com hematoxilina e eosina. Examine o cérebro para sonda correta e posicionamento de eletrodo1,2.
      Nota: Consertar o cérebro em refrigeração 2-methylbutane e armazená-los a-80 ° C. Use qualquer outra coloração comprovada sobre as seções de tecido nervoso que permite a visualização do trato da sonda e do eléctrodo.

6. cromatográfico análise de glutamato e aspartato

  1. Preparação de derivatizing agente
    1. Misture os respectivos volumes de 20:1 (v/v) de reagente orthophthaldialdehyde (OPA) e 2-mercaptoetanol (5-ME) no frasco. Feche o frasco usando o septo apertado cap e ar.
      Atenção: Trabalhar sob a capa de química.
    2. A solução preparada de vórtice e colocá-lo no mostruário automático para a posição de derivatizing agente.
  2. Preparação de amostras do fluído
    1. Colocar o inserto de vidro com mola inferior a 2ml de mostruário marrom. Prepare os frascos para todas as amostras, medidas em um lote.
    2. Leve as amostras de diálise 20 µ l de congelador-80 ° C e deixe-os derreter. 1 µ l da solução de remover e adicionar 1 µ l de padrão interno (IS) L-Homosserina (50 µM) a 19 µ l da amostra, assim a amostra contém 2,5 µM de IS. Pipetar 20 µ l da amostra diálise para a inserção de vidro no frasco e selá-lo com um septo de ar comprimido.
    3. Coloque os frascos que contêm as amostras para o mostruário automático usando o software cromatográfico para rotular as amostras em suas posições.
  3. Análise cromatográfica de amostras para determinar a concentração de glutamato e aspartato
    1. Execute as análises no sistema cromatógrafo líquido com deteção de spectrofluorometric. Detecta os aminoácidos após 2min pré-coluna derivatização com 20 μL de orthophthaldialdehyde/5-Mercaptoetanol 20:1 (v/v) adicionada à 20 μL da amostra.
    2. Prepare o sistema para análise de aminoácidos. Ligue o mostruário, a bomba, o desgaseificador, o detector e unidade controladora juntamente com o computador.
    3. Mergulhe os sifões nas garrafas contendo a fase móvel e limpar os canais da bomba a ser usado para a análise cromatográfica.
    4. Começar a aumentar o fluxo da fase móvel, verificando a pressão sobre a coluna (por exemplo, começar a 0,2 mL/min e aumentar o fluxo de 0,2 mL/min adicionais cada 5 min até alcançar o fluxo de trabalho). Deixe o sistema funcionar no trabalho fluxo de 0,8 mL/min. para pelo menos 1 h equilibrar a coluna.
      Atenção: Instável pressão indica a presença de ar no sistema. A pressão não deve exceder 25 MPa.
    5. Definir o ganho, alta sensibilidade e excitação e emissão de comprimentos de onda no detector para 345/455 nm respectivamente. Redefina o sinal do detector (analógicos).
    6. Usando o software de cromatografia em fase gasosa, envie o método para o instrumento. Agora, o cromatógrafo deve estar pronto para medir.
    7. Separar as amostras do fluído, padrão cravado amostras do fluído, bem como padrões (0,25 µM – 2,5 µM aspartato e glutamato em solução de Ringer) na coluna cromatográfica apropriada. Calibrar o método cromatográfico e estabelecer os limites de deteção e quantificação antes de qualquer análise de amostras de diálise.
    8. Ativar a única análise ou criar a sequência das amostras a serem analisados utilizando o software de cromatografia e executar a sequência.
      Atenção: Execute mais de uma amostra em branco e amostras-padrão diferentes dentro da sequência de dialisato amostras a fim de controlar a precisão do método.
    9. Uma vez que os cromatogramas são adquiridos, analisá-las com o software de cromatografia. Verifique a integração dos picos de interesse para a trama de calibração. Use a área de altura ou pico pico para quantificação.
    10. Finalizada a gravação de amostra encha a coluna e o sistema com um solvente orgânico (por exemplo, 50% acetonitrila em água ultrapura) para evitar seu envelhecimento e molde crescimento nele.
    11. Desligar o sistema.

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Representative Results

Recuperação de sonda

A recuperação média (ou seja, o conteúdo do ácido aminado no perfusato como uma porcentagem do conteúdo em um volume igual de solução frasco) foi 15.49 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6.32 ± 0,64 a 3 µ l/min por glutamato e 14.89 ± 0,36% a uma taxa de fluxo de 2 µ L/min e 10.13 ± 0,51 em 3 µ l/min para aspartato ao usar a sonda de membrana cuprophane. Se usar a sonda de membrana de poliacrilonitrila, a recuperação média foi 13.67 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6,55 ± 1,07 a 3 µ l/min por glutamato e 14.29 ± 0,62% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 8,49 ± 0,15 a 3 µ l/min para aspartato (Figura 4A-4B). Como pode ser visto claramente na Figura 4A, a taxa de fluxo mais lenta (2 µ l/min) melhora o desempenho dialyzing de ambas as sondas. Para os seguintes experimentos a sonda de membrana dotada cuprophane pintada em um fluxo taxa 2 µ l/min foi escolhido, porque sua recuperação média foi maior (mesmo se não significativamente) a este ritmo de fluxo para ambos os analitos e por causa da continuidade experimental (estas sondas foram utilizados para a análise de GABA em precedência1).

Desenvolvimento de convulsões e progressão da doença após o estado de mal epiléptico

O comportamental e monitorização de EEG de convulsões, sua avaliação, foi feito em todos os animais utilizados neste estudo para confirmar o desenvolvimento e a progressão da doença TLE nestes.

O robusto SE convulsivos, que foi interrompido após 3h usando diazepam, ocorreu 25±5 min após a injeção de pilocarpina. Então, todos os animais entraram em um estado de latência, em que eles eram aparentemente bem e eles eram continuamente monitorado a fim de verificar que nem ataques espontâneos ocorreram nos primeiros 9 dias ou para identificar a primeira convulsão espontânea, respectivamente para vídeo-EEG a latência e o primeiro grupo de apreensão. A primeira apreensão espontânea ocorreu 11,3 ± 0,6 dias após SE (quer dizer SEM ±, n = 21). Daí em diante, apreensões ocorreram em clusters e agravada em tempo. No final da fase crônica (55-62 dias depois SE) os ratos epilépticos experimentaram 3.3±1.2 (quer dizer SEM ±, n = 12) generalizado apreensões diariamente. Havia uma clara progressão da doença. Muitos, mas nem todas as apreensões de EEG, correspondem-se com a atividade de apreensão comportamental. Figura 5B mostra a atividade epileptiforme paroxística gravado que observou-se cerca de 500 ms antes e durante as convulsões comportamentais. Figura 5A mostra vestígios de controle em ratos não-epiléptica.

Representativos valores basais de aminoácidos encontrados em potássio e microdialysis perfusato estimularam a liberação de glutamato

Concentração de glutamato basal encontrada em ratos epilépticos crônicos (0,87 ± 0,06 µM) foi significativamente maior do que nos animais controle (0,59 ± 0,03 µM; p < 0.05 vs controles; ANOVA One-Way e post hoc Dunnett testar). Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa entre epiléptica crônica (0,31 ± 0,04 µM) e concentrações de aspartato de animais não-epiléptica (0,30 ± 0,05 µM) em basal ou alta K+ evocadas. Veja o artigo original para detalhes2. Os relatado níveis basais de glutamato no controle de ratos estão em consonância com os encontrados por outros em semelhantes estudos (isto é, sobre 0,75 µM quando usando um fluxo de 2 µ l/min e membranas de 2 mm de comprimento efetivo)46,47,48 ,,49,50,,51,52,53. No entanto, diversos fatores podem influenciar os resultados do microdialysis, por exemplo, o comprimento efectivo da sonda e a membrana cortada.

Alta K+-evocou uma liberação adicional de glutamato por cerca de 30 min em ratos controle e por cerca de 60 min em ratos epilépticos crônicos (Figura 6). Veja o artigo original para detalhes2. Como pode ser visto do curso de tempo descrito, a resolução de tempo de 10 min do microdialysis foi suficiente para capturar as variâncias na liberação de glutamato encontrado em ambos os grupos de animais.

Limites e calibração de HPLC

Os dados foram calculados com base nas curvas de calibração obtidas com soluções padrão de glutamato e aspartato e o L-Homosserina padrão interno. A concentração dos neurotransmissores glutamato e aspartato no perfusates foi expresso em valores absolutos (µmol/L). Cada parcela de calibração foi construída por análise de soluções de glutamato e aspartato em quatro níveis de concentração (cinco repetições em cada nível). Foram calculados coeficientes de regressão para calibração parcelas: y = kx + q, onde x foi a relação de concentração de aspartato ou do glutamato para L-Homosserina (IS) e y foi correspondente pico-relação da área do aspartato ou do glutamato a L-Homosserina ( É). Calculou-se o coeficiente de determinação (r2). A aplicabilidade do método HPLC estava dentro dos limites; o limite de quantificação foi determinado como a menor concentração na curva de calibração padrão e o limite superior de quantificação como a maior concentração utilizada de analitos de aminoácidos para a calibração, respectivamente. Limite de detecção (LOD) também foi calculada. Alguns desses valores são delineadas na tabela 1. Um cromatograma da amostra em branco modelo padrões diálise amostra e coletado amostra obtida com acima método descrito são mostrados na Figura 7.

Localização de sonda

Microdialysis sonda e gravação eletrodos foram implantados em hipocampo ventral bem e verificou-se sua colocação correta. Somente aqueles animais onde a implantação foi màxima em 500 μm distante de coordenadas estabilizadas (ver Figura 8) foram incluídos na análise.

Figure 1
Figura 1. Passo a passo preparação do dispositivo a ser implantado. (A) 3-canal eletrodo com 10 cm tempo de aterramento eletrodo na capa protetora na cânula de esquerda e guia para microdialysis à direita necessários para montar o dispositivo. B. A cânula de eletrodo e guia desencapada em detalhe. O primeiro passo é remover (C) e inserir a facilidade (D) a cânula de metal guia de e em seu plástico fictício poucas vezes para seu lançamento, uma vez implantado na cabeça do animal. O segundo passo é dobrar duas vezes o eletrodo registrando torcido para ser alinhado com cânula guia de diálise (E, F). (G) a ponta do eletrodo deve ser cortada para ser mais a ponta da cânula guia de metal de 0,5 mm. (H) verificar a precisão do corte usando o paquímetro digital. Posteriormente, cerca de 1 mm argola de silício longo deve ser usada para corrigir o alinhamento do eletrodo para guiar o pé de cânula (I). (J) a fotografia mostrando como tocar o eletrodo e guia eixo da cânula. A etapa final é colocar uma gota de resina ou cola para o pedestal de cânula guia fixação a argola de silício para isso (K). (L) dispositivo montado pronto para ser esterilizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Fotografias de diferentes tipos de dispositivos para microdialysis-EEG em ratos usado (A) e a fotografia do titular clip sonda (B) utilizado para a implantação desses dispositivos. (A) a cânula guia (em verde) é substituída por uma cânula microdialysis tipicamente 24 h antes do experimento. O conector elétrico do dispositivo (a primeira à esquerda foi usada para as gravações descritas neste manuscrito) permite a ligação de fios que conduzem o sinal elétrico ao equipamento de coleção de dados e amplificador. O dispositivo é cirurgicamente no crânio de ratos anestesiados e gravações podem ser obtidas mais tarde, sem causar dor ou desconforto no livremente se comportando ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Delineamento experimental. A semana antes da indução do estado de mal epiléptico (SE), os ratos são implantados com o dispositivo. SE é induzida pela pilocarpina e animais (se não a diálise e matou a 24 h após SE; os ratos do grupo agudo) são vídeo monitorado por 5 dias (linha azul) e, em seguida, vídeo-EEG monitorados para avaliar a frequência de apreensão e duração nas jaulas em casa (linha verde). Para o experimento de microdialysis, o controle de não-epiléptica epiléptico e respectivo ratos são transferidos para outro EEG configurar ainda vídeo-EEG e equipados com gaiolas de cilindro em 24h antes da sessão do microdialysis monitorado (linha verde clara). As linhas verticais vermelhas representam as sessões de diálise em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento de doença epiléptica. As linhas vermelhas horizontais representam os diferentes grupos de animais epilépticos (e respectivos animais não-epiléptica), onde a seta indica o último dia do microdialysis e o dia da morte do animal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. In vitro a recuperação de duas sondas de diálise. Mesmo em vitro recuperação (%) de aspartato e glutamato utilizando dois diferentes sondas microdialysis comercialmente disponíveis (ambos dotados de membrana de longa dializando de 1 mm) (A) 2 µ l/min e taxa de fluxo (B) 3 µ l/min. Os dados são da média ± SEM das 3 experimentos independentes executados em triplica. Não existem diferenças estatisticamente significativas entre a eficiência de várias sondas (estudante está pareado teste t, p < 0,05). Usando um fluxo taxa 2 μL/min que a recuperação de glutamato aumentou cerca de 5% em comparação com a taxa de fluxo 3 µ l/min, assim, a taxa de fluxo mais lenta foi usada para experiências microdialysis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Gravações de EEG ilustrativas do hipocampo ventral de atividades paraoxystic, como pode ser visto na fase crônica em ratos controle e epilético. (A) dois traços representativos gravado em dois ratos tratados salinos de não-epiléptica. (B) traços gravados em dois ratos epilépticos. Epileptiforme descargas correspondem com convulsões comportamentais de classe 3 nestes ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Curso de tempo do efeito da estimulação de potássio na liberação de glutamato do hipocampo rato. Resultado representativo do microdialysis experimento realizado em 6 controle (círculos abertos) e 6 ratos de epilepsia crônicos (círculos pretos). O gráfico mostra as mudanças temporais da concentração de glutamato do fluído no decurso de experiências microdialysis e durante a estimulação de alta 100 mM K+ . O tempo de alto estímulo K+ (10 min) é indicado pela barra preta na parte inferior do gráfico. Os dados são os meios ± SEM de 6 animais por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Ilustração de cromatogramas. Picos conhecidos são rotulados. Rastreamento de rosa: cromatograma da solução de Ringer sem aminas intencionalmente adicionadas após derivatização OPA/5-ME (amostra em branco). Azul de rastreamento: cromatograma da amostra do fluído após derivatização mostrando os picos de aminoácidos: aspartato (tR 4,80 min), glutamato (tR 6,75 min) e glutamina (tR min 9,19) e o pico do IS L-Homosserina (2,5 µM, tempo de retenção, t R min 9,83). Traço vermelho: cromatograma do padrão de aspartato (2,5 µM) e glutamato (2,5 µM) em solução de Ringer. Fundo azul e amarelo de imagens encontra-se para a fase móvel A (azure) e mobile fase parte B (amarelo), usado para a eluição de analitos. Um retângulo vermelho indicado área (tR 10,41 min e ainda mais) mostra os picos de substâncias desconhecidas e produtos de degradação da OPA. Todos os volumes de injeção foram 20 µ l. Os derivados foram separados com um caudal de 0,8 mL/min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8. Imagem representativa da colocação do eletrodo combinado-sonda dentro do hipocampo ventral. (A) fotografia mostra o susto deixada pela ponta do dispositivo em detalhe (seta preta). (B) esquemática ilustração das posições de ponta de eletrodo-sonda dentro do hipocampo ventral implantado de 12 ratos. Os quadrados sólidos (alguns sobreposição) indicam dicas de sonda-terra corretamente localizadas. Quadrados abertos indicam dicas de sonda-eletrodo incorretamente localizadas em animais excluídos do estudo (n = 3). Fatias coronais do cérebro contendo pontas de prova e locais de gravação foram processadas após experimentos para análise histológica. Os números acima a ilustração mostram a distância do Bregma (de acordo com Pellegrino et al . 1979 atlas do cérebro de rato; barra de nariz + 5,0 mm, coordenadas usado:-3,40 mm, L + 5,4 mm; P + 7,5 mm da dura-máter). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Analito c (μmol/l) k q r2 LOD (pmol/l)
Glutamato 0,25-2.5 5.215 1043.79 0.999 19,4
Aspartato de 0,25-2.5 2.258 1994.72 0.998 31.7

Tabela 1. Características de quantificação do método HPLC utilizado para a determinação de aminoácidos. Gama de padrões (c), inclinação (k), interceptar (q), coeficiente de determinação (r2) e limite de detecção (LOD) descrevendo a calibração parcelas de concentração obtidos com soluções padrão de glutamato e aspartato (0,25, 0,5, 1,0 e 2,5 µM ) e do padrão interno L-Homosserina (2,5 µM) usando o método HPLC descrito com deteção de spectrofluorometric.

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Discussion

Neste trabalho, mostramos como uma gravação de vídeo-EEG contínua juntamente com microdialysis pode ser executada em um modelo experimental de TLE. Técnicas de gravação de vídeo-EEG são usadas para diagnosticar corretamente as diferentes fases da progressão da doença em animais e a técnica do microdialysis é usada para descrever as alterações na liberação de glutamato que ocorrem no tempo (sem alterações foram encontradas para aspartato em um estudo publicado anteriormente2). Recomendamos o uso de um único dispositivo/implante para realizá-las tanto em cada animal pelas razões discutidas na introdução.

Sempre que disponível, radiotelemetria deve ser preferida para sistemas amarrados para gravação de EEG crônica que minimiza interferências com comportamento e reduz o risco de danos e sofrimento para os animais,54. No entanto, a gravação de EEG amarrada é muito menos cara do que a telemetria.

Em nosso laboratório, usamos os conectores para o EEG gravação sistema e microdialysis tubos em paralelo, tal que os fios e tubulações são anexadas dois diferentes articulações. Esta é a questão mais crítica para estas experiências: os tubos e fios tendem a cruzar-se com frequência devido aos movimentos do animal. Portanto, vamos usar conectores e tubos longos o suficiente para deixar o animal, de perseguir a própria cauda (um comportamento que é tipicamente observado com estimulação de potássio) ou cair e rolar durante as crises de epilepsia generalizadas. Recomenda-se ainda mais firme as cânulas microdialysis inseridas em seu guia por argila de modelagem, a fim de reforçar o contacto com o guia (às vezes, microdialysis cânulas são esbarrou contra as paredes da gaiola durante convulsões generalizadas e podem deslizamento fora). Por outro lado, é aconselhável manter o tubo mais curto possível minimizar o atraso entre o tempo neuroquímico e hora da coleta. Isto é particularmente importante quando os períodos de recolha são curtos. Em geral, o tubo do microdialysis deve ser de comprimento adequado e capacidade para garantir que o tempo de amostragem não exceda o tempo entre a saída de diálise e coleção. Foi observado que os solutos tendem a difundir mais entre algumas fichas, se o tempo de morte de tubulação é superior a taxa de amostragem55. Portanto, o tempo/volume morto experimental da tubulação do microdialysis deve ser reduzido tanto quanto possível e determinado com precisão, a fim de correlacionar os dados de neuroquímica com comportamento do animal. Finalmente, é importante notar que tanto gira e eletrodos juntamente com cânula para estudos combinados de EEG e microdialysis são comercialmente disponíveis. Portanto, sempre que possível, configure o sistema de EEG com a opção de realizar os experimentos do microdialysis.

As recomendações de menores são: (i) antes de iniciar qualquer experimento, verifi que se o EEG gravação sistema e/ou microdialysis configurar estão funcionando corretamente e solucionar qualquer problema; Sugerimos que ter um reserva conjunto pronto (outra bomba com seringas montado e concluído de tubo preenchido com soluções de trabalho) quando executa a experiência, bem como um número suficiente de pronto a usar microdialysis sondas para mudar de partido queridos; (ii) ao transferir o animal para a jaula de trabalho EEG-microdialysis é útil ter uma segunda pessoa, auxiliando e começando as aquisições; (iii) Certifique se de que a coluna e mostruário atingiram as temperaturas adequadas antes de cromatografia; Além disso, usar padrões e construir as parcelas de calibração antes de quaisquer amostras do fluído são injetadas na coluna cromatográfica; (v) sempre que necessário, tente desenvolver a cromatografia em fase gasosa ou outro método analítico para medir vários analitos ao mesmo tempo.

Alterações na neurotransmissão têm implicações em muitas doenças do SNC (incluindo epilepsia) e tem havido um grande interesse nas décadas de quantificar estas mudanças durante a progressão de uma saudável para um fenótipo de doente. Hoje, apenas algumas técnicas permitem a medição de mudanças nos níveis de neurotransmissor durante dias ou meses. Microdialysis é uma destas técnicas. Em um grande número de casos, como o descrito aqui, é realizada em animais movimentando-se livremente e acoplado ao convencionais ensaios analíticos off-line, como a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou eletroforese capilar (CE), com a qual atinge 5-30 min resolução temporal31,56. Claramente, esses intervalos de amostragem não refletem o neurotransmissor rápido dinâmica nas proximidades de sinapses, mas pode ser conveniente para alguns aplicativos de microdialysis de longo prazo (por exemplo, desenvolvimento de doença ou estudos do efeito de drogas) que exigem acoplamento de neuroquímico, EEG e dados comportamentais. No entanto, outros estudos estão principalmente preocupados com medição em tempo real ou perto de mudanças em tempo real no neurotransmissor de lançamento. Para estes, a técnica do microdialysis deve ser aperfeiçoada para aumentar a velocidade de amostragem (diminuindo volumes de amostra). Com efeito, a técnica do microdialysis clássico é muitas vezes criticada por sua pobres temporais (minutos) e a resolução espacial (a sonda convencional é muito maior que a fenda sináptica)9,21,56, 57. no entanto, é a sensibilidade em massa do método analítico acoplado ao microdialysis o que determina a resolução de tempo microdialysis (i.e., sua resolução é igual ao tempo necessário ter suficiente amostra ser detectado por uma analítica técnica56). Assim, quando o microdialysis produz pequenas quantidades de amostras, a sensibilidade das técnicas de quantificação deve ser aumentada. Até à data, tais melhorias na resolução temporal da técnica microdialysis seguiram 3 linhas diferentes. Um destes é representado pela miniaturização das colunas e/ou células de deteção dos métodos clássicos de HPLC; Estes são chamados de técnicas UHPLC (ultra-alto desempenho-HPLC) e permitem alcançar 1-10 min tempo resolução58,59,60. Outra abordagem é para acoplar uma clássica HPLC para espectrometria de massa (MS) ou em tandem (MS/MS) para análise multiplex de neurotransmissores no cérebro dialysates. Ensaios de HPLC-MS combinados tem uma excelente sensibilidade e chegar a cerca de 1-5 min tempo resolução56,61,,62,63. Uma terceira linha de melhoria existe em modificações de eletroforese capilar (CE). Se CE usa laser induziu a deteção de fluorescência (CE-LIFD), permite a determinação das concentrações de submicromolar de vários neurotransmissores em frações de nanolitros obtidas a cada 5 min55,64,65 ou mesmo em 10 s intervalos56. Uma vantagem clara que emerge UHPLCs ou abordagens analíticas avançadas do CEs é que a amostragem pode ser feita em animais, não comprometendo a experimentos em que comportamento espontâneo deve ser observado e analisado movimentando-se livremente. Por outro lado, existem métodos que permite a amostragem do fluído cérebro em 100 milissegundos resolução temporal (reator de enzima, por exemplo, com base em ensaios on-line ou coleção de gotículas de dialisato acoplado às técnicas de MS), mas estas são geralmente usado em animais conteve66 ou sob anestesia geral67,68,69, não permitindo ao casal microdialysis com estudos comportamentais.

Quando se considera a segunda mais importante fraqueza do microdialysis, ou seja, relativamente baixa resolução espacial, devido à dimensão da membrana (muitas vezes cerca de 0,5 mm de diâmetro e 1-4 mm de comprimento), uma alternativa podem ser as microsondas desenvolvidas com baixo fluxo amostragem de encaixe. Estes testes consistem em sílica dois capilares (de 20 ID µm e 200 µm OD) fundiram side-by-side e revestido com um tubo de polímero. Durante o experimento, estes capilares são pintados em taxas de fluxo muito baixo, tal que o fluido é puxado para fora de um capilar e uma amostra é obtida do outro com a mesma taxa de fluxo. Porque a amostragem ocorre apenas na ponta da sonda, a resolução espacial é maior do que com a sonda para microdialysis70. Outra possibilidade é mudar de sondas miniaturizadas para matrizes de microeletrodos (biosensores) para avaliação de neurotransmissores em tempo real. Diferentes técnicas eletroquímicas (baseadas principalmente em voltametria ou amperometry) permitam a amostragem de analito muito perto da sinapse (escala mícron) e em menos de 1 s31,70,71. Estes dispositivos podem medir a concentração de analitos múltiplos de várias regiões do cérebro. No entanto, eles também exigem alguns refinamentos, por exemplo, para evitar artefatos e uma relativamente rápida deterioração.

Considerando os últimos avanços na vivo neuroquímicos monitoramento, parece provável que os métodos de amostragem de transmissor diferentes serão combinados em um sensor em um futuro próximo. O trabalho na microfabricated amostragem sondas já começou, e acreditamos que novos progressos em tecnologias microfabrication juntamente com avanços analíticos facilitará ainda mais na vivo neuroquímicos monitoramento investigação. Neste momento, no entanto, o microdialysis convencional correlacionada com EEG continua a ser um método válido para muitas aplicações de neurociência.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores desejam agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon e Eleonora Palma à sua contribuição para manuscritos publicados em precedência.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

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Neurociência edição 141 microdialysis glutamato aspartato epilepsia modelo de pilocarpina cirurgia estereotáxica estimulação de potássio Eletroencefalografia cromatografia líquida
Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente
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Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

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