Summary
כאן, אנו מתארים שיטה ויוו microdialysis לניתוח שחרור אספרטט ולא גלוטמט בהיפוקמפוס הגחון של חולדות אפילפסיה ואפילפטי, בשילוב עם הקלטות EEG. חוץ-תאית ריכוזי אספרטט גלוטמט יכול להיות בקורלציה עם השלבים השונים של המחלה.
Abstract
Microdialysis היא טכניקה neuroscience ומבוססת זה לא מופיע את השינויים של חומרים פעילים נוירולוגית לשדר לחלל המוח אינטרסטיציאליות עם ההתנהגות ו/או עם תוצאה מסוימת של פתולוגיה (למשל, התקפים על אפילפסיה). כשלומדים אפילפסיה, הטכניקה microdialysis משולב לעתים קרובות עם לטווח קצר או לטווח ארוך אפילו וידאו-אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ניטור להעריך בתדירות ההתקפים ספונטנית, חומרתה, התקדמות, קיבוץ באשכולות. Microdialysis-EEG המשולב מבוסס על השימוש של מספר שיטות וכלים. כאן, אנחנו הופיעה ויוו microdialysis רציף וידאו EEG הקלטה יצוא גלוטמט, אספרטט צג לאורך זמן, בשלבים שונים של ההיסטוריה הטבעית של אפילפסיה במודל של עכברים. גישה משולבת זו מאפשרת הזיווג של שינויים שחרור נוירוטרנסמיטר עם שלבים מסוימים של מחלת התפתחות, התקדמות. ריכוז חומצת אמינו ב dialysate נקבע ע י כרומטוגרפיה נוזלית. כאן, אנו מתארים את השיטות ואת החלוקה לרמות ראשי אחד אמצעי זהירות לנקוט במהלך ויוו microdialysis-EEG, עם תשומת לב מיוחדת בניתוח stereotaxic, אשלגן הבזליים וגבוה המרצה במהלך microdialysis, עומק אלקטרודות EEG הקלטה וניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית של אספרטט גלוטמט dialysate. גישה זו עשוי להיות מותאם כדי לבחון מגוון רחב של סמים או מחלה הנגרמת שינויים של פיזיולוגיים ריכוזי אספרטט גלוטמט במוח. בהתאם לזמינות assay אנליטי המתאים, זה עשוי להיות עוד יותר משמש לבדיקת מולקולות שונות מסיסים בעת העסקת EEG הקלטה בו זמנית.
Introduction
כדי לספק תובנות תיפקודי של גלוטמט בתיווך שליחים של GABAergic עצבית מעכבות וכתוצאה מכך להתקפים ספונטנית אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE), אנחנו באופן שיטתי פיקוח ריכוזי חוץ-תאית גאבא1 ו מאוחר יותר הרמות של גלוטמט אספרטט2 באמצעות microdialysis בהיפוקמפוס הגחון של חולדות בנקודות שונות בזמן-של המחלה הטבעית כמובן, קרי, במהלך פיתוח והתקדמות של אפילפסיה. לקחנו יתרון של TLE פילוקרפין דגם בחולדות, אשר מחקה את המחלה באופן מדויק מבחינת שינויים התנהגותיים, אלקטרופיזיולוגיות, histopathological3,4 , אנחנו בקורלציה dialysate ריכוז אמינו חומצות כדי שלה שלבים שונים: השלב חריפה לאחר העלבון epileptogenic, שלב החביון, זמנם של ההתקף הראשון ספונטנית ו6,5,7phass כרונית. מסגור את שלבי המחלה היה מופעל על ידי ניטור וידאו EEG לטווח ארוך, EEG מדויק, איפיון קליני של התקפים ספונטנית. היישום של השיטה microdialysis המשויכת לטווח ארוך ניטור וידאו EEG מאפשרת לנו להציע השערות מכניסטית TLE neuropathology. לסיכום, בטכניקה המתוארת בכתב יד זה מאפשר הזיווג של שינויים עצבית בתוך אזור המוח מוגדר עם פיתוח, התקדמות של אפילפסיה במודל חיה.
התקנים לזווג, המורכב של אלקטרודה עומק juxtaposed כדי בצינורית microdialysis, מועסקים לעיתים קרובות בלימודי מחקר אפילפסיה שבו שינויים עצביים, שלהם מטבוליטים או אנרגיה מצעים צריכים להיות בקורלציה פעילות. עצבית. ברוב המכריע של המקרים, זה נמצא בשימוש בחיות מתנהגות באופן חופשי, אך זה יכול להתבצע גם בצורה דומה בבני אדם, למשל, בקרב חולי אפילפסיה טוהר הפרמה קופ עמידים לעומק החקירה אלקטרודה לפני הניתוח8. EEG הקלטה וגם אוסף dialysate יכול להתבצע בנפרד (למשל, השתלת האלקטרודה באונה אחת, את microdialysis בדיקה ההמיספרה השנייה או אפילו ביצוע את microdialysis בקבוצה אחת של בעלי חיים בעת ביצוע הבלעדית EEG בקבוצה אחרת של בעלי חיים). עם זאת, צימוד האלקטרודות כדי הגששים ייתכן יתרונות מרובים: זה מפשט את ניתוח stereotaxic, מגביל את רקמת נזק באונה אחת בלבד (תוך השארת האחר, ללא פגע, כפקד ללימודי היסטולוגית), ו homogenizes את תוצאות כמו אלה מתקבלים באותו האזור במוח, אותה חיה.
מצד שני, הכנת המכשיר בדיקה-אלקטרודה microdialysis בשילוב דורש מיומנויות זמן אם זה תוצרת בית. אחד לבזבז סכומי כסף גבוהים יחסית אם רכשת מהשוק. יתר על כן, כאשר microdialysis רגשים (בדיקה טיפים הם בדרך כלל 200-400 מיקרומטר קוטר ו 7-12 מ מ אורך)9ו אלקטרודות EEG (אלקטרודה טיפים בדרך כלל של 300-500 מיקרומטר בקוטר, מספיק זמן כדי להגיע את מבנה המוח של ריבית10)? יחד, המכשיר הנטען מייצגת אובייקט מגושם וכבד יחסית בצד אחד של הראש, וזה בעייתי לבעלי ונוטים להיות איבדה במיוחד כאשר הוא מחובר המשאבה דיאליזה ומערכת הקלטה EEG קווית. היבט זה רלוונטי יותר בבעלי אפילפטי קשה לטפל, פחות גמישים לפגישות microdialysis. טכניקות ניתוחיות נכונה וטיפול לאחר הניתוח המתאים יכול לגרום השתלים לאורך זמן לגרום אי נוחות מינימלית בעלי חיים, צריך להיות נרדף עבור ניסויים combinatory microdialysis EEG10,11, 12.
היתרונות ואת המגבלות של הטכניקה microdialysis נבדקו בפירוט בידי מדעני מוח רבים. היתרון העיקרי שלו על פני ויוו זלוף טכניקות אחרות (למשל, זרימה מהירה מו-דו או גביע קורטיקלית זלוף) היא בקוטר קטן של המכשיר אשר משתרע על שטח יחסית מדויק של עניין13,14, 15. שנית, קרום microdialysis יוצר מכשול פיסי בין הרקמות של perfusate; לכן, משקל מולקולרי גבוה חומרים לא לחצות, אל תתערבו עם ניתוח ה-16,17. יתר על כן, הרקמה מוגן מפני הזרם מערבולות perfusate18. יתרון חשוב נוסף הוא האפשרות לשנות את זרימת perfusate עבור למקסם את ריכוז analyte perfusate (קרי, התהליך של microdialysis יכולות ובכן להגדיר באופן מתמטי, ניתן לשנות להניב תשואה גבוהה ריכוזי analyte המדגם)19. לבסוף, ניתן להשתמש בטכניקה כדי להשרות את תרופות או חומרים פעילים פרמקולוגית לתוך הרקמה עניין וכדי לקבוע את ההשפעה שלהם באתר של התערבות20. מצד שני, microdialysis יש זמן מוגבל רזולוציה (בדרך כלל יותר מ 1 דקות בשל הזמן הנדרש לאיסוף דגימות) בהשוואה חיישנים ביולוגיים או אלקטרוכימי; זו טכניקה פולשנית הגורמת נזק לרקמות; זה פוגע את האיזון עצבית בתוך המרחב סביב הקרום עקב מעבר הצבע ריכוז רציפה של כל חומרים מסיסים אשר מזין את perfusate יחד עם analyte עניין. לבסוף, הטכניקה microdialysis מאוד מושפע ממגבלות שיטות אנליטיות מועסק כימות של חומרים perfusate9,21,22,23 . כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) לאחר derivatization עם orthophthaldialdehyde עבור ניתוח גלוטמט אספרטט בדגימות ביולוגיות טוב המאומת24,25,26 , 27 ו שלה דיון נרחב מתוך הטווח של כתב יד זה, אך הנתונים הופק באמצעות שיטה זו יתוארו בפרוטרוט.
כאשר מבוצעת כראוי וללא שינויים של ההרכב perfusate, microdialysis יכול לספק מידע אמין על רמות הבסיס של שחרור נוירוטרנסמיטר. החלק הגדול ביותר של רמות הבסיס הוא כנראה התוצאה של העודפים המשדר הסינפסות9. כי במקרים רבים דגימה פשוטה של הנוירוטרנסמיטר בחלל תוספת סינפטית אינה מספיקה לרדוף אחר המטרות של חקירה, הטכניקה microdialysis יכול להיות גם מועסק כדי לעורר את הנוירונים או כדי לשלול מהם חשוב יונים פיזיולוגיים כגון K+ או Ca2 +, על מנת לעורר או למנוע את שחרור הנוירוטרנסמיטר.
גירוי K+ גבוהה משמש לעיתים קרובות מצאו כדי לעורר פעילות. עצבית לא רק בבעלי חיים ערה, אלא גם בתרבויות ראשי ו organotypic. החשיפה של מערכת העצבים המרכזית בריאה לפתרונות עם ריכוזים גבוהים של K+ (40-100 מ מ) מעורר את בזרימת של נוירוטרנסמיטורים28. יכולת זו של נוירונים לספק שחרור נוסף בתגובה גבוהה K+ אולי התגלה באפילפטיים חיות1 וב -29,אחרים מחלות ניווניות30. באופן דומה, ה-Ca2 + מניעת (מתקבל על ידי פרפוזיה Ca2 + פתרונות חינם) משמש ליצירת סידן תלוית שחרור של מרבית הנוירוטרנסמיטרים נמדדת microdialysis. בדרך כלל הוא האמין כי Ca2 + התלויים שחרור הוא ממוצא עצביים, ואילו Ca2 + עצמאית שחרור מקורו עכשיו, דונלד, אך מחקרים רבים העלו מחלוקת על המשמעות של Ca2 +-מדידות רגיש למשל גלוטמט או GABA9: לפיכך, במידת האפשר, רצוי לתמוך microdialysis מחקרים עם לימודי microsensor, כמו אלה האחרונים יש רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ומאפשר האלקטרודות כדי להתקרב הסינפסות31.
בנוגע microdialysis מחקרים בבעלי חיים אפילפטי, חשוב להדגיש כי הנתונים המתקבלים רובם להסתמך על וידאו או וידאו EEG ניטור של התקפים, קרי, ההתרחשות ארעית של סימנים או תסמינים בשל חריגה סינכרוני או יתר פעילות. עצבית את המוח32. יש קצת פרטים של התקפים electrographic בבעלי פילוקרפין מטופלים אשר יש לקחת בחשבון בעת הכנת הניסוי. התקפים ספונטנית ולאחריו פעילות מדוכא עם EEG תכופים קוצים interictal3 , מתרחשים באשכולות33,34. חיות-אפילפטי המופעלים המזויפים עשוי להפגין הפציינט35 ולכן הפרמטרים להערכה הקלטות EEG צריך להיות מתוקנן36 ו, במידת האפשר, התזמון של הפעלות microdialysis צריכה להיות מוגדרת היטב. לבסוף, אנו ממליצים בחום בעקבות עקרונות ותקנים מתודולוגי עבור ניטור וידאו EEG בחולדות למבוגרים שליטה המתוארים על ידי מומחים של הליגה הבינלאומית נגד אפילפסיה, החברה האמריקאית אפילפסיה בדוחות שלהם לאחרונה37 ,38.
כאן, אנו מתארים microdialysis ושל גלוטמט אספרטט במקביל הקלטות וידאו EEG לטווח ארוך בבעלי חיים אפילפטי וניתוח שלהם dialysate על ידי HPLC. יושם דגש על השלבים הקריטיים של פרוטוקול אחד צריך לדאוג לקבלת התוצאה הטובה ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי אוניברסיטת פרארה אכפת חיה מוסדיים והוועדה שימוש ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (הרשאה: במס ההכנסה ובמשרד 246/2012-B) בהתאם להנחיות המפורטות בקהילות אירופה הוראת המועצה של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). פרוטוקול זה מכוון במיוחד עבור קביעת גלוטמט, אספרטט עכברוש המוח dialysates שהושג תחת שליטה EEG microdialysis הפעלות בחולדות אפילפסיה ואפילפטי. רבים מן החומרים המתוארים כאן אולי ניתן להחליף בקלות עם אלה אחד המשתמש במעבדתו EEG הקלטות או microdialysis.
1. הרכבה של המכשיר Microdialysis בדיקה-אלקטרודה
- השתמש אלקטרודה שני, מעוותת של ערוץ 3 (עם לפחות 20 מ מ חתך אורך של האלקטרודה ברישום ו 10 ס מ, זמן ההארקה אלקטרודה), כמה זה כדי בצינורית מדריך כדי להכין את ההתקן. ראו דוגמאות בצינורית אלקטרודה ומדריך 3-ערוץ לדיאליזה ב איור 1A-1B.
- להסיר (איור 1C) ולהוסיף (איור 1D) הצינורית מתכת וקבלנות לתוך הצינורית פלסטיק דמה מספר פעמים לפני השימוש כדי להקל על הוצאתה ברגע של מתג שלה עבור בדיקה microdialysis של בעל חיים.
- לכופף את החוטים מעוות של רישום אלקטרודה פעמיים (איור 1E-1F) על מנת ליישר את החוטים עם הצינורית דמה של המדריך, לחתוך את הטיפ אלקטרודה (איור 1 ג'י) להיות יותר לקצה הצינורית מדריך (איור 0.5 מ מ 1 H) באמצעות של caliper דיגיטלית.
- להכין circlet סיליקון רב של 1 מ מ (יתר 2 מ מ, עובי 0.3 מ מ; איור 1I) להכניס את קצה הצינורית מדריך ואת קצה האלקטרודות מעוות circlet סיליקון באמצעות את הפינצטה (איור 1J). לתקן אותו על גבי כף הרגל של המדריך בצינורית הדום עם דבק פולימרי של פעולה מהירה או שרף (איור 1 K). ראה הדוגמה של ההתקנים שהושלמו איור 1 L ואיור 2A.
- לחטא את המכשיר תחת אור UV קוטל חידקים עבור 4 h סיבוב מעל המתקן ארבע פעמים אז כמו כל צדדיו חשוף לאור לשעה.
הערה: ייתכן התאספו רבים הגששים אלקטרודות ו- microdialysis מתוצרת בית בצורה דומה. הראש מעל השתל שתואר על חולדות יש את הממדים הבאים: 7 מ מ רוחב x עומק 5 מ מ x 10 מ מ אורך בין החלק העליון לחלק על-גבי מעמד הבוהן; הקצה השתל הוא בערך 11 מ מ אורך, 600 מיקרומטר בקוטר ואת כל המכשיר עם משקולות על 330-360 מ"ג. המכשיר עשוי לעשות שימוש חוזר פעמיים או שלוש פעמים אם (i) אורך מספיק של האלקטרודה הקרקע שנשאר על הגולגולת במהלך הניתוח לשימוש הבא ו (ii) כאשר הרג את החיה, המכשיר לשחזר יחד עם הבטון שיניים זה נותר אצטון overnigh טי, כזו עשוי להיות disaggregated באופן מכני הבטון ואת המכשיר שטף לעקר שוב.
2. ניתוח stereotaxic
- השתמש stereotaxic מכשיר, רכב הגישוש מחזיק קליפ (איור 2B) עבור השתלה המכשיר בעקבות תקני עכשווי ניתוחים aseptic ללא כאבים-39,-40,-41.
- עזים ומתנגד העכברושים ספראג-Dawley למבוגרים עם תערובת קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (43 מ"ג/ק"ג ו 7 מ"ג/ק"ג, i.p.) ולתקן את זה אל מסגרת stereotaxic. להוסיף הרדמה איזופלוריין (1.4% באוויר; 1.2 mL/min) הזרקה קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים הראשונית שכן היא מאפשרת לשלוט העומק של הרדמה בזמן. לגלח את הפרווה על ראשה.
- ספוגית פני העור בראש על-ידי פתרון המבוסס על יוד ואחריו 70% אתנול להתכונן לניתוח aseptic39.
- שתל המכשיר בצינורית-אלקטרודה מדריך מוכן בקדימות (1.1 – 1.5) לתוך ההיפוקמפוס הגחון נכון בעזרת הקואורדינטות הבאות: האף בר + 5.0 מ"מ, א' – 3.4 מ"מ, L + 4.5 מ מ, P + 6.5 מ"מ עד bregma1,2. בצע את טכניקות סטנדרטי עבור ניתוחים stereotaxic10,11,12.
- ודא כי זה אינו מכסה את הברגים עגינת. כאשר זה גובר על המנגנון stereotaxic, לתפוס את המכשיר עבור הראש בצינורית מדריך כמו זה יכול להיות בקלות המיושר בעל רגש.
- לעגן את המכשיר בגולגולת לפחות ארבעה ברגים אל חלד לזיין אותן לתוך העצם הגולגולת (1 בורג לתוך הבורג השמאלי ו- 1 לתוך הצלחות נכון עצם המצח, בורג 1 לתוך השמאל הקודקוד בורג 1 לתוך הצלחות עצם interparietal). להוסיף טיפה של דבק רקמות לתקן עוד יותר את כל בורג לעצם הגולגולת.
- לכסות מחצית האשכולות בורג עם מלט methacrylic. לקדם את הכריכה של הבטון על ידי עשיית חריצים רדודים העצם כדי להגדיל את הדבקות.
- ברגע קצה המכשיר ממוקם לתוך רקמת המוח, סובב את החוט של האלקטרודה הקרקע בסביבות 3 ברגי עיגון. לכסות כל הנטען ברגים את ההתקן עם מלט שיניים42,12,, או43.
- לפקח החיות במהלך הניתוח ואת לשעה בערך לאחר מכן עד העברת לכלוב בהגינות. לשמור אותם על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. לאפשר העכברושים להתאושש במשך שבעה ימים לפחות לאחר ההשתלה התקן.
- נטר את החיות לפחות פעם ביום במשך 3 ימים אחרי הניתוח סימנים של כאב או מצוקה. תן את החיות עם קרם אנטיביוטי (gentamycin 0.1%) בקרבת אתר חרות כדי למנוע את הזיהום, מקבל (טרמדול 5 מ"ג/ק"ג, i.p.) במשך 3 ימים למנוע את הכאב לאחר ניתוח.
3. האונה הרקתית אינדוקציה אפילפסיה על ידי פילוקרפין ו הקצאה של חיות לקבוצות ניסיוני
- לאחר שבוע של ההחלמה שלאחר הניתוח, להקצות את החיות באופן אקראי לקבוצות: חיות (i) בקרת קבלת הרכב ובעלי (ii) אפילפטי שיקבל פילוקרפין. שימוש מספר באופן יחסי גבוה יותר של בעלי חיים עבור קבוצת אפילפטי מאז לא כל פילוקרפין מנוהל חולדות יפתחו את המחלה.
- תזריק מנה של methylscopolamine (1 מ"ג/ק"ג, ספורטינג) ו- 30 דקות לאחר מכן, זריקה אחת של פילוקרפין (350 מ"ג/ק"ג, i.p.) כדי לעודד את סטטוס אפילפטיקוס (SE). מזריקים methylscopolamine ועל הרכב (saline) לעכברושים שליטה. השתמש 1 מ"ל מזרק עם מחט 25 גרם עבור כל הממשלים i.p..
- בדוק חזותית החיות כדי להתחיל יש ויהיו התנהגותית (נעים vibrissa בתוך 5 דקות, מהנהן בראש, שיבוט הגפיים), במרחק 25 דקות לשבט ברציפות כל הגוף (SE).
- לעצור את 2 SE h לאחר תחילתה יש תמותה כ-25% ו תקופה רעה כמוס של 10 ימים בערך על ידי מינהל דיאזפם (20 מ"ג/ק"ג, i.p.). להתבונן להקליט כל התחלה התנהגות ההתקף מיד לאחר הזריקה פילוקרפין ו להמשך לפחות 6 שעות לאחר מכן.
- תן תמיסת המלח חיות (1 מ"ל, i.p.) בעזרת מזרק 1 מ"ל 25 גרם פתרון המחט וסוכרוז (1 מ"ל, ת. ד) באמצעות מזרק 1 מ"ל ואת המחט 17 גרם הזנה גמיש עבור 2-3 ימים לאחר SE כדי לקדם את ההתאוששות של ירידה במשקל הגוף.
- אל תכלול בעלי החיים לא להשיג את משקל הגוף הראשונית בתוך השבוע הראשון לאחר פילוקרפין SE מן המחקר (למעט קבוצת חריפה נהרג 24 שעות לאחר SE, שבהם הגוף משקל לעקוב אינה אפשרית).
- להקצות פוסט-SE חיות קבוצות באופן אקראי כדי שונות ניסיוני (איור 3): חריפה שלב (איפה microdialysis מתקיים 24 שעות לאחר SE), השהיה (7-9 ימים לאחר SE), ההתקף הראשון ספונטנית (כ 11 ימים לאחר SE) ו (תקופת כרונית מתחיל בערך 22-24 ימים לאחר SE, כלומר כ- 10 ימים אחרי ההתקף הראשון). לפקח על החיות על ההתרחשות של התקפים ספונטנית.
הערה: השתמש הקריטריונים הבאים כלילה/אי-כלילה לניסויים נוספים בחולדות אפילפסיה: התפתחות SE עוויתית בתוך 1 h לאחר פילוקרפין המינהל; משקל לזכות בשבוע הראשון לאחר SE ומיקום נכון של המכשיר microdialysis, אלקטרודה.
4. אפילפטית התנהגות ניטור וניתוח
- ניטור לטווח ארוך של התנהגות אפילפטי
- כ- 6 שעות לאחר פילוקרפין המינהל (קרי, בקצה של התבוננות ישירה על ידי החוקרים), מקום החיות הכלובים נקי הביתה ולהתחיל ניטור וידאו 24 שעות ביממה.
- המשך וידאו 24 h ניטור עד ליום 5, באמצעות מערכת מעקב וידאו דיגיטלי.
- החל ביום 5, להתחבר העכברושים בכלובים שלהם מלבני הביתה מערכת הקלטה EEG קשור ולהמשיך ניטור וידאו 24 שעות ביממה.
- קבע הפרמטרים על המגבר ממוקם מחוץ כלוב פאראדיי (הגברה קבע גורם בערוץ כל אחד על פי ייחודה של האות EEG של כל בעל חיים בודד) ואת התחלה EEG רכישה שהבחין האות EEG המיוצר על ידי ינותק את הכבלים. שימוש דגימה בשיעור 200 Hz ולהעביר נמוך הגדר סינון עד 0.5 הרץ.
- להתחבר החיה כבלים מחזיק את הראש של חיה בין שתי נמתח אצבעות של יד אחת ולדפוק את המחברים את המעמד אלקטרודה באמצעות היד השנייה חינם. התחל הרכישה.
התראה: ודא האות ללא ממצאים. חפצים נפוצים הם קוצים מאוד העולה על המשקל. - יום לפני microdialysis הניסוי, העברת החיות לתוך מערכת EEG קשור מצויד פלקסיגלס צילינדרים עבור microdialysis. נתק את החיות EEG tethering מערכת בכלוב הביתה לפשל המחברים של האלקטרודה מבלי לעצור את החיה. מקם את החיה בתוף פלקסיגלס גבוהה.
- פיקוח על התנהגות אפילפטי יום לפני, במהלך הפגישה microdialysis
- . הפעילי את מגבר ממוקם מחוץ לכלוב פאראדיי פתח את תוכנת EEG. התחל EEG רכישה שהבחין האות EEG המיוצר על ידי כבלים לא קשורים.
- להתחבר החיה מערכת הקלטה קשור EEG מחזיק את הראש של חיה בין שתי נמתח אצבעות של יד אחת ולדפוק את המחברים את המעמד אלקטרודה באמצעות היד השנייה חינם. הגדר גורם הגברה (רווח) על כל אחד מהערוצים מגבר לפי האות אלקטרודה אחת חיה כך האות EEG הוא בקנה מידה. תן את החיה לחקור את הכלוב חדש (גליל) במשך לפחות שעה בהסתכלות ישירה של החוקר.
- הערה: 24 שעות לפני microdialysis הניסוי, החולדות הם מורדם לזמן קצר עם איזופלוריין עבור המתג של מדריך קנולות כדי בדיקה microdialysis. לנצל הרגע כאשר הם אינם מרדימים לחבר אותם אל מערכת הקלטה EEG.
- לקצר או להאריך את כבל וקופצניים לפי הסחורה של בעל החיים. ודא כי הכבלים לא יפריעו של חיה ותנועותיו שקרן.
- בדוק מסגור תמונה נכונה של מצלמות הוידאו. התחל הקלטת וידאו EEG.
- זיהוי של התקפים ופעילות EEG
- השתמש שחקן תוכנה לצפייה בקטעי הוידיאו. גלול את הסרט 8 פעמים מהר יותר מאשר משחק בזמן אמת, אני לא בטוח-ויהיו מוכללת (ראה חיה האחורי עם forelimb קלונוס או חיה לגידול ונופל עם קלונוס forelimb). להאט את הוידאו ורשום את הזמן המדויק של ההתחלה ואת הסוף של ההתקף התנהגותית.
- תהליך הנתונים על-ידי ספירת מספר מוכללת ויהיו שנצפתה 24 שעות של וידאו רשומות ולבטא אותם בתדירות ההתקפים, משך אומר ערכים של התקפים כל שנצפתה 24 שעות ביממה.
- מגדירים הפרכוס EEG בתקופות של פעילות התקפי של תדר גבוה (> 5 הרץ) מאופיין > 3-fold משרעת קבועה מעל בסיסית עם התקדמות של התדר ספייק נמשך לפחות 3 s2,44 או דומה28. השתמש בתוכנה EEG כדי לעבד את הקלטות EEG raw. לפצל את עקבות EEG 1 h שברים. העתק שברים עקיבה EEG להגיש לבדיקה אוטומטית ספייק תוכנות.
- לנתח את הנתונים פעילות EEG באמצעות פרמטרים מוגדרים מראש (4.3.3.) ותוכנה EEG. לנהל את כל הסרטונים ניתוחים ב שני חוקרים עצמאיים עיוורים עבור הקבוצה שנותחה בעלי חיים. במקרה של סטייה, להפוך אותם לבחון מחדש את הנתונים יחד כדי להגיע להסכמה45.
5. Microdialysis
- במבחנה בדיקה שחזור
- הכינו את המכשיר לשימוש הראשון שלה על פי הוראות היצרן, טיפול זה שרוול המגן שלה.
- הפעל את הניסוי שהפקידים: להכין שלושה צינורות בדיקה של 1.5 mL, טעינת אותם עם 1 מ"ל של תמיסת רינגר המכיל התערובת של סטנדרטים (2.5 מיקרומטר של גלוטמט) ו- 2.5 מיקרומטר של אספרטט. מכניסים mL 1.5 טעון שלוש מבחנות ערכת חימום לחסום עד 37 ° C ומקם אותה על בחישה.
הערה: להשתמש את פתרונות סטנדרטיים באותו ולידציות כרומטוגרפיה. - חותם צינורות הבדיקה 1.5 mL עם סרט פרפין, לנקב אותו על ידי פינצטה חדה לעשות חור של 1 מ מ קוטר.
- לקחת את החללית והוספתו לתוך החור שנעשו בסרט פרפין. לטבול את הקרום לפחות 2 מ מ תחת רמת פתרון. תיקון נוסף החללית כדי 1.5 mL מבחנה פרפין סרט צילום.
התראה: ודא כי הטיפ לא לגעת בקירות של 1.5 mL בו מום. - להתחבר לים החוקרת המזרק רכוב על המשאבה אינפוזיה באמצעות מתאמי FEP-צנור ו- tubing. לחלופין, השתמש בסדר נשא אבובים ניילון של 0.28 מ מ ID ו- 0.61 מ מ OD ומתאמי צינורות צבעוניות (אדום וכחול אבובים מתאמי) עבור חיבורים.
- הפעל את המשאבה ב 2 µL/דקה ולתת את הנוזלים מופיעים בקצה עודפים. להתחבר לשקע בדיקה mL 0.2 איסוף מבחנה באמצעות מתאמי FEP-צנור ו- tubing.
הערה: השתמש FEP-אבובים עבור כל החיבורים. חותכים לאורך הרצוי של אבובים באמצעות סכין גילוח. השתמש אבובים המתאמים של צבע שונה עבור כניסת ו עודפים של המכשיר. תן את המשאבה לרוץ במשך 60 דק בדיקת דליפות, בועות אוויר. אלה לא צריך להיות נוכח. - הגדר את משאבת זרימה תעריף 2 µL/min ולהתחיל לאסוף הדגימות בצד עודפים של הצנרת.
- לאסוף דגימות perfusate 30 דקות 3 נפח שווה שלוש, דוגמאות הפתרון ב 1.5 mL בו מום. לקחת דגימות נפח שווה מן כל 30 דקות באמצעות את microsyringe שקוע בתוך תמיסת סטנדרט בצינור מבחן 1.5 mL 1.5 mL מבחנה.
- חזור על הניסוי (5.1.1-5.1.8) הגדרת המשאבה עד זרימת שיעור 3 µL/min (5.1.7) יש השוואה שחזור המכשיר בעת שימוש שני המחירים זרימה זלוף שונים.
- בסיום, לעצור את המשאבה לשטוף את הצנרור עם מים מזוקקים, 70% אתנול, לדחוף את האוויר לתוך זה. לאחסן את המכשיר בקבוקון מלא מים מזוקקים נקיים. לשטוף היטב את המכשיר על ידי פרפוזיה זה ב 2 µL/דקה על ידי מים מזוקקים מוקדמת האחסון.
- לנתח את הריכוז של גלוטמט אספרטט הדגימות ידי כרומטוגרפיה (ראה את הפרטים שלהלן; 6.3).
- לחשב את שחזור באמצעות המשוואה הבאה:
שחזור (%) = (Cperfusate /Cdialysed פתרון) x 100.
- מפגשים Microdialysis בחופשיות העברת חולדות
- נהלים מפוח: בדיקה ההכנסה ולאחר בדיקה, אינפוזיה משאבה הגדרה ולהתחיל
- להכין את הגששים microdialysis לשימוש הראשון על פי המדריך למשתמש יצרן ולמלא אותם עם תמיסת רינגר. לחתוך 10 ס מ על פיסות FEP-אבובים וחבר אותם קנולות כניסת ו עודפים של המכשיר באמצעות המתאמים אבובים בצבעים שונים.
- ודא כי הצנרת נוגע המתאמים עם אין שטח מת ב כל החיבורים.
- 5.2.1.3-24 שעות לפני הניסוי microdialysis, עזים ומתנגד בקצרה את החיה עם איזופלוריין (5% באוויר) בלשכת הגיוס עד שכיבה. הסר את הצינורית דמה שלה מדריך שימוש את הפינצטה, מחזיק את הראש של החיה בחוזקה. את הגשוש microdialysis, ניחן קרום dialyzing, לתוך הצינורית מדריך, המשרד לקדם את קנולות microdialysis שנוספה במדריך שלהם על-ידי בפלסטלינה.
התראה: אל תתנו את החללית לגעת בקירות של שרוול מגן בדיקה כאשר לחילוץ. - מכניסים את החיה הצילינדר פלקסיגלס ולתת לו לחקור את האווירה החדשה. לחבר את החיה למערכת הקלטה EEG קשור כמתואר לעיל (בצע את הנקודות 4.2.2 ו 4.2.3).
- בצע את ער, בחופשיות הזזת עכבר תנועות, להתחבר לים של המכשיר המזרק 2.5 מ עם המחט 22 גרם קהות המכיל תמיסת רינגר באמצעות המתאמים אבובים. לדחוף תמיסת רינגר בתוך החללית הוצאת 1 מ"ל של תמיסת רינגר 10 s ללא הרף דוחף את הבוכנה של מזרק 2.5 מ ל. בדוק הירידה של הנוזל המופיעים לשקע. החללית עכשיו הוא מוכן לשימוש.
- ממלאים את מזרקים 2.5 מ ל מחובר FEP-אבובים על-ידי מתאמי אבובים עם תמיסת רינגר והר אותם לתוך למשאבה אינפוזיה. . הפעל את המשאבה ב 2 µL/דקה . תן לזה לרוץ בין לילה.
הערה: להשתמש לאורך הרצוי של כל FEP-אבובים אך לחשב אבובים האחסון מת לדעת מתי אמורה להתחיל את גירוי K+ גבוהה, כדי לתאם את כימות הנתונים בשינויים עצבית במוח בעלי חיים. להשתמש בועת האוויר שנוצרו בהצנרת מתחת זרימת העבודה כדי לחשב את הזמן הזה.
- אוסף דגימות במהלך גירוי הקלטה של אשלגן EEG
- לוודא העדר התקפים ב-3 שעות לפני תחילת איסוף הדגימה (הקלטות וידאו EEG) ולהמשיך לעקוב אחר פעילות ההתקף במהלך microdialysis.
- עוצרים את המשאבה נושאת את מזרקים FEP-אבובים לצינוריות התמלא תמיסת רינגר. הר לתוך למשאבה עוד סט מזרקים 2.5 מ ל מחובר FEP-אבובים עם אבובים מתאמי התמלא תמיסת רינגר ששונה המכיל 100 מ מ K+ פתרון.
- . הפעל את המשאבה ב 2 µL/דקה ולתת לו לרוץ. מילוי מהירה יותר של הצנרת, להגדיר את המשאבה µL 5/min לשעה של מילוי. בדוק אם העדר של בועות אוויר בתוך המערכת. ודא כי הצנרת נוגע המתאמים עם אין שטח מת ב כל החיבורים.
- בדיקת המכשיר אם מוכן לשימוש של בעל חיים כפי שתואר לעיל (5.2.1.5).
הערה: אם מסיבה כלשהי המכשיר לא עובד, לשנות אותו. עבור מקרים אלה, שמור הגששים microdialysis מוכן כמה מוכן לשימוש ליד תחנת microdialysis EEG. נתק את החיה של EEG כבלים, עזים ומתנגד זה בקצרה עם איזופלוריין במידת הצורך להבין את השינוי. - חיבור הצנרת FEP מזרקים התמלא לפתרון רינגר הצינורית כניסת של המכשיר ב כל חיה ולחכות המראה של הטיפה נוזלי על הקצה לשקע.
- להתחבר לשקע של המכשיר FEP-אבובים, מה שמוביל אוסף מבחנה. הכנס הצנרת FEP לתוך מבחנה 0.2 מ ל סגור עם כובע מחורר. ודא כי הצינור נשאר במקום על ידי תיקון עם חתיכה של דוגמנות קליי.
- להמשיך להפעיל את המשאבה ב 2 µL/דקה במשך 60 דקות ללא איסוף דגימות equilibrate את המערכת (דוגמה אפס).
- לאסוף 5 דוגמאות dialysate 30 דקות רצופות (µL 60 נפח בהתאמה) בתנאים בסיסית (זלוף עם תמיסת רינגר נורמלי). לאחסן דגימות הקרח.
- לחשב את הזמן שהדרוש נוזלי לעבור מהמשאבה לראש של החיה (זה תלוי נפח מת אבובים, דהיינו, זמן בועות אוויר), להחליף את הצנרת FEP העובר מן תארגן את הדברים המכיל תמיסת רינגר רגיל כדי מזרקים המכיל שונה תמיסת רינגר (100 מ מ K+) הפעם בלי לעצור את המשאבה. בדוק אם העדר של בועות אוויר בתוך המערכת. תן את המשאבה לרוץ למשך 10 דקות.
התראה: תוך עשר דקות של גירוי K+ גבוהה, החיות נוטים להעביר את עצמם זמן ולהציג בדרך כלל מספר רב של כלב רטוב שייק (שליטה ומתוך תפיסה אשכול חיות) או התקפים התנהגותית (אפילפסיה בעלי חיים), אז תהיה מוכן להתערב כדי להגן על צינורות וכבלים מסובבת. - לאחר 10 דקות, החלפת הצנרת של מזרקים המכיל 100 מ מ K+ צלצולים יותר לפתרון תמיסת רינגר נורמלי ולתת את המשאבה לרוץ. לא לבטל את המשאבה במהלך השינויים פתרון כך זה יהיו ירידה של הנוזל בקצה של הצנרת להיות מחוברים בקו.
- מהרגע בו dialysate מכיל אשלגן גבוהה, קרי, לאחר גביית החמישי שלאחר equilibration dialysate, לאסוף את השברים dialysate כל 10 דקות (20 µL) במשך 30 דקות נוספות 1 ח' 3 לאסוף דגימות dialysate ולעצור משאבה. לאחסן את הדגימות הקרח.
- לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס לאחר הניסוי עד hplc, קורס ניתוח.
- חזור על שהניסוי microdialysis במשך 3 ימים רצופים, חוץ חריפה (24 שעות), קבוצת ההתקף הראשון, שבו הפעלה אחד בלבד microdialysis מתרחש 24 שעות לאחר SE או בתוך 24 שעות אחרי ההתקף הראשון ספונטנית (איור 3).
- בסיום כל ניסוי, להרדימו ממנת הרדמה, מסירים את המוח לצורך אימות של בדיקה והשמת אלקטרודה.
- נהלים מפוח: בדיקה ההכנסה ולאחר בדיקה, אינפוזיה משאבה הגדרה ולהתחיל
- Post-microdialysis הליכים
- לשטוף את הגששים microdialysis בשימוש עם מים מזוקקים ואחסן אותם בבקבוקון מלא מים מזוקקים נקיים עד לשימוש הבא.
הערה: הממברנות לשימוש חוזר עשוי הגדילו חדירות; בדוק ההתאוששות בדיקה לפני שימוש חוזר ונשנה. - יש לשטוף את microdialysis כל להגדיר (צינורות, מחברים, מזרקים) עם מים מזוקקים ואחריו 70% אתנול. החלף אתנול האוויר ולאחסן את ערכת עד בסביבה סטרילית.
- לפצל את הדגימות dialysate הבזליים 20 שברים µL ולהשתמש סיעה אחת בלבד 20 µL לניתוח הבזליים ריכוז חומצת אמינו. חנות האחסון מדגם הנותרים לניתוח נוסף או מאשרות ב-80 מעלות צלזיוס.
- לתקן את השכל בפורמלין 10% ולשמר אותם על-ידי הטבעה-פרפין1. Coronally סעיף המוחות לפרוסות, תכתים אותם ועם hematoxylin אאוזין. לבחון את השכל עבור בדיקה נכונה אלקטרודה השמה1,2.
הערה: לתקן את המוח 2 מקורר-methylbutane ואחסן אותם ב- 80 ° c השתמש בכל אחרים מוכח מכתים על הסעיפים רקמות עצבים המאפשר להמחיש את דרכי החללית ואת אלקטרודה.
- לשטוף את הגששים microdialysis בשימוש עם מים מזוקקים ואחסן אותם בבקבוקון מלא מים מזוקקים נקיים עד לשימוש הבא.
6. ניתוח כרומטוגרפי ושל גלוטמט אספרטט
- הכנת derivatizing הסוכן
- מערבבים בהתאמה הכרכים 20:1 (v/v) של ריאגנט orthophthaldialdehyde (אופה) ומרקפטואתנול (5-ME) בבקבוקון. לסגור את הצנצנת באמצעות כובע ואוויר מחצה חזק.
התראה: לעבוד מתחת למכסה המנוע כימי. - מערבולת הפתרון מוכן ולשים אותו תעשיה למקומן עבור derivatizing הסוכן.
- מערבבים בהתאמה הכרכים 20:1 (v/v) של ריאגנט orthophthaldialdehyde (אופה) ומרקפטואתנול (5-ME) בבקבוקון. לסגור את הצנצנת באמצעות כובע ואוויר מחצה חזק.
- הכנת דוגמאות dialysate
- מכניסים את תותב זכוכית עם התחתון האביב המבחנה תעשיה חום 2 מ"ל. להכין את הבקבוקונים כל דוגמאות נמדד אצווה אחת.
- סעו הדגימות דיאליזה µL 20-80 ° C המקפיא ולתת להם להתמוסס. להסיר µL 1 של התמיסה ולהוסיף 1 µL של תקן פנימי (IS) L-Homoserine (50 מיקרומטר) כדי µL 19 של המדגם, ולכן הדוגמה מכילה 2.5 מיקרומטר של IS. פיפטה 20 µL של המדגם דיאליזה לתוך תותב זכוכית בתוך המבחנה, לסגור איתכם מחצה אוויר חזק.
- מקם את הבקבוקונים המכיל את הדגימות לתוך מזהמי מזון באמצעות התוכנה כרומטוגרפי לתייג את הדגימות בעמדות שלהם.
- ניתוח כרומטוגרפי של דגימות לקביעת ריכוז גלוטמט אספרטט
- להפעיל את הבדיקות על המערכת של כרומטוגרפיה נוזלית עם זיהוי spectrofluorometric. לזהות את חומצות אמינו אחרי 2 דקות מראש הטור derivatization עם 20 μL של 5/orthophthaldialdehyde-mercaptoethanol 20:1 (v/v) נוספו 20 μL מדגם.
- הכן המערכת לניתוח חומצות אמינו. . הפעילי את מזהמי מזון, המשאבה, את degasser, גלאי, יחידת השליטה יחד עם המחשב
- לטבול את סיפונים לתוך הבקבוקים המכיל את שלב ניידים ולטהר את הערוצים של המשאבה כרומטוגרפי שישמש עבור הניתוח.
- להתחיל להגביר את הזרימה של השלב ניידים בדיקת הלחץ על העמודה (למשל, מתחילים ב- 0.2 mL/min ו להגביר את הזרימה עבור נוספים 0.2 מ"ל לדקה בכל 5 דקות עד להשגת בזרימת עבודה). תן למערכת להפעיל הקבלה לזרום 0.8 מ לדקה במשך לפחות שעה equilibrate את העמודה.
התראה: לחץ לא יציב מעיד על קיומם של האוויר בתוך המערכת. הלחץ לא יעלה על 25 מגפ ס. - להגדיר את הרווח, רגישות גבוהה, אורכי הגל עירור, פליטה הגלאי כדי 345/455 nm בהתאמה. לאפס את האות גלאי (AUTOZERO).
- באמצעות התוכנה כרומטוגרפי, לשלוח את שיטת המכשיר. עכשיו, כרומטוגרפיה אמור להיות מוכן למדוד.
- להפריד בין הדגימות dialysate, תקן עלה דגימות dialysate, כמו גם סטנדרטים (מיקרומטר 0.25 – 2.5 מיקרומטר אספרטט ולא גלוטמט תמיסת רינגר) על העמודה כרומטוגרפי המתאים. לכייל את שיטת כרומטוגרפי ולהקים את מגבלות זיהוי, כימות לפני כל ניתוח דגימות של דיאליזה.
- להפעיל את ניתוח יחיד או ליצור את הרצף של הדגימות כדי להיות מנותח באמצעות התוכנה כרומטוגרפיה ולהפעיל את הרצף.
התראה: הפעל מדגם ריק אחד או יותר ודוגמאות תקן שונים בתוך הרצף של דגימות dialysate על מנת לשלוט על הדיוק בשיטה. - ברגע chromatograms נרכשים, לנתח אותם עם בדיקות תוכנה. בדוק את השתלבותם של הפסגות של הריבית העלילה כיול. השתמש באזור גובה או שיא שיא על כימות.
- לאחר ההקלטה מדגם הוא סיים למלא את העמודה ואת המערכת עם הממס האורגני (לדוגמה, 50% acetonitrile במים הנדסה גנטית) כדי למנוע הצמיחה שלה הזדקנות ועובש בתוך זה.
- כבה את המערכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדיקה שחזור
ההתאוששות רשע (קרי, חומצת אמינו רשע בתוכן perfusate כאחוז של התוכן אמצעי שווה של הפתרון המבחנה) היה ± 15.49 0.42% בקצב הזרימה של μL 2/min ו- ± 6.32 0.64 ב μL 3/דקה על גלוטמט ו ± 14.89 0.36% בקצב הזרימה של 2 ΜL/min ו- ± 10.13 0.51 ב μL/דקה 3 עבור אספרטט בעת שימוש המכשיר הממברנה cuprophane. אם משתמש החללית ממברנה polyacrylonitrile, ההחלמה הממוצע היה ± 13.67 0.42% בקצב הזרימה של μL 2/min ו- ± 6.55 1.07 ב μL 3/דקה על גלוטמט ו ± 14.29 0.62% בקצב הזרימה של μL 2/min ו- ± 8.49 0.15 ב μL 3/דקה עבור אספרטט (איור 4A-4B). כמו זה ניתן לראות בבירור ב איור 4A, קצב הזרימה איטית יותר (μL 2/דקה) משפר את הביצועים dialyzing של שני רגשים. עבור החללית ממברנה ניחן cuprophane perfused ב μL שיעור 2 זרימה/דקה ניסויים הבאות נבחר, כי שחזור הממוצע שלה היה גבוה יותר (גם אם לא באופן משמעותי) בקצב הזה זרימה עבור שני analytes ובגלל ההמשכיות ניסיוני (אלו הגששים שימשו לניתוח גאבא קדימות1).
התקפים ופיתוח התקדמות המחלה לאחר סטטוס אפילפטיקוס
את התנהגותי, EEG ניטור של התקפים, ההערכה שלהם, נעשה כל החיות מועסקים במחקר זה כדי לאשר את הפיתוח ואת התקדמות המחלה TLE אלה.
SE עוויתית חזקים, שנקטעה לאחר 3 שעות באמצעות דיאזפאם, אירעה 25±5 דקות אחרי הזריקה פילוקרפין. לאחר מכן, כל החיות נכנסת למצב השהיה בו הם היו ככל הנראה היטב, הם היו באופן רציף פיקוח על מנת לוודא כי אין התקפים הספונטנית התרחשה 9 הימים הראשונים או כדי לזהות את ההתקף הראשון ספונטנית, בהתאמה עבור וידאו EEG ההשהיה וקבוצת ההתקף הראשון. ההתקף ספונטנית הראשונה אירעה 11.3 ± 0.6 ימים לאחר SE (זאת אומרת ± SEM, n = 21). לאחר מכן, אירע אשכולות ויהיו מחמירות בזמן. בשלב כרוני מאוחר (ימים 55-62 לאחר SE) לעכברושים אפילפטי חוו 3.3±1.2 (זאת אומרת ± SEM, n = 12) מוכללת ויהיו מדי יום. הייתה התקדמות ברורה של המחלה. רבים, אבל לא כל EEG התקפים, התכתב עם פעילות תפיסה התנהגותית. איור 5B מציג לפעילות אפילפטית התקפי מוקלטות שנצפתה בערך 500 ms לפני ובמהלך התקפים התנהגותית. איור 5A מראה עקבות שליטה בחולדות-אפילפטי.
נציג ערכי הבסיס של חומצות אמינו נמצא microdialysis perfusate, אשלגן מגורה שחרור גלוטמט
ריכוז גלוטמט הבזליים מצא בחולדות אפילפטי כרונית (0.87 ± 0.06 מיקרומטר) היה גבוה באופן משמעותי מאשר בבעלי השליטה (0.59 אינצ ± 0.03 מיקרומטר; p < 0.05 לעומת פקדים; חד-כיווני אנובה, של Dunnett הוק לאחר הבדיקה). היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין אפילפסיה כרונית (0.31 ± 0.04 מיקרומטר)-אפילפטי חיות (0.30 ± 0.05 מיקרומטר) K הבזליים או גבוהה+ עורר אספרטט ריכוזים. ראה את המאמר המקורי עבור פרטים2. הרמות הבזליים המדווחת של גלוטמט בשליטה עכברושים עולים בקנה אחד עם אלה שנמצאו על-ידי אחרים, דומים מחקרים (כלומר, על 0.75 מיקרומטר בעת שימוש זרם µL 2/min וממברנות של 2 מ מ אורך)46,47,48 ,49,50,51,52,53. עם זאת, גורמים רבים ושונים יכולים להשפיע על התוצאות של microdialysis, לדוגמה אורך יעיל של החללית ואת קרום חתוך.
K גבוה+-עורר שחרור נוסף של גלוטמט במשך כ 30 דקות בחולדות שליטה ועבור כ 60 דקות בחולדות אפילפטי כרונית (איור 6). ראה את המאמר המקורי עבור פרטים2. כפי שניתן לראות מן מסלול הזמן מתוארים, 10 דקות זמן ברזולוציה של microdialysis היה מספיק ללכוד את הסטיות במהדורה גלוטמט נמצאו שתי קבוצות של בעלי חיים.
כיול HPLC ומגבלות
הנתונים היו מחושבים בהתבסס על עקומות כיול שהושג עם פתרונות סטנדרטיים של גלוטמט אספרטט ולא את פנימי סטנדרטי L-homoserine. הריכוז של נוירוטרנסמיטורים גלוטמט אספרטט ב perfusates היה בא לידי ביטוי בערכים מוחלטים (µmol/L). כל חלקה כיול נבנתה על ידי ניתוח של פתרונות ושל גלוטמט אספרטט ברמות ריכוז ארבעה (משכפל חמש בכל רמה). מקדמי רגרסיה חושבו עבור כיול חלקות: y = kx + q, כאשר x היה היחס הריכוז של אספרטט או גלוטמט ל L-homoserine (IS) ו y היה היחס שיא-האזור המקביל של אספרטט או גלוטמט כדי (L-homoserine IS). מחושב מקדם הדטרמינציה (r2). תחולתה של שיטת HPLC היה בתוך הגבולות; הגבול התחתון של כימות נקבע כמו הריכוז הנמוך ביותר עקומת כיול סטנדרטי, הגבול העליון של כימות כמו הריכוז הגבוה ביותר בשימוש של חומצת אמינו analytes לצורך כיול, בהתאמה. גבול של זיהוי (לוד) גם מחושב. חלק ערכים אלה מפורטים בטבלה1. Chromatogram דגם מדגם ריק, תקני מדגם דיאליזה דוגמה ומאופקים שהושג עם מעל בשיטה המתוארת מוצגים איור 7.
בדיקה לוקליזציה
Microdialysis החללית ואת ההקלטה אלקטרודה היו מושתל לתוך ההיפוקמפוס נכון הגחון, את מיקומם הנכון אומתה. איפה ההשתלה היה מקסימאלית ב 500 μm רחוק מיוצב קואורדינטות (ראה איור 8) רק את החיות האלה נכללו בניתוח.
איור 1. שלב אחר שלב הכנת המכשיר כדי להיות מושתלים. (א) 3-ערוץ אלקטרודה עם 10 ס מ זמן ההארקה אלקטרודה בתוך שרוול המגן שלה על הצינורית left ומדריך עבור microdialysis בצד ימין צריך להרכיב את המכשיר. (ב). הצינורית אלקטרודה ומדריך חשופות בפירוט. הצעד הראשון הוא כדי להסיר (ג) ולהוסיף (ד) הצינורית מתכת וקבלנות לתוך הפלסטיק שלה דמה כמה פעמים כדי להקל על השקתו פעם מושתל לתוך הראש של החיה. השלב השני הוא לכופף שתי פעמים האלקטרודה ברישום מעוות ייושר כדי בצינורית מדריך דיאליזה (E, F). (ז עצה אלקטרודה) צריך להיות חתוך יהיה 0.5 מ מ ארוך יותר לקצה הצינורית פורטל מתכת וקבלנות משנה. (ח) לבדוק מידת הדיוק של החתך באמצעות של caliper דיגיטלית. לאחר מכן, כ- 1 מ מ סיליקון רב circlet יש להשתמש כדי לתקן את היישור של אלקטרודה להנחות את הרגל בצינורית (I). (י) הצילום המדגימה את האלקטרודה וטבעת מדריך בצינורית פיר. השלב הסופי הוא לשים טיפה של שרף או דבק על גבי המעמד בצינורית מדריך לתקן את circlet סיליקון אליו (K). (L) המכשיר התאספו כדי לעקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. תמונות של סוגים שונים של מכשירי microdialysis EEG אצל חולדות בשימוש (א) ו הצילום של המחזיק סרטון בדיקה (ב) נהגה שתל התקנים אלה. (א) בצינורית מדריך (בירוק) מוחלף על ידי בצינורית microdialysis בדרך כלל 24 שעות לפני הניסוי. מחבר החשמל של המכשיר (הראשונה שמאלה שימש ההקלטות המתואר בכתב היד) היתרי ההחזקה של חוטים כי התנהלות האות החשמלי כדי מגבר וציוד אוסף נתונים. המכשיר מחובר בניתוח הגולגולת של חולדות מרדימים, ניתן להשיג הקלטות מאוחר יותר ללא גרימת כאב או אי נוחות להתנהג בחופשיות חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תכנון ניסויים. שבוע לפני סטטוס אפילפטיקוס (SE) אינדוקציה, החולדות הן מושתל עם המכשיר. SE הנגרמת על ידי פילוקרפין וחיות (אם לא דיאליזה, נהרג ב- 24 שעות לאחר SE; העכברושים מקבוצת חריפה) נמצאים הסרטונים במעקב במשך 5 ימים (קו כחול) ולאחר מכן וידאו EEG מנוטר כדי להעריך את תדירות ההתקפים ואת משך בכלובים שלהם הביתה (הקו הירוק). לניסוי microdialysis, אפילפסיה, בהתאמה-אפילפטי הפקד חולדות מועברים EEG נוספת להגדיר מאובזר עם כלובים גליל ב- 24 שעות לפני הדיון microdialysis ואני עדיין וידאו EEG פיקוח (קו ירוק בהיר). הקווים האדומים אנכי מייצגים את ההפעלות דיאליזה בנקודות שונות בזמן-התפתחות מחלת אפילפסיה. הקווים האדומים אופקי מייצגים את קבוצות שונות של אפילפסיה (וחיות בהתאמה-אפילפטי), לאן החץ מציין היום האחרון של microdialysis ועד ליום מותו של בעל החיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. במבחנה שחזור של שני רגשים דיאליזה. מתכוון במבחנה השחזור (%) של אספרטט ולא גלוטמט באמצעות שני רגשים microdialysis זמינים מסחרית שונים (שניהם ניחן ממברנה זמן dialyzing 1 מ מ) ב 2 (א) μL/min, קצב הזרימה µL (B) 3/min. הנתונים הם זאת אומרת ± SEM של 3 ניסויים עצמאיים להפעיל ב- triplicates. לא קיימים הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין היעילות של הגששים שונים (תלמיד של אינטראקצית מבחן t, p < 0.05). באמצעות זרימת תעריף 2 μL/דקות שהתאוששות גלוטמט גדל בכ-5% לעומת קצב הזרימה µL/דקה 3, ולכן קצב הזרימה איטית יותר שימש לניסויים microdialysis. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. הקלטות EEG המחשה ההיפוקמפוס הגחון של פעילויות paraoxystic, כפי שניתן לראות בשלב כרוני בחולדות ובקרה אפילפטי. (א) שני סימנים. נציג נרשמו שני עכברושים-אפילפטי מלוחים שטופלו. (ב) עקבות נרשמו שני עכברושים אפילפטיים. הפרשות אפילפטית להתכתב עם מחלקה 3 התקפים התנהגותיות אצל אלה חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. כמובן זמן ההשפעה של גירוי אשלגן על שחרור גלוטמט מההיפוקמפוס עכברוש. נציג תוצאת הניסוי microdialysis לבצע בקרה 6 (מעגלים פתוחים) וחולדות 6 כרונית אפילפסיה (עיגולים שחורים). הגרף מראה את השינויים הטמפורלי של גלוטמט dialysate ריכוז במהלך הניסויים microdialysis ובמהלך גבוהה 100 מ מ K+ גירוי. הזמן של K+ גבוהה הגירוי (10 דקות) מזוהה באמצעות הפס השחור על התחתון של הגרף. הנתונים הם ± באמצעים SEM של חיות 6 לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. איור של chromatograms. פסגות ידוע מסומנות. ורוד מעקב: chromatogram של תמיסת רינגר ללא אמינים במכוון שנוספו לאחר OPA/5-ME derivatization (דוגמה ריק). כחול מעקב: chromatogram מדגם dialysate לאחר derivatization מציג את הפסגות של חומצות אמינו: אספרטט (tR 4.80 min), גלוטמט (tR 6.75 min), גלוטמין (tR 9.19 min), את שיא של IS L-homoserine (2.5 מיקרומטר, זמן השמירה, t R 9.83 min). מעקב אדום: Chromatogram של תקן של אספרטט (2.5 מיקרומטר) ו גלוטמט (2.5 מיקרומטר) תמיסת רינגר. רקע תכלת וצהוב של היציעים תמונה עבור ניידים שלב א' (תכלת) ו- mobile שלב B (צהוב) החלק המשמש • תנאי analytes. מלבן אדום המצוין אזור (tR 10.41 min נוסף) מציג את הפסגות של חומרים לא ידועים ומוצרים השפלה אופה. כל אמצעי האחסון הזרקת היו 20 µL. נגזרות הופרדו בספיקה של 0.8 מ ל לדקה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8. תמונת הנציגה של אלקטרודה משולב-בדיקה ובהשתלבותם ההיפוקמפוס הגחון. (א) תמונה מראה והפחד שהותיר את הטיפ המכשיר בפרוטרוט (חץ שחור). (ב) איור סכמטי של עמדות קצה האלקטרודה-בדיקה בתוך ההיפוקמפוס הגחון מושתל של חולדות 12. הריבועים מוצק (כמה חופפים) מצביעים על בדיקה כראוי מקומי-אלקטרודה טיפים. ובכיכרות פתוחות לציין בדיקה באופן שגוי מקומי-אלקטרודה טיפים בבעלי חיים נכללו במחקר (n = 3). פרוסות המוח הילתית המכיל הגששים ורישום אתרים עובדו לאחר ניסויים לבדיקה היסטולוגית. המספרים מעל האיור להראות את המרחק מן Bregma (על פי פלגרינו. et al. 1979 אטלס של מוח עכברוש; בר האף + 5.0 מ"מ, המשמש הקואורדינטות:--3.4 מ. מ., L + 5.4 מ מ; P + 7.5 מ מ דורא). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| Analyte | c (μmol/l) | k | q | r2 | לוד (pmol/l) |
| גלוטמט | 0.25-2.5 | 5.215 | 1043.79 | 0.999 | 19.4 |
| אספרטט | 0.25-2.5 | 2.258 | 1994.72 | 0.998 | 31.7 |
טבלה 1. כימות מאפייני שיטת HPLC המשמשת לקביעת חומצות אמינו. ריכוז מגוון של סטנדרטים (c), מדרון (k), יירוט (q), מקדם הדטרמינציה (r2) ואת מגבלת של זיהוי (לוד) המתאר את הכיול מתווה שהושג עם פתרונות סטנדרטיים ושל גלוטמט אספרטט (0.25, 0.5, 1.0 ו- 2.5 מיקרומטר ) ו- L תקן פנימי-homoserine (2.5 מיקרומטר) באמצעות השיטה המתוארת HPLC עם זיהוי spectrofluorometric.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו, אנו מראים כיצד ניתן לבצע הקלטות וידאו EEG רציף בשילוב עם microdialysis במודל ניסיוני של TLE. טכניקות הקלטה וידאו EEG משמשים כדי לאבחן כראוי את השלבים השונים של התקדמות המחלה בבעלי חיים, הטכניקה microdialysis משמש לתיאור השינויים במהדורה גלוטמט המתרחשות בזמן (אין שינויים מעולם לא נמצא אספרטט ב מחקר שפורסם בעבר2). אנו ממליצים השימוש של המכשיר/שתל בודד כדי לבצע אותן הן כל בעל חיים מהסיבות נדון בהקדמה.
בכל פעם זמין, radiotelemetry צריך להיות המועדפת מערכות עגינה עבור הקלטת EEG כרונית כמו זה ממזער הפרעות התנהגות ומפחית נזק סיכון ומצוקה על חיות54. עם זאת, ההקלטה EEG קשור יקר הרבה פחות טלמטריה.
במעבדה שלנו, אנו משתמשים המחברים ל EEG הקלטה ומערכת microdialysis אבובים במקביל, כך חוטים של tubings מחוברים שני סביבול שונים. זהו הנושא הקריטי ביותר עבור ניסויים אלה: חוטים של אבובים נוטים לחצות לעתים קרובות עקב התנועות של החיה. לכן, אנו משתמשים מחברים לצנרת מספיק זמן לתת החיה לרדוף אחרי הזנב של עצמו (התנהגות נצפית בדרך כלל עם גירוי אשלגן) או ליפול ולהתגלגל במהלך התקפים אפילפטיים מוכללת. מומלץ המשרד עוד יותר את קנולות microdialysis שנוספה במדריך שלהם על-ידי בפלסטלינה, על מנת לחברם המדריך (לפעמים, microdialysis קנולות הם נתקלתי בקירות של הכלוב במהלך התקפים כללית וייתכן נעלם). מצד שני, רצוי לשמור לאורך צינור קצר ככל האפשר למזער את ההשהיה בין אוסף זמן וזמן עצבית. זה חשוב במיוחד כאשר אוסף תקופות קצרות. באופן כללי, הצנרת microdialysis צריך להיות באורך נאותה, היכולת לוודא הזמן דגימה אינו עולה על הזמן בין שקע דיאליזה אוסף. זה היה ציין כי מומסים בגבול נוטים לפזר יותר בין קצת השתלה אם הזמן מת אבובים עדיפה קצב הדגימה55. לכן, ניסיוני מת הזמן/הנפח של אבובים microdialysis צריך להיות מופחת ככל האפשר, נקבע במדויק על מנת לתאם את הנתונים נוירוכימיה עם ההתנהגות של החיה. לבסוף, חשוב לציין כי סביבול והן אלקטרודות בשילוב עם בצינורית ללימודים משולבים EEG ו- microdialysis הם זמינים מסחרית. לפיכך, במידת האפשר, להגדיר את המערכת EEG עם האפשרות לבצע את הניסויים microdialysis.
ההמלצות משנית: (i) לפני תחילת כל ניסוי, בדיקת EEG הקלטה מערכת ו/או microdialysis להגדיר מתפקדים כראוי ולפתור כל בעיה; אנו ממליצים כי בעל מילואים אחד להגדיר מוכן (עוד משאבה עם מזרקים רכוב על והשלים צינורות התמלא פתרונות עבודה) בעת ביצוע הניסוי, כמו גם מספר מספיק של מוכן לשימוש microdialysis רגשים לשינוי שבור אלה; (ii) בעת העברת בעלי חיים לתוך הכלוב עבודה EEG-microdialysis שזה עוזר לך אדם השני סיוע ומתחילים את הרכישות; (iii) להפוך בטוח כי העמודה ואת תעשיה הגיעו הטמפרטורות המתאימות לפני כרומטוגרפיה; בנוסף, להשתמש בסטנדרטים ולבנות החלקות כיול לפני דוגמיות dialysate מוזרקים על העמודה כרומטוגרפי; (v) במידת הצורך, נסה לפתח את כרומטוגרפי או שיטה אחרת אנליטיות למדידת analytes מרובים בו זמנית.
שינויים עצבית יש השלכות רבות הפרעות CNS (כולל אפילפסיה), ולא היה מתעניין מאוד במהלך העשורים לכמת את השינויים הללו במהלך ההתקדמות של בריאה כדי הפנוטיפ נגועים. היום, רק כמה טכניקות מאפשרים מדידת שינויים רמות הנוירוטרנסמיטר במשך ימים או חודשים. Microdialysis הוא אחד של טכניקות אלה. במספר רב של מקרים, כמו זה שתואר כאן, היא הופיעה לנוע בחופשיות חיות, הבנויות על-קונבנציונאלי מבחני אנליטי מקוון כמו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) או נימי אלקטרופורזה (CE), אשר הוא מגיע 5-30 מינימום רזולוציה טמפורלית31,56. בבירור, ובקביעה של מרווחי דגימה אלה אינן משקפות נוירוטרנסמיטר מהירה דינמיקה של synapses, אבל יכול להיות נוח לטווח ארוך microdialysis יישומים מסוימים (למשל, התפתחות המחלה או סמים אפקט מחקרים) אשר דורשים צימוד עצבית, EEG ונתוני התנהגותית. עם זאת, מחקרים אחרים מוטרדים בעיקר מדידה בזמן אמת או קרוב שינויים בזמן אמת עצבי שחרור. עבור אלה, הטכניקה microdialysis חייב להיות מעודן כדי להגביר את המהירות של הדגימה (ולכן יורד מדגם כרכים). אכן, הטכניקה microdialysis הקלאסי הוא שהפסיקה שלו המסכן טמפורלית (דקות), רזולוציה מרחבית (החללית קונבנציונלי הוא הרבה יותר גדול מאשר החריץ סינפטית)9,21,56, 57. זאת, רגישות מסה של השיטה האנליטית מצמידים microdialysis מה קובע את הרזולוציה זמן microdialysis (קרי, את הרזולוציה שלה שווה את הזמן הנדרש יש מספיק מדגם יזוהו על-ידי אנליטית טכניקת56). לכן, כאשר microdialysis מייצרת כמויות זעירות של דגימות, הרגישות של כימות טכניקות חייב להיות מוגברת. עד כה, כה שיפורים ברזולוציה הטמפורלית של הטכניקה microdialysis בעקבות 3 קווים שונים. אחד כזה מיוצג על-ידי מזעור של עמודות ו/או זיהוי תאים בשיטות HPLC קלאסי; אלה נקראים UHPLC (אולטרה-שלוקחות HPLC) טכניקות ומאפשרים להשיג 1-10 דקות זמן רזולוציה58,59,60. גישה אחרת היא זוג של HPLC קלאסי ספקטרומטר מסה (MS) או טנדם (MS/MS) לניתוח מולטיפלקס של נוירוטרנסמיטרים במוח dialysates. מבחני HPLC-MS משולב יש רגישות מצוינת ולהגיע על 1-5 דקות זמן רזולוציה56,61,62,63. שורה שלישית של שיפור קיימת בשינויים של נימי אלקטרופורזה (CE). אם CE שימושים לייזר המושרה זיהוי קרינה פלואורסצנטית (CE-LIFD), היא מאפשרת קביעת ריכוזי נוירוטרנסמיטורים שונים בחלקים nanoliter השיג כל 5 דקות55,64,65 submicromolar או אפילו ב- s 10 מרווחי56. יתרון ברור המגיח מתוך UHPLCs או גישות אנליטיות מתקדמות של CEs היא כי ניתן לעשות הדגימה במעבר בחופשיות חיות, לא להתפשר על ניסויים שבהם התנהגות ספונטנית עליך ניתן להקליט ולצפות במעשיהם ניתח. מצד שני, ישנן שיטות המתיר הדגימה dialysate המוח-אפילו מאה אלפיות השניה ברזולוציה הטמפורלית (לדוגמה, אנזים כור על בסיס מבחני ופשוט או droplet אוסף של dialysate בשילוב טכניקות MS), אבל אלו לרוב נעשה שימוש בחיות מאופקת66 או תחת הרדמה כללית67,68,69, המאפשר לא כמה microdialysis עם מחקרים התנהגותיים.
כאשר בוחנים את החולשה השני הכי חשוב של microdialysis, קרי, רזולוציה מרחבית נמוכה יחסית בגלל הממדים ממברנה (לעתים קרובות על 0.5 מ מ קוטר ו 1-4 מ מ אורך), חלופה יכולים להיות microprobes מפותחים עם תזרים נמוך מו-דו הדגימה. רגשים אלו מורכבות שני סיליקה נימים (מתוך 20 מיקרומטר ID ו- OD 200 מיקרומטר) התמזגו side-by-side, ולא שמטו עם אבובים פולימריים. במהלך הניסוי, נימים אלה הם perfused במחירים זרימה נמוכה מאוד, כך נוזל הוא הוציא נימי אחד, מדגם מאוחזר מן האחר באותו קצב זרימה. כי הדגימה מתרחשת רק בקצה בדיקה, הרזולוציה המרחבית גדול עם החללית בשביל microdialysis70. אפשרות נוספת היא לעבור מתצוגת הגששים ולמחקר מערכים microelectrode (ביולוגיים) להערכת עצבי בזמן אמת. טכניקות שונות אלקטרוכימי (מבוסס בעיקר על voltammetry או amperometry) היתר הדגימה analyte קרוב מאוד אל הסינפסה (סולם מיקרון) ותוך פחות מ- 1 s31,70,71. התקנים אלה ניתן למדוד את ריכוז analytes מרובים מרובות אזורים במוח. עם זאת, הם גם דורשים כמה ליטושים, לדוגמה להימנע חפצים ולירידה מהירה יחסית.
בהתחשב החידושים האחרונים של ויוו עצבית ניטור, סביר להניח כי שיטות דגימה שונה המשדר ישולבו חיישן אחד בעתיד הקרוב. העבודה על הגששים הדגימה microfabricated כבר החל, אנו מאמינים התקדמות נוספת בטכנולוגיות מיקרו-מלאכותית מקדמות אנליטית יותר יקל על ויוו עצבית ניטור החקירה. בשלב זה, עם זאת, microdialysis המקובלת בקורלציה EEG נשאר שיטה חוקית עבור יישומים רבים במדעי המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות אנה Binaschi, פאולו Roncon והוא אלאונורה פלמה על תרומתם כתבי יד לאור הקדימויות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml - tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml - diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
References
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
- Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
- Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
- Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
- Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
- Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
- Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
- Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
- Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
- Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
- Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
- Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
- Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
- Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
- Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
- Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
- Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
- Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
- Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
- Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
- Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
- Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
- Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
- Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
- Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
- Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
- Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
- Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
- Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
- Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
- Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
- Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
- Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
- Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
- Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
- Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
- Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
- Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
- Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
- Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
- Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
- Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
- Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
- Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
- Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
- Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
- Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
- Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
- Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
- Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
- Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
- Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
- Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).
