כאן, אנו מתארים שיטה ויוו microdialysis לניתוח שחרור אספרטט ולא גלוטמט בהיפוקמפוס הגחון של חולדות אפילפסיה ואפילפטי, בשילוב עם הקלטות EEG. חוץ-תאית ריכוזי אספרטט גלוטמט יכול להיות בקורלציה עם השלבים השונים של המחלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Microdialysis של חומצות אמינו מעוררות במהלך ההקלטות EEG בחופשיות העברת חולדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Microdialysis היא טכניקה neuroscience ומבוססת זה לא מופיע את השינויים של חומרים פעילים נוירולוגית לשדר לחלל המוח אינטרסטיציאליות עם ההתנהגות ו/או עם תוצאה מסוימת של פתולוגיה (למשל, התקפים על אפילפסיה). כשלומדים אפילפסיה, הטכניקה microdialysis משולב לעתים קרובות עם לטווח קצר או לטווח ארוך אפילו וידאו-אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ניטור להעריך בתדירות ההתקפים ספונטנית, חומרתה, התקדמות, קיבוץ באשכולות. Microdialysis-EEG המשולב מבוסס על השימוש של מספר שיטות וכלים. כאן, אנחנו הופיעה ויוו microdialysis רציף וידאו EEG הקלטה יצוא גלוטמט, אספרטט צג לאורך זמן, בשלבים שונים של ההיסטוריה הטבעית של אפילפסיה במודל של עכברים. גישה משולבת זו מאפשרת הזיווג של שינויים שחרור נוירוטרנסמיטר עם שלבים מסוימים של מחלת התפתחות, התקדמות. ריכוז חומצת אמינו ב dialysate נקבע ע י כרומטוגרפיה נוזלית. כאן, אנו מתארים את השיטות ואת החלוקה לרמות ראשי אחד אמצעי זהירות לנקוט במהלך ויוו microdialysis-EEG, עם תשומת לב מיוחדת בניתוח stereotaxic, אשלגן הבזליים וגבוה המרצה במהלך microdialysis, עומק אלקטרודות EEG הקלטה וניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית של אספרטט גלוטמט dialysate. גישה זו עשוי להיות מותאם כדי לבחון מגוון רחב של סמים או מחלה הנגרמת שינויים של פיזיולוגיים ריכוזי אספרטט גלוטמט במוח. בהתאם לזמינות assay אנליטי המתאים, זה עשוי להיות עוד יותר משמש לבדיקת מולקולות שונות מסיסים בעת העסקת EEG הקלטה בו זמנית.
מבוא
כדי לספק תובנות תיפקודי של גלוטמט בתיווך שליחים של GABAergic עצבית מעכבות וכתוצאה מכך להתקפים ספונטנית אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE), אנחנו באופן שיטתי פיקוח ריכוזי חוץ-תאית גאבא1 ו מאוחר יותר הרמות של גלוטמט אספרטט2 באמצעות microdialysis בהיפוקמפוס הגחון של חולדות בנקודות שונות בזמן-של המחלה הטבעית כמובן, קרי, במהלך פיתוח והתקדמות של אפילפסיה. לקחנו יתרון של TLE פילוקרפין דגם בחולדות, אשר מחקה את המחלה באופן מדויק מבחינת שינויים התנהגותיים, אלקטרופיזיולוגיות, histopathological3,4 , אנחנו בקורלציה dialysate ריכוז אמינו חומצות כדי שלה שלבים שונים: השלב ח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי אוניברסיטת פרארה אכפת חיה מוסדיים והוועדה שימוש ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (הרשאה: במס ההכנסה ובמשרד 246/2012-B) בהתאם להנחיות המפורטות בקהילות אירופה הוראת המועצה של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). פרוטוקול זה מכוון במיוחד עבור קביעת גלוטמט, אספרטט עכברוש המוח dialysates שהושג תחת שליטה EEG microdialysis הפעלות בחולדות אפילפסיה ואפילפטי. רבים מן החומרים המתוארים כאן אולי ניתן להחליף בקלות עם אלה אחד המשתמש במעבדתו EEG הקלטות או microdialysis.
1. הרכבה של המכשיר Microdialysis בדיקה-אלקטרודה
- השתמש אלקטרודה שני, מעוותת של ערוץ 3 (עם לפחות 20 מ מ חתך אורך של האלקטרודה ברישום ו 10 ס מ, זמן ההארקה אלקטרו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדיקה שחזור
ההתאוששות רשע (קרי, חומצת אמינו רשע בתוכן perfusate כאחוז של התוכן אמצעי שווה של הפתרון המבחנה) היה ± 15.49 0.42% בקצב הזרימה של μL 2/min ו- ± 6.32 0.64 ב μL 3/דקה על גלוטמט ו ± 14.89 0.36% בקצב הזרימה של 2 ΜL/min ו- ± 10.13 0.51 ב μL/דקה 3 עבור אספרטט בעת שימוש המכשיר הממברנה cuprophane. אם משתמש החללית ממברנה polyacrylonitrile, ההחלמה הממוצע היה ± 13.67 0.42% בקצב הזרימה של μL 2/min ו- ± 6.55 1.07 ב μL 3/דקה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעבודה זו, אנו מראים כיצד ניתן לבצע הקלטות וידאו EEG רציף בשילוב עם microdialysis במודל ניסיוני של TLE. טכניקות הקלטה וידאו EEG משמשים כדי לאבחן כראוי את השלבים השונים של התקדמות המחלה בבעלי חיים, הטכניקה microdialysis משמש לתיאור השינויים במהדורה גלוטמט המתרחשות בזמן (אין שינויים מעולם לא נמצא אספרטט ב מחקר שפורסם בעבר2). אנו ממליצים השימוש של המכשיר/שתל בודד כדי לבצע אותן הן כל בעל חיים מהסיבות נדון בהקדמה.
בכל פעם זמין, radiotelemetry צריך להיות המועדפת מערכות עגינה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות אנה Binaschi, פאולו Roncon והוא אלאונורה פלמה על תרומתם כתבי יד לאור הקדימויות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלקטרודה דו-מפותלת בעלת 3 ערוצים | Invivo1, פלסטיק אחד, רואנוק, וירג'יניה, ארה"ב | MS333 / 3-B / SPC | חומר |
| צינורית | Agn Tho's, Lindig ö, שוודיה | MAB 4.15.IC | |
| חומר שרף KK2 פלסטיק | Elettra Sport, לקו, איטליה | KK2 | חומר |
| סופר התקפה ג'ל Loctite Henkel | Italia Srl, מילאנו, איטליה | 2047420_71941 | חומר |
| Imalgene-Ketamine | Merial, טולוז, צרפת | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, מילאנו, איטליה | X1251 | חומר |
| Isoflurane-Vet | Merial, טולוז, צרפת | 103120022 (AIC) | תמיסת |
| Altadol 50 מ"ג/מ"ל - tramadol | Formevet, מילאנו, איטליה | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD איטליה, רומא, איטליה | 20891077 (AIC) | חומר |
| סימפלקס מהיר צמנט שיניים | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, סווינדון, בריטניה | ACR811 | חומר |
| GlasIonomer CX-Plus צמנט | שופו, קיוטו, יפן | PN1167 | |
| מחזיק קליפ בדיקה | Agn Tho's, Lindigö, שוודיה | p/n 100 5001 | ציוד |
| היסטואקריל® דבק עור מקומי כחול | TissueSeal, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב | TS1050044FP חומר | |
| Valium 10 מ"ג/2 מ"ל - דיאזפם | רוש, מונזה, איטליה | 019995063 (AIC) | חומר |
| מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G | Vetrotecnica, פדובה, איטליה | 11.3500.05 | חומר |
| מחט האכלה גמישה של חולדה 17G | Agn Tho's, Lindigö שוודיה | 7206 | Material |
| Grass Technology מכשירים Grass | Technologies, Natus Neurology Incorporated, פלזנטון, קליפורניה, ארה"ב | M665G08 | (מגבר AS40, תיבת ראש, כבלים מחברים, דגם טלפקטור RPSA S40) |
| רכישת נתונים מודולרית ו מערכת ניתוח MP150 | Biopac, גולטה, קליפורניה, ארה"ב | ציוד | MP150WSW |
| מערכת מעקב וידאו דיגיטלית | AverMedia Technologies, פרמונט, קליפורניה, ארה"ב | V4.7.0041FD | ציוד |
| בדיקת מיקרודיאליזה | Agn Tho's, Lindigö שוודיה | MAB 4.15.1.Cu | |
| חומר מיקרודיאליזה בדיקה | סינפטק, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה"ב | S-8010 | |
| מחמם בלוק | Grant Instruments, קיימברידג', אנגליה | QBD2 | בוחש ציוד |
| Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, מסטרה, איטליה | 711 | ||
| משאבת עירוי | Univentor, Zejtun, מלטה | 864 | ציוד |
| צינורות פוליאתן משובחים | סמיתס מדיקל אינטרנשיונל בע"מ, קין, ניו המפשייר, ארה"ב | 800/100/100/100 | חומר |
| מתאמי צינורות כחולים | Agn Tho's, Lindig ö שוודיה | 1002 | חומר |
| מתאמי צינורות אדומים | Agn Tho's, Lindigö שוודיה | 1003 | חומר |
| מזרק 2.5 מ"ל עם מחט 22G | Chemil, פדובה, איטליה | S02G22 | |
| חומר מכסה בקבוקון | Cronus, Labicom, Olomouc, צ'כיה | VCA-1004TB-100 | חומר |
| מחיצה | Thermo Scientific, Rockwoood, טנסי, ארה"ב | National C4013-60 8 מ"מ TEF / SIL מחיצה | חומר |
| זכוכית עם קפיץ תחתון | Supelco, סיגמה, מילאנו, איטליה | 27400-U | |
| בקבוקון דגימה אוטומטית | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, מונזה, איטליה | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 בקר מערכת ויחידת מסיר גז | Knauer, ברלין, גרמניה | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 משאבת שיפוע רבעונית | Knauer, ברלין, גרמניה | V7603 | Equipment |
| גלאי ספקטרופלואורומטרי | Shimadzu, קיוטו, יפן | RF-551 | ציוד |
| עמוד כרומטוגרפי | Knauer, ברלין, גרמניה | 25EK181EBJ | חומר |
| טרום עמודה כרומטוגרפית | Knauer, ברלין, גרמניה | P5DK181EBJ | חומר |
| פתרון פאזה נייד A | 0.1 M מאגר נתרן פוספט, פתרון pH 6.0 | ||
| פתרון שלב נייד B | 40% 0.1 M מאגר נתרן פוספט, 30% מתנול, 30% אצטוניטריל, pH 6.5 | ||
| תמיסת רינגר | תמיסה במ"מ: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% תמיסת BSA | ||
| שונה הרכב תמיסת רינגר | במ"מ: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% תמיסת מלח תמיסת BSA | ||
| 0.9% NaCl, pH מותאם ל-7.0 | תמיסת | ||
| סוכרוז | תמיסה 10% סוכרוז בתמיסת מים |
מקורות
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
