Summary
Her beskriver vi en metode for i vivo microdialysis å analysere aspartate og glutamat utgivelse ventrale prefiks epileptiske og ikke-epileptiske rotter, i kombinasjon med EEG innspillinger. Ekstracellulære konsentrasjoner av aspartate og glutamat kan være korrelert med de ulike fasene av sykdommen.
Abstract
Microdialysis er en veletablert nevrovitenskap teknikk som korrelerer endringene av nevrologisk aktive stoffer spre inn i hjernen interstitielle rommet med atferd / med bestemt utfallet av en patologi (f.eks beslag for epilepsi). Når studere epilepsi, er microdialysis teknikken ofte kombinert med kortsiktige eller selv langsiktige video-Elektroencefalogram (EEG overvåking for å vurdere spontan anfall frekvens, alvorlighetsgrad, progresjon og klynger). Kombinert microdialysis-EEG er basert på bruk av flere metoder og instrumenter. Her utført vi i vivo microdialysis og kontinuerlig video-EEG opptak til skjermen glutamat og aspartate ut over tid, i forskjellige faser av den naturlige historien epilepsi i en rotte modell. Dette kombinert tilnærming kan sammenkoblingen av endringer i nevrotransmitter utgivelsen med bestemte stadier av sykdom utvikling og progresjon. Aminosyren konsentrasjonen i den dialysate ble bestemt av flytende kromatografi. Her beskriver vi de metoder og disposisjon de viktigste forholdsregler som bør ta under i vivo microdialysis-EEG, med spesiell oppmerksomhet til stereotaxic kirurgi, basal og høyt kalium stimulering under microdialysis, dybde elektroden EEG innspillingen og høy ytelse flytende kromatografi analyse av aspartate og glutamat i den dialysate. Denne tilnærmingen kan tilpasses til å teste en rekke narkotika eller sykdom induserte endringer i fysiologiske konsentrasjonen av aspartate og glutamat i hjernen. Avhengig av tilgjengelighet av riktig analytisk analysen, kan det videre brukes til å teste forskjellige løselige molekyler når ansette EEG opptak samtidig.
Introduction
For å gi innsikt i funksjonelle nedskrivning av glutamat-mediert eksitatoriske og GABAergic hemmende neurotransmission resulterer i spontan beslag i tinninglappen epilepsi (TLE), kartlagt vi systematisk ekstracellulære konsentrasjoner av GABA1 og senere nivåene av glutamat og aspartate2 av microdialysis ventrale prefiks rotter på ulike tidspunkt av sykdom naturlig kurs, dvsunder utvikling og progresjon av epilepsi. Vi tok fordel av TLE pilokarpin modellen i rotter, som etterligner sykdommen svært nøyaktig i atferdsmessige, elektrofysiologiske og histopathological3,4 og vi korrelert dialysate konsentrasjonen av aminosyre syrer til sine ulike faser: den akutte fasen etter epileptogenic fornærmelse, ventetid fasen, første spontane beslag og den kroniske phass5,6,7. Innramming sykdom faser ble aktivert av langsiktig EEG video-overvåking og presis EEG og klinisk karakteristikk av spontane beslag. Anvendelse av microdialysis teknikken knyttet til langsiktige EEG video-overvåking tillatt oss å foreslå mekanistisk hypoteser for TLE neuropathology. Oppsummert gir teknikken er beskrevet i dette manuskriptet sammenkoblingen av nevrokjemiske endringer innenfor et definert hjernen med utvikling og progresjon av epilepsi i en dyremodell.
Sammenkoblede enheter, består av en dybde elektrode satt sammen til en microdialysis kanyle, er ofte ansatt i epilepsi forskningsstudier der endringer i nevrotransmittere, metabolitter eller energi underlag bør være korrelert til nevronale aktivitet. I de aller fleste tilfeller, det er brukt i fritt oppføre dyr, men det også kan gjennomføres på en lignende måte i mennesket, f.eksi pharmaco-resistente epileptiske pasienter som gjennomgår dybde elektrode undersøkelse før kirurgi8. Både EEG opptak og dialysate samling kan utføres separat (f.eksimplanting elektroden i en halvkule og microdialysis-sonde i den andre halvkulen eller aften utføre microdialysis i en gruppe dyr ved utføring den eneste EEG i en annen gruppe av dyr). Imidlertid koble elektrodene til sonder kan ha flere fordeler: det forenkler stereotaxic kirurgi, begrenser vevsskade eneste halvkule (samtidig, intakt, som en kontroll for histologiske studier), og homogenizes resultatene som dette er Hentet fra samme hjernen regionen og samme dyret.
På den annen side, krever utarbeidelse av kombinert microdialysis sonde elektrode enheten ferdigheter og tid hvis det er hjemmelaget. En kunne bruke relativt høye mengder penger hvis kjøpt fra markedet. Videre, når microdialysis sonder (sonde tips er vanligvis 200-400 µm i diameter og 7-12 mm store)9og EEG elektroder (elektrode tips er vanligvis på 300-500 µm i diameter, og lenge nok til hjernen strukturen i rundt10) sammen, representerer montert enheten en store og relativt tunge objekt på siden av hodet, som er plagsom for dyr og utsatt for tapt spesielt når den er koblet til dialyse pumpen og hard-wire EEG opptak systemet. Dette aspektet er mer relevant i epileptiske dyr som er vanskelig å håndtere og mindre adaptive til microdialysis økter. Riktig kirurgiske teknikker og riktig postoperativ behandling kan føre til varige implantater som forårsaker minimal dyr ubehag og kompetansesentre for combinatory microdialysis-EEG eksperimenter10,11, 12.
Fordeler og begrensninger av microdialysis teknikken har gjennomgått av mange neuroscientists. Dens primære fordel over andre i vivo perfusjon teknikker (f.eks, skyv / trekk-rask flyt eller kortikale cup perfusjon) er en liten diameter av sonden som dekker et relativt presis området rundt13,14, 15. Andre danner microdialysis membranen en fysisk barriere mellom vev og perfusate; Derfor høy-molekylær vekt stoffer krysse ikke og forstyrrer ikke analyse16,17. Videre er vevet beskyttet mot turbulente flyten av perfusate18. En annen viktig fordel er muligheten til å endre perfusate flyt for å maksimere analytt konsentrasjonen i perfusate (dvs., prosessen med microdialysis kan være godt definert matematisk og kan endres for å gi høy konsentrasjoner av analytt i eksemplet)19. Til slutt, teknikken kan brukes til å sette mot narkotika eller farmakologisk aktive stoffer inn i vevet rundt og bestemme deres effekt på stedet av intervensjon20. På den annen side, har microdialysis en begrenset oppløsning tid (vanligvis mer enn 1 min på grunn av tiden det tar for innsamling av prøver) i forhold til elektrokjemiske eller biologiske sensorer; Det er en invasiv teknikk som forårsaker skade på vev; det kompromisser nevrokjemiske balansen i løpet rundt membranen på grunn av kontinuerlig konsentrasjon gradient av alle vannløselige stoffer som går perfusate med analytt rundt. Til slutt, den microdialysis teknikken er sterkt påvirket av grensene for analytiske teknikker ansatt for kvantifisering av stoffer i det perfusate9,21,22,23 . Høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) når derivatization med orthophthaldialdehyde for glutamat og aspartate analyse i biologiske prøver er også godkjent24,25,26 , 27 og dens omfattende diskusjon er utenfor omfanget av dette manuskriptet, men dataene produsert ved hjelp av denne metoden vil bli beskrevet i detalj.
Når utført riktig og uten modifikasjoner av perfusate sammensetning, kan microdialysis gi pålitelig informasjon om den basale nivået av nevrotransmitter-løslate. Den største delen av den basale nivået er sannsynligvis et resultat av senderen smitteeffekter fra synapser9. Fordi i mange tilfeller enkle prøvetaking av nevrotransmitter inn ekstra synaptic ikke er tilstrekkelig til å forfølge målene for etterforskning, kan microdialysis teknikken benyttes også stimulerer neurons eller frata dem viktig. fysiologiske systemer som K+ eller Ca2 +, for å fremkalle eller hindre at nevrotransmitteren.
Høy K+ stimulering brukes ofte i nevrobiologi for å stimulere neuronal aktivitet ikke bare i våken dyr, men også i primær og organotypic kulturer. Eksponering for en sunn sentralnervesystemet løsninger med høye konsentrasjoner av K+ (40-100 mM) fremkaller middelklasseinnbyggere nevrotransmittere28. Denne evnen av neurons å gi en ekstra utgivelse svar på høy K+ bli skadet i epileptiske dyr1 og andre nevrodegenerative sykdommer29,30. Tilsvarende Ca2 + deprivasjon (fås ved perfusing Ca2 + gratis løsninger) brukes til å opprette kalsium-avhengige utgivelsen av de fleste nevrotransmittere målt ved microdialysis. Det er generelt antatt at Ca2 + avhengige utgivelsen er neuronal opprinnelse, mens Ca2 + uavhengig utgivelse stammer fra glia, men mange studier hevet kontroversen over betydningen av Ca2 +-sensitive målinger av f.eks glutamat eller GABA9: Derfor, hvis mulig, er det tilrådelig å støtte microdialysis studier med microsensor studier som disse sistnevnte har høyere romlig oppløsning og elektrodene kan komme nærmere synapser31.
Når microdialysis studier i epileptiske dyr er det viktig å understreke at dataene innhentet fra de fleste av dem er avhengige av video eller video-EEG overvåking av beslag, i.e.av forbigående forekomsten av tegn og/eller symptomer som skyldes unormal overdreven eller synkron neuronal aktivitet i hjernen32. Det er litt nærmere electrographic beslag i pilokarpin behandlet dyr som bør vurderes når du forbereder eksperimentet. Spontan beslag følges av deprimert aktivitet med hyppige EEG interictal toppene3 og i klynger33,34. Falske styres ikke-epileptiske dyr kan oppføre anfall-lignende aktivitet35 og derfor parameterne for EEG opptak evaluering bør være standardisert36 og hvis mulig, tidspunktet for microdialysis økter skal være godt definert. Til slutt, vi anbefaler følgende prinsipper og metodologiske standarder for video-EEG overvåking kontroll voksen gnagere skissert av eksperter av International League mot epilepsi og amerikanske epilepsi samfunnet i de aller siste rapportene37 ,38.
Her beskriver vi microdialysis av glutamat og aspartate parallelt med langsiktige EEG video-opptakene i epileptiske dyr og analyse i den dialysate av HPLC. Vi vil understreke viktige trinnene av protokollen som man bør ta vare på for best resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer er godkjent ved Universitetet av Ferrara institusjonelle Animal Care og bruk komité og italienske Helsedepartementet (authorization: DM 246/2012-B) retningslinjer i de europeiske fellesskaps Rådsdirektiv av 24 November 1986 (86/609/EEC). Denne protokollen er spesielt tilpasset for glutamat og aspartate vilje i rotte hjernen dialysates innhentet under EEG kontroll over microdialysis økter i epileptiske og ikke-epileptiske rotter. Mange av materialer beskrevet her kan lett erstattes med dem som en bruker i sitt laboratorium for EEG opptak eller microdialysis.
1. montering av Microdialysis sonde elektrode enheten
- Bruk en 3-kanals to-vridd elektrode (med minst 20 mm kutte lengden på registrering elektroden og en 10 cm lang jording elektrode) og par den å en guide kanyle å klargjøre enheten. Eksempler på 3-kanals elektrode og guide kanyle for dialyse i figur 1A-1B.
- Ta (figur 1 c) og sett (figur 1 d) metall guide kanyle inn den dummy plast kanyle et par ganger før bruk for å lette fjerning i øyeblikket sin bryteren for microdialysis sonde i dyr.
- Bøye vridd ledninger å registrere elektrode to ganger (figur 1E-1F) for å justere ledninger med den dummy kanyle guide og klipp elektrode spissen (figur 1G) skal 0,5 mm lengre enn spissen av guide kanyle (figur 1 H) bruke den digitale caliper.
- Ha klar 1 mm lang silisium circlet (OD 2 mm, tykkelse 0,3 mm; Figur 1I) og sette inn spissen av guide kanyle og spissen av vridd elektrodene i silisium circlet ved hjelp av pinsett (figur 1J). Fikse det på foten av guiden kanyle pidestall med polymer lim rask handling eller harpiks (figur 1 K). Se eksempel på fullført enhetene i figur 1 L og figur 2A.
- Sterilisere enheten under bakteriedrepende UV-lyset for 4 h. tur over enheten fire ganger så som hver av sidene er utsatt for lyset 1t.
Merk: Mange hjemmelaget elektroder og microdialysis sonder kan monteres på en lignende måte. Leder av ovenfor beskrevet implantat for rotter har følgende dimensjoner: 7 mm bredde x 5 mm (dybde) x 10 mm lengde fra toppen til pidestall tå; implantatet spissen er ca 11 mm lang, 600 µm i diameter og alle enheten veier ca 330-360 mg. Enheten kan gjenbrukes to eller tre ganger hvis (i) tilstrekkelig lengde på bakken elektroden står på skallen under operasjonen for neste bruk og (ii) Når Dyret er drept, og enheten gjenopprettet med dental sement er det igjen på aceton moderne t, slik at sement mekanisk kan disaggregated og enheten vasket og steriliseres igjen.
2. stereotaxic kirurgi
- Bruk en stereotaxic apparat og probe klipp holder (figur 2B) for enheten implantasjon etter moderne standarder for aseptiske og smertefri operasjoner39,40,41.
- Bedøve voksen Sprague-Dawley rotter med ketamin/xylazine blanding (43 mg/kg og 7 mg/kg, IP) og fastsette den stereotaxic rammen. Legge til isoflurane anestesi (1,4% i luft, 1,2 mL/min) første ketamin/xylazine injeksjon som gjør det mulig for å kontrollere dybden av anestesi i tid. Barbere pelsen på dyret.
- Vattpinne hodet hudoverflaten av jod-basert løsning etterfulgt av 70% etanol å forberede den for aseptiske kirurgi39.
- Implantatet guide kanyle-elektroden enheten i prioritet (1.1-1.5) til høyre ventrale hippocampus bruker følgende koordinater: nese bar + 5.0 mm, A-3.4 mm, L + 4,5 mm, P + 6.5 mm bregma1,2. Følg standard teknikker for stereotaxic operasjoner10,11,12.
- Kontroller at det ikke dekker forankring skruene. Når du monterer den på stereotaxic apparatet, forstå enheten guide kanyle hodet som dette lett kan justeres til sonde abonnenten.
- Anchor enheten til skallen med minst fire rustfritt skruer skru dem i hodeskallen bein (1 skrue til venstre og 1 skruen i høyre frontale Ben plater, 1 skrue i venstre parietal og 1 skrue i interparietal bein platene). Legg en dråpe vev lim til ytterligere fikse hver skrue skallen beinet.
- Dekk halvparten av skruen tråder med methacrylic sement. Fremme binding av sement å grunne furer i benet å øke etterlevelse.
- Når spissen av enheten er plassert i hjernevevet, vri ledningen på bakken elektroden rundt 3 forankring skruer. Dekk alle monterte skruer og enheten med dental sement12,42,43.
- Overvåke dyrene under operasjonen og i ca 1 time etter til oppreist og flytte rundt buret. Holde dem på en oppvarming pad å unngå nedkjøling. Tillate rotter å gjenopprette for minst 7 dager etter enheten implantasjon.
- Overvåke dyrene minst én gang daglig i 3 dager etter operasjonen for underskriver av smerte eller ubehag. Gi dyrene med antibiotikumet kremen (gentamycin 0,1%) nær radert området for å hindre infeksjon og et smertestillende (tramadol 5 mg/kg, IP) for 3 dager å hindre etter kirurgiske smerten.
3. tinninglappen epilepsi induksjon av Pilocarpine og tildeling av dyr eksperimentelle grupper
- Etter en uke med etter kirurgisk utvinning, tilordne dyrene tilfeldig til grupper: (i) kontrollen dyr motta kjøretøy og (ii) epileptisk dyr som skal motta pilokarpin. Bruk et proporsjonalt høyere antall dyr for epileptiker gruppe siden ikke alle pilokarpin administreres rotter vil utvikle sykdommen.
- Sprøyte inn en dose av methylscopolamine (1 mg/kg, SC) og 30 min etter en enkelt injeksjon av pilokarpin (350 mg/kg, IP) å indusere status epilepticus (SE). Sette inn methylscopolamine og bilen (saltvann) for kontrollen rottene. Bruk 1 mL sprøyte med 25G nål for alle IP-administrasjoner.
- Sjekk visuelt dyrene for å begynne å atferdsdata anfall (flytter vibrissa innen 5 min, nikker hodet, kloning lemmer) og 25 min klone kontinuerlig alle kroppen (SE).
- Arrestere SE 2t etter utbruddet har en dødelighet ca 25% og en gjennomsnittlig latent periode på ca 10 dager av administrasjonen av diazepam (20 mg/kg, IP). Observere og registrere alle beslag atferd begynnelsen umiddelbart etter pilokarpin injeksjon og fortsette i minst 6 h etterpå.
- Gi dyr saltkildene (1 mL, IP) 1 mL sprøyte med 25G nål og sucrose løsning (1 mL, PO) bruker 1 mL sprøyte og fleksibel fôring 17G nål for 2-3 dager etter SE for å fremme utvinning av kroppen vekttap.
- Ekskludere dyr som ikke oppnå første kroppsvekten innen den første uken etter pilokarpin SE fra studien (unntatt akutt gruppen drepte 24 h SE, hvor kroppen vekt oppfølging ikke er mulig).
- Tilordne innlegg-SE dyr tilfeldig til ulike eksperimentelle grupper (Figur 3): akutt fase (der de microdialysis foregår 24 timer etter SE), ventetid (7-9 dager etter SE), første spontane anfall (ca 11 dager etter SE) og kronisk perioden ( starter ca 22-24 dager etter SE, dvs ca 10 dager etter første beslag). Overvåke dyr forekomsten av spontane beslag.
Merk: Bruk følgende inkludering/ekskludering kriterier for ytterligere eksperimenter i epileptiske rotter: utvikling av convulsive SE innen 1 time etter pilokarpin administrasjon; vektøkning i den første uken etter SE og riktig posisjonering microdialysis sonde og elektroden.
4. epileptiske atferd overvåking og analyse
- Langsiktig oppfølging av epileptiske atferd
- Ca 6 timer etter pilokarpin administrasjon (dvspå slutten av direkte observasjon av forskerne), plasserer dyrene bur rent hjem og starte 24 timer video overvåking.
- Fortsette 24 timer video overvåking til dag 5, bruke en digital video overvåkningssystem.
- Begynnelsen på dag 5, koble rottene i burene sine hjem rektangulære til bundet EEG opptak og fortsette 24 timer video overvåking.
- Sett parameterne på forsterkeren plassert utenfor buret (angi forsterkningen faktor på hver kanal etter spesifisitet av EEG hvert enkelt dyr) og start EEG oppkjøpet observere EEG signalet produsert av usammenhengende kabler. Bruk sampling rate 200 Hz og pass lav filter sett til 0,5 Hz.
- Koble dyret til kabler holder et dyr hodet mellom to strukket fingrene på en hånd og skru ned kontaktene å elektrode sokkelen bruker den andre gratis. Starte oppkjøpet.
Forsiktig: Kontroller at signalet er gratis gjenstander. Vanlige gjenstander er toppene sterkt overstiger skalaen. - En dag før microdialysis eksperimentere, overføre dyrene i bundet EEG systemet utstyrt med plexiglass sylindere for microdialysis. Koble dyrene fra EEG tethering system i hjem bur skruen opp kontaktene fra elektroden uten holde dyr. Plassere dyret i høy plexiglass sylindere.
- Overvåking av epileptiske oppførsel en dag før og under microdialysis økten
- Slå på forsterkeren utenfor buret. Åpne EEG programvare. Start EEG oppkjøpet observere EEG signalet produsert uten kabler.
- Koble dyret bundet EEG opptak systemet holder et dyr hodet mellom to strukket fingrene på en hånd og skru ned kontaktene å elektrode sokkelen bruker den andre gratis. Angi en forsterkning faktor (gevinst) på hver kanal av forsterker ifølge elektrode signal enkelt dyr så EEG signalet er i skala. La dyret utforske nye buret (sylindere) minst 1t under direkte observasjon av forskeren.
- NOTE 24 timer før microdialysis eksperimenter, rotter er kort anesthetized med isoflurane for bytte av guide cannulas å microdialysis sonde. Dra nytte av når de er anesthetized for å koble dem til EEG opptak systemet.
- Forkorte eller forlenge pendulous kabel ifølge dyrets vare. Kontroller at kablene ikke forstyrre med dyr bevegelser og liggende holdning.
- Kontroller om riktig bilde innramming av videokameraene. Starte EEG video-opptaket.
- Identifikasjon av beslag og EEG aktivitet
- Bruk en programvare spiller for å se videoer. Rull filmen 8 ganger raskere enn sanntid spille og individuate generalisert beslag (se dyr bak med forlemen clonus eller dyr oppdrett og faller med forlemen clonus). Avta videoen og Merk det akkurat den gangen av begynnelsen og slutten av atferdsmessige beslag.
- Prosessen dataene ved å telle antall generalisert beslag observert i 24 video poster og uttrykkes i beslag hyppighet og varighet som betyr verdier av alle beslag i 24 timer.
- Definere EEG beslag som perioder med paroxysmal aktivitet av høy frekvens (> 5 Hz) preget av en > 3-fold amplituden økning over grunnlinjen med utviklingen av spike frekvensen som varer i minimum 3 s2,44 eller lignende28. Bruk EEG programvaren behandle rå EEG innspillinger. Delt EEG spor i 1t fraksjoner. Kopier EEG sporing fraksjoner til fil for programvaren automatisk spike analyse.
- Analysere EEG aktivitetsdata bruker EEG programvare og forhåndsdefinerte parametere (4.3.3.). Gjennomføre alle video analyser i to uavhengige etterforskere blinde for gruppen analysert dyr. Ved avvik, gjøre dem revurdere dataene sammen for å nå en konsensus45.
5. Microdialysis
- In vitro sonde utvinning
- Forbered sonden for første gangs bruk i henhold til produsentens instruksjoner, håndtere det i beskyttende ermet.
- Utføre eksperimentet i tre eksemplarer: forberede tre 1,5 mL reagensglass med 1 mL av Ringer i løsning som inneholder blanding av standarder (2,5 µM av glutamat) og 2,5 µM av aspartate. Tre lastet 1,5 mL test-rør inn blokk varmeapparatet satt til 37 ° C og plasserer den på rørestang.
Merk: Bruk de samme standard løsningene for kromatografi kalibreringer. - Seal 1,5 mL reagensglass med parafin film og punktering det av skarpe pinsett for å lage et hull på ca 1 mm i diameter.
- Ta proben og sett den i hullet i parafin film. Fordype membranen minst 2 mm under løsning nivå. Fastsette videre at proben 1,5 mL reagensglasset av parafin.
Forsiktig: Kontroller at tuppen ikke touch veggene i reagensglasset 1,5 mL. - Koble sonde innløpet til sprøyten monteres på infusjonen pumpen bruker FEP-rør og rør. Eventuelt bar bruk fin polyeten rør 0,28 mm ID og 0,61 mm OD og farget rør kort (rød og blå rør kort) for tilkoblinger.
- Starte pumpen på 2 µL/min og la væsken vises ved uttaket spissen. Koble sonde uttaket til 0,2 mL samle reagensglasset med FEP-rør og rør.
Merk: Bruk FEP-rør for alle tilkoblinger. Kutte ønsket lengde rør ved hjelp av et barberblad. Bruke rør-kort av forskjellige farger for innløp og utløp av sonden. La pumpen kjøres for 60 min. Sjekk lekkasjer og luftbobler. Dette bør ikke finnes. - Angi pumpen flow rate 2 µL/min og starte å avhente eksemplar på uttak side av slangen.
- Samle tre 30 min perfusate prøver og tre like volum prøver av løsningen i reagensglasset 1,5 mL. Ta like volum prøvene fra 1,5 mL reagensglasset enhver 30 min bruker microsyringe nedsenket i standard løsningen i reagensglasset 1,5 mL.
- Gjenta eksperimentet (5.1.1-5.1.8) sette opp pumpen å flow rate 3 µL/min (5.1.7) å ha en sonde utvinning sammenligning ved to forskjellige perfusjon strømningshastigheter.
- Når ferdig, stopper pumpen og skyll slangen med destillert vann, 70% etanol og presse luften inn i den. Lagre sonden i et hetteglass fylt med ren destillert vann. Skyll sonden grundig av perfusing den 2 µL/minutter av destillert vann før lagring.
- Analysere konsentrasjonen av glutamat og aspartate i utvalgene av kromatografi (se detaljer nedenfor; 6,3).
- Beregne gjenoppretting ved hjelp av følgende ligning:
Systemgjenoppretting (%) = (Cperfusate /Cdialysed løsning) x 100.
- Microdialysis økter i fritt flytte rotter
- Skytevåpen prosedyrer: sonde innsetting og testing, infusjon pumpe innstillingen og begynne
- Forberede microdialysis sonder for første bruk ifølge produsenten brukerhåndboken og fylle dem med Ringer i løsningen. Kuttet ca 10 cm lange biter FEP-rør og koble dem til innløp og utløp cannulas av sonden bruker rør adaptere av forskjellige farger.
- Kontroller at slangen berører kortene uten døde avstand i alle tilkoblinger.
- 5.2.1.3. 24 timer før microdialysis eksperimentet, bedøve kort dyret med isoflurane (5% i luft) i en induksjon kammer til liggende. Fjern den dummy kanyle fra sin guide ved hjelp av pinsett og holde at dyret fast. Sett inn microdialysis proben, utstyrt med en dialyzing membran, i guide kanyle og firmaet videre microdialysis cannulas settes inn i deres guide av modell-leire.
Forsiktig: Ikke la sonden berøre veggene av beskyttende sonde ermet når utdrager. - Dyret inn plexiglass sylinderen og utleie den utforske nye stemningen. Koble dyret til bundet EEG opptak som beskrevet ovenfor (følg punktene 4.2.2 og 4.2.3).
- Følg den våken og fritt flytte rotte bevegelser og koble mengden av sonden til 2,5 mL sprøyte med avstumpet 22G nål som inneholder Ringer i løsningen bruker rør adaptere. Presse Ringer i løsning innenfor sonden utkasting 1 mL av Ringer i løsningen i 10 s skyve kontinuerlig stempelet av 2,5 mL sprøyte. Se etter slipp av væsken vises på utløpet. Sonden er nå klar til bruk.
- Fyll opp 2,5 mL sprøyter koblet til FEP-rør med rør adaptere med Ringer i løsningen og montere dem på infusjonen pumpen. Starte pumpen på 2 µL/min. La den løpe over natten.
Merk: Bruke ønsket lengde alle FEP-rør men beregne rør døde volumet å vite når høy K+ stimulering skal startes og relatere kvantifisering dataene med nevrokjemiske endringer i dyr hjerne. Bruke luftboble opprettet i slangen under arbeider flyten for å beregne denne gangen.
- Samling av prøvene under EEG opptak og kalium stimulering
- Kontroller at beslag i 3 h før utbruddet av prøvetakingen (EEG video-opptak) og fortsetter å overvåke beslag aktivitet under microdialysis.
- Stopp pumpen bærer FEP-rør cannulated sprøyter fylt opp med Ringer i løsningen. Montere på pumpen et annet sett med 2,5 mL sprøyter koblet til FEP-rør med rør kort fylt opp med en modifisert Ringer løsning som inneholder 100 mM K+ løsning.
- Starte pumpen på 2 µL/min og la den kjøre. For rask fylling av slangen, angi pumpen på 5 µL/min for tiden av fylling. Sjekk for fraværet av luftbobler i systemet. Sørg for at slangen berører kortene uten døde avstand i alle tilkoblinger.
- Test sonden hvis klar til bruk i dyr som beskrevet ovenfor (5.2.1.5).
Merk: Hvis for noe grunn sonden ikke fungerer, endres. For slike tilfeller holde noen forberedt microdialysis sonder klar til bruk nær microdialysis-EEG arbeidsstasjonen. Koble dyret fra EEG kabler og bedøve det kort med isoflurane om nødvendig å realisere endringen. - Koble FEP-slangen av sprøyter fylt opp med Ringer i løsning innløp kanyle av sonde i hvert dyr og vente på utseendet av flytende slipp på tuppen av uttaket.
- Koble utløpet av sonden til FEP-slangen, som fører til samlingen i reagensglasset. FEP-slangen inn lukket 0,2 mL reagensglasset med en perforert cap. Sikre at røret forblir på plass ved å feste med et stykke modellering leire.
- Fortsette å kjøre pumpen på 2 µL/min for 60 min uten å samle prøver å equilibrate systemet (null utvalget).
- Samle 5 påfølgende 30 min dialysate prøver (60 µL respektive volum) under grunnlinjen forhold (perfusjon med normal Ringer i løsning). Lagre prøvene på is.
- Beregne tiden det tar flytende skjedde fra pumpen til dyrets hodet (det avhenger av død volumet av rør, dvs, luft boble tid) og bytte FEP-slangen som går fra sprøyter som inneholder vanlige Ringer i løsning sprøyter som inneholder endres (100 mM K+) Ringer i løsning uten å stoppe pumpen. Sjekk for fraværet av luftbobler i systemet. La pumpen kjøre i 10 min.
Forsiktig: I 10 min av høy K+ stimulering, dyrene tendens til å bevege seg frenetisk og vanligvis presenterer en rekke våt hund vibrering (kontroll og ut av beslag klynge dyr) eller atferdsmessige beslag (epileptiske dyr), så vær klar til beskytte rør og kabler fra vri. - Etter 10 min, Skru slangen fra sprøyter som inneholder 100 mM K+ Ringer løsning til normal Ringer i løsningen og la pumpen kjøres. Ikke slå av pumpen under løsning endringene slik at som det vil være en dråpe flytende på slutten av slangen skal kobles til linjen.
- Fra øyeblikket der de dialysate inneholder høyt kalium, dvs., etter samling av den femte etter balanse dialysate, samle dialysate fraksjoner hvert 10 min (20 µL) for 1 h. samle 3 ytterligere 30 min dialysate prøver og stoppe det pumpen. Lagre prøvene på is.
- Lagre prøvene ved-80 ° C etter eksperimentet til såkalt HPLC-analyse.
- Gjenta microdialysis eksperimentere for 3 dager, med unntak av akutt (24 timer) og første anfall gruppen, som eneste microdialysis økten foregår 24 timer etter SE eller innen 24 timer etter første spontane beslag (Figur 3).
- Fullført hvert eksperiment, euthanize dyret med en anesthetic overdose og fjern hjernen for verifisering av sonde og elektroden plassering.
- Skytevåpen prosedyrer: sonde innsetting og testing, infusjon pumpe innstillingen og begynne
- Post-microdialysis prosedyrer
- Skyll brukte microdialysis sonder med destillert vann og lagre dem i et hetteglass fylt med ren destillert vann til neste bruk.
Merk: Gjenbrukt membraner kan ha økt permeabilitet; Sjekk for sonden utvinning før gjentatt bruk. - Skyll den hele microdialysis satt opp (rør, kontakter og sprøyter) med destillert vann etterfulgt av 70% etanol. Erstatt etanol med luft og lagre satt opp i et sterilt miljø.
- Delt basale dialysate prøvene i 20 µL fraksjoner, og bruker bare en 20 µL brøkdel for aminosyre basale konsentrasjon analyse. Lagre gjenværende eksempel volumet for ytterligere eller bekreftende analyse på-80 ° C.
- Rett hjernen i 10% formalin og beskytte dem ved innebygging av parafin1. Coronally delen hjernen i skiver og stain dem med hematoxylin og eosin. Undersøke hjernen for riktig sonde og elektroden plassering1,2.
Merk: Fastsette hjernen i avkjølt 2-methylbutane og lagre dem på-80 ° C. Bruke noen andre bevist flekker på delene nervøse vev som tillater for å visualisere den sonde og elektroden tarmkanalen.
- Skyll brukte microdialysis sonder med destillert vann og lagre dem i et hetteglass fylt med ren destillert vann til neste bruk.
6. brukt kromatografiske analyse av glutamat og Aspartate
- Utarbeidelse av derivatizing agent
- Bland de respektive mengder 20:1 (v/v) orthophthaldialdehyde reagens (OPA) og 2-mercaptoethanol (5-ME) i ampullen. Lukk ampullen bruker den cap og luft stramt septum.
Forsiktig: Arbeid under kjemiske panseret. - Vortex løsningen og putte den i autosampler i posisjon for derivatizing agent.
- Bland de respektive mengder 20:1 (v/v) orthophthaldialdehyde reagens (OPA) og 2-mercaptoethanol (5-ME) i ampullen. Lukk ampullen bruker den cap og luft stramt septum.
- Utarbeidelse av dialysate prøver
- Inn 2 mL brun autosampler ampullen Glassinnsatsen med bunnen våren. Forberede hetteglass alle prøver målt i én omgang.
- Ta 20 µL dialyse prøvene fra-80 ° C fryseren og la dem smelte. Fjern 1 µL av løsningen og tilsett 1 µL av interne standard (IS) L-Homoserine (50 µM) til 19 µL av utvalget, dermed utvalget inneholder 2,5 µM av IS. Pipetter 20 µL av dialyse utvalget i Glassinnsatsen i hetteglass og forsegle den med en lufttett septum.
- Plass hetteglass som inneholder prøvene i autosampler ved hjelp av brukt kromatografiske programvare for å merke eksemplene i sine posisjoner.
- Brukt kromatografiske analyse å bestemme glutamat og aspartate konsentrasjon
- Kjøre analysene på flytende chromatograph systemet med spectrofluorometric deteksjon. Oppdage aminosyrer etter 2 min pre kolonnen derivatization med 20 μL av orthophthaldialdehyde/5-mercaptoethanol 20:1 (v/v) lagt til 20 μL av prøven.
- Forberede systemet aminosyrer analyse. Slå på autosampler, pumpen, degasser, detektor og kontrollerende enhet med datamaskinen.
- Dyppe vannlåser i flaskene inneholder den mobile fasen og tømme kanalene av brukt kromatografiske pumpen skal brukes for analyse.
- Begynne å øke flyten av mobile fasen sjekke trykket på kolonnen (f.eksstart på 0,2 mL/min og øke flyten for ekstra 0,2 mL/min hvert 5 min til å oppnå arbeider flyten). La systemet kjører på arbeider flyt 0,8 mL/min for minst 1 time å equilibrate kolonnen.
Forsiktig: Ustabil press indikerer tilstedeværelse av luften i systemet. Trykket må ikke overstige 25 MPa. - Angi gevinst, høy følsomhet og eksitasjon og utslipp bølgelengdene på detektoren til 345/455 nm henholdsvis. Tilbakestille detektor signalet (AUTOZERO).
- Bruke brukt kromatografiske programvaren, sende metoden på apparatet. Nå, chromatograph bør være klar til å måle.
- Skille dialysate prøvene, standard piggete dialysate prøver, i tillegg til standarder (0,25 µM-2,5 µM aspartate og glutamat i Ringer i løsning) på den aktuelle brukt kromatografiske kolonnen. Kalibrer metoden brukt kromatografiske og etablere gjenkjenning og kvantifisering grensene før noen dialyse prøver analyse.
- Aktivere enkel analyse eller lage sekvensen av prøvene skal analyseres ved hjelp av kromatografi programvare og kjøre sekvensen.
Forsiktig: Kjøre mer enn ett tomt utvalg og annen standard prøver i rekkefølgen av dialysate prøver for å kontrollere at metoden. - Når chromatograms er ervervet, analysere dem med kromatografi programvare. Sjekk integrering av toppene av interesse i kalibrering tomten. Bruk peak høyde eller peak området for kvantifisering.
- Når prøven innspillingen er ferdig fyll kolonnen og systemet med en organisk løsemiddel (f.eks, 50% acetonitrile i ultrapure vann) for å hindre aldring og mold veksten i den.
- Slå av systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonden utvinning
Mener utvinning (dvs. mener aminosyre innholdet i perfusate som en prosentandel av innholdet i en like volum av ampullen løsningen) var 15.49 ± 0.42% på en strømningshastighet på 2 μL/min og 6.32 ± 0.64 på 3 μL/min for glutamat og 14.89 ± 0,36% på en strømningshastighet på 2 ΜL/min og 10.13 ± 0,51 på 3 μL/min for aspartate ved cuprophane membran sonden. Hvis bruker polyakrylonitril membran sonden, mener utvinning var 13.67 ± 0.42% på en strømningshastighet på 2 μL/min og 6.55 ± 1.07 på 3 μL/min for glutamat og 14.29 ± 0,62% på en strømningshastighet på 2 μL/min og 8.49 ± 0,15 på 3 μL/min for aspartate (figur 4A-4B). Det kan sees tydelig i figur 4A, forbedrer tregere flow rate (2 μL/min) dialyzing ytelsen til både sonder. For følgende eksperimenter cuprophane membran utstyrt sonden parfyme på en flow rate 2 μL/min ble valgt, fordi sin mener utvinning var høyere (selv om ikke betydelig) på denne infusjonshastigheten for både analytter og på grunn av eksperimentelle kontinuitet (disse sonder ble brukt for å analysere GABA i prioritet1).
Beslag utvikling og progresjon av sykdommen etter status epilepticus
Det opptreden og EEG overvåking av beslag, deres evaluering, ble gjort i alle dyr ansatt i denne studien å bekrefte utvikling og progresjon av TLE sykdom i disse.
Robust convulsive SE, som ble avbrutt etter 3 h med diazepam, oppstod 25±5 min etter pilokarpin injeksjon. Så, alle dyrene inn en ventetid tilstand der de var tydeligvis godt og de var kontinuerlig video-EEG overvåket for å kontrollere at ingen spontan beslagene gjort i første 9 dager eller å identifisere første spontane beslag, henholdsvis for ventetid og den første anfall-gruppen. Første spontane beslaget skjedde 11.3 ± 0,6 dager etter SE (mener ± SEM, n = 21). Deretter beslag skjedde i klynger og forverret i tid. I slutten kronisk fase (dager 55-62 etter SE) epileptiske rotter opplevde 3.3±1.2 (mener ± SEM, n = 12) generalisert beslag daglig. Det var en klar progresjon av sykdommen. Mange, men ikke alle EEG beslag, korresponderte med atferdsdata beslag aktivitet. Figur 5B viser registrerte paroxysmal epileptiform aktiviteten ble observert rundt 500 ms før og under atferdsmessige beslag. Figur 5A viser kontroll spor i ikke-epileptiske rotter.
Representant basale verdier av aminosyrer finnes i microdialysis perfusate og kalium stimulere utgivelsen av glutamat
Basal glutamat konsentrasjon i kronisk epileptiske rotter (0.87 ± 0,06 µM) var betydelig høyere enn i kontrollen dyr (0.59 ± 0,03 µM, p < 0,05 vs kontroller; enveis ANOVA og post hoc Dunnett test). Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom kronisk epileptisk (0.31 ± 0,04 µM) og ikke-epileptiske dyr (0,30 ± 0,05 µM) i basale eller høy K+ utløste aspartate konsentrasjoner. Se opprinnelige artikkelen detaljer2. Den rapporterte basale nivået av glutamat kontroll rotter er i tråd med de som finnes andre i lignende studier (dvs.om 0,75 µM ved en 2 µL/min flyt og membraner av 2 mm effektiv lengde)46,47,48 ,,49,,50,,51,,52,,53. Imidlertid kan mange ulike faktorer påvirke resultatene av microdialysis, for eksempel den effektive lengden av sonden og membranen avskåret.
Høy K+-utløste en ekstra utgivelse av glutamat i ca 30 min i kontroll rotter og ca 60 min i kronisk epileptiske rotter (figur 6). Se opprinnelige artikkelen detaljer2. Som kan sees fra avbildet time course, var 10 min tid oppløsningen av microdialysis nok til å fange variansen i glutamat løslate funnet i begge grupper av dyr.
HPLC kalibrering og grenser
Dataene ble beregnet basert på kalibrering kurver med standard løsninger av glutamat og aspartate og den interne standard L-homoserine. Konsentrasjonen av nevrotransmittere glutamat og aspartate i perfusates ble uttrykt i absolutte verdier (µmol/L). Hver kalibrering tomten ble konstruert av analyse av løsninger av glutamat og aspartate på fire konsentrasjon nivåer (fem gjentak på hvert nivå). Regresjon koeffisienter var beregnet for kalibrering tomter: y = kx + q, der x var konsentrasjon andelen aspartate eller glutamat til L-homoserine (IS) og y var tilsvarende peak-området forholdet mellom aspartate eller glutamat til L-homoserine ( ER). Bestemmelseskoeffisient (r2) ble beregnet. Anvendelse av HPLC metoden var innenfor; nedre grense for kvantifisering identifiserte som den laveste konsentrasjonen i standard kalibreringskurven og den øvre grensen for kvantifisering som den høyeste brukte konsentrasjonen av aminosyren analytter for kalibrering, henholdsvis. Grensen for påvisning (LOD) ble også beregnet. Noen av disse verdiene er avgrenset i tabell 1. En modell chromatogram i tomme utvalg, standarder eksempel og samlet dialyse eksempel oppnådd med over beskrevet metoden er vist i figur 7.
Sonden lokalisering
Microdialysis sonde og opptak elektroden ble implantert i høyre ventrale hippocampus og riktige plasseringen ble bekreftet. Bare disse dyrene der implantation hadde maksimalt 500 μm fjernt fra stabilisert koordinater (se Figur 8) ble inkludert i analysen.
Figur 1. Trinnvis forberedelse av enheten til å bli implantert. (A) 3-kanals elektrode med 10 cm lang jording elektrode i beskyttende ermet på den venstre og guide kanyle for microdialysis til høyre for å samle enheten. (B). de nakne elektrode og guide kanyle i detalj. Det første trinnet er å fjerne (C) og sett (D) metall guide kanyle fra og til sin plast dummy noen ganger enkel utgivelsen når implantert i at dyret. Det andre trinnet er å bøye to ganger vridd registrering elektroden å bli justert til dialyse guide kanyle (E, F). (G) elektroden tips bør kuttes skal 0,5 mm lengre enn spissen av metall guide kanyle. (H) sjekk for presisjonen av kuttet med den digitale caliper. Deretter ca 1 mm lang silisium circlet skal brukes til å fastsette justeringen av elektrode å veilede kanyle fot (I). (J) bilde viser hvordan ringe elektroden og veilede kanyle akselen. Det siste trinnet er å sette en dråpe harpiks eller lim på guide kanyle sokkelen fikse silisium circlet til det (K). (L) montert enheten klar til å bli sterilisert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilder av ulike typer enheter for microdialysis-EEG i rotter brukes (A) og fotografiet av sonden klipp holderen (B) brukes til implantatet enhetene. (A) den guide kanyle (i grønt) er erstattet av en microdialysis kanyle vanligvis 24 timer før eksperimentet. Den elektriske kontakten på enheten (første til venstre ble brukt til opptakene beskrevet i dette manuskriptet) tillater feste ledninger som utfører elektrisk signal til forsterker og dataene samling utstyr. Enheten er kirurgisk knyttet til skallen bedøvet rotter og opptak kan hentes senere uten å forårsake smerte eller ubehag i fritt oppfører seg rotter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksperimentell design. Uken før statusen epilepticus (SE) induksjon, rotter er implantert med enheten. SE er indusert av pilokarpin og dyr (hvis ikke dialyzed og drept på 24 h etter SE; rotter fra akutt gruppe) er video overvåket i 5 dager (blå linjen) og video-EEG overvåket for å vurdere anfall hyppighet og varighet i burene sine hjem (grønn linje). For microdialysis eksperimentet overvåket epileptiske og tilsvarende ikke-epileptiske kontrollen rotter er overført til en annen EEG utstyrt med sylinder bur i 24 timer før microdialysis økten og fortsatt video-EEG (lys grønn linje). Loddrett røde linjene representerer på dialyse sesjoner på ulike tidspunkt av epileptiske sykdom utvikling. Vannrett røde linjene representerer de ulike gruppene epileptiske dyr (og respektive ikke-epileptiske dyr), der pilen viser den siste dagen i microdialysis og dagen for dyr død. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. In vitro utvinning av to dialyse sonder. Mener i vitro utvinning (%) av aspartate og glutamat bruker to ulike kommersielt tilgjengelig microdialysis sonder (begge utstyrt med 1 mm lange dialyzing membran) (A) 2 μL/min og (B) 3 µL/min strømningshastighet. Er de gjennomsnittlig ± SEM 3 uavhengige eksperimenter kjøre i triplicates. Det er ikke statistisk betydelige forskjeller mellom effektiviteten av ulike sonder (Student er unpaired t-test, p < 0,05). Bruke en flow rate 2 μL/min glutamat utvinningen økte ca 5% sammenlignet med 3 µL/min strømningshastighet, ble dermed tregere infusjonshastigheten brukt for microdialysis eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Illustrerende EEG opptak fra ventrale hippocampus paraoxystic aktiviteter som kan sees på kronisk fase i kontroll og epileptisk rotter. (A) to representant spor spilt inn to saltvann behandlet ikke-epileptiske rotter. (B) spor spilt inn to epileptiske rotter. Epileptiform utslipp tilsvarer klasse 3 atferdsmessige beslag i disse rotter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Gang-løpet av effekten av kalium stimulering på glutamat utgivelse fra rotte hippocampus. Representant resultatet av microdialysis eksperimentet utføres i 6 kontroll (åpne sirkler) og 6 kronisk epileptiske rotter (svart sirkler). Grafen viser temporal endringer dialysate glutamat konsentrasjon i microdialysis eksperimenter og under høy 100 mM K+ stimulering. Tidspunktet for høy K+ stimulans (10 min) angis av den sorte linjen nederst i diagrammet. Dataene er betyr ± SEM 6 dyr per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Illustrasjon av chromatograms. Kjente topper er merket. Rosa spor: chromatogram Ringer i løsning uten bevisst lagt aminer etter OPA/5-ME derivatization (tom utvalget). Blå spor: chromatogram av dialysate prøve etter derivatization viser toppene av aminosyrer: aspartate (tR 4.80 min), glutamat (tR 6.75 min) og glutamin (tR 9.19 min) og toppen av er L-homoserine (2,5 µM tiden, t R 9,83 min). Rød spor: Chromatogram av aspartate (2,5 µM) og glutamat (2,5 µM) i Ringer i løsningen. Asurblå og gul bakgrunn av bildet tribunene for mobile fase A (azure) og mobile fase B (gul) del brukes til analytter elueringsrør. En rød firkant angitt område (tR 10.41 min og videre) viser fjelltoppene ukjent stoffer og OPA nedbrytningsprodukter. Alle injeksjon volumer var 20 µL. Derivater ble skilt ved en strømningshastighet på 0,8 mL/min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Representativt bilde av kombinerte elektrode-probeplassering innen ventrale hippocampus. (A) fotografiet viser skremme igjen av enheten spissen i detalj (svart pil). (B) skjematisk illustrasjon av elektroden-sonden tips stillinger innenfor implantert ventrale hippocampus 12 rotter. Solid rutene (noen overlappende) angir riktig lokalisert sonde elektrode tips. Åpne firkanter angir feil lokaliserte sonde elektrode tips i dyr ekskludert fra studien (n = 3). Koronale hjernen skiver som inneholder sonder og opptak områder ble behandlet etter eksperimenter for histologiske analyse. Tallene ovenfor illustrasjonen viser avstanden fra Bregma (ifølge Pellegrino et al. 1979 atlas av rotte hjernen; nese bar + 5.0 mm, koordinerer brukt: en-3.4 mm, L + 5.4 mm; P + 7,5 mm fra dura). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Analytt | c (μmol/l) | k | q | r2 | LOD (pmol/l) |
| Glutamat | 0.25-2.5 | 5.215 | 1043.79 | 0.999 | 19.4 |
| Aspartate | 0.25-2.5 | 2.258 | 1994.72 | 0.998 | 31,7 |
Tabell 1. Kvantifisering kjennetegner HPLC metoden brukes til aminosyrer besluttsomhet. Konsentrasjon rekke standarder (c), skråningen (k), snappe (q), bestemmelseskoeffisient (r-2) og grensen for påvisning (LOD) beskriver kalibreringen tomter oppnådd med standard løsninger av glutamat og aspartate (0,25, 0.5, 1.0 og 2,5 µM ) og interne standard L-homoserine (2,5 µM) med metoden beskrevet HPLC med spectrofluorometric deteksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet viser vi hvordan en kontinuerlig EEG video-opptak kombinert med microdialysis kan utføres i en eksperimentell modell av TLE. Video-EEG brenning brukes til å identifisere de ulike fasene av sykdomsprogresjon i dyr og microdialysis teknikken brukes til å beskrive endringene i glutamat utgivelsen som oppstår i tiden (ingen endringer ble funnet for aspartate i en tidligere publisert studie2). Vi anbefaler bruk av en enkelt enhet/implantatet å utføre dem både i hvert dyr av grunner omtalt i innledningen.
Når det er tilgjengelig, bør radiotelemetry Superforecast foretrekkes bundet systemer for kronisk EEG opptak som minimerer forstyrrelser med oppførsel og reduserer skade risiko og nød for dyr54. Bundet EEG innspillingen er imidlertid mye billigere enn telemetri.
I vårt laboratorium bruker vi kontaktene å EEG innspilling system og microdialysis rør parallelt, slik at ledninger og produksjonsrør er knyttet til to ulike dreies. Dette er det mest kritiske problemet for disse eksperimentene: ledninger og rør pleier å krysse ofte på grunn av dyr bevegelser. Derfor bruker vi kontakter og rør lenge nok å la dyr jage sin egen hale (en atferd som er vanligvis observert med kalium stimulering) eller falle ned og rulle under generalisert epileptiske anfall. Det anbefales å autorisere ytterligere microdialysis cannulas settes inn i deres guide av modell-leire, for å styrke sin kontakt med guide (noen ganger microdialysis cannulas er bumped mot veggene i buret under generalisert beslag og kan slip av). På den annen side, anbefales det å holde slangen så kort som mulig, minimere forsinkelsen mellom nevrokjemiske og samling tid. Dette er spesielt viktig når samling periodene er korte. Generelt microdialysis slangen bør være tilstrekkelig lengde og kapasitet til å sikre at prøvetaking gang overstiger ikke tiden mellom dialyse stikkontakt og samling. Det ble observert at solutes tendens til å spre mer mellom noen plugger hvis rør død tid er overlegen sampling rate55. Derfor bør det eksperimentelle død tid/volumet microdialysis rør, redusert så mye som mulig og bestemt meget presist for å koordinere neurochemistry dataene med dyr atferd. Endelig, er det viktig å merke seg at både dreies og elektroder kombinert med kanyle for kombinert EEG og microdialysis studier er kommersielt tilgjengelig. Derfor mulig sette opp EEG systemet med muligheten til å utføre microdialysis eksperimenter.
Mindre anbefalinger er: (i) før du starter noen forsøk, sjekk at EEG innspilling system og/eller microdialysis satt opp fungerer som de skal og feilsøke problemer; Vi foreslår at det å ha en reserve satt opp klare (en annen pumpe med sprøyter montert på og fullført rør fylt opp med arbeider løsninger) når utføre eksperimentet, samt et tilstrekkelig antall klar til bruk microdialysis sonder for å endre brutt de; (ii) når overføring dyr til byrået arbeider EEG-microdialysis er det nyttig å ha en annen person hjelper og starter oppkjøpene; (iii) gjør at at kolonne- og autosampler nådde de aktuelle temperaturene før kromatografi; i tillegg bruker standardene og konstruere kalibrering tomter før noen dialysate eksempler er injisert på kolonnen brukt kromatografiske; (v) når nødvendig, prøv å utvikle de brukt kromatografiske eller andre analysemetode måle flere analytter samtidig.
Endringer i neurotransmission har implikasjoner i mange CNS lidelser (inkludert epilepsi) og det har vært en stor interesse over flere tiår å kvantifisere endringene under progresjon fra en sunn til en syk fenotypen. I dag la bare noen teknikker for måling av endringer i neurotransmitter nivåer over dager eller måneder. Microdialysis er en av disse teknikkene. I mange tilfeller som beskrevet her, det er utført i fritt flytte dyr og koblet til konvensjonelle frakoblet analytisk analyser som Væskekromatografi (HPLC) eller kapillært geleelektroforese (CE), med som det når 5-30 min midlertidig løsning31,56. Åpenbart gjenspeiler intervallene prøvetaking ikke den raske nevrotransmitteren dynamics vicinity i synapser, men kan være praktisk for noen langsiktige microdialysis programmer (f.eks, sykdom utvikling eller narkotika Effektstudier) som krever koplingen nevrokjemiske og EEG atferdsdata. Men andre studier er primært opptatt måle sanntid eller nær sanntid endringer i nevrotransmitter løslate. For disse må microdialysis teknikken være raffinert øke samplingsfrekvens (derfor redusere eksempel volumer). Faktisk den klassiske microdialysis teknikken blir ofte kritisert for dårlig timelige (minutter) og romlig oppløsning (konvensjonelle sonden er mye større enn den synaptiske kløften)9,21,56, 57. men det er masse følsomheten på analysemetode koplet til microdialysis hva bestemmer microdialysis tid oppløsningen (dvs., oppløsningen er lik tiden det tar å har nok prøve å bli oppdaget av en analytisk teknikken56). Dermed når microdialysis produserer ørsmå mengder av prøver, må følsomheten på kvantifisering teknikker økes. Hittil har fulgte slike forbedringer i midlertidig løsning av microdialysis teknikken 3 forskjellige linjer. En av disse er representert ved miniatyrisering kolonnene og/eller påvisning celler av klassiske HPLC metoder; Disse kalles UHPLC (ultra-performant HPLC) teknikker og tillater for å oppnå 1-10 min tid oppløsning58,59,60. En annen tilnærming er å en klassisk HPLC massespektrometri (MS) eller tandem (MS-/ MS) for multiplex analyse av nevrotransmittere i hjernen dialysates. Kombinert HPLC-MS analyser har en utmerket følsomhet og nå om 1-5 min tid oppløsning56,61,62,63. En tredje linje av forbedringen finnes i modifikasjoner av kapillær geleelektroforese (CE). Hvis CE bruker laser indusert fluorescens gjenkjenning (CE-LIFD), kan fastsettelse av submicromolar konsentrasjoner av ulike nevrotransmittere i nanoliter fraksjoner innhentet hver 5 min55,64,65 eller til og med 10 s intervaller56. En klar fordel som fremkommer fra UHPLCs eller avansert CEs analytiske metoder er at prøvetaking kan gjøres i fritt flytte dyr, ikke at eksperimenter som spontan opptreden må være observert og analysert. På den annen side, finnes metoder som tillater hjernen dialysate prøvetaking på selv hundre millisekunder midlertidig løsning (f.eks enzym reaktoren basert online analyser eller slippverktøy samling av dialysate koblet til MS teknikker), men disse er brukes vanligvis i behersket dyr66 eller under narkose67,68,69, ikke tillater å par microdialysis atferdsmessige studier.
Når du vurderer den nest viktigste svakheten av microdialysis, dvs. relativt lav romlig oppløsning på grunn av membran dimensjonene (ofte om 0,5 mm i diameter og 1-4 mm store), et alternativ kan du microprobes utvikles med lav-flow Skyv / trekk-prøvetaking. Disse sonder består av to silisium kapillærene (av 20 µm ID og 200 µm OD) smeltet side-ved-side og omsluttet med en polymere rør. Under eksperimentet, er disse kapillærene perfused til svært lav flow priser, slik at væsken er trukket ut av en kapillære og en prøve er Hentet fra den andre på samme flow rate. Fordi prøvetaking skjer bare i probespissen, er romlig oppløsning større enn med proben for microdialysis70. En annen mulighet er å bytte fra miniatyriserte sonder til microelectrode matriser (biosensors) for sanntids nevrotransmitter evaluering. Ulike elektrokjemiske teknikker (basert på voltammetry eller amperometry) tillater analytt prøvetaking nær synapse (mikron skala), og i mindre enn 1 s31,70,71. Disse enhetene kan måle konsentrasjonen av flere analytter fra flere områder av hjernen. De krever imidlertid også noen forbedringer, for eksempel å unngå gjenstander og en relativt rask forverring.
Vurderer de siste fremskrittene i vivo nevrokjemiske overvåke, det virker sannsynlig at ulike senderen Prøvetaking metoder vil bli kombinert i én sensor i nær fremtid. Arbeidet på microfabricated prøvetaking sonder har allerede startet, og vi tror at videre i microfabrication teknologi sammen med analytiske utviklingen videre vil lette i vivo nevrokjemiske overvåking etterforskning. På denne tiden er imidlertid den konvensjonelle microdialysis korrelert til EEG en gyldig metode for mange nevrovitenskap programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Anna Binaschi, Paolo Roncon og Eleonora Palma for deres bidrag til manuskripter publisert i prioritet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml - tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml - diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
References
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
- Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
- Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
- Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
- Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
- Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
- Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
- Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
- Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
- Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
- Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
- Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
- Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
- Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
- Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
- Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
- Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
- Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
- Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
- Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
- Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
- Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
- Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
- Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
- Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
- Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
- Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
- Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
- Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
- Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
- Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
- Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
- Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
- Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
- Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
- Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
- Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
- Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
- Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
- Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
- Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
- Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
- Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
- Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
- Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
- Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
- Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
- Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
- Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
- Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
- Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
- Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
- Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).
