Summary
Her, beskriver vi en metode til i vivo mikrodalyse til at analysere aspartat og glutamat udgivelse i den ventrale hippocampus epileptiske og ikke-epileptiske rotter i kombination med EEG optagelser. Ekstracellulære koncentrationer af aspartat og glutamat kan være korreleret med de forskellige faser af sygdommen.
Abstract
Mikrodalyse er en veletableret neurovidenskab teknik, der korrelerer ændringer af neurologisk lægemiddelstoffer spreder ind i hjernen interstitielle rum med adfærd og/eller specifikke resultatet af en patologi (fx anfald for epilepsi). Når man studerer epilepsi, er den mikrodalyse teknik ofte kombineret med kortsigtede eller endda langsigtede video-electroencefalografi (EEG) overvågning for at vurdere spontane anfald hyppigheden, sværhedsgrad, progression og klyngedannelse. Den kombinerede mikrodalyse-EEG er baseret på brug af flere metoder og instrumenter. Her, udførte vi i vivo mikrodalyse og kontinuerlig video-EEG optagelse til skærm glutamat og aspartat udstrømning over tid, i forskellige faser af den naturlige historie af epilepsi i en rotte model. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for parring af ændringer i neurotransmitter frigivelse med bestemte faser af udvikling af sygdom og progression. Koncentrationen af aminosyren i den dialysat var bestemt af væskekromatografi. Her, vi beskrive metoder og skitsere de vigtigste forebyggende foranstaltninger man skal tage under i vivo mikrodalyse-EEG, med særlig vægt på de stereotaxisk kirurgi, basal og høj kalium stimulering under mikrodalyse, dybde elektrode EEG registrering og højtydende væskekromatografi analyse af aspartat og glutamat i den dialysat. Denne tilgang kan tilpasses til at teste forskellige stof eller sygdom induceret ændringer af de fysiologiske koncentrationer af aspartat og glutamat i hjernen. Afhængigt af tilgængeligheden af en passende analytisk assay, kan det yderligere bruges til at teste forskellige opløselige molekyler, når ansætte EEG optagelse på samme tid.
Introduction
For at give indsigt i den funktionelle svækkelse af glutamat-medieret excitatoriske og GABAergic hæmmende neurotransmission resulterer i spontane anfald i FLE (TLE) har overvåges vi systematisk ekstracellulære koncentrationer af GABA1 og senere niveauer af glutamat og aspartat2 af mikrodalyse i den ventrale hippocampus af rotter på forskellige tidspunkter af sygdommens naturlige kursus, dvs, i løbet af udvikling og progression af epilepsi. Vi tog fordel af TLE pilocarpin model i rotter, som efterligner sygdom meget præcist med hensyn til adfærdsmæssige, elektrofysiologiske og histopatologiske forandringer3,4 og vi korreleret dialysat koncentrationen af amino syrer til sine forskellige faser: den akutte fase efter den epileptogenic fornærmelse, latency fase, tidspunktet for den første spontane anfald og kronisk phass5,6,7. Indramning sygdom faser blev aktiveret af video-EEG langtidsovervågning og præcise EEG og klinisk karakterisering af spontane anfald. Anvendelsen af mikrodalyse teknik forbundet med langsigtede video-EEG overvågning tilladt os at foreslå mekanistiske hypoteser for TLE neuropatologiske. I Resumé tillader teknikken beskrevet i dette håndskrift bindingen af neurokemiske forandringer inden for et defineret hjernen område med udvikling og progression af epilepsi i en dyremodel.
Forbundne enheder, der består af en dybde elektrode sammenstillet til en mikrodalyse kanyle, er ofte beskæftiget i epilepsi forskningsundersøgelser hvor ændringer i neurotransmittere, deres metabolitter eller energi substrater bør være korreleret til neuronal aktivitet. I langt de fleste tilfælde, det bruges i frit opfører dyr, men det også kan gennemføres på samme måde i mennesker, fxi farmako-resistente epileptiske patienter i dybde elektrode undersøgelse før kirurgi8. Både EEG registrering og dialysat samling kan udføres særskilt (f.eks.implantering elektrode i en halvkugle og mikrodalyse sonde i anden halvkugle eller selv udføre mikrodalyse i én gruppe af dyr, mens de udfører den eneste EEG i en anden gruppe af dyr). Dog kobling elektroder til sonder kan have flere fordele: det forenkler stereotaxisk kirurgi, begrænser vævsskader til kun én halvkugle (mens den anden intakt, som et kontrolelement for histologiske undersøgelser), og homogenizes resultater som disse er fremstillet af det samme område af hjernen og de samme dyr.
På den anden side kræver forberedelse af koblede mikrodalyse sonde-elektrode enhed færdigheder og tid, hvis det er hjemmelavet. Man kunne bruge relativt store mængder af penge, hvis købt fra markedet. Desuden, hvornår mikrodalyse sonder (sonde tips er typisk 200-400 µm i diameter og 7-12 mm lange)9og EEG elektroder (elektrode tips er normalt af 300-500 µm i diameter, og lang nok til at nå den hjerne struktur af interesse10) kombineret, repræsenterer de monterede enhed en pladskrævende og relativt tunge objekt på den ene side af hovedet, som er besværlige for dyr og tilbøjelige til at være tabt, især når det er tilsluttet til dialyse pumpen og hårdt-wire EEG optagelse system. Dette aspekt er mere relevante i epileptiske dyr, der er svære at håndtere og mindre adaptive til mikrodalyse sessioner. Korrekte kirurgiske teknikker og passende postoperativ pleje kan resultere i langvarig implantater, der forårsager minimal animalske ubehag og bør videreføres for combinatory mikrodalyse-EEG eksperimenter10,11, 12.
Fordele og begrænsninger af den mikrodalyse teknik er blevet behandlet i detaljer af mange neuroforskere. Dens primære fordel over andre i vivo perfusion teknikker (f.eks., hurtigt flow push-pull eller kortikale cup perfusion) er en lille diameter af sonden, der dækker et relativt præcise område af interesse13,14, 15. For det andet skaber den mikrodalyse membran en fysisk barriere mellem væv og perfusate; derfor høj Molekylær vægt stoffer krydse ikke og forstyrrer ikke analysen16,17. Desuden, væv er beskyttet fra turbulent strømning af perfusate18. En anden vigtig fordel er muligheden for at ændre perfusate strømmen for at maksimere analysandens koncentration i perfusate (dvs., processen med mikrodalyse godt kan defineres matematisk og kan ændres til at give høj koncentrationer af analysand i prøveopløsningen)19. Endelig, teknikken kan bruges til at indgyde stoffer eller restkoncentrationer af farmakologisk virksomme stoffer i væv af interesse og bestemme deres virkning i stedet for intervention20. På den anden side har mikrodalyse en begrænset løsningstid (typisk mere end 1 min på grund af den nødvendige tid til indsamling af prøver) i forhold til elektrokemisk eller biologiske sensorer; Det er en invasiv teknik, der forårsager vævsskader; Det bringer den neurokemiske balance i rummet omkring membran på grund af den fortsatte koncentration graduering af alle opløselige stoffer, der træder perfusate sammen med analysanden af interesse. Endelig, den mikrodalyse teknik er stærkt påvirket af grænserne for de analytiske teknikker anvendes til kvantificering af stoffer i perfusate9,21,22,23 . High-performance væskekromatografi (HPLC) efter forædling med orthophthaldialdehyde for glutamat og aspartat analyse i biologiske prøver er blevet godt valideret24,25,26 , 27 og dens omfattende diskussion er ikke omfattet af dette manuskript, men de data, der er produceret ved hjælp af denne metode vil blive beskrevet i detaljer.
Når udført korrekt og uden ændringer af perfusate sammensætning, kan mikrodalyse give pålidelige oplysninger om de basale niveauer af neurotransmitter frigivelse. Den største del af de basale niveauer er sandsynligvis et resultat af senderen afsmitning fra synapser9. Fordi i mange tilfælde enkel prøveudtagning af neurotransmitter i det ekstra synaptic rum ikke er tilstrækkelige til at forfølge målene i en undersøgelse, kan mikrodalyse teknik anvendes også, at stimulere neuroner eller at fratage dem vigtige fysiologiske ioner som K+ eller Ca2 +, at fremmane eller forhindre frigivelse af neurotransmitter.
Høj K+ stimulation er ofte brugt i neurobiologi for at stimulere neuronal aktivitet ikke blot i vågen dyr, men også i grundskolen og organotypic kulturer. Udsættelse af en sund centralnervesystemet til løsninger med høje koncentrationer af K+ (40-100 mM) fremkalder udstrømningen af neurotransmittere28. Denne evne af neuroner til at give en yderligere frigivelse i svar til høj K+ kan blive kompromitteret i epileptiske dyr1 og andre neurodegenerative sygdomme29,30. Ligeledes frigive Ca2 + afsavn (fremstillet ved perfusing Ca2 + gratis løsninger) bruges til at etablere calcium-afhængige af de fleste neurotransmittere målt ved mikrodalyse. Det menes generelt, Ca2 + afhængige frigivelse er af neuronal oprindelse, hvorimod Ca2 + selvstændig frigivelsen stammer fra glia, men mange undersøgelser rejst kontrovers over betydningen af Ca2 +-følsomme målinger af f.eks. glutamat eller GABA9: således, hvis det er muligt, er det tilrådeligt at støtte mikrodalyse undersøgelser med mikrosensorer undersøgelser, som sidstnævnte har højere spatial opløsning og elektroderne giver mulighed for at komme tættere på synapser31.
Vedrørende mikrodalyse undersøgelser i epileptiske dyr er det vigtigt at understrege, at oplysninger indhentet fra de fleste af dem afhængige af video eller video-EEG overvågning af anfald, dvs, forbigående forekomsten af tegn og/eller symptomer på grund af unormale overdreven eller synkron neuronal aktivitet i hjernen32. Der er noget specielt for electrographic anfald i pilocarpin behandlet dyr, som bør overvejes, når du forbereder eksperimentet. Spontane anfald efterfølges af deprimeret aktivitet med hyppige EEG interictal pigge3 og forekomme i klynger33,34. Forlorne drives ikke-epileptiske dyr kan udstille beslaglæggelse-lignende aktivitet35 og derfor parametre for EEG optagelser evaluering bør være standardiseret36 og, hvis det er muligt, timingen af mikrodalyse sessioner skal være veldefineret. Endelig, vi varmt anbefale følgende principper og metodologiske standarder for video-EEG overvågning i kontrol voksen gnavere skitseret af eksperter fra internationale liga mod epilepsi og amerikanske epilepsi samfund i deres meget nylige rapporterne37 ,38.
Her beskriver vi mikrodalyse af glutamat og aspartat parallelt med de langsigtede video-EEG optagelser i epileptiske dyr og deres analyse i den dialysat ved HPLC. Vi vil understrege de kritiske trin i den protokol, som man bør tage sig af for bedste resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer er blevet godkendt af universitetet i Ferrara institutionelle Animal Care og brug udvalget og af det italienske sundhedsministerium (tilladelse: D.M. 246/2012-B) i overensstemmelse med retningslinjerne i de Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv af 24 November 1986 (86/609/EØF). Denne protokol er specielt tilpasset glutamat og aspartat bestemmelse i rat brain dialysates opnået under EEG kontrol af mikrodalyse sessioner i epileptiske og ikke-epileptiske rotter. Mange af de materialer, der er beskrevet her kan let udskiftes med dem, man bruger i sit laboratorium for EEG optagelser eller mikrodalyse.
1. montering af mikrodalyse sonde-elektrode-enhed
- Brug en 3-kanals to-snoet elektrode (med mindst en 20 mm skær længden af den registrerende elektrode og en 10 cm lange grundstødning elektrode) og koble det til en guide kanyle for at forberede enheden. Se eksempler på 3-kanals elektrode og guide tungeholder til dialyse i figur 1A-1B.
- Fjern (figur 1 c) og Indsæt (fig. 1 d) metal guide kanyle ind i dummy plast kanylen et par gange før brug for at lette dens fjernelse for øjeblikket af dens switch mikrodalyse sonde i dyr.
- Bøje snoet ledningerne af registreringen elektrode to gange (figur 1E-1F) for at justere ledninger med dummy kanylen af guide og skære elektrode tip (figur 1 g) til at være 0,5 mm længere end spidsen af guide kanyle (figur 1 H) ved hjælp af den digitale caliper.
- Har klar 1 mm lange silicium tudorroser (OD 2 mm, tykkelse 0,3 mm; Figur 1I) og Indsæt spidsen af guide kanyle og spidsen af de snoede elektroder i silicon tudorroser ved hjælp af pincet (figur 1J). Ordne det på foden af vejledningen kanyle piedestal med polymer lim af hurtig handling eller harpiks (figur 1 K). Se eksempel på de færdige enheder i figur 1 L og figur 2A.
- Sterilisere enhed under Bakteriedræbende UV-lys for 4 h. tur over enheden fire gange så hver af dens sider er udsat for lys for 1 h.
Bemærk: Mange hjemmelavede elektroder og mikrodalyse sonder kan samles i en lignende måde. Leder af ovenfor beskrevne implantat til rotter har følgende dimensioner: 7 mm bredde x 5 mm dybde x 10 mm længde fra top til piedestal tå; implantatet tip er omkring 11 mm lang, 600 µm i diameter og alle enheden vejer ca 330-360 mg. Enheden kan genbruges to eller tre gange hvis (i) en tilstrækkelig længde af jorden elektrode er tilbage på kraniet under operationen til næste brug og (ii) når dyret er dræbt, og enheden rentetillæg dental cement det overlades i acetone overnigh Thomsen, sådan, at cement kan være mekanisk opdelt, og enheden vasket og steriliseret igen.
2. stereotaxisk kirurgi
- Bruge et stereotaxisk apparatur og sonde klip indehaveren (figur 2B) til enheden implantation efter moderne standarder for aseptisk og smerte-fri operationer39,40,41.
- Bedøver de voksne Sprague-Dawley rotter med ketamin/xylazin blanding (43 mg/kg og 7 mg/kg, i.p.) og ordne det på stereotaxisk rammen. Tilføje isofluran anæstesi (1,4% i luften; 1,2 mL/min.) til indledende ketamin/xylazin indsprøjtning, da det giver mulighed for at styre dybden af anæstesi i tid. Barbere pels på dyrets hoved.
- Vatpind hoved hudens overflade af jod-baserede løsning efterfulgt af 70% ethanol til at forberede aseptisk kirurgi39.
- Implantat guide kanyle-elektrode enheden parat i forrang (1.1-1.5) i lige ventrale hippocampus ved hjælp af følgende koordinater: næse bar + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm til bregma1,2. Følg standardteknikker for stereotaxisk operationer10,11,12.
- Sikre, at det ikke dækker de forankring skruer. Når du monterer det på den stereotaxisk apparatur, forstå enheden for guide kanyle hoved som det nemt kan justeres til indehaveren af sonden.
- Anker enhed til kraniet med mindst fire rustfri skruer skrue dem ind i kraniet knoglen (1 skrue i den venstre og 1 skrue i de højre frontal knogleplader, 1 skrue ind i den venstre parietal og 1 skrue i interparietal knogleplader). Tilføj en dråbe af væv lim til yderligere fix hver skrue på kraniet knoglen.
- Dække halvdelen af gevind med methacrylsyre cement. Fremme binding af cement ved at gøre lavvandede riller i knoglen til at øge overholdelsen af.
- Når spidsen af enheden er placeret i hjernevævet, twist wiren af jorden elektrode omkring 3 forankring skruer. Dække alle monteret skruer og enhed med dental cement12,42,43.
- Overvåge dyrene under operationen og for omkring 1 h derefter indtil opretstående og bevæger sig rundt i buret. Holde dem på en opvarmning pad til at undgå hypotermi. Gøre det muligt rotter at inddrive i mindst 7 dage efter enhed implantation.
- Overvåge dyr mindst én gang dagligt i 3 dage efter operationen for tegn på smerte eller lidelse. Give dyrene med antibiotisk creme (phosphatbufferet 0,1%) tæt på webstedet indridset at forhindre infektion og en smertestillende (tramadol 5 mg/kg, i.p.) i 3 dage for at forhindre de post-operative smerter.
3. frontal-lap epilepsi induktion af pilocarpin og tildeling af dyr til eksperimentelle grupper
- Efter en uge med post-kirurgisk opsving, tildele dyrene tilfældigt til grupper: (i) kontrol dyr modtager køretøj og (ii) epileptisk dyr, der skal modtage pilocarpin. Brug et forholdsmæssigt højere antal dyr for epileptiske gruppe da ikke alle af pilocarpin administreres rotter vil udvikle sygdommen.
- Indsprøjtes en dosis af methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) og 30 min efter en enkelt injektion af pilocarpin (350 mg/kg, i.p.) til at fremkalde status epilepticus (SE). Sprøjt methylscopolamine og køretøj (saltvand) til kontrol rotter. Brug 1 mL sprøjte med 25G kanyle til alle i.p. forvaltninger.
- Kontroller visuelt dyr for at begynde at have adfærdsmæssige anfald (flytning vibrissa i 5 min, nikkede med hovedet, kloning lemmer) og inden for 25 min at klone kontinuerligt alle kroppen (SE).
- Arrestere SE 2 h efter debut til har en dødelighed ca. 25% og en gennemsnitlig latent periode på ca 10 dage ved administration af diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observere og registrere nogen beslaglæggelse adfærd begyndelsen straks efter pilocarpin injektion og fortsætte i mindst 6 timer derefter.
- Give dyrene saltvand (1 mL, i.p.) ved hjælp af 1 mL sprøjte med 25G kanyle og saccharose løsning (1 mL, p.o.) ved hjælp af 1 mL sprøjte og fleksible fodring 17G kanyle i 2-3 dage efter SE for at fremme inddrivelsen af kroppen vægttab.
- Udelukke de dyr, der ikke opnår den oprindelige kropsvægt inden for den første uge efter pilocarpin SE fra undersøgelsen (bortset fra akutte gruppen dræbt 24 h efter SE, hvor organ vægt opfølgningen ikke er muligt).
- Tildele post-SE dyr tilfældigt til forskellige eksperimentelle grupper (figur 3): akut fase (hvor mikrodalyse finder sted 24 timer efter SE), latenstid (7-9 dage efter SE), første spontane anfald (ca. 11 dage efter SE) og kronisk periode ( starter omkring 22-24 dage efter SE, dvs omkring 10 dage efter den første anfald). Overvåge dyr for forekomst af spontane anfald.
Bemærk: Brug følgende inklusion/udelukkelse kriterier for yderligere eksperimenter i epileptiske rotter: udvikling af krampagtig SE inden for 1 time efter pilocarpin administration; vægtøgning i den første uge efter SE og den korrekte placering af mikrodalyse sonde og elektrode.
4. epileptiske adfærd overvågning og analyse
- Langtidsovervågning af epileptiske adfærd
- Ca 6 h efter pilocarpin administration (dvs.ved udgangen af direkte observation af forskerne), placere dyrene i de ren hjem bure og starte 24 h video overvågning.
- Fortsætte den 24 h video overvågning indtil dag 5, ved hjælp af en digital videoovervågning system.
- Begynder på dag 5, tilsluttes tøjret EEG optagelse system rotter i deres hjem rektangulære bure og fortsætte 24 h video overvågning.
- Sæt parametre på forstærkeren placeret udenfor Faraday bur (sæt forstærkning faktor på hver kanal ifølge specificiteten af EEG-signalet af hvert enkelt dyr) og start EEG erhvervelse observere EEG-signalet produceret af usammenhængende kabler. Brug prøveudtagning Vurder 200 Hz og pass low filtersæt til 0,5 Hz.
- Tilslut dyret til kabler holder en dyrets hoved mellem to strakte fingre på en hånd og skrue ned stik til elektrode piedestal ved hjælp af de andre frie hænder. Start erhvervelse.
Forsigtighed: Sikre, at signalet er fri af artefakter. Fælles artefakter er pigge langt overstiger skalaen. - En dag, før mikrodalyse eksperimentere, overføre dyrene ind i tøjret EEG systemet udstyret med plexiglas cylindre til mikrodalyse. Afbryde dyrene fra EEG tethering system i hjem bur skrue op stik fra elektrode uden at begrænse dyret. Placere dyret i høj plexiglas cylindre.
- Overvågning af epileptiske adfærd om dagen før og under mikrodalyse session
- Tænd forstærkeren placeret uden for Faraday bur. Åbn EEG-softwaren. Start EEG erhvervelse observere EEG-signalet produceret af usammenhængende kabler.
- Tilslut dyret til tøjret EEG-registreringssystemet holding en dyrets hoved mellem to strakte fingre på en hånd og skrue ned stik til elektrode piedestal ved hjælp af de andre frie hænder. Angive en forstærkning faktor (gevinst) på hver kanal på forstærkeren ifølge elektrode signal af enkelt dyr så EEG-signalet er i skala. Lad dyret udforske nye buret (cylinder) i mindst 1 time under den direkte observation af forskeren.
- Bemærk: 24 timer før mikrodalyse eksperiment, rotter er kortvarigt bedøvede med isofluran for skift af guide cannulas til mikrodalyse sonde. Drage fordel af det øjeblik, når de er bedøvede for at forbinde dem til EEG optagelse system.
- Forkorte eller forlænge hængende kabel efter dyrets råvare. Sørg for, at kablerne ikke interfererer med dyrets bevægelser og liggende stilling.
- Check for korrekt billede indramning af video-kameraer. Starte video-EEG-målingen.
- Identifikation af beslaglæggelser og EEG aktivitet
- Bruge en software-afspiller til at se videoerne. Rulle filmen 8 gange hurtigere end den realtid afspilning og individuate generaliserede anfald (Se dyr til bageste med forelimb clonus eller dyr opdræt og falder med forelimb clonus). Bremse videoen og Bemærk det præcise tidspunkt for begyndelsen og slutningen af adfærdsmæssige beslaglæggelse.
- Proces data ved at tælle antallet af generaliserede anfald observeret i 24 h video poster og udtrykke dem med hensyn til beslaglæggelse hyppighed og varighed som værdier af alle beslaglæggelser observeret i 24 timer.
- Definere EEG anfald som perioder af paroxysmal aktivitet af høj frekvens (> 5 Hz) karakteriseret ved en > 3-fold amplitude increment over baseline med progression af spike frekvens, der varer i mindst 3 s2,44 eller lignende28. Bruge EEG software til at behandle de rå EEG optagelser. Opdele EEG spor i 1 h fraktioner. Kopiere EEG sporing fraktioner til fil for software automatisk spike analyse.
- Analysere EEG aktivitetsdata ved hjælp af EEG software og foruddefinerede parametre (4.3.3.). Gennemføre alle video analyser i to uafhængige efterforskere, der er blind for gruppen af analyserede dyr. I tilfælde af divergens, gøre dem gennemgå dataene sammen for at nå frem til en konsensus45.
5. mikrodalyse
- In vitro sonde opsving
- Forberede sonde til sin første brug ifølge producentens anvisninger, håndtere det i sin beskyttende hylster.
- Eksperiment i tre eksemplarer: forberede tre 1,5 mL reagensglas læsse dem med 1 mL Ringers løsning indeholdende en blanding af standarder (2,5 µM af glutamat) og 2,5 µM af aspartat. Sætte tre indlæst 1,5 mL reagensglas til blok varmelegeme sæt til 37 ° C og anbring den på omrøreren.
Bemærk: Brug de samme standardopløsninger til kromatografi kalibreringer. - Forsegle 1,5 mL reagensglas med paraffin film og punktere det af skarpe pincet til at lave et hul på ca. 1 mm i diameter.
- Tag sonden og sæt det ind i hullet i paraffin film. Fordyb membran på mindst 2 mm under niveauet løsning. Fastsætte yderligere sonde til 1,5 mL reagensglas af paraffin film.
Forsigtighed: Sikre at aflæsse ikke røre væggene i 1,5 mL reagensglas. - Tilslut sondens åbning til sprøjten monteret på infusion pumpen bruger FEP-rør og slanger-adaptere. Eventuelt bar brug fine polyethylen slanger 0,28 mm ID og 0,61 mm OD og farvede slanger adaptere (rød og blå slange adaptere) for forbindelser.
- Start pumpen 2 µL/min. og lad væsken vises på outlet spids. Tilslut sonde outlet til 0,2 mL indsamling reagensglas bruger FEP-rør og slanger-adaptere.
Bemærk: Bruge FEP-slanger for alle forbindelser. Skære den ønskede længde af slange ved at bruge et barberblad. Bruge slangen adaptere i forskellige farve for luftindtag og -udtag af sonden. Lad pumpen køre for 60 min. Check for utætheder og luft bobler. Disse bør ikke være til stede. - Indstil pumpen til flow sats 2 µL/min og begynde at indsamle prøver på afgangssiden af slangen.
- Indsamle tre 30 min perfusate prøver og tre ens bind prøver af løsningen i 1,5 mL reagensglas. Udtage lige saa stort volumen af 1,5 mL reagensglas hvert 30 min ved hjælp af mikrosprøjte nedsænket i standardopløsning i 1,5 mL reagensglas.
- Gentage forsøget (5.1.1-5.1.8) opsætning af pumpe til flow sats 3 µL/min (5.1.7) at have en sonde opsving sammenligning når du bruger to forskellige perfusion strømningshastigheder.
- Når du er færdig, stop pumpen og skyl slanger med destilleret vand, 70% ethanol og skubbe luften ind i den. Butikken sonden i et hætteglas fyldt med ren destilleret vand. Skyl sonden grundigt af perfusing det 2 µL/min. af destilleret vand forudgående oplagring.
- Analysere koncentrationen af glutamat og aspartat i prøverne af kromatografi (se detaljerne nedenfor; 6,3).
- Beregne genopretning ved hjælp af følgende ligning:
Recovery (%) = (Cperfusate cdialysed løsning) x 100.
- Mikrodalyse sessioner i frit flytte rotter
- Forberedende procedurer: sonde indsættelse og prøvning, infusion pumpe indstilling og starte
- Forberede mikrodalyse sonder til den første brug efter fabrikantens brugervejledning og fylde dem med Ringers løsning. Skær ca. 10 cm lange stykker af FEP-slangen og forbinde dem til indsugnings- og cannulas af sonden ved hjælp af slanger adaptere i forskellige farver.
- Sørg for at slangen berører adaptere med ingen døde rum i alle forbindelser.
- 5.2.1.3. 24 h før mikrodalyse eksperiment, bedøver kort dyret med isofluran (5% i luften) i en induktion salen indtil liggende. Fjerne den dummy kanyle fra sin guide bruger en pincet og hold dyrets hoved fast. Indsæt mikrodalyse sonde, udstyret med en dialyzing membran, i guide kanyle og virksomheden yderligere mikrodalyse cannulas indsat i deres vejledning af modeling ler.
Forsigtighed: Lad ikke sonden røre væggene i den beskyttende sonde ærme når udvinding. - Sætte dyret i plexiglas-cylinder og lad det udforske den nye atmosfære. Tilsluttes tøjret EEG registreringssystemet dyret, som beskrevet ovenfor (Følg punkt 4.2.2 og 4.2.3).
- Følg den vågen og frit flytte rotte bevægelser og forbinde indløb af sonden til 2,5 mL sprøjte med afrundede 22G kanyle indeholdende Ringers løsning ved hjælp af slanger adaptere. Skubbe Ringers løsning inde sonden skubbe 1 mL Ringers løsning i 10 s presser hele tiden stemplet af 2,5 mL sprøjte. Check for dråbe af væsken optræder på stikkontakten. Sonden er nu klar til brug.
- Fylde de 2,5 mL sprøjter tilsluttet FEP-slangen af slangen adaptere med Ringers løsning og montere dem på infusion pumpe. Start pumpen på 2 µL/min. Lad det køre natten over.
Bemærk: Bruge den ønskede længde af alle FEP-slange, men beregner slanger dødvolumen at vide hvornår de høje K+ stimulation bør indledes og at korrelere kvantificering data med neurokemiske forandringer i dyrenes hjerne. Bruge luft boblen lavet i slangen under arbejdet flow til at beregne denne gang.
- Indsamling af prøver under EEG registrering og kalium stimulation
- Kontrollér fravær af anfald i de 3 h forud for starten af stikprøven samling (video-EEG optagelser) og fortsætte med at overvåge beslaglæggelse aktivitet under mikrodalyse.
- Stop pumpen transporterer FEP-slangen kanylerede injektionssprøjter fyldt med Ringers løsning. Mount på pumpen et andet sæt af 2,5 mL sprøjter tilsluttet FEP-slanger med slanger adaptere fyldt med en modificeret Ringers løsning med 100 mM K+ løsning.
- Start pumpen 2 µL/min. og lad det køre. For hurtig fyldning af slangen, sæt pumpen på 5 µL/min for tidspunktet for påfyldning. Kontrol for fravær af luftbobler i systemet. Sørg for at slangen berører adaptere med ingen døde rum i alle forbindelser.
- Teste sonden hvis klar til brug i dyr som beskrevet ovenfor (5.2.1.5).
Bemærk: Hvis anden grund sonden ikke virker, skal du ændre den. For disse tilfælde holde et par forberedt mikrodalyse sonder klar til brug i nærheden af mikrodalyse-EEG-arbejdsstation. Afbryde dyret fra EEG kabler og bedøver den kort med isofluran, hvis det er nødvendigt at indse ændringen. - Tilslut FEP-slangen af injektionssprøjter fyldt med Ringers løsning til indløb kanylen af sonden i hvert dyr og vente på udseendet af den flydende drop på spidsen af forretningen.
- Tilslut afgangen fra sonden til FEP-slangen, hvilket fører til samling i reagensglasset. Indsæt FEP-slangen i lukket 0,2 mL reagensglas med et perforeret loft. Sikre, at røret forbliver i stedet ved fastsættelse af med et stykke af modeling ler.
- Fortsætte med at køre pumpen ved 2 µL/min. for 60 min. uden indsamling af prøver for at reagensglasset system (nul eksempel).
- Indsamle 5 på hinanden følgende 30 min dialysat prøver (60 µL respektive volumen) under baseline betingelser (perfusion med normal Ringers løsning). Gemme prøver på is.
- Beregne den tid, det tager væske til at passere fra pumpen i dyrets hoved (det afhænger af dødvolumen slanger, dvs., bubble sendetid) og skifte FEP-slangen, der går fra sprøjter indeholdende normal Ringers løsning til sprøjter indeholdende ændret (100 mM K+) Ringers løsning på dette tidspunkt uden at stoppe pumpen. Kontrol for fravær af luftbobler i systemet. Lad pumpen køre i 10 min.
Forsigtighed: I 10 min af høj K+ stimulation, dyrene tendens til at flytte sig frenetically og normalt præsentere et stort antal våd hund ryster (kontrol og beslaglæggelse klynge dyr) eller adfærdsmæssige anfald (epileptiske dyr), så vær klar til at gribe ind til beskytte slanger og kabler fra vridning. - Efter 10 min, skifte slange fra sprøjter indeholdende 100 mM K+ Ringer løsning til normal Ringers løsning og lad pumpen køre. Skal ikke slukke pumpen under løsning ændringer så, at der vil være en dråbe af væsken i slutningen af slanger tilsluttes i linje.
- Fra det øjeblik hvor den dialysat indeholder høj kalium, dvs, efter indsamling af den femte post ækvilibrering dialysat, indsamle de dialysat fraktioner hver 10 min (20 µL) for 1 h. indsamle 3 yderligere 30 min dialysat prøver og stoppe den pumpe. Gemme prøver på is.
- Opbevare prøver på-80 ° C efter forsøget indtil HPLC-analysen.
- Gentag mikrodalyse eksperiment i 3 dage i træk, med undtagelse af akut (24 h) og første beslaglæggelse gruppe, som kun en mikrodalyse session finder sted 24 timer efter SE eller inden for 24 timer efter den første spontane anfald (figur 3).
- Ved afslutningen af hvert eksperiment, aflive dyret med en bedøvende overdosis og fjerne hjernen for verifikation af sonden og elektrode placering.
- Forberedende procedurer: sonde indsættelse og prøvning, infusion pumpe indstilling og starte
- Post-mikrodalyse procedurer
- Skyl de anvendte mikrodalyse sonder med destilleret vand og gemme dem i et glas fyldt med ren destilleret vand indtil næste brug.
Bemærk: Genbrugte membraner kan have øget permeabilitet; Check for sonden recovery før dens gentagen brug. - Skyl den hele mikrodalyse sat op (slanger, stik og sprøjter) med destilleret vand efterfulgt af 70% ethanol. Erstatte ethanol med luft og gemme sættet op i et sterilt miljø.
- Opdele de basale dialysat prøver i 20 µL fraktioner og bruge kun en 20 µL brøkdel aminosyre basal koncentration analyse. Gemme den resterende prøve volumen for yderligere eller bekræftende analyse ved-80 ° C.
- Fix hjerner i 10% formalin og bevare dem ved integrering af paraffin1. Coronally afsnit hjerner i skiver og bejdse dem med hæmatoxylin og eosin. Undersøge hjerner for korrekte sonde og elektrode placering1,2.
Bemærk: Fix hjerner i luftkølet 2-methylbutane og opbevar dem ved-80 ° C. Bruge nogen andre gennemprøvede farvning på afsnittene nervevæv, der gør det muligt for at visualisere sonde og elektrode-tarmkanalen.
- Skyl de anvendte mikrodalyse sonder med destilleret vand og gemme dem i et glas fyldt med ren destilleret vand indtil næste brug.
6. kromatograferingen af glutamat og aspartat
- Forberedelse af afledende agent
- Bland de respektive bind 20:1 (v/v) af orthophthaldialdehyde reagens (OPA) og 2-mercaptoethanol (5-ME) i hætteglasset. Luk hætteglasset ved hjælp af den fælles landbrugspolitik og luft stramme septum.
Forsigtighed: Arbejde under den kemiske hætte. - Vortex fremstillet opløsning og sætte det ind i autosampler i position til afledende agent.
- Bland de respektive bind 20:1 (v/v) af orthophthaldialdehyde reagens (OPA) og 2-mercaptoethanol (5-ME) i hætteglasset. Luk hætteglasset ved hjælp af den fælles landbrugspolitik og luft stramme septum.
- Forberedelse af dialysat prøver
- Sætte glasindsats med bunden foråret i 2 mL brun autosampler hætteglas. Forberede hætteglassene for alle prøverne målt i én batch.
- Tage 20 µL dialyse prøver fra-80 ° C fryser og lade dem smelte. Fjerne 1 µL af opløsningen og tilføje 1 µL af intern standard (IS) L-Homoserine (50 µM) til 19 µL af prøven, således prøven indeholder 2,5 µM af IS. Med pipette overfoeres 20 µL af dialyse prøven til glasindsats i hætteglas og forsegle det med en air tight septum.
- Placer hætteglas indeholdende prøverne i autosampler med den chromatografiske software for at mærke prøver i deres holdninger.
- Chromatografisk analyse af prøver til bestemmelse af glutamat og aspartat koncentration
- Køre analyserne på flydende chromatografen system med registrering af spectrofluorometric. Opdage aminosyrerne, efter 2 min før kolonne forædling med 20 μL af orthophthaldialdehyde/5-mercaptoethanol 20:1 (v/v) tilsættes 20 μL af prøven.
- Forberede aminosyrer analyse systemet. Tænd autosampler, pumpen, afgasser, detektor og styrende enhed sammen med computeren.
- Fordybe medfører tab i flasker med den mobile fase og rense kanaler af kromatografiske pumpen skal bruges til analyse.
- Begynder at øge strømmen af den mobile fase kontrol presset på kolonnen (f.eks.start på 0,2 mL/min. og øge flow for yderligere 0,2 mL/min. hvert 5 min indtil opnåelse arbejde flow). Lade systemet køre på arbejde flow 0,8 mL/min. for mindst 1 h til blandingen henstår kolonnen.
Forsigtighed: Ustabile pres indikerer tilstedeværelsen af luft i systemet. Presset må ikke overstige 25 MPa. - Sæt gevinsten, høj følsomhed og excitations- og bølgelængder på detektor til 345/455 nm henholdsvis. Nulstille detektor signal (AUTOZERO).
- Ved hjælp af kromatografiske software, send metoden til instrumentet. Nu, kromatografen bør være klar til at måle.
- Adskille de dialysat prøver, standard spiked dialysat prøver samt standarder (0,25 µM – 2,5 µM aspartat og glutamat i Ringers løsning) på den relevante kromatografiske kolonne. Kalibrere den chromatografiske metode og etablere påvisning og kvantificering grænserne før enhver dialyse prøver analyse.
- Aktivere en enkelt analyse eller oprette sekvens af prøver der skal analyseres ved hjælp af kromatografi software og køre sekvensen.
Forsigtighed: Køre mere end én blindprøve og forskellige standardprøverne inden for sekvensen af dialysat prøver for at kontrollere metode nøjagtighed. - Når kromatogrammer er erhvervet, analysere dem med kromatografi software. Kontroller integration af toppene af interesse i kalibrering plot. Bruge højde eller peak topareal for kvantificering.
- Når prøven optagelsen er færdig med at udfylde kolonnen og systemet med et organisk opløsningsmiddel (f.eks., 50% acetonitril i ultrarent vand) for at forhindre sin aldrende og mug vækst i det.
- Lukke systemet ned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonden opsving
Den gennemsnitlige genfindelse (dvs. den gennemsnitlige aminosyre indhold i perfusate som en procentdel af indholdet i et lige saa stort volumen af hætteglasset løsning) var 15.49 ± 0,42% med en væskehastighed på 2 μl/min og 6,32 ± 0,64 3 μL/min. for glutamat og 14.89 ± 0,36% med en væskehastighed på 2 ΜL/min og 10.13 ± 0,51 3 μL/min. for aspartat når du bruger cuprophane membran sonde. Hvis bruger polyacrylonitril membran sonde, den gennemsnitlige genfindelse var 13,67 ± 0,42% med en væskehastighed på 2 μl/min og 6,55 ± 1,07 3 μL/min. for glutamat og 14.29 ± 0,62% med en væskehastighed på 2 μl/min og 8,49 ± 0,15 3 μL/min. for aspartat (figur 4A-4B). Som det kan ses tydeligt i figur 4A, forbedrer den langsommere strømningshastighed (2 μl/min) begge sonder dialyzing ydeevne. For følgende eksperimenter cuprophane membran begavet sonden perfunderet en flow sats 2 μl/min. blev valgt, fordi den gennemsnitlige genfindelse var højere (selv om det ikke signifikant) på denne strømningshastighed begge analysander og eksperimenterende kontinuitet (disse sonder blev brugt til at analysere GABA i forud for1).
Anfald udvikling og progression af sygdommen efter status epilepticus
Den adfærdsmæssige og EEG overvågning af anfald, deres evaluering blev gjort i alle de dyr, der er ansat i denne undersøgelse at bekræfte af udvikling og progression af TLE sygdom i disse.
Den robuste krampagtig SE, der blev afbrudt efter 3 h ved hjælp af diazepam, opstod 25±5 min efter pilocarpin injektion. Så, alle dyr ind en latenstid tilstand, hvor de var tilsyneladende godt og de var konstant video-EEG overvåges for at kontrollere, at ingen spontane anfald fandt sted i de første 9 dage eller til at identificere de første spontane anfald, henholdsvis for latenstiden og gruppen beslaglæggelse. Den første spontane anfald opstod 11,3 ± 0,6 dage efter SE (betyde ± SEM, n = 21). Derefter anfald fandt sted i klynger, og forværret i tid. I sene kronisk fase (dage efter SE 55-62) de epileptiske rotter oplevet 3.3±1.2 (mener ± SEM, n = 12) generaliserede anfald dagligt. Der var en klar progression af sygdommen. Mange, men ikke alle EEG anfald, svarede med adfærdsmæssige beslaglæggelse aktivitet. Figur 5B viser den registrerede paroxysmal epileptiform aktivitet, der blev observeret omkring 500 ms før og under adfærdsmæssige anfald. Fig. 5A viser kontrol spor i ikke-epileptiske rotter.
Repræsentative basale værdier af aminosyrer findes i mikrodalyse perfusate og kalium stimuleret frigivelsen af glutamat
Basal glutamat koncentration findes i kronisk epileptiske rotter (0.87 ± 0,06 µM) var betydeligt højere end i kontroldyr (0,59 ± 0,03 µM; p < 0,05 vs kontrolelementer; en-vejs ANOVA og post hoc Dunnett test). Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem kronisk epileptisk (0.31 ± 0,04 µM) og ikke-epileptiske dyr (0,30 ± 0,05 µM) i basal eller høj K+ fremkaldte aspartat koncentrationer. Se den originale artikel for detaljer2. De rapporterede basal niveauer af glutamat i kontrol rotter er i overensstemmelse med dem, der findes af andre i lignende undersøgelser (dvs., om 0,75 µM når du bruger en 2 µL/min. flow og membraner af 2 mm effektiv længde)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Dog, mange forskellige faktorer kan påvirke resultaterne af mikrodalyse, for eksempel den faktiske længde af sonden og membranen afskåret.
Høj K+-fremkaldte en yderligere frigivelsen af glutamat til ca 30 min i kontrol rotter og ca 60 min i kronisk epileptiske rotter (figur 6). Se den originale artikel for detaljer2. Som det kan ses fra den afbillede tidsforløb, var 10 min gang opløsning af mikrodalyse nok til at fange afvigelser i glutamat release fundet i begge grupper af dyr.
HPLC kalibrering og grænser
Dataene blev beregnet på baggrund af kalibreringskurver fremstillet med standard løsninger af glutamat og aspartat og den interne standard L-homoserine. Koncentrationen af neurotransmittere glutamat og aspartat i perfusates var udtrykt i absolutte værdier (µmol/L). Hver kalibrering plot blev bygget af analyse af løsninger af glutamat og aspartat på fire koncentrationsniveauer (fem replikater på hvert niveau). Regression koefficienter blev beregnet for kalibrering parceller: y = kx + q, hvor x var koncentrationsgrad aspartat eller glutamat til L-homoserine (IS) og y var tilsvarende topareal forholdet af aspartat eller glutamat til L-homoserine ( ER). Determinationskoefficienten (r2) blev beregnet. Anvendeligheden af HPLC-metoden var inden for grænserne; den nedre grænse for kvantificering blev fastsat som den laveste koncentration i standard kalibreringskurven og den øvre grænse for kvantificering som den højeste anvendte koncentration af aminosyre analysander for kalibrering, henholdsvis. Detektionsgrænsen (LOD) blev også beregnet. Nogle af disse værdier er afgrænset i tabel 1. En model kromatogram af blindprøve, standarder eksempeldatabase og indsamlede dialyse prøven fremstillet med ovenfor beskrevne metode er vist i figur 7.
Sonden lokalisering
Mikrodalyse sonde og optagelse elektrode er implanteret i lige ventrale hippocampus og deres korrekte placering blev efterprøvet. Kun dyr hvor implantation blev maksimalt i 500 μm fjernt fra stabiliseret koordinater (Se figur 8) indgik i analysen.
Figur 1. En trinvis udarbejdelse af enheden til implanteres. A 3-kanals elektrode med 10 cm lange grundstødning elektrode i sin beskyttende hylster på den venstre og guide tungeholder til mikrodalyse til højre for at samle enheden. (B). den nøgne elektrode og guide kanyle i detaljer. Det første skridt er at fjerne (C) og Indsæt (D) metal guide kanyle til sin plast dummy par gange til og fra lethed sin udgivelse engang implanteret i dyrets hoved. Det andet skridt er at bøje to gange den snoede registrerende elektrode skal justeres til dialyse guide kanyle (E, F). (G) elektrode tip skal skæres for at være 0,5 mm længere end spidsen af metal guide kanyle. (H) check for præcisionen af snittet ved hjælp af den digitale caliper. Efterfølgende, ca 1 mm bør lang silicium tudorroser anvendes til at fastsætte justeringen af elektrode til at guide kanyle foden (I). J fotografiet viser, hvordan du ring elektrode og guide kanyle skaft. Det sidste trin er at sætte en dråbe harpiks eller lim på guide kanyle piedestal fastsættelse af silicium tudorroser til det (K). (L) samlet enheden klar til at blive steriliseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fotografier af forskellige typer af udstyr til mikrodalyse-EEG i rotter anvendes (A) og fotografiet af indehaveren sonde klip (B) anvendes til implantatet disse enheder. A guide kanyle (i grønt) er erstattet af en mikrodalyse kanyle typisk 24 timer før forsøget. Det elektriske stik af enheden (første venstre blev brugt for de optagelser, der er beskrevet i dette manuskript) tillader fastgørelse af ledninger, denne adfærd elektriske signal til forstærker og data samling udstyr. Enheden er kirurgisk knyttet til kraniet af bedøvede rotter og optagelser kan hentes senere uden at forårsage smerte eller ubehag i frit opfører rotter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksperimentelle design. Ugen før status epilepticus (SE) induktion, rotter er implanteret med enheden. SE er foranlediget af pilocarpin og dyr (hvis ikke dialysebehandling og dræbt på 24 h efter SE-selskabet rotter fra akut-gruppen) er video overvåget i 5 dage (blå linje) og derefter video-EEG overvåges for at vurdere beslaglæggelse hyppighed og varighed i deres hjem bure (grøn linje). For det mikrodalyse eksperiment overvåges de epileptiske og respektive ikke-epileptiske kontrol rotter er overført til en anden EEG oprettet udstyret med cylinder bure i 24 timer før mikrodalyse session og stadig video-EEG (lys grøn linje). De lodrette røde linjer repræsenterer dialyse sessioner på forskellige tidspunkter af epileptiske sygdomsudvikling. De vandrette røde linjer repræsenterer de forskellige grupper af epileptiske dyr (og respektive ikke-epileptiske dyr), hvor pilen angiver den sidste dag i mikrodalyse og dag i dyrets død. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. In vitro inddrivelse af to dialyse sonder. Mener i vitro opsving (%) af aspartat og glutamat ved hjælp af to forskellige kommercielt tilgængelig mikrodalyse sonder (begge udstyret med 1 mm lange dialyzing membran) på (A) 2 μl/min og (B) 3 µL/min strømningshastighed. Data er den gennemsnitlige ± SEM 3 uafhængige forsøg køre i tre. Der er ikke statistisk signifikante forskelle mellem effektiviteten af forskellige sonder (studerende er parrede t-test, p < 0,05). Ved hjælp af en flow sats 2 μl/min glutamat opsving steg omkring 5% i forhold til 3 µL/min strømningshastighed, blev således den langsommere strømningshastighed brugt i mikrodalyse eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Illustrative EEG optagelser fra ventrale hippocampus af paraoxystic aktiviteter som kan ses på kronisk fase i kontrol og epileptisk rotter. (A) to repræsentative spor registreret i to saltvand behandlede ikke-epileptiske rotter. (B) spor registreret i to epileptiske rotter. Epileptiform udledninger svarer med klasse 3 adfærdsmæssige anfald i disse rotter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Tidsforløb for effekten af kalium stimulation på glutamat udgivelse fra rotte hippocampus. Repræsentative resultatet af mikrodalyse eksperiment udført i 6 kontrol (åben cirkler) og 6 kronisk epileptiske rotter (sorte cirkler). Grafen viser de tidsmæssige ændringer af dialysat glutamat koncentration under mikrodalyse eksperimenter og under høj 100 mM K+ stimulation. Tidspunktet for høj K+ stimulus (10 min) er angivet med den sorte bjælke på bunden af grafen. Dataene er middel ± SEM af 6 dyr pr. gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Illustration af kromatogrammer. Kendte bjergtoppe er mærket. Pink spor: kromatogram af Ringers løsning uden forsætligt tilsat aminer efter OPA/5-ME forædling (blindprøve). Blå spor: kromatogram af dialysat prøve efter forædling viser toppene af aminosyrer: aspartat (tR 4,80 min), glutamat (tR 6,75 min) og glutamin (tR 9,19 min) og peak af IS L-homoserine (2,5 µM, retentionstid, t R 9.83 min). Røde spor: kromatogram af standard af aspartat (2,5 µM) og glutamat (2,5 µM) i Ringers løsning. Azurblå og gule baggrund af billedet står for mobil fase A (azure) og mobile fase B (gul) del anvendes til analysander eluering. Et rødt rektangel angivet område (tR 10.41 min og yderligere) viser toppene af ukendte stoffer og OPA nedbrydningsprodukter. Alle injektionsvolumener var 20 µL. Derivater var adskilt med en væskehastighed på 0,8 mL/min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Repræsentativt billede af kombineret elektrode-sonde placering inden for den ventrale hippocampus. (A) fotografi viser skræmme efterladt af enheden tip i detaljer (sort pil). B skematisk illustration af elektrode-sonde tip holdningerne i de implanterede ventrale hippocampus af 12 rotter. De faste pladser (nogle overlappende) angive korrekt lokaliserede sonde-elektrode tips. Åbne pladser indikere forkert lokaliserede sonde-elektrode tips i dyr udelukket fra undersøgelsen (n = 3). Koronale hjernen skiver indeholdende sonder og optagelse websteder blev behandlet efter eksperimenter for histologiske analyse. Tallene ovenfor illustrationen viser afstanden fra Bregma (ifølge Pellegrino et al. 1979 atlas af rotte hjernen; næse bar + 5,0 mm, koordinerer anvendes: en-3.4 mm, L + 5,4 mm; P + 7.5 mm fra dura). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Analysand | c (μmol/l) | k | q | r2 | LOD (pmol/l) |
| Glutamat | 0,25-2,5 | 5.215 | 1043.79 | 0.999 | 19.4 |
| Aspartat | 0,25-2,5 | 2.258 | 1994.72 | 0.998 | 31,7 |
Tabel 1. Kvantificering Karakteristik af HPLC metode anvendes til bestemmelse af aminosyrer. Koncentration række standarder (c), hældning (k), skæring (q), determinationskoefficienten (r2) og detektionsgrænsen (LOD) beskriver kalibreringen observationsområder fremstillet med standard løsninger af glutamat og aspartat (0,25, 0,5, 1,0 og 2,5 µM ) og intern standard L-homoserine (2,5 µM) Brug den beskrevne HPLC-metode med spectrofluorometric påvisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde viser vi, hvordan en kontinuerlig video-EEG registrering kombineret med mikrodalyse kan udføres i en eksperimentel model af FLE. Video-EEG optagelse teknikker bruges til at korrekt diagnosticere de forskellige faser af sygdomsprogression i dyr og mikrodalyse teknik bruges til at beskrive de ændringer i glutamat udgivelse, der forekommer i tid (ingen ændringer er blevet fundet for aspartat i en tidligere offentliggjort undersøgelse2). Vi anbefaler brugen af en enkelt enhed/implantat til at udføre dem begge i hvert dyr grunde drøftet i indledningen.
Når det er muligt, bør radiotelemetry foretrukne tøjret systemer for kronisk EEG optagelse, da det minimerer interferens med adfærd og reducerer risiko for skade og lidelse for dyrene54. Men tøjret EEG optagelsen er meget billigere end telemetri.
I vores laboratorium bruger vi stik til EEG optagelse system og mikrodalyse slanger parallelt, således at ledninger og tubings er knyttet til to forskellige drejes. Dette er den mest kritiske spørgsmål for disse eksperimenter: ledninger og slanger tendens til at krydse ofte på grund af dyrets bevægelser. Derfor kan vi bruge stik og slanger længe nok til at lade dyret jagte sin egen hale (en adfærd, der er typisk observeret med kalium stimulation) eller falde ned og roll under generaliserede epileptiske anfald. Det er tilrådeligt at autorisere yderligere mikrodalyse cannulas indsat i deres vejledning af modeling ler, for at styrke deres kontakt med guide (undertiden, mikrodalyse cannulas er stødte mod væggene i buret under generaliserede anfald og kan slip ud). På den anden side er det tilrådeligt at holde slanger så kort som muligt for at minimere forsinkelser mellem neurokemiske tid og afhentningstidspunkt. Dette er især vigtigt, når samling perioder er korte. Generelt er mikrodalyse slanger skal være af tilstrækkelig længde og kapacitet til at sikre, at Prøvetagningstiden overstiger ikke tid mellem dialyse udtag og samling. Det konstateredes, at de opløste stoffer tilbøjelige til at diffuse mere mellem nogle stik, hvis slangen døde tid er overlegen i forhold til prøveudtagning sats55. Derfor bør den eksperimentelle døde tid/volumen af mikrodalyse slangen reduceret så meget som muligt og bestemt meget præcist for at korrelere neurochemistry data med dyrets adfærd. Endelig er det vigtigt at bemærke at både drejes og elektroder kombineret med kanyle for kombinerede EEG og mikrodalyse undersøgelser er kommercielt tilgængelige. Derfor, når det er muligt, oprette EEG system med mulighed for at udføre mikrodalyse eksperimenter.
De mindre anbefalinger er: (i) før du begynder enhver eksperiment, kontrollere, EEG optagelse system og/eller mikrodalyse oprettet fungerer korrekt og foretage fejlfinding af problemer; Vi foreslår, at det at have en reserve oprettet klar (en anden pumpe med sprøjter monteres og afsluttet af slangen fyldt med arbejde løsninger) Hvornår udfører forsøget, samt et tilstrækkeligt antal klar til at bruge mikrodalyse sonder til at ændre brudt dem; (ii) når du overfører dyr ind i orden EEG-mikrodalyse buret er det nyttigt at have en anden person bistå og starter erhvervelser; (iii) gøre sikker på, at kolonne og autosampler nåede de passende temperatur inden kromatografi; Derudover bruge standarder og konstruere kalibrering parceller inden enhver dialysat prøver er sprøjtet på kolonnen kromatografiske; (v) når nødvendigt, forsøge at udvikle den chromatografiske eller andre analytiske metode til at måle flere analysander på samme tid.
Ændringer i neurotransmission få konsekvenser i mange CNS lidelser (herunder epilepsi) og der har været en stor interesse i årtier at kvantificere disse ændringer under progression fra en sund til en syge fænotype. I dag, tillader kun et par teknikker måling af ændringer i neurotransmitter niveauer over dage eller måneder. Mikrodalyse er en af disse teknikker. I et stort antal sager, som der beskrives her, det er udført i frit flytte dyr og koblet til konventionelle offline analytiske assays som højtryksvæskekromatografi (HPLC) eller kapillær elektroforese (CE), med hvilket det når 5-30 min tidsmæssige opløsning31,56. Klart, disse dataindsamlingsintervaller afspejler ikke den hurtige neurotransmitter dynamics i nærheden af synapser, men kan være bekvemt for nogle langsigtede mikrodalyse applikationer (f.eks., udvikling af sygdom eller narkotika Effektstudier) som kræver kobling neurokemiske, EEG og adfærdsmæssige data. Men, andre undersøgelser er primært beskæftiger sig med måling af real-time eller tæt på real-time ændringer i neurotransmitter frigivelse. For disse, skal den mikrodalyse teknik raffineres øge hastigheden af prøveudtagning (derfor faldende prøve diskenheder). Faktisk, den klassiske mikrodalyse teknik er ofte kritiseret for sin fattige tidsmæssige (minutter) og rumlige opløsning (konventionelle sonden er meget større end den synaptiske kløft)9,21,56, 57. det er dog den masse følsomhed analysemetodens koblet til mikrodalyse hvad bestemmer mikrodalyse tidsopløsning (dvs., dets opløsning er lig med den tid at have nok prøve at blive opdaget af en analytisk teknik56). Således, når mikrodalyse producerer små mængder af prøver, skal følsomheden af kvantificering teknikker steg. Til dato, fulgt sådanne forbedringer i tidsmæssige opløsning af mikrodalyse teknik 3 forskellige linjer. En af disse er repræsenteret af miniaturisering af kolonnerne og/eller afsløring celler af klassiske HPLC metoder; Disse kaldes UHPLC (ultra-højtydende HPLC) teknikker og gør det muligt for at opnå 1-10 min gang resolution58,59,60. En anden metode er at koble en klassisk HPLC til massespektrometri (MS) eller tandem (MS/MS) for multiplex analyse af neurotransmittere i hjernen dialysates. Kombineret HPLC-MS assays har en fremragende følsomhed og nå om 1-5 min gang resolution56,61,62,63. En tredje linje forbedring findes i ændringer af kapillær elektroforese (CE). Hvis CE bruger laser induceret fluorescens påvisning (CE-LIFD), det giver mulighed for bestemmelse af submicromolar koncentrationen af forskellige neurotransmittere i nanoliter fraktioner opnået hvert 5 min55,64,65 eller endda på 10 s intervaller56. En klar fordel, der kommer fra UHPLCs eller avancerede CEs analytiske tilgange er, at prøveudtagningen kan ske frit flytte dyr, ikke at gå på kompromis eksperimenter spontan adfærd skal overholdes og analyseret. På den anden side er der metoder, der tillader hjernen dialysat prøveudtagning i endnu hundrede millisekunder tidsmæssige opløsning (fx enzym reaktor baseret on-line assays eller droplet samling af dialysat koblet til MS-metoder), men disse er typisk anvendes i behersket dyr66 eller under generel anæstesi67,68,69, ikke at tillade at par mikrodalyse med adfærdsmæssige undersøgelser.
Når man overvejer den næstvigtigste svaghed af mikrodalyse, dvs., relativt lav rumlige opløsning på grund af dimensionerne membran (ofte omkring 0,5 mm i diameter og 1-4 mm lang), et alternativ kan være microprobes udviklet med lav-flow push-pull prøveudtagning. Disse prober består af to silica kapillærer (af 20 µm ID og 200 µm OD) smeltet side-by-side og beklædt med en polymere slanger. Under eksperimentet, er disse kapillærer perfunderet på meget lav strømningshastigheder, sådan at væske er trukket ud af en kapillær og en prøve er hentet fra den anden på den samme strømningshastighed. Fordi Stikprøvetagning opstår kun på sonden tip, er den rumlige opløsning større end med sonden for mikrodalyse70. En anden mulighed er at skifte fra miniaturized sonder til mikroelektrode arrays (biosensorer) for real-time neurotransmitter evaluering. Forskellige elektrokemiske teknikker (baseret hovedsagelig på voltammetry eller amperometry) tillader analysand prøveudtagning synapse (micron skala) og i mindre end 1 s31,70,71. Disse enheder kan måle koncentrationen af flere analysander fra flere områder af hjernen. De kræver dog også nogle justeringer, for eksempel at undgå artefakter og en relativt hurtig forværring.
I betragtning af de seneste fremskridt i vivo neurokemiske overvågning, det forekommer sandsynligt, at de forskellige sender prøveudtagningsmetoder vil blive kombineret i én sensor i den nærmeste fremtid. Arbejde på microfabricated sonderne er allerede begyndt, og vi mener, at yderligere fremskridt inden for microfabrication teknologier sammen med analytiske fremskridt yderligere vil fremme i vivo neurokemiske overvågning undersøgelse. På dette tidspunkt, men forbliver den konventionelle mikrodalyse korreleret til EEG en gyldig metode til mange programmer, neuroscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Anna Binaschi, Paolo Roncon og Eleonora Palma for deres bidrag til manuskripter udgivet i forrang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml - tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm - gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml - diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
References
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
- Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
- Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
- Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
- Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
- Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
- Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
- Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
- Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
- Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
- Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
- Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
- Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
- Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
- Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
- Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
- Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
- Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
- Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
- Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
- Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
- Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
- Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
- Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
- Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
- Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
- Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
- Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
- Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
- Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
- Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
- Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
- Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
- Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
- Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
- Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
- Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
- Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
- Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
- Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
- Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
- Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
- Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
- Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
- Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
- Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
- Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
- Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
- Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
- Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
- Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
- Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
- Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
- Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
- Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).
