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Neuroscience

自由运动大鼠脑电图记录过程中兴奋氨基酸的微透析

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

在这里, 我们描述了一种方法, 在体内微透析分析天冬氨酸和谷氨酸释放在腹侧海马的癫痫和非癫痫大鼠, 结合脑电图记录。天冬氨酸和谷氨酸的细胞外浓度可能与疾病的不同阶段有关。

Abstract

微透析是一种成熟的神经科学技术, 它将扩散到大脑间质空间的神经质活性物质的变化与病理的行为和/或病理的具体结果 (如癫痫发作)联系起来。为癫痫)。在研究癫痫时, 微透析技术通常与短期甚至长期的视频脑电图 (eeg) 监测相结合, 以评估自发发作的频率、严重程度、进展和聚类。联合微透析-脑电图是在使用多种方法和仪器的基础上进行的。在这里, 我们进行了体内微透析和连续视频脑电图记录, 以监测谷氨酸和天冬氨酸流出随着时间的推移, 在不同阶段的自然历史癫痫在大鼠模型。这种组合方法允许将神经递质释放的变化与疾病发展和进展的特定阶段配对。采用液相色谱法测定透析液中氨基酸的浓度。在这里, 我们描述了方法, 并概述了一个人在体内微透析-脑电图应采取的主要预防措施, 特别注意立体定向手术, 基础和高钾刺激在微透析, 深度电极脑电图记录和高效液相色谱分析天冬氨酸和谷氨酸在透析液中。这种方法可以用来测试各种药物或疾病引起的大脑中天冬氨酸和谷氨酸的生理浓度的变化。根据适当的分析分析分析的可用性, 它可以进一步用于测试不同的可溶性分子时, 同时使用脑电图记录。

Introduction

为了深入了解谷氨酸介导的兴奋性和 gabap 抑制神经传递导致颞叶癫痫 (tle) 自发性癫痫发作的功能损害, 我们系统地监测了细胞外的浓度。gaba 1 及更高版本的谷氨酸和天冬氨酸2的水平, 通过微透析在大鼠的腹侧海马在疾病的自然过程的不同时间点,即在癫痫的发展和进展。我们利用大鼠的 tle 皮尔卡平模型, 在行为、电生理和组织病理学变化方面非常准确地模仿了这种疾病, 并将氨基的透析液浓度相关酸到其不同的阶段: 急性阶段后的癫痫侮辱, 潜伏期阶段, 第一次自发性发作的时间和慢性药物5,6, 7.通过长期的视频脑电图监测、精确的脑电图和自发性癫痫的临床特征, 确定了疾病阶段的框架。微透析技术与长期视频脑电图监测相关的应用使我们能够提出 tle 神经病理学的机械假设。总之, 本手稿中描述的技术允许将大脑区域内的神经化学改变与动物模型中癫痫的发展和进展配对。

配对装置由与微透析插管并列的深度电极组成, 经常用于癫痫研究, 在这些研究中, 神经递质、其代谢物或能量底物的变化应与神经元活动相关。在绝大多数情况下, 它被用于行为自由的动物, 但它也可以在人类以类似的方式进行,例如, 在手术前接受深度电极调查的药物耐药癫痫患者8。脑电图记录和透析液收集都可以单独进行 (例如, 将电极植入一个半球, 将微透析探针植入另一个半球, 甚至在一组动物中进行微透析在另一组动物中唯一的脑电图)。然而, 将电极耦合到探针可能有多重优点: 它简化了立体定向手术, 将组织损伤限制在一个半球 (同时保持另一个完整, 作为组织学研究的控制), 并将结果同质为这些是从相同的大脑区域和相同的动物中获得的。

另一方面, 耦合微透析探针电极装置的制备如果是自制的, 则需要技能和时间。如果从市场上购买, 人们可以花相对较高的钱。此外, 当微透析探针 (探针尖端通常直径 200-400μm, 7-12 毫米长)9和 eeg 电极 (电极尖端通常直径为 300-500μm, 长度足以达到感兴趣的大脑结构10时) 10 是耦合, 安装的设备代表一个笨重和相对沉重的物体在头部的一侧, 这是麻烦的动物和容易丢失, 特别是当它连接到透析泵和硬线脑电图记录系统。这一方面更相关的癫痫动物是困难的处理和较少适应微透析过程。适当的手术技术和适当的术后护理可以导致持久的植入物, 导致最小的动物不适, 应追求组合微透析-脑电图实验10,11, 12岁

微透析技术的优点和局限性已被许多神经科学家详细地综述。它比其他体内灌注技术 (例如, 快速流动推拉或皮质杯灌注) 的主要优势是探针的小直径, 涵盖了一个相对精确的感兴趣的区域13,14, 15岁第二, 微透析膜在组织和胚芽之间形成物理屏障;因此, 高分子量物质不交叉, 也不干扰分析16,17。此外, 组织被保护免受湍流流动的香水18。另一个重要的优点是有可能改变灌注流, 以最大限度地提高在热液中的分析物浓度 (即, 微透析的过程可以很好地定义数学, 并可以修改到产生高产量样品中分析物的浓度)19。最后, 该技术可用于将药物或药理活性物质注入感兴趣的组织, 并确定其在干预部位20的效果.另一方面, 与电化学或生物传感器相比, 微透析的解决时间有限 (由于采集样品所需的时间, 通常超过 1分钟);它是一种侵入性技术, 导致组织损伤;它破坏了膜周围空间内的神经化学平衡, 因为所有可溶性物质的连续浓度梯度与感兴趣的分析物一起进入香水。最后, 微透析技术受到用于对材料 9、21、22、23进行定量的分析技术的限制的高度影响..用邻苯二甲酯衍生后的高效液相色谱法 (hplc) 对生物样品中的谷氨酸和天冬氨酸进行分析, 得到了24,25,26的良好验证。,27及其广泛的讨论超出了本手稿的范围, 但将详细描述使用这种方法产生的数据。

当正确地进行, 而不修改的香水成分, 微透析可以提供可靠的信息, 神经递质释放的基础水平。基础水平的最大部分很可能是突触9的发射机溢出的结果.因为在许多情况下, 在额外的突触空间中对神经递质进行简单的取样不足以实现调查的目标, 所以微透析技术也可以用来刺激神经元或剥夺它们的重要作用生理离子, 如 k+或 ca2 +, 以唤起或防止神经递质的释放。

高 k+刺激经常用于神经生物学, 以刺激神经元的活动, 不仅在清醒的动物, 但也在初级和有机类型培养。健康的中枢神经系统暴露在高浓度 k+ (40-100 mm) 的溶液中, 会唤起神经递质28的流出.这种神经元在应对高 k+时提供额外释放的能力可能会在癫痫动物1和其他神经退行性疾病 29、30 中受到损害。同样, ca2 +剥夺 (通过灌注 ca2 +游离溶液获得) 被用来建立钙依赖释放的大多数神经递质测量微透析。一般认为 ca2 +依赖释放是神经元的起源, 而 ca2 +独立释放源于胶质细胞, 但许多研究对 ca2+敏感测量的含义引发了争议。谷氨酸或 gaba9: 因此, 如果可能的话, 最好支持微透析研究与微传感器研究, 因为后者具有较高的空间分辨率, 电极允许接近突触 31.

关于癫痫动物的微透析研究, 重要的是要强调的是, 从它们中的大多数获得的数据依赖于对癫痫发作的视频或视频脑电图监测,即由于异常而短暂出现体征和症状大脑中过度或同步的神经元活动 32。在准备实验时, 应考虑皮卡平治疗动物的电图癫痫发作的一些具体问题。自发性发作后, 伴随着抑郁活动, 脑电图间尖峰频繁, 在33,34组发生。sham 操作的非癫痫动物可能表现出类似癫痫发作的活动35 , 因此脑电图记录评估的参数应标准化36 , 如果可能, 微透析的时间应明确界定。最后, 我们强烈建议遵循国际抗癫痫协会和美国癫痫学会专家在其最近的报告中概述的控制成年啮齿类动物的视频脑电图监测的原则和方法标准37 ,38。

本文介绍了谷氨酸和天冬氨酸的微透析与癫痫动物的长期视频脑电图记录以及它们在透析液中的高效液相色谱分析。我们将强调议定书的关键步骤, 一个人应该注意, 以取得最好的结果。

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Protocol

所有实验程序都已由费拉拉大学动物护理和使用机构委员会和意大利卫生部根据欧洲共同体概述的准则批准 (授权: d. m. 246/ensen-b)1986年11月24日理事会指令 (86/609/EEC)。该方案是专门为谷氨酸和天冬氨酸的测定在脑电图控制下获得的癫痫大鼠和非癫痫大鼠微透析过程中的谷氨酸和天冬氨酸的测定而进行的。这里描述的许多材料可能很容易被你在实验室中用于脑电图记录或微透析的材料所取代。

1. 微透析探针电极装置的组装

  1. 使用3通道双扭曲电极 (注册电极的切割长度至少为20毫米, 接地电极长度为10厘米), 并将其与导向插管耦合以准备设备。参见图 1a-1b中用于透析的3通道电极和导插管的示例.
  2. 取出 (图 1c) 并在使用前将金属引导插管插入虚拟塑料插管几次, 以方便其在动物微透析探针开关时的拆卸。
  3. 将注册电极的扭曲电线弯曲两次 (图 1e-1f), 以便将电线与导轨的假插管对齐, 并将电极尖端 (图 1E) 切割为比导管尖端长0.5 毫米 (图 1. f)1h) 使用数字卡钳。
  4. 准备好1毫米长的硅圆环 (大径2毫米, 厚度0.3 毫米;图 1 i)并使用推子将导管的尖端和扭曲电极的尖端插入硅圆环 (图 1j)。用快速作用的聚合物胶或树脂将其固定在导轨插管基座的脚上 (图 1k)。请参见图 1l 和图 2 a中已完成设备的示例。
  5. 在杀菌紫外线下对设备进行灭菌 4小时. 翻转设备 4次, 使其两侧暴露在光线下1小时。
    注: 许多自制电极和微透析探头可能以类似的方式组装。上述大鼠植入物的头部有以下尺寸: 7 毫米宽度 x 5 毫米深度 x 10 毫米长度从顶部到基座脚趾;植入物尖端长约11毫米, 直径600微米, 所有设备的重量约为 330-360 毫克。如果 (一) 在手术中在头骨上留下足够长的接地电极供下次使用, (二) 动物被杀死时, 该装置与牙科水泥一起回收, 则该装置可再利用两三次, 留在丙酮过夜t, 使水泥可以机械地分类, 并使设备再次清洗和消毒。

2. 立体定向手术

  1. 按照无菌和无痛手术的当代标准, 使用立体定向装置和探头夹架 (图 2b) 进行设备植入, 遵循非菌性和无痛手术的当代标准 39、40、41。
    1. 用酮胺-威士忌 (43mg/kg 和 7mg/kg, ip.) 对成年 sprague-dawley 大鼠进行麻醉, 并将其固定在立体定向框架上。在最初的酮胺/木糖注射液中加入异氟醚麻醉 (空气中的 1.4%; 1.2 mL/min), 因为它可以及时控制麻醉深度。把毛沙头上。
  2. 用碘溶液擦拭头部皮肤表面, 然后采用70% 乙醇, 为无菌手术做好准备 39.
    1. 使用以下坐标将优先制备的导向插管电极装置 (1.1–1.5) 插入右腹侧海马体: 鼻杆 + 5.0 mm、a–3.4 毫米、l + 4.5 毫米、p + 6.5 mm 至 bregma1,2。遵循标准技术的立体定向手术10,11,12。
    2. 确保它不覆盖锚固螺钉。将其安装到立体定向装置上时, 抓住导向插管头的装置, 因为这可能很容易与探头支架对齐。
  3. 将设备固定在头骨上, 至少有四个不锈钢螺钉将其拧入颅骨骨 (1个螺钉插入左, 1个螺钉插入右额叶骨板, 1个螺钉固定到左顶骨板, 1个螺钉固定到顶叶骨板)。添加一滴组织胶, 以进一步固定每个螺丝到颅骨骨。
    1. 用甲基丙烯酸水泥覆盖一半的螺纹。促进水泥的结合, 在骨骼中制作浅沟槽, 以增加粘附。
  4. 一旦设备的尖端被定位到脑组织中, 将接地电极的电线绕在3个锚固螺钉周围。用牙科水泥覆盖所有安装的螺丝和设备 12、42、43.
  5. 在手术期间和手术后约1小时监测动物, 直到直立并在笼子周围移动。将它们放在加热垫上, 以避免体温过低。让老鼠在植入设备后至少恢复7天。
  6. 在手术后3天内, 每天至少监测一次动物是否有疼痛或疼痛的迹象。给动物服用抗生素霜 (庆大霉素 0.1%), 靠近切割部位, 以防止感染和镇痛 (曲马多 5 mg/kg, i. p.) 3天, 以防止手术后疼痛。

3. 皮尔卡平诱导黄土癫痫, 动物分配给实验群体

  1. 经过一周的术后恢复后, 随机将动物分配给组: (i) 控制接收车辆的动物和 (ii) 接收皮尔卡平的癫痫动物。使用更多的动物的癫痫组, 因为不是所有的皮尔卡平管理的大鼠会发展这种疾病。
  2. 在一次注射皮尔卡平 (350 mg kg, i. p.) 以诱发癫痫持续状态 (se) 后, 注射一剂甲基多巴胺 (1 mg/kg, s. c.) 和30分钟后。向对照大鼠注射甲基多巴胺和车辆 (盐水)。使用1毫升注射器与25g 针的所有 ip 管理。
    1. 检查视觉上的动物开始有行为癫痫发作 (移动跳过5分钟内, 点头, 克隆四肢) 和25分钟内连续克隆所有身体 (se)。
  3. 在发病后2小时内通过服用地西平 (20 mg/2 kg, i. p.) 将其停用, 使其死亡率约为 25%, 平均潜伏期约为10天。观察并记录皮尔卡平注射液后立即开始的任何癫痫发作行为, 并在注射后至少6小时继续。
  4. 给动物生理盐水 (1 毫升, i. p.) 使用1毫升注射器与25g 针和蔗糖溶液 (1 毫升, p. o.) 使用1毫升注射器和灵活喂养17g 针2-3天的 se 后, 以促进体重减轻的恢复。
    1. 排除在皮尔卡平 se 后的第一周内没有达到初始体重的动物 (除了在 se 之后24小时死亡的急性群体, 在那里体重随访是不可能的)。
  5. 将 se 后动物随机分配给不同的实验组 (图 3): 急性期 (微透析发生24小时后, se)、潜伏期 (se 之后 7-9)、第一次自发性发作 (在 se 之后约 11天) 和慢性期 (大约在 se 之后的22天开始, 即第一次发作后10天左右)。监测动物是否发生自发癫痫发作。
    请注意:在癫痫大鼠的进一步实验中采用以下包含/排除标准: 皮尔卡平给药后1小时内发生惊厥 se;在 se 之后的第一周体重增加, 微透析探针和电极的正确定位。

4. 癫痫行为监测与分析

  1. 癫痫行为的长期监测
    1. 在皮尔卡平给药后约 6小时 (即, 在研究人员直接观察结束时), 将动物放入干净的家庭笼子, 并开始24小时视频监控。
    2. 继续使用24小时视频监控, 直到第5天, 使用数字视频监控系统。
    3. 从第5天开始, 将家中长方形笼子里的老鼠连接到系好的脑电图记录系统, 并继续24小时视频监控。
    4. 设置位于法拉第笼外的放大器上的参数 (根据每个动物的脑电图信号的特异性在每个通道上设置放大因子), 并开始对未连接产生的脑电图信号进行脑电图采集电缆。使用采样率 200 hz 和低通滤波器设置为 0.5 hz。
    5. 将动物连接到将动物的头夹在一只手的两个伸出手指之间的电缆上, 用另一只自由的手将连接器拧下来。开始收购。
      注意事项:确保信号没有伪影。常见的文物是尖峰大大超过规模。
    6. 在微透析实验的前一天, 将动物转移到配备了有机玻璃圆筒进行微透析的连接脑电图系统中。断开动物与家庭笼子中的脑电图网络连接系统的连接, 在不约束动物的情况下将连接器从电极上拧紧。将动物放入高有机玻璃气瓶中。
  2. 在微透析前后一天监测癫痫行为
    1. 打开位于法拉第保持架外的放大器。打开脑电图软件。启动脑电图采集, 观察未连接电缆产生的脑电图信号。
    2. 将动物连接到系绳的脑电图记录系统, 将动物的头夹在一只手的两个伸展手指之间, 用另一只自由的手将连接器拧下来。根据单个动物的电极信号, 在放大器的每个通道上设置一个放大因子 (增益), 使脑电图信号处于尺度。让动物在研究人员的直接观察下, 探索新的笼子 (圆筒) 至少1小时。
    3. 注:在微透析实验前 24小时, 用异氟烷对大鼠进行短暂麻醉, 以便将引导插管转换为微透析探针。利用他们被麻醉的那一刻, 将他们连接到脑电图记录系统。
    4. 根据动物的商品缩短或延长下垂电缆。确保电缆不会干扰动物的运动和躺着姿势。
    5. 检查摄像机的正确图像帧。开始视频脑电图录制。
  3. 癫痫发作和脑电图活动的识别
    1. 使用软件播放器观看视频。滚动电影比实时播放快 8倍, 并个性化的全身癫痫发作 (见动物与前肢克隆人或动物饲养和下降与前肢克隆人)。放慢视频的速度, 注意行为癫痫发作开始和结束的确切时间。
    2. 通过计算在24小时视频记录中观察到的全身癫痫发作次数来处理数据, 并将其表示为24小时内观察到的所有癫痫发作的平均值。
    3. 将脑电图发作定义为高频 (& gt;5 hz) 的突发性活动周期, 其特征是基线上的 gt;3 倍振幅增量, 尖峰频率的进展至少持续 3秒2、44或相似28。使用脑电图软件处理原始脑电图记录。将脑电图轨迹拆分为1小时分数。将 eeg 跟踪分数复制到文件中, 以便进行软件自动尖峰分析。
    4. 利用脑电图软件和预定义参数 (4.3.3) 分析脑电图活动数据。在两名独立的调查人员中进行所有视频分析, 他们对被分析的动物群体进行盲人分析。如有分歧, 让他们一起重新审查数据, 以达成共识45。

5. 微透析

  1. 体外探针回收
    1. 根据制造商的说明准备探头首次使用, 并在其保护套中处理探头。
    2. 运行实验一式三份: 准备三个 1.5 ml 试管加载1毫升的林格溶液, 其中包含标准的混合物 (2.5μm 谷氨酸和2.5μm 天冬氨酸)。将三个加载的 1.5 ml 试管放入块加热器设置为 37°c, 并将其放置在搅拌器上。
      请注意:使用相同的标准解决方案进行色谱校准。
    3. 用石蜡膜密封 1.5 ml 试管, 用尖锐的推子刺穿, 使其直径约1毫米的孔。
    4. 取探头, 将其插入石蜡膜制成的孔中。将膜浸入溶液水平下至少2毫米。用石蜡膜将探头进一步固定到 1.5 ml 试管。
      注意事项:确保尖端不接触 1.5 ml 试管的墙壁。
    5. 使用 fep 管和管接头将探头入口连接到安装在输液泵上的注射器上。(可选) 使用 0.28 mm id 和 0.28 mm od 的细孔聚乙烯管和彩色管适配器 (红色和蓝色管适配器) 进行连接。
    6. 在2μlmmin 处启动泵, 让流体出现在出口尖端。使用 fep 管和管接头将探头插座连接到 0.2 ml 收集试管。
      请注意:所有连接都使用 fep 管。使用剃须刀刀片切割所需的管材长度。使用不同颜色的管接头进行探头的入口和出口。让泵运行 60分钟, 检查是否有泄漏和气泡。这些不应该存在。
    7. 将泵设置为流量 2μl/min, 并开始收集管道出口一侧的样品。
    8. 在 1.5 ml 试管中收集 3个30分钟的灌注样品和3个等量的溶液样品。使用浸入 1.5 ml 试管中的标准溶液中的微注射器, 每30分钟从 1.5 ml 试管中提取一次相同体积的样品。
    9. 重复实验 (5.1.1-5.1.8), 将泵设置为流量 3μlmmin (5.1.7), 以便在使用两种不同的灌注流量时进行探头恢复比较。
    10. 完成后, 停止泵, 用蒸馏水、70% 乙醇冲洗油管, 然后将空气推入其中。将探头存放在盛满干净蒸馏水的小瓶中。在储存前, 用蒸馏水将探头在2μlmmin 中彻底冲洗。
    11. 用色谱法分析样品中谷氨酸和天冬氨酸的浓度 (详见下文; 6.3)。
    12. 使用以下公式计算恢复:
      回收率 (%) = (c诚意透析溶液) x 100。
  2. 在自由移动的大鼠中进行微透析
    1. 制备程序: 探头插入和测试, 输液泵的设置和启动
      1. 根据制造商用户指南准备首次使用的微透析探头, 并将其填充响铃解决方案。切割约10厘米长的 fep 管材, 并使用不同颜色的管接头将其连接到探头的入口和出口插管。
      2. 确保管道接触到所有连接中没有死角的适配器。
      3. 5.2.1.3. 在微透析实验前 24小时, 用异氟醚 (5% 在空气中) 在诱导室对动物进行短暂麻醉, 直至卧式。用推子将假插管从导轨上取出, 紧紧地抓住动物的头部。将具有透析膜的微透析探针插入导管中, 并通过模拟粘土进一步坚定插入其导轨中的微透析插管。
        注意事项:提取时, 不要让探头接触保护探头套筒的墙壁。
      4. 把动物放入有机玻璃圆筒, 让它探索新的氛围。如上所述, 将动物连接到系带的脑电图记录系统 (按照4.2.2 点和 4.2.3)。
      5. 跟随醒着、自由移动的大鼠动作, 用带有林格液的钝的22g 针, 使用管接头将探头的入口连接到2.5 毫升注射器上。在探头内推步器溶液, 在10秒内喷射1毫升的林格溶液, 连续推动 2.5 ml 注射器的活塞。检查出口上是否出现了液体的滴。探头现在可以使用了。
      6. 用 ringer 溶液将用管接头连接到 fep 管的 2.5 ml 注射器填充, 并将其安装在输液泵上。以2μlp 分钟启动泵。让它一夜之间运行。
        请注意:使用所有 fep 管的所需长度, 但计算油管的死体积, 以了解何时应启动高 k+刺激, 并将定量数据与动物大脑中的神经化学变化相关联。使用在工作流下的管道中产生的气泡来计算这一次。
    2. 脑电图记录和钾刺激过程中的样本采集
      1. 验证样本采集 (视频脑电图记录) 开始前3小时内没有癫痫发作, 并继续监测微透析过程中的癫痫发作活动。
      2. 停止泵携带的 fep 管插管注射器充满了林格的解决方案。安装在泵上另一套 2.5 ml 注射器连接到 fep 管与管适配器充满了一个修改后的 ringer 的解决方案, 其中包含 100 mmk +解决方案。
      3. 启动泵在 2μlmin, 让它运行。为了更快速地灌装油管, 请将泵设置为5μlmmin 进行灌装。检查系统中是否没有气泡。确保管道接触到所有连接中没有死角的适配器。
      4. 如可在动物中使用, 请测试探头 (5.2.1.5)。
        请注意:如果由于某种原因, 探测器无法正常工作, 请将其更改。对于这些病例, 请在微透析-eeg 工作站附近准备使用一些准备好的微透析探针。将动物从脑电图电缆上断开, 并在必要时将其短暂麻醉, 以实现改变。
      5. 将充满林格溶液的注射器的 fep 管连接到每个动物的探头入口插管, 并等待出口尖端的液滴的出现。
      6. 将探头的出口连接到 fep 管, 从而在试管中收集探头。用穿孔帽将 fep 管材插入封闭的 0.2 ml 试管中。通过固定一块建模粘土, 确保管材停留在该位置。
      7. 继续以2μl/min 运行泵 60分钟, 而无需采集样品以平衡系统 (零样品)。
      8. 在基准条件下 (与正常林格溶液灌注), 连续采集5分钟透析液样品 (60μl 各自体积)。将样品存放在冰上。
      9. 计算液体从泵进入动物头部所需的时间 (这取决于油管的死体积,即气泡时间), 并切换从含有正常林格溶液的注射器到含有以下的注射器的 fep 管材修改 (100 mmk +) 林格的解决方案在这个时候, 而不停止泵。检查系统中是否没有气泡。让泵运行10分钟。
        注意事项:在10分钟的高 k+刺激, 动物往往移动自己疯狂, 通常提出大量的湿狗震动 (控制和癫痫发作集群动物) 或行为癫痫发作 (癫痫动物), 所以准备干预保护管道和电缆不被扭曲。
      10. 10分钟后, 将含有 100 mm k+ ringer 溶液的注射器中的注射器的油管切换到正常的 ringer 溶液中, 让泵运行。在溶液改变过程中, 不要关闭泵, 以便在要在线连接的管道末端会有一滴液体。
      11. 从透析液含有高钾的那一刻起,即在收集了第五次平衡后透析液后, 每隔 10分钟 (20μl) 收集透析液分数 1小时, 收集 3个30分钟的透析液样品并停止泵。把样品存放在冰上。
      12. 实验结束后将样品存放在-80°c, 直至 hplc 分析。
      13. 连续3天重复微透析实验, 但急性 (24小时) 和第一癫痫发作组除外, 其中只有一次微透析在 se 后24小时或第一次自发性癫痫发作后24小时内发生 (图 3)。
      14. 每次实验完成后, 用麻醉过量对动物进行安乐死, 并取出大脑进行探针和电极放置的验证。
  3. 微透析后的程序
    1. 用蒸馏水冲洗使用过的微透析探针, 并将其存放在盛满干净蒸馏水的小瓶中, 直到下一次使用。
      请注意:再利用的膜可能具有更高的渗透率;在重复使用探头之前, 请检查探头是否恢复。
    2. 用蒸馏水冲洗整个微透析装置 (油管、连接器和注射器), 然后用70% 的乙醇冲洗。将乙醇更换为空气, 并将设置存储在无菌环境中。
    3. 将基部透析液样品分成20μl 分数, 仅使用一个20μl 分数进行氨基酸基部浓度分析。将剩余的样品体积存放在-80°c, 以便进行进一步或确认性分析。
    4. 修复大脑中10% 福尔拉林, 并保存他们通过石蜡嵌入1。将大脑克隆成切片, 并用血红素和 eosin 染色。检查大脑是否有正确的探头和电极位置1,2。
      请注意:将大脑固定在冷却的 2-甲基丁烷中, 并将其存储在-80°c。在神经组织部分使用任何其他经过验证的染色, 以便将探针和电极道可视化。

6. 谷氨酸和天冬氨酸的色谱分析

  1. 衍生剂的制备
    1. 将相应体积 20:1 (v/v) 的邻邻二醛试剂 (opa) 和 2-硫醇 (5-me) 在小瓶中混合。使用瓶盖和气密隔膜关闭小瓶。
      注意事项:在化学引擎盖下工作。
    2. 将制备的溶液涡旋, 放入自动采样器中, 作为衍生剂的位置。
  2. 透析液样品的制备
    1. 将底部弹簧的玻璃插入物放入2毫升棕色自动采样器小瓶中。为在一个批次中测量的所有样品准备小瓶。
    2. 从-80°c 的冰柜中取出20μl 透析样品, 让它们熔化。去除液的 1μl, 并在样品的19μl 中加入1μl 的内部标准 (is) l------------------------------------------------------------------------------------将透析样品的液滴20μl 插入玻璃中, 然后用气密隔膜将其密封。
    3. 使用色谱软件将含有样品的小瓶放入自动采样器中, 将样品标记在其位置上。
  3. 样品色谱分析测定谷氨酸和天冬氨酸浓度
    1. 采用光谱法检测对液相色谱仪系统进行分析。在样品20:1 中加入20:1 的正交醛-硫醇 20:1 (v/v), 检测2分钟前柱衍生化后的氨基酸。
    2. 准备氨基酸分析系统。与计算机一起打开自动采样器、泵、脱气器、检测器和控制单元。
    3. 将虹吸管浸入含有流动相的瓶子中, 并清除色谱泵的通道, 用于分析。
    4. 开始增加流动相的流量, 检查柱上的压力 (例如, 从 0.2 mL/min 开始, 每5分钟增加0.2mlmmin 的流量, 直到达到工作流量)。让系统在工作流 0.8 mL/min 运行至少 1小时, 以平衡列。
      注意事项:不稳定的压力表示系统中存在空气。压力不应超过 25 mpa。
    5. 将探测器上的增益、高灵敏度以及激发和发射波长分别设置为 345/455 nm。重置检测器信号 (autozero)。
    6. 使用色谱软件, 将该方法发送到仪器。现在, 色谱仪应该已经准备好测量了。
    7. 在适当的色谱柱上分离透析样品、标准尖刺透析样品以及标准 (0.25μm-2.5 微米天冬氨酸和林格溶液中的谷氨酸)。校准色谱方法, 并在分析任何透析样品之前建立检测和定量限制。
    8. 激活单个分析或创建要使用色谱软件进行分析的样本序列, 然后运行序列。
      注意事项:在透析液样品序列中运行多个空白样品和不同的标准样品, 以控制方法的准确性。
    9. 一旦获得色谱图, 用色谱软件对其进行分析。检查兴趣峰值的集成到校准图中。使用峰值高度或峰值区域进行量化。
    10. 一旦样品记录完成, 用有机溶剂 (例如, 超纯水中的50% 乙腈) 填充色柱和系统, 以防止其老化和霉菌生长。
    11. 关闭系统。

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Representative Results

探头恢复

平均回收率 (即在小瓶溶液中的平均氨基酸含量占含量的百分比在小瓶溶液中的含量百分比) 为 15.49±0.42%, 流量为 2μl%, 在3μlp 的流量下为 6.32±0.64, 在流量率为2的情况下为14.89±0.36% 在使用铜叶膜探针时, 为天冬氨酸在3μl/min 时使用。如果使用聚丙烯腈膜探针, 平均回收率为 13.67±0.42%, 流量为 2μlmmin, 在3μlmin 下的平均回收率为 6.55±1.07. 在2μlp 的流速和3.3μlmmin 的流速下, 为 14.29±0.62% (图 4a-4b)。如图 4 a所示, 较慢的流速 (2μlmmin) 提高了两个探头的透析性能。在下面的实验中, 选择了 cu氟烷膜赋予的探针在流速为2μlmmin 的情况下灌注, 因为它的平均回收率较高 (即使没有显著), 在这个流速对两个分析物和实验连续性 (这些探针用于分析 gaba 的优先级 1)。

癫痫持续状态后癫痫发作的发展和进展

在本研究中使用的所有动物中, 都对癫痫发作进行了行为和脑电图监测, 以证实这些疾病的发展和进展。

用地西平3小时后中断的强抽搐 se, 发生在皮尔卡平注射后25±5分钟。然后, 所有的动物进入潜伏期, 他们显然很好, 他们不断的视频脑电图监测, 以核实没有发生自发发作在头 9天, 或确定第一次自发发作, 分别延迟和第一个癫痫发作组。第一次自发性发作发生在 se (平均±sem, n意义 21) 后的11.3±0.6 天。此后, 缉获量以集群形式发生, 并随着时间的推移而加重。在晚期慢性期 (se 之后的55-62 天), 癫痫大鼠每天经历3.3 ±1.2 (平均±sem, n=12) 全身性癫痫发作。这种疾病有明显的进展。许多, 但不是所有的脑电图发作, 对应于行为癫痫发作活动。图 5b显示了在行为发作之前和期间观察到的记录的阵发性癫痫样活动。图 5a显示了非癫痫大鼠的控制痕迹。

微透析、乳酸钾刺激谷氨酸释放中氨基酸的代表性基础值

慢性癫痫大鼠的基底谷氨酸浓度 (0.87±0.06μm) 明显高于对照动物 (0.59±0.03μm; p & lt; 0.05 vs. 对照; 单向方差和产后 dunnett 测试)。慢性癫痫 (0.31±0.04μm) 与非癫痫动物 (0.30±0.05μm) 在基部或高 k+诱发电位浓度中无统计学意义差异。有关详细信息2, 请参阅原始文章。对照大鼠中报告的谷氨酸的基本水平与其他研究中发现的水平一致 (即使用2μlmin 流量时的约0.75μm 和有效长度为2毫米的膜)46、47、48 , 49,50,51,52,53。然而, 许多不同的因素会影响微透析的结果, 例如探针的有效长度和膜的切断。

在控制大鼠中, 高 k+-诱发谷氨酸的额外释放约 30分钟, 在慢性癫痫大鼠中增加约 60分钟 (图 6)。有关详细信息2, 请参阅原始文章。从所描述的时间过程中可以看出, 微透析的10分钟时间分辨率足以捕捉两组动物在谷氨酸释放方面的差异。

高效液相色谱校准和限制

根据谷氨酸和天冬氨酸的标准溶液和内部标准 l-均向的校准曲线计算数据。在灌注剂中谷氨酸和天冬氨酸的神经递质浓度以绝对值 (μmomosl) 表示。每个校准图都是通过分析四种浓度水平 (每个浓度水平五个重复) 的谷氨酸和天冬氨酸溶液来构建的。为校准图计算了回归系数: y = kx + q, 其中 x 是天冬氨酸或谷氨酸与 l--均向的浓度比, y 是天冬氨酸或谷氨酸与 l--------------------------------------------------------------------------------------------使. (is)。计算了测定系数 (r2)。高效液相色谱法的适用性在一定范围内;定量的下限分别确定为标准校准曲线中的最低浓度, 定量的上限为用于校准的氨基酸分析物的最高浓度。还计算了检测极限 (lod)。表 1描述了其中的一些值。用上述方法获得的空白样品、标准样品和收集的透析样品的模型色谱显示在图 7中。

探头本地化

将微透析探针和记录电极植入右腹侧海马, 并对其正确位置进行了验证。只有那些在距离稳定坐标500μm 的地方最大植入的动物 (见图 8) 才被纳入分析。

Figure 1
图1。要植入的设备的分步准备.(a) 3 通道电极, 其保护套在左侧的保护套中, 有10厘米长的接地电极, 右侧引导插管进行微透析, 以组装设备。(b). 裸电极和导管的细节。第一步是取出 (c) 并插入 (d) 金属导管, 几次进入其塑料假体, 以缓解其释放, 一旦植入动物的头部。第二步是弯曲两次扭曲的注册电极, 以对齐透析引导插管 (e, f)。(g) 电极尖端应切割为比金属导管尖端长0.5 毫米。(h) 使用数字卡钳检查切割的精度。随后, 应使用约1毫米长的硅圆环固定电极的对齐方式, 以引导插管脚 (i)。(j) 显示如何环绕电极和引导插管轴的照片。最后一步是将一滴树脂或胶水放在导轨管座上, 将硅圈固定在导管基座上 (k)。(l) 组装设备, 准备消毒。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。用于植入这些装置的大鼠微透析脑电图的不同类型装置的照片 (a) 和用于植入这些装置的探针夹持有人 (b) 的照片.(a) 导轨插管 (绿色) 在实验前24小时被典型的微透析插管取代。设备的电气连接器 (左一, 用于本手稿中描述的录音) 允许将传导电信号的电线连接到放大器和数据收集设备。该装置经手术连接到麻醉大鼠的头骨上, 以后可在不给行为自由的大鼠造成疼痛或不适的情况下获得录音。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。实验设计.癫痫持续状态 (se) 诱导前一周, 老鼠被植入该装置。se 是由皮尔卡平和动物诱导的 (如果不是透析, 在 se 之后24小时杀死; 来自急性组的老鼠) 被视频监测 5天 (蓝线), 然后视频脑电图监测, 以评估其家庭笼子中的癫痫发作频率和持续时间 (绿线)。对于微透析实验, 癫痫和各自的非癫痫控制大鼠被转移到另一个脑电图设置配备了圆筒笼子在24小时前微透析会议和仍然视频 eeg 监测 (浅绿线)。垂直红线代表癫痫发展的不同时间点的透析过程。水平红线代表不同的癫痫动物群 (和各自的非癫痫动物), 箭头表示微透析的最后一天和动物死亡的那一天。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。两个透析探针的体外回收.平均在 (a) 2μlmmin 和 (b) 3μlmin 流量下, 使用两种不同的商业上可获得的微透析探针 (均为1毫米长的透析膜) 对天冬氨酸和谷氨酸进行体外回收 (%)。数据是3个独立实验的平均±sem, 有三重奏可选。各种探针的效率之间没有统计学上的显著差异 (学生的未配对 t 检验, p<0.05)。采用流量 2μl/min, 谷氨酸回收率比3μlmin 流量提高约 5%, 因此微透析实验采用了较慢的流速。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。在控制和癫痫大鼠的慢性阶段可以看到的来自副囊活动腹侧海马的脑电图记录。(a) 在两只接受盐水治疗的非癫痫大鼠身上记录了两种代表性痕迹。(b) 在两只癫痫大鼠身上记录的痕迹。癫痫样排出与这些大鼠的第3类行为发作相对应。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图6。钾刺激对大鼠海马谷氨酸释放影响的时间过程.在6个对照组 (开放圈) 和6例慢性癫痫大鼠 (黑眼圈) 进行微透析实验的有代表性的结果。该图显示了在微透析实验过程中和在高 100 mmk +刺激过程中, 谷氨酸谷氨酸浓度的时间变化。高 k+刺激 (10分钟) 的时间由图底部的黑条表示。数据是每组6只动物的方法± sem。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图7。色谱图的插图.已知峰值被标记。粉红痕迹: 从未共用胺的林格溶液色谱图 (空白样品)。蓝色痕迹: 透析液样品在衍生化后显示氨基酸峰值的色谱图: 天冬氨酸 (tr 4.80分钟)、谷氨酸 (tr 6.75分钟) 和谷氨酰胺 (tr 9.19 分钟) 和 is l---------------------------------------------------------r 9.83 分钟)。红色痕迹: 林格溶液中天冬氨酸 (2.5μm) 和谷氨酸 (2.5μm) 标准的色谱图。azure 和图片的黄色背景代表用于分析物洗脱的移动阶段 a (azure) 和移动阶段 b (黄色) 部分。一个红色的矩形指示区域 (tr 1041 分钟及更远) 显示未知物质和 opa 降解产物的峰值。所有注射量为20μl。导数以 0.8 mL/min 的流速分离,请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 8
图8。在腹侧海马内联合电极探针放置的代表性图像.(a) 照片详细显示了设备提示留下的恐慌 (黑色箭头)。(b) 12只大鼠植入腹侧海马内电极探针尖端位置示意图。实心正方形 (一些重叠) 表示正确的局部探针电极尖端。开放方块表示在排除在研究之外的动物中, 不正确地定位探针电极尖端 (n应从 3) 中排除。通过组织学分析实验, 对含有探针和记录部位的冠状脑切片进行了处理。上图上面的数字显示了与 bregma 的距离 (根据 pellegrino等人1979年的大鼠大脑地图集; 鼻条 + 5.0 毫米, 使用的坐标: a-3.4 毫米, L+5.4 毫米;p + 7.5 毫米, 离杜拉很远)。请点击这里查看此图的较大版本.

分析仪 c (μmol) K 问 r2 lod (pmol/l)
谷氨酸 0.25-2。5 5.215 1043.79 0.999 19。4
阿斯特拉特 0.25-2。5 2.258 1994.72 0.998 31。7

表1。高效液相色谱法测定氨基酸的定量特性。标准 (c)、斜率 (k)、截距 (q)、测定系数 (r 2) 和检测极限 (lod) 的浓度范围, 描述使用谷氨酸和天冬氨酸标准溶液 (0.25、0.5、1.0 和2.5 微米) 获得的校准图) 和内部标准 l---------------------------------------------------------------------

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Discussion

在这项工作中, 我们展示了如何连续的视频脑电图记录与微透析相结合, 可以在一个实验模型的 tle。视频脑电图记录技术用于正确诊断动物疾病进展的不同阶段, 微透析技术用于描述及时发生的谷氨酸释放的变化 (没有发现任何变化)在先前发表的研究报告中的天冬氨酸 2)。出于简介中讨论的原因, 我们强烈建议使用单个设备植入物在每种动物中同时执行它们。

只要有的话, 应该优先使用无线电测量系统, 而不是长期记录脑电图的系带系统, 因为它最大限度地减少了对行为的干扰, 并减少了动物的危害风险和困扰54。然而, 系带脑电图记录的成本远远低于遥测。

在我们的实验室中, 我们同时使用脑电图记录系统和微透析管的连接器, 这样电线和管管就会连接到两个不同的旋转器上。这是这些实验最关键的问题: 由于动物的运动, 电线和管道往往经常交叉。因此, 我们使用连接器和导管足够长的时间, 让动物追逐自己的尾巴 (这种行为, 通常观察到钾刺激) 或下降和滚动在全身癫痫发作。建议进一步坚定在他们的指南插入微透析插管通过建模黏土, 为了加强他们与指南的联络 (有时, 微透析插管被碰撞对笼子的墙壁在广义癫痫期间和可能滑落)。另一方面, 建议尽可能缩短管材, 最大限度地减少神经化学时间与收集时间之间的延迟。当收集周期较短时, 这一点尤其重要。一般来说, 微透析管的长度和能力应该足够, 以确保取样时间不超过透析出口和收集之间的时间。研究表明, 如果油管的死时间优于采样率55, 溶质往往会在某些插头之间扩散得更多。因此, 应尽可能地减少微透析管的实验死时间, 并非常精确地确定, 以便将神经化学数据与动物的行为联系起来。最后, 需要注意的是, 用于联合脑电图和微透析研究的旋转和电极加上插管都是可以在商业上获得的。因此, 只要有可能, 就建立脑电图系统, 并可选择进行微透析实验。

次要建议是: (i) 在开始任何实验之前, 检查脑电图记录系统和/或微透析设置是否正常运行, 并解决任何问题;我们建议在进行实验时, 准备好一个储备 (另一个泵, 用注射器安装在充满工作解决方案的管道上并完成), 以及足够数量的准备使用微透析探头来更换破损一个;(ii) 在将动物转移到工作的 eeg-微透析笼时, 由第二人协助并开始收购是有帮助的;(iii) 确保色谱前柱和自动取样器达到适当的温度;此外, 在色谱柱上注入任何透析液样品之前, 使用标准并构造校准图;(v) 在需要时, 尝试开发色谱或其他分析方法, 同时测量多种分析物。

神经传递的改变对许多中枢神经系统疾病 (包括癫痫) 都有影响, 几十年来, 人们非常关注在从健康表型发展到患病表型的过程中量化这些变化。如今, 只有少数技术可以测量几天或几个月来神经递质水平的变化。微透析是其中的一种技术。在许多情况下, 如这里所述, 它是在自由移动的动物中进行的, 并与传统的离线分析检测 (如高效液相色谱 (hplc) 或毛细管电泳 (ce), 它达到5-30最小时间分辨率 31,56。显然, 这些采样间隔并不反映突触附近的快速神经递质动态, 但可能会方便一些长期的微透析应用 (如疾病开发或药物效应研究), 而这些应用需要神经化学、脑电图和行为数据的耦合。然而, 其他研究主要涉及测量神经递质释放的实时或接近实时变化。对于这些, 必须改进微透析技术, 以提高采样速度 (从而减少样品量)。事实上, 经典的微透析技术经常被批评为其糟糕的时间 (分钟) 和空间分辨率 (传统的探针是远远大于突触裂隙)9,21, 56, 57. 然而, 决定微透析时间分辨率的是与微透析相结合的分析方法的质量敏感性 (即其分辨率等于有足够的样品可由分析检测所需的时间)。技术56)。因此, 当微透析产生少量样品时, 必须提高定量技术的灵敏度。迄今为止, 微透析技术在时间分辨率方面的这种改进遵循了3条不同的思路。其中一个表现为经典高效液相色谱法的柱和/或检测细胞的小型化;这些被称为 uhplc (超性能高效液相色谱) 技术, 并允许实现1-10 的时间分辨率58,59,60。另一种方法是将经典的高效液相色谱与质谱 (ms) 或串联 (msms) 结合, 对大脑透析器中的神经递质进行多重分析。联合 hplc-ms 检测具有出色的灵敏度, 达到约1-5 的时间分辨率56,61,62, 63.在毛细管电泳 (ce) 的修饰方面存在第三道改进。如果 ce 使用激光诱导荧光检测 (CE-LIFD), 则可以每 5分钟55、64、65测定纳米微组分中各种神经递质的亚冰体浓度甚至在 10秒间隔 56。uhplc 或先进的 ces 分析方法所产生的一个明显优势是, 采样可以在自由移动的动物中进行, 而不会损害必须观察和分析自发行为的实验。另一方面, 有一些方法允许大脑透析液采样在甚至100毫秒的时间分辨率 (例如,基于酶反应器在线检测或液滴收集的透析液结合到 ms 技术), 但这些都是通常用于受约束的动物66或全身麻醉67,68, 69, 不允许结合微透析与行为研究。

在考虑微透析的第二个最重要的弱点时,即由于膜尺寸 (通常直径约0.5 毫米, 长1-4 毫米), 空间分辨率相对较低, 另一种选择可能是低流量开发的微探针推拉采样。这些探头由两个硅毛细管 (20μm id 和 200μm od) 并排熔融, 并用聚合物管护套。在实验过程中, 这些毛细血管在很低的流量下被灌注, 这样液体就会从一个毛细管中抽出来, 在相同的流量下从另一个毛细血管中提取样本。由于采样仅发生在探针尖端, 因此空间分辨率大于用于微透析的探头70。另一种可能是从微型探测器切换到微电极阵列 (生物传感器) 进行实时神经递质评估。不同的电化学技术 (主要基于伏安法或安培计) 允许分析物取样非常接近突触 (微米刻度), 并在不到 1秒31,70,71。这些设备可以测量来自多个大脑区域的多个分析物的浓度。然而, 它们也需要一些改进, 例如, 以避免伪影和相对快速的恶化。

考虑到体内神经化学监测的最新进展, 在不久的将来, 不同的发射机采样方法似乎有可能被组合在一个传感器中。微制造取样探头的工作已经开始, 我们相信, 微制造技术的进一步进展加上分析进展, 将进一步促进体内神经化学监测调查。然而, 在这个时候, 传统的微透析与脑电图相关仍然是许多神经科学应用的有效方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者希望感谢 anna binaschi、paolo roncon 和 eleonora palma 对优先出版的手稿的贡献。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

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Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

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