Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Summary

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Abstract

Microdialisi sono una tecnica consolidata neuroscienze che correla le modifiche di neurologico attivi diffusione nello spazio interstiziale del cervello con il comportamento e/o con l'esito specifico di una patologia (ad es., crisi epilettiche per l'epilessia). Quando si studia l'epilessia, la tecnica della microdialisi è spesso combinata con a breve termine o addirittura a lungo termine dei video-elettroencefalografia (EEG) di monitoraggio per valutare la frequenza di grippaggio spontaneo, gravità, progressione e clustering. Il microdialysis-EEG combinato si basa sull'uso di diversi metodi e strumenti. Qui, abbiamo effettuato mediante microdialisi in vivo e continuo dei video-EEG registra a monitor di glutammato e aspartato di deflusso nel tempo, nelle diverse fasi della storia naturale dell'epilessia in un modello del ratto. Questo approccio combinato consente l'abbinamento delle modifiche nel rilascio del neurotrasmettitore con specifiche fasi della progressione e lo sviluppo della malattia. La concentrazione dell'amminoacido nel dializzato è stata determinata per cromatografia liquida. Qui, descriviamo il metodi e delineare le principali misure di precauzione uno dovrebbero prendere durante la microdialisi in vivo -EEG, con particolare attenzione alla chirurgia stereotassica, stimolazione basale e alto potassio durante microdialisi, profondità registrazione degli elettrodi EEG e analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni di aspartato e glutammato nel dializzato. Questo approccio può essere adattato per testare una varietà di droga o di malattia ha indotto cambiamenti delle concentrazioni fisiologiche di aspartato e glutammato nel cervello. A seconda della disponibilità di un appropriato test analitico, possono essere ulteriormente utilizzato per testare diverse molecole solubili quando si impiegano registrazione EEG allo stesso tempo.

Introduction

Per consentono di comprendere il danno funzionale di neurotrasmissione eccitatorio e GABAergic neurotrasmissione inibitoria conseguente crisi epilettiche spontanee nell'epilessia del lobo temporale (TLE), abbiamo monitorato sistematicamente concentrazioni extracellulari di GABA1 e successivamente i livelli di glutammato e aspartato2 mediante microdialisi nell'ippocampo ventrale dei ratti in vari momenti della malattia naturale corso, vale a dire, durante lo sviluppo e la progressione dell'epilessia. Abbiamo approfittato del modello Pilocarpina TLE in ratti, che imita la malattia con estrema precisione in termini di cambiamenti comportamentali, elettrofisiologici e istopatologico3,4 e abbiamo correlato la concentrazione del dializzato di aminoacidi acidi di sue diverse fasi: la fase acuta dopo l'insulto epilettogena, la fase di latenza, tempo del primo grippaggio spontaneo e la phass cronica5,6,7. Inquadrare le fasi di malattia è stato attivato dal controllo del video-EEG a lungo termine e preciso EEG e caratterizzazione clinica di crisi epilettiche spontanee. Applicazione della tecnica del microdialysis connesso con controllo video-EEG a lungo termine ci ha permesso di proporre ipotesi meccanicistiche per neuropatologia TLE. In sintesi, la tecnica descritta in questo manoscritto permette l'abbinamento delle alterazioni neurochimiche all'interno di un'area definita del cervello con lo sviluppo e la progressione dell'epilessia in un modello animale.

Dispositivi associati, costituiti da un elettrodo di profondità giustapposto a una cannula di microdialisi, sono spesso impiegati in studi di ricerca di epilessia dove cambiamenti in neurotrasmettitori, loro metaboliti o substrati di energia dovrebbero essere correlate all'attività neuronale. Nella maggior parte dei casi, viene utilizzato a comportarsi liberamente gli animali, ma può anche essere condotta in modo simile in esseri umani, per esempio, in pazienti epilettici farmaco-resistente in fase di indagine di elettrodo di profondità prima della chirurgia8. Registrazione EEG sia dializzato raccolta può essere eseguita separatamente (ad esempio, impiantare l'elettrodo in un emisfero e la microdialisi della sonda in altro emisfero o anche eseguendo il microdialysis in un gruppo di animali durante l'esecuzione il suola EEG in un altro gruppo di animali). Tuttavia, gli elettrodi di accoppiamento a sonde può avere molteplici vantaggi: esso semplifica la chirurgia stereotassica, limita il danno di tessuto a un solo emisfero (mentre l'altra, lasciando intatti, come un controllo per gli esami istologici) e omogeneizza i risultati come questi sono ottenuti dalla stessa regione del cervello e l'animale stesso.

D'altra parte, la preparazione del dispositivo accoppiato microdialysis sonda elettrodo richiede abilità e il tempo se è fatta in casa. Uno potrebbe spendere quantità relativamente elevate di denaro se acquistato dal mercato. Inoltre, quando la microdialisi sonde (punte della sonda sono in genere 200-400 µm di diametro e 7-12 mm di lunghezza) sono9e gli elettrodi EEG (elettrodi sono solitamente di 300-500 µm di diametro e abbastanza a lungo per raggiungere la struttura del cervello di interesse10) accoppiato, il dispositivo montato rappresenta un oggetto ingombrante e relativamente pesante su un lato della testa, che è fastidioso per gli animali e incline a essere perso specialmente quando è collegato alla pompa dialisi e il sistema di registrazione EEG di filo duro. Questo aspetto è più rilevante negli animali epilettici che sono difficili da gestire e meno adattivo per le sessioni di microdialysis. Tecniche chirurgiche adeguate e appropriate cure post-operatorie possono provocare gli impianti di lunga durata che causano disagio minimo animale e dovrebbero essere perseguiti per esperimenti di microdialisi combinatorio-EEG10,11, 12.

Vantaggi e limiti della tecnica microdialysis sono stati esaminati in dettaglio da molti neuroscienziati. Il suo vantaggio primario rispetto ad altre in vivo aspersione tecniche (ad es., flusso rapido push-pull o aspersione corticale tazza) è un piccolo diametro della sonda che copre una zona relativamente precisa di interesse13,14, 15. In secondo luogo, la membrana di microdialysis crea una barriera fisica tra il tessuto e il perfusato; Pertanto, sostanze di alto peso molecolare non attraversano e non interferire con le analisi16,17. Inoltre, il tessuto è protetta dal flusso turbolento del perfusato18. Un altro importante vantaggio è la possibilità di modificare il flusso di perfusato per massimizzare la concentrazione dell'analita nel perfusato (cioè, il processo di microdialysis può ben essere definito matematicamente e può essere modificato per alto rendimento concentrazione dell'analita nel campione)19. Infine, la tecnica può essere utilizzata per infondere i farmaci o sostanze farmacologicamente attive nel tessuto di interesse e determinare il loro effetto presso il sito di intervento20. D'altra parte, microdialisi ha un tempo di risoluzione limitata (in genere più di 1 min a causa del tempo necessario per la raccolta di campioni) rispetto ai sensori elettrochimici o biologici; è una tecnica invasiva che provoca danni ai tessuti; compromette l'equilibrio neurochimico all'interno dello spazio intorno alla membrana dovuto la pendenza di concentrazione continua di tutte le sostanze solubili che entra il perfusato insieme con l'analita di interesse. Infine, la tecnica della microdialisi è fortemente influenzata dai limiti delle tecniche analitiche utilizzate per la quantificazione di sostanze del perfusato9,21,22,23 . La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione con orthophthaldialdehyde per l'analisi di glutammato e aspartato in campioni biologici è stato convalidato ben24,25,26 , 27 e la sua vasta discussione è fuori della portata di questo manoscritto, ma i dati prodotti con questo metodo verranno descritti in dettaglio.

Quando eseguita correttamente e senza modifiche della composizione di perfusato, microdialisi è in grado di fornire informazioni attendibili circa i livelli basali del rilascio di neurotrasmettitore. La maggior parte dei livelli basali è probabilmente il risultato di spillover trasmettitore da sinapsi9. Perché in molti casi il campionamento semplice del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico extra non è sufficiente a perseguire gli obiettivi di un'inchiesta, la tecnica della microdialisi può essere impiegata anche per stimolare i neuroni o di privarli di importanti ioni fisiologici come K+ o Ca2 +, al fine di evocare o impedire il rilascio del neurotrasmettitore.

Alta K+ stimolazione viene spesso utilizzata in neurobiologia per stimolare l'attività neuronale non solo negli animali svegli, ma anche nelle colture primarie e organotipiche. L'esposizione di un sano sistema nervoso centrale a soluzioni con alte concentrazioni di K+ (40-100 mM) evoca l'efflusso di neurotrasmettitori28. Questa capacità dei neuroni di fornire una versione aggiuntiva in risposta ad alta K+ può essere compromessa in animali epilettici1 e in altre malattie di neurodegenerative29,30. Allo stesso modo, il Ca2 + privazione (ottenuta irrorando soluzioni Ca2 + libera) viene utilizzata per stabilire calcio-dipendente rilascio di neurotrasmettitori più misurati dal microdialysis. Si ritiene generalmente che il Ca2 + dipendente rilascio è di origine neuronale, considerando che il rilascio di Ca2 + indipendente proviene da cellule gliali, ma molti studi sollevato polemiche sopra il significato di Ca2 +-misure sensibili di es. glutammato o GABA9: così, se possibile, si consiglia di sostenere gli studi di microdialisi con microsensor studi, come questi ultimi hanno una più alta risoluzione spaziale e gli elettrodi consente di avvicinarsi alla sinapsi31.

Per quanto riguarda gli studi di microdialisi in animali epilettici, è importante sottolineare che i dati ottenuti dalla maggior parte di essi si basano su video o video-EEG monitoraggio dei grippaggi, cioè, dell'occorrenza transitoria di segni e/o i sintomi dovuto anormale sincrone o eccessiva attività neuronale nel cervello32. Ci sono alcune specifiche dei grippaggi elettrografici negli animali trattato Pilocarpina che dovrebbero essere considerati quando si prepara l'esperimento. Crisi epilettiche spontanee sono seguiti da attività depressa con frequenti punti interictal di EEG3 e si verificano in cluster33,34. Sham azionati non-epilettici animali possono esibire grippaggio-come attività35 e pertanto i parametri per la valutazione di registrazioni EEG dovrebbero essere standardizzato36 e, se possibile, i tempi di microdialysis sessioni dovrebbero essere ben definito. Infine, ti raccomandiamo vivamente di seguire i principi e le norme metodologiche per controllo del video-EEG in roditori adulti controllo delineato dagli esperti della International League Against Epilepsy e società americana di epilessia nei loro rapporti molto recenti37 ,38.

Qui, descriviamo il microdialysis del glutammato e aspartato in parallelo con le registrazioni video-EEG a lungo termine negli animali epilettici e la loro analisi nel dializzato da HPLC. Ci metterà in risalto i passaggi critici del protocollo che uno dovrebbe prendersi cura di per il miglior risultato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Università di Ferrara istituzionale Animal Care e uso Comitato e dal Ministero italiano della salute (autorizzazione: D.M. 246/2012-B) in conformità con le linee guida delineate nelle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Questo protocollo è specificamente regolato per la determinazione del glutammato e aspartato in dializzato di cervello di ratto ottenuti sotto controllo EEG delle sessioni di microdialisi in ratti epilettici e non-epilettici. Molti dei materiali descritti qui può essere facilmente sostituiti con quelli che si utilizza nel suo laboratorio per le registrazioni di EEG o microdialysis.

1. montaggio del dispositivo Microdialysis sonda elettrodo

  1. Utilizzare un elettrodo ritorto due 3 canali (con almeno un 20 mm lunghezza dell'elettrodo registrazione di taglio e un 10 cm lungo elettrodo di messa a terra) e abbinarlo a una cannula di guida per preparare il dispositivo. Vedere esempi della cannula elettrodo e guida a 3 canali per dialisi in Figura 1A-1B.
  2. Rimuovere (Figura 1) e inserire (Figura 1), la cannula di metallo guida nella cannula di plastica fittizia un paio di volte prima l'utilizzo al fine di facilitare la sua rimozione nel momento del suo interruttore per sonda per microdialisi in animale.
  3. Piegare i fili intrecciati di registrazione elettrodo due volte (Figura 1E-1F) al fine di allineare i fili con la cannula fittizio della guida e tagliare la punta dell'elettrodo (Figura 1) per essere 0,5 mm più la punta della cannula guida (Figura 1 H) utilizzando il calibro a corsoio digitale.
  4. Avere pronto il cerchietto di silicone lungo 1 mm (diametro esterno 2 mm, spessore 0,3 mm; Figura 1I) e inserire la punta della cannula guida e la punta degli elettrodi contorti del cerchietto di silicio con le pinzette (Figura 1J). Risolvere il problema sul piede della Guida piedistallo cannula con colla di polimero di resina (Figura 1 K) o un'azione rapida. Vedere l'esempio dei dispositivi completati nella Figura 1 L e Figura 2A.
  5. Sterilizzare il dispositivo sotto luce UV germicida per 4 h. Capovolgere il dispositivo quattro volte così come ciascuno dei suoi lati è esposto alla luce per 1 h.
    Nota: Molte sonde elettrodi e microdialisi fatti in casa possono essere montate in modo simile. La testa di sopra descritto impianto per ratti ha le seguenti dimensioni: larghezza 7 mm x 5 mm profondità x lunghezza 10 mm dall'alto verso il piedistallo punta; la punta dell'impianto è di circa 11 mm di lunghezza, 600 µm di diametro e tutto il dispositivo pesa circa 330-360 mg. Il dispositivo può essere riutilizzato due o tre volte se (i) una lunghezza sufficiente di elettrodo di terra è lasciata sul cranio durante la chirurgia per il successivo utilizzo e (ii) quando l'animale viene ucciso, e il dispositivo recuperato insieme con il cemento dentale è lasciato in acetone estaurate t, tale che il cemento può essere meccanicamente disaggregato, e il dispositivo lavati e sterilizzati nuovamente.

2. stereotassica chirurgia

  1. Utilizzare un stereotassiche apparato e sonda clip porta (Figura 2B) per l'impianto del dispositivo seguendo gli standard contemporanei per ambulatori asettica e indolore39,40,41.
    1. Anestetizzare i ratti Sprague-Dawley adulti con miscela di chetamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, i.p.) e fissarlo sul telaio stereotassica. Aggiungere anestesia isoflurano (1,4% nell'aria; 1,2 mL/min) a iniezione iniziale di chetamina/xilazina e permette di controllare la profondità dell'anestesia in tempo. Radere il pelo sulla testa dell'animale.
  2. Tampone di superficie della pelle di testa di soluzione a base di iodio seguita da etanolo al 70% per prepararla per chirurgia asettica39.
    1. Impiantare il dispositivo di cannula-elettrodo guida preparato in precedenza (1.1-1.5) nell'ippocampo ventrale destra utilizzando le seguenti coordinate: naso bar + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm a bregma1,2. Seguire le tecniche standard per interventi di chirurgia stereotassica10,11,12.
    2. Assicurarsi che non copre le viti di ancoraggio. Quando montarlo sul apparato stereotassica, afferrare il dispositivo per la testa della cannula guida come questo può essere facilmente allineato al titolare della sonda.
  3. Ancorare il dispositivo al cranio con almeno quattro viti inox avvitandoli nell'osso del cranio (1 vite nella vite di sinistra e 1 nelle piastre di osso frontale destro, 1 vite in parietale sinistra e 1 vite nelle piastre dell'osso interparietale). Aggiungere una goccia di colla del tessuto per fissare ulteriormente ogni vite all'osso del cranio.
    1. Coprire metà della filettatura della vite con cemento metacrilico. Promuovere l'associazione del cemento facendo scanalature poco profonde nell'osso per aumentare l'aderenza.
  4. Una volta che la punta del dispositivo viene posizionata nel tessuto cerebrale, torcere il filo dell'elettrodo di terra intorno alle 3 viti di ancoraggio. Coprire tutto montate, le viti e il dispositivo con il cemento dentale12,42,43.
  5. Monitorare gli animali durante l'intervento chirurgico e per circa 1 h da allora in poi fino al montante e lo spostamento intorno alla gabbia. Tenerli su un tappetino riscaldante per evitare l'ipotermia. Consentire i ratti a recuperare per almeno 7 giorni dopo l'impianto del dispositivo.
  6. Monitorare gli animali almeno una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per i segni di dolore o angoscia. Dare agli animali con la crema antibiotica (gentamicina 0,1%) vicino al sito inciso per prevenire l'infezione e un analgesico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) per 3 giorni evitare il dolore post-operatorio.

3. induzione di epilessia del lobo temporale di pilocarpina e assegnazione degli animali ai gruppi sperimentali

  1. Dopo una settimana di recupero post-chirurgico, assegnare gli animali casualmente ai gruppi: (i) controllo animali che ricevono gli animali veicolo e (ii) epilessia che riceveranno la pilocarpina. Uso un numero proporzionalmente superiore di animali per gruppo epilettico dal momento che non tutti la pilocarpina amministrato ratti svilupperà la malattia.
  2. Iniettare una dose di methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) e 30 minuti dopo, una singola iniezione di pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) per indurre il epilepticus di condizione (SE). Iniettare methylscopolamine e il veicolo (salino) per i ratti di controllo. Utilizzare siringa da 1 mL con ago da 25G per tutte le amministrazioni di i.p..
    1. Controllare visivamente gli animali per iniziare ad avere crisi epilettiche comportamentale (vibrissa entro 5 min, annuendo testa, clonazione degli arti in movimento) e a 25 min da duplicare continuamente tutto il corpo (SE).
  3. Arrestare il SE 2 h dopo l'inizio per avere una mortalità di circa il 25% e un periodo latente medio di circa 10 giorni dalla somministrazione di diazepam (20 mg/kg, i.p.). Osservare e registrare qualsiasi sequestro comportamento inizio immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina e continuare per almeno 6 ore da allora in poi.
  4. Dare le saline di animali (1ml, i.p.) usando la siringa da 1 mL con soluzione di ago e saccarosio 25G (1 mL, p.o.) utilizzando la siringa da 1 mL e ago 17G alimentazione flessibile per 2-3 giorni dopo SE per promuovere il recupero della perdita di peso corporeo.
    1. Escludere gli animali che non raggiungono il peso corporeo iniziale entro la prima settimana dopo Pilocarpina SE dallo studio (tranne che per il gruppo acuto ucciso 24 h dopo SE, dove il corpo peso follow-up non è possibile).
  5. Assegnare post-SE gli animali in modo casuale a diversi gruppi sperimentali (Figura 3): acuta di fase (dove il microdialysis avviene 24 ore dopo SE), latenza (7-9 giorni dopo SE), primo grippaggio spontaneo (circa 11 giorni dopo SE) e cronica (periodo inizia circa 22-24 giorni dopo SE, vale a dire circa 10 giorni dopo il primo sequestro). Monitorare gli animali per il verificarsi di crisi epilettiche spontanee.
    Nota: Utilizzare i seguenti criteri di inclusione/esclusione per ulteriori esperimenti in ratti epilettici: sviluppo di convulsiva SE entro 1 h dopo la somministrazione di Pilocarpina; aumento di peso nella prima settimana dopo il SE e il corretto posizionamento della sonda per microdialisi ed elettrodo.

4. analisi e monitoraggio del comportamento epilettico

  1. Monitoraggio a lungo termine del comportamento epilettico
    1. Circa 6 h dopo la somministrazione di pilocarpina (vale a dire, alla fine di osservazione diretta dai ricercatori), posizionare gli animali nelle gabbie casa pulita e avviare il monitoraggio video 24 h.
    2. Continuare il video 24h monitoraggio fino al giorno 5, utilizzando un sistema di videosorveglianza digitale.
    3. All'inizio della giornata 5, connettersi i ratti nelle loro gabbie rettangolari casa cablata sistema di registrazione EEG e continuare la sorveglianza video 24 h.
    4. Set di parametri dell'amplificatore, posizionato all'esterno la gabbia di Faraday (fattore di amplificazione impostato su ogni canale secondo la specificità del segnale EEG di ogni singolo animale) e l'acquisizione di inizio EEG osservando i segnali EEG generati dalla non connesso cavi. Uso campionamento frequenza 200 Hz e passa-basso filtro impostato a 0,5 Hz.
    5. Collegare l'animale ai cavi che tiene la testa di un animale tra allungate due dita di una mano e avvitamento verso il basso i connettori al piedistallo elettrodo con l'altra mano libera. Avviare l'acquisizione.
      Attenzione: Assicurarsi che il segnale sia privo di artefatti. Gli elementi comuni sono le punte che superano notevolmente la scala.
    6. Un giorno prima di sperimentano la microdialisi, trasferire gli animali nel sistema EEG tethered equipaggiato con cilindri in plexiglass per microdialisi. Scollegare gli animali da EEG tethering sistema in gabbia a casa strizzando i connettori dall'elettrodo senza frenare l'animale. Metti l'animale nei cilindri plexiglass alto.
  2. Monitoraggio del comportamento epilettico un giorno prima e durante la sessione di microdialisi
    1. Accendere l'amplificatore, posizionato all'esterno della gabbia di Faraday. Aprire il software di EEG. Avvia l'acquisizione di EEG osservando i segnali EEG prodotto da cavi non connessi.
    2. Collegare l'animale per il sistema di registrazione EEG tethered che tiene la testa di un animale tra allungate due dita di una mano e avvitamento verso il basso i connettori al piedistallo elettrodo con l'altra mano libera. Impostare un fattore di amplificazione (guadagno) su ogni canale dell'amplificatore secondo segnale elettrodo del singolo animale, quindi il segnale EEG è in scala. Lasciate che l'animale Esplora la nuova gabbia (cilindro) per almeno 1 h sotto l'osservazione diretta del ricercatore.
    3. Nota: 24 ore prima la microdialisi esperimento, i ratti sono brevemente anestetizzati con isoflurano per l'interruttore di cannule di guida alla sonda per microdialisi. Approfitta del momento quando essi sono anestetizzati per collegarli al sistema di registrazione EEG.
    4. Accorciare o prolungare il cavo pendulo secondo delle materie prime dell'animale. Assicurarsi che i cavi non interferiscano con i movimenti e la postura menzogne dell'animale.
    5. Controllare l'inquadratura corretta immagine delle telecamere. Avviare la registrazione video-EEG.
  3. Identificazione dei grippaggi e attività EEG
    1. Utilizzare un player software per guardare i video. Scorrere il film 8 volte più veloce rispetto al tempo reale giocando e individuare i grippaggi generalizzati (Vedi animale parte posteriore con il clonus arto anteriore o animale allevamento e cadere con il clonus zampa anteriore). Rallentare il video e annotare l'ora precisa dell'inizio e della fine del sequestro del comportamento.
    2. Processo i dati contando il numero dei grippaggi generalizzati osservato nella 24 ore di registrazioni video e di esprimere in termini di frequenza delle crisi e la durata come valori medi di tutti i sequestri osservati in 24h.
    3. Definire i grippaggi di EEG come i periodi di attività parossistica di alta frequenza (> 5 Hz) caratterizzata da un > incremento di ampiezza 3 volte rispetto al basale con la progressione della frequenza spike che dura da un minimo di 3 s2,44 o simile a28. Utilizzare software di EEG per elaborare le registrazioni di EEG grezze. Dividere le tracce di EEG in frazioni di 1 h. Copiare le frazioni di tracciato EEG per il file per l'analisi di software automatico spike.
    4. Analizzare i dati di attività EEG utilizzando software di EEG e parametri predefiniti (4.3.3.). Effettuare tutte le analisi dei video in due ricercatori indipendenti che sono ciechi per il gruppo di animali analizzati. In caso di divergenza, li rendono di riesaminare i dati insieme per raggiungere un consenso45.

5. microdialisi

  1. In vitro recupero sonda
    1. Preparare la sonda per il primo utilizzo secondo le istruzioni del produttore, la gestione in sua custodia protettiva.
    2. Eseguire l'esperimento in triplice copia: preparare tre provette da 1,5 mL caricarli con 1 mL di soluzione di Ringer contenente la miscela di standard (2,5 µM di glutammato) e 2,5 µM di aspartato. Mettere tre caricato 1,5 mL provette nel blocco riscaldatore set a 37 ° C e posizionarlo sull'agitatore.
      Nota: Utilizzare le stesse soluzioni standard per tarature di cromatografia.
    3. Sigillare le provette da 1,5 mL con la pellicola di paraffina e perforarla di pinzette taglienti per fare un buco di circa 1 mm di diametro.
    4. Prendere la sonda e inserirlo nel foro fatto nel film di paraffina. Immergere la membrana almeno 2 mm sotto il livello della soluzione. Difficoltà ulteriormente la sonda a 1,5 mL provetta da film di paraffina.
      Attenzione: Assicurarsi che la punta non tocchi le pareti della provetta da 1,5 mL.
    5. Collegare l'entrata della sonda alla siringa montata la pompa di infusione utilizzando adattatori FEP-tubi e tubazioni. Facoltativamente, utilizzare bene foro tubi politene di 0,28 mm ID e 0,61 mm OD e adattatori tubi colorati (rosso e blu della tubazione adattatori) per le connessioni.
    6. Avviare la pompa a 2 µ l/min e lasciare che il fluido appaiono all'estremità di uscita. Collegare l'uscita di sonda con 0,2 mL provetta usando adattatori FEP-tubi e tubi di raccolta.
      Nota: Utilizzare tubazione di FEP per tutte le connessioni. Tagliare alla lunghezza desiderata del tubo utilizzando una lama di rasoio. Utilizzare schede di tubi di diverso colore per ingresso e uscita della sonda. Lasciare la pompa esegue per 60 min. Check per perdite e bolle d'aria. Questi non dovrebbero essere presenti.
    7. Impostare la pompa per il portata 2 µ l/min e iniziare a raccogliere i campioni sul lato di uscita del tubo.
    8. Raccogliere tre campioni di perfusato 30 min e tre campioni di uguale volume della soluzione nella provetta da 1,5 mL. Prelevare i campioni di volume uguale dalla provetta da 1,5 mL ogni 30 min utilizzando la microsiringa immerso nella soluzione standard nella provetta da 1,5 mL.
    9. Ripetere l'esperimento (5.1.1-5.1.8) impostazione della pompa per la portata 3 µ l/min (5.1.7) per avere un confronto di recupero sonda quando si utilizzano due portate diverse di aspersione.
    10. Al termine, arrestare la pompa e sciacquare il tubo con acqua distillata, etanolo al 70% e spingere l'aria in esso. Conservare la sonda in un flacone riempito con acqua distillata. Sciacquare la sonda irrorando a 2 µ l/min di acqua distillata prima del deposito.
    11. Analizzare la concentrazione del glutammato e aspartato nei campioni di cromatografia (vedere i dettagli qui sotto; 6,3).
    12. Calcolare il recupero utilizzando la seguente equazione:
      Recupero (%) = (Cperfusato /Cdializzati soluzione) x 100.
  2. Sessioni di microdialisi in ratti liberi di muoversi
    1. Preparative procedure: inserimento della sonda e verifica, infusione pompa impostazione e avviare
      1. Preparare le sonde di microdialysis per il primo utilizzo secondo le istruzione del produttore e riempirli con soluzione di Ringer. Tagliare circa 10cm lunghi pezzi di FEP-tubazione e collegarle alle cannule di aspirazione e mandata della sonda utilizzando gli adattatori di tubi di colori diversi.
      2. Assicurarsi che il tubo tocca le schede senza spazio morto in tutte le connessioni.
      3. 5.2.1.3. 24 h prima dell'esperimento di microdialisi, brevemente anestetizzare l'animale con isoflurano (5% in aria) in una camera di induzione fino a recumbent. Rimuovere la cannula fittizia dalla sua guida con le pinzette e tenendo saldamente la testa dell'animale. Inserire la sonda per microdialisi, dotata di una membrana dialyzing, nella cannula guida e ditta ulteriormente le cannule di microdialysis inserite nella loro guida da argilla di modellistica.
        Attenzione: La sonda non devono toccare le pareti del manicotto protettivo sonda durante l'estrazione.
      4. Mettere l'animale nel cilindro in plexiglass e lasciarlo a esplorare il nuovo ambiente. Connettersi al sistema di registrazione EEG legato l'animale come descritto sopra (seguire i punti 4.2.2 e 4.2.3).
      5. Seguire la sveglio e liberi di muoversi movimenti di ratto e connettere l'ingresso della sonda alla siringa 2,5 mL con ago 22G blunted contenente soluzione di Ringer utilizzando gli adattatori di tubi. Spingere il lattato Ringer all'interno della sonda espulsione 1 mL di soluzione di Ringer in 10 s continuamente spingendo il pistone della siringa da 2,5 mL. Verifica per la goccia di liquido che appaiono sulla presa. La sonda è ora pronta per l'uso.
      6. Riempire le siringhe di 2,5 mL collegate alla tubazione di FEP da adattatori di tubi con soluzione di Ringer e montarli sulla pompa di infusione. Avviare la pompa a 2 µ l/min. Lasciar correre tutta la notte.
        Nota: Utilizzare la lunghezza desiderata del FEP-tubazione di tutto ma calcolare il volume morto della tubazione di sapere quando deve essere avviata la stimolazione di K+ alta e di correlare i dati di quantificazione con cambiamenti neurochimici nel cervello degli animali. Utilizzare la bolla d'aria creata nel tubo sotto il flusso di lavoro per calcolare questa volta.
    2. Raccolta dei campioni durante la stimolazione di potassio e registrazione EEG
      1. Verificare l'assenza di grippaggi in 3 ore che precedono l'inizio della raccolta del campione (registrazioni video-EEG) e continuare a monitorare l'attività di sequestro durante microdialysis.
      2. Fermare la pompa che trasportano le siringhe di FEP-tubazione cannulata riempite con soluzione di Ringer. Montare sulla pompa un altro set di siringhe da 2,5 mL collegato alla tubazione di FEP con tubi adattatori riempiti con soluzione di Ringer un modificato contenente 100 mM K+ soluzione.
      3. Avviare la pompa a 2 µ l/min e lasciar correre. Per il più rapido riempimento della tubazione, è necessario impostare la pompa a 5 µ l/min per il tempo di riempimento. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema. Assicurarsi che il tubo tocca le schede senza spazio morto in tutte le connessioni.
      4. La sonda di prova se pronto per l'uso in animali come descritto sopra (5.2.1.5).
        Nota: Se per qualche motivo la sonda non funziona, è necessario modificarlo. Per questi casi, mantenere alcuni preparati microdialysis sonde pronti per l'uso vicino alla workstation di microdialysis-EEG. Scollegare l'animale da EEG cavi e anestetizzare brevemente con isoflurano se necessario per realizzare il cambiamento.
      5. Collegare la tubazione di FEP di siringhe riempito con soluzione di Ringer per la cannula di aspirazione della sonda in ogni animale e attendere la comparsa della goccia del liquida sulla punta della presa.
      6. Collegare l'uscita della sonda con la tubazione di FEP, che conduce alla raccolta nella provetta. Inserire la tubazione di FEP nella provetta 0,2 mL chiuso con un tappo forato. Assicurarsi che il tubo rimanga nel posto di fissaggio con un pezzo di argilla di modellistica.
      7. Continuare a far funzionare la pompa a 2 µ l/min per 60 min senza raccogliere campioni per equilibrare il sistema (campione di zero).
      8. Raccogliere 5 campioni di dializzato consecutivi 30 min (60 µ l di rispettivi) sotto condizioni di base (perfusione con soluzione di Ringer lattato normale). Conservare i campioni su ghiaccio.
      9. Calcolare il tempo che necessario liquido per passare dalla pompa nella testa dell'animale (dipende dal volume morto di tubazione, vale a dire, tempo di bolla di aria) e passare la tubazione di FEP che va dalle siringhe contenenti la soluzione di Ringer lattato normale per siringhe contenenti modificato lattato (100 mM K+) Ringer in questo momento senza fermare la pompa. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema. Lasciare la pompa per 10 min.
        Attenzione: In 10 min di alta K+ stimolazione, gli animali tendono a muoversi se stessi freneticamente e di solito presentano un gran numero di cane bagnato scuote (controllo e fuori gli animali sequestro cluster) o comportamentali sequestri (animali epilettici), in modo da essere pronti ad intervenire per proteggere i tubi e i cavi da torsione.
      10. Dopo 10 minuti, passare il tubo dalle siringhe contenenti 100 mM K+ Ringer soluzione alla soluzione di Ringer lattato normale e far funzionare la pompa. Non spegnere la pompa durante i cambiamenti di soluzione affinché che ci sarà una goccia di liquido all'estremità del tubo per essere collegati in linea.
      11. Dal momento in cui il dialisato contiene alto potassio, vale a dire, dopo la raccolta del quinto post-equilibrazione del dializzato, raccogliere le frazioni del dializzato ogni 10 min (20 µ l) per i campioni del dializzato di 1 h. 3 raccogliere ulteriori 30 min e interrompere la pompa. Conservare i campioni su ghiaccio.
      12. Conservare i campioni a-80 ° C dopo l'esperimento fino all'analisi HPLC.
      13. Ripetere che il microdialysis sperimentare per 3 giorni consecutivi, ad eccezione del acuta (24h) e il primo gruppo di sequestro, in cui sola microdialysis sessione avviene 24h dopo SE o all'interno di 24 h dopo il primo grippaggio spontaneo (Figura 3).
      14. Al termine di ogni esperimento, eutanasia animale con un'overdose di anestetica e rimuovere il cervello per la verifica del posizionamento sonda e l'elettrodo.
  3. Procedure post-microdialisi
    1. Sciacquare le sonde usate microdialisi con acqua distillata e memorizzarli in un flacone riempito con acqua distillata fino all'utilizzo successivo.
      Nota: Le membrane riutilizzate possono avere maggior permeabilità; Verifica per il recupero della sonda prima dell'uso ripetuto.
    2. Sciacquare il microdialysis intero set up (tubi, connettori e siringhe) con acqua distillata seguita da etanolo al 70%. Sostituire etanolo con aria e archiviare il set di in un ambiente sterile.
    3. I campioni di dializzato basali si divise in 20 µ l e utilizzare un solo 20 µ l frazione per analisi concentrazione basale dell'amminoacido. Memorizzare il volume restante del campione per analisi ulteriore o di conferma a-80 ° C.
    4. Difficoltà i cervelli in formalina al 10% e preservarli dall'inclusione in paraffina1. Coronalmente sezione i cervelli a fette e li macchia con ematossilina ed eosina. Esaminare il cervello per sonda corretta e posizionamento elettrodo1,2.
      Nota: Difficoltà i cervelli in raffreddato 2-metilbutano e conservarli a-80 ° C. Utilizzare altri macchiatura provata sulle sezioni di tessuto nervoso che permette di visualizzare il tratto di sonda ed elettrodo.

6. gascromatografica di glutammato e aspartato

  1. Preparazione del derivatizzante agente
    1. Mescolare i rispettivi volumi 20:1 (v/v) di reagente orthophthaldialdehyde (OPA) e 2-mercaptoetanolo (5-ME) nel flaconcino. Chiudere la fiala utilizzando il setto stretto tappo e aria.
      Attenzione: Lavorare sotto cappa chimica.
    2. Vortice la soluzione preparata e metterla nell'autocampionatore nella posizione per derivatizzante agente.
  2. Preparazione dei campioni del dializzato
    1. Mettere l'inserto di vetro con molla inferiore nel flacone marrone autosampler 2 mL. Preparare i flaconi per tutti i campioni misurati in un unico batch.
    2. Prendere il 20 campioni di dialisi µ l dal congelatore a-80 ° C e farli sciogliere. Rimuovere 1 µ l della soluzione e aggiungere 1 µ l di standard interno (IS) L-omoserina (50 µM) a 19 µ l del campione, così il campione contiene 2,5 µM di IS. Pipettare 20 µ l del campione dialisi nell'inserto in flaconcino di vetro e sigillare con un setto di tenuta d'aria.
    3. Posizionare le fiale contenenti i campioni nell'autocampionatore utilizzando il software cromatografico per etichettare i campioni nelle loro posizioni.
  3. Analisi cromatografica dei campioni per determinare la concentrazione di glutammato e aspartato
    1. Eseguire le analisi sul sistema cromatografo liquido con rilevazione di spectrofluorometric. Rilevare gli aminoacidi dopo 2 min pre-colonna derivatizzazione con 20 μL di orthophthaldialdehyde/5-mercaptoetanolo 20:1 (v/v) aggiunto al 20 μL di campione.
    2. Preparare il sistema per l'analisi di amminoacidi. Accendere l'autocampionatore, la pompa, il degassificatore, il rilevatore e unità di controllo insieme al computer.
    3. Immergere i sifoni delle bottiglie contenenti la fase mobile e i canali della pompa deve essere utilizzato per l'analisi cromatografica di spurgo.
    4. Iniziare ad aumentare il flusso della fase mobile controllando la pressione sulla colonna (ad esempio, iniziare a 0,2 mL/min e aumentare il flusso per ulteriori 0,2 mL/min ogni 5 min fino a raggiungere il flusso di lavoro). Lasciate che il sistema corre al lavoro flusso 0,8 mL/min per almeno 1 h equilibrare la colonna.
      Attenzione: Pressione instabile indica la presenza di aria nel sistema. La pressione non deve superare 25 MPa.
    5. Impostare il guadagno, alta sensibilità e le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sul rilevatore di 345/455 nm rispettivamente. Reimpostare il segnale del rivelatore (AUTOZERO).
    6. Utilizzando il software cromatografico, il metodo send allo strumento. Ora, il cromatografo dovrebbe essere pronto a misurare.
    7. Separare i campioni del dializzato, standard a spillo campioni di dializzato, nonché standard (0,25 µM – 2,5 µM aspartato e glutammato in soluzione di Ringer) sulla colonna cromatografica appropriata. Calibrare il metodo cromatografico e stabilire i limiti di rilevazione e quantificazione prima di qualsiasi analisi di campioni di dialisi.
    8. Attivare l'analisi singola o creare la sequenza dei campioni da analizzare utilizzando il software di cromatografia ed eseguire la sequenza.
      Attenzione: Eseguire più di un campione in bianco e diversi campioni standard all'interno della sequenza di campioni del dializzato al fine di controllare l'accuratezza del metodo.
    9. Una volta acquisiti i cromatogrammi, analizzarli con il software di cromatografia. Verifica l'integrazione dei picchi dell'interesse la trama di calibrazione. Utilizzare area di altezza o picco picco per la quantificazione.
    10. Una volta terminata la registrazione di esempio riempire la colonna e il sistema con un solvente organico (ad es., 50% acetonitrile in acqua ultrapura) per prevenire l'invecchiamento e muffa nella crescita in esso.
    11. Arrestare il sistema.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Recupero della sonda

Il recupero medio (cioè, il contenuto medio dell'amminoacido nel perfusato come percentuale del contenuto in un volume uguale di soluzione flaconcino) era 15.49 ± 0,42% ad una portata di 2 μL/min e 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min per il glutammato e 14.89 ± 0,36% ad una portata di 2 ΜL/min e 10.13 ± 0.51 a 3 μL/min per aspartato quando si utilizza la sonda di membrana cuprophane. Se si utilizza la sonda di membrana polyacrylonitrile, il recupero medio era 13.67 ± 0,42% ad una portata di 2 μL/min e 6,55 ± 1.07 a 3 μL/min per il glutammato e 14,29 ± 0.62% ad una portata di 2 μL/min e 8,49 ± 0.15 a 3 μL/min per aspartato (Figura 4A-4B). Come si può chiaramente vedere in Figura 4A, il più lento tasso di flusso (2 μL/min) migliora le prestazioni dialyzing di entrambe le sonde. Per i seguenti esperimenti la sonda di membrana dotata di cuprophane irrorata a un portata 2 μL/min è stato scelto, perché il recupero medio era più alto (anche se non significativamente) questa portata per entrambi analiti e a causa della continuità sperimentale (queste sonde sono stati utilizzati per l'analisi di GABA in precedenza1).

I grippaggi sviluppo e progressione della malattia dopo il epilepticus di condizione

Il comportamentale e monitoraggio EEG delle crisi epilettiche, la loro valutazione, è stato fatto in tutti gli animali impiegati in questo studio per confermare lo sviluppo e la progressione della malattia TLE in questi.

La robusta SE convulsiva, che è stata interrotta dopo 3 h usando diazepam, si è verificato 25±5 min dopo l'iniezione di pilocarpina. Quindi, tutti gli animali entra in uno stato di latenza in cui erano apparentemente bene e sono stati costantemente monitorati al fine di verificare che si è verificato nessun grippaggio spontaneo nei primi 9 giorni o per identificare il primo grippaggio spontaneo, rispettivamente per video-EEG la latenza e il primo gruppo di sequestro. Il primo grippaggio spontaneo accaduto 11,3 ± 0,6 giorni dopo SE (media ± SEM, n = 21). Da allora in poi, convulsioni si è verificato in grappoli e aggravata nel tempo. Nella fase cronica tarda (giorni 55-62 dopo SE) i ratti epilettici sperimentato 3.3±1.2 (media ± SEM, n = 12) i grippaggi generalizzati al giorno. C'era una chiara progressione della malattia. Molti, ma non tutti i grippaggi di EEG, corrispondeva con crisi comportamentale. Figura 5B Mostra l'attività epileptiform parossistica registrato che è stato osservato circa 500 ms, prima e durante i grippaggi del comportamento. Figura 5A Mostra tracce di controllo in ratti non-epilettici.

Valori rappresentativi basali di aminoacidi presenti in potassio e microdialisi perfusato ha stimolato il rilascio di glutammato

Concentrazione di glutammato basale trovato in ratti epilettici cronici (0,87 µM ± 0,06) era significativamente superiore negli animali di controllo (0,59 ± 0.03 µM; p < 0.05 vs controlli; One-way ANOVA e di post-hoc Dunnett prova). Non c'era differenza statisticamente significativa tra epilessia cronica (0.31 ± 0,04 µM) e concentrazioni di animali non-epilettici (0.30 ± 0,05 µM) in basale o alta K+ evocati aspartato. Vedere l'articolo originale per dettagli2. I livelli di glutammato nel controllo ratti sono in linea con quelli trovati da altri in simili riferiti basali studia (vale a dire, circa 0,75 µM quando si utilizza un flusso di 2 µ l/min e membrane della lunghezza effettiva di 2 mm)46,47,48 ,49,50,51,52,53. Tuttavia, diversi fattori possono influenzare i risultati di microdialisi, ad esempio la lunghezza effettiva della sonda e la membrana tagliato fuori.

Alta K+-evocato un ulteriore rilascio di glutammato per circa 30 min nei ratti di controllo e per circa 60 min in ratti epilettici cronici (Figura 6). Vedere l'articolo originale per dettagli2. Può essere visto dal corso tempo raffigurati, la risoluzione di tempo di 10 min di microdialysis è stato sufficiente per acquisire le varianze nel rilascio di glutammato trovato in entrambi i gruppi di animali.

Limiti e calibrazione di HPLC

I dati sono stati calcolati curve di taratura ottenute con soluzioni standard di glutammato e aspartato e la L-omoserina standard interna. La concentrazione dei neurotrasmettitori glutammato e aspartato nel perfusati è stato espresso in valori assoluti (µmol/L). Ogni trama di calibrazione è stato costruito da analisi di soluzioni di glutammato e aspartato a quattro livelli di concentrazione (cinque replica a ogni livello). Coefficienti di regressione sono stati calcolati per le trame di calibrazione: y = kx + q, dove x è il rapporto di concentrazione di aspartato o glutammato per L-omoserina (IS) e y è stato il rapporto tra area del picco corrispondente aspartato o glutammato a (L-omoserina È). È stato calcolato il coefficiente di determinazione (r2). L'applicabilità del metodo HPLC era entro i limiti; il limite inferiore di quantificazione è stato determinato come la più bassa concentrazione nella curva di taratura standard e il limite di quantificazione come la più alta concentrazione usata di analiti di aminoacido per la calibrazione, rispettivamente. Limite di rilevabilità (LOD) inoltre è stato calcolato. Alcuni di questi valori sono delineati nella tabella 1. Un cromatogramma di modello del campione in bianco, standard campione e raccolti dialisi campione ottenuto con sopra metodo descritto sono mostrati nella Figura 7.

Localizzazione della sonda

Microdialisi sonda e l'elettrodo di registrazione sono stati impiantati nell'ippocampo ventrale destra e assicurarne il posizionamento corretto è stato verificato. Soltanto gli animali dove l'impianto era al massimo a 500 μm distanti dalle coordinate stabilizzate (Vedi Figura 8) sono stati inclusi nell'analisi.

Figure 1
Figura 1. Preparazione dettagliata del dispositivo per essere impiantati. (A) 3-canale elettrodo con 10cm lungo elettrodo di messa a terra in sua custodia protettiva sulla cannula sinistra e guida per microdialisi sulla destra necessario per assemblare il dispositivo. (B). la cannula elettrodo e Guida nuda in dettaglio. Il primo passo è quello di rimuovere (C) e inserire facilità (D) la cannula di metallo guida da e nella sua plastica fittizio poche volte al suo rilascio una volta impiantato nella testa dell'animale. Il secondo passo è quello di piegare due volte l'elettrodo di registrazione contorto per essere allineati alla cannula di guida di dialisi (E, F). (G) la punta dell'elettrodo deve essere tagliata per essere 0,5 mm più la punta della cannula guida metallica. (H) verificare la precisione del taglio utilizzando il calibro a corsoio digitale. Successivamente, circa 1 mm cerchietto lungo in silicone deve essere utilizzato per correggere l'allineamento dell'elettrodo per guidare il piede di cannula (I). (J) la fotografia che Mostra come anello l'elettrodo e guida albero cannula. Il passo finale è quello di mettere una goccia di resina o colla sul basamento cannula guida fissaggio il cerchietto di silicio ad esso (K). (L) dispositivo assemblato pronto per essere sterilizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Fotografie di diversi tipi di dispositivi per microdialisi-EEG nei ratti e usato (A) e la fotografia del titolare clip sonda (B) usato per l'impianto di questi dispositivi. (A) la cannula di guida (in verde) è sostituita da una cannula di microdialysis in genere 24 h prima dell'esperimento. Il connettore elettrico del dispositivo (prima a sinistra è stata utilizzata per le registrazioni descritte in questo manoscritto) permette il collegamento di cavi che conducono il segnale elettrico per attrezzature di raccolta dati e amplificatore. Il dispositivo è chirurgicamente attaccato al cranio di ratti anestetizzati e le registrazioni possono essere ottenute più tardi senza causare dolore o disagio a comportarsi liberamente ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Disegno sperimentale. La settimana prima di induzione di stato epilettico (SE), i ratti sono impiantati con il dispositivo. SE è indotta da pilocarpina e animali (se non dializzati e ucciso a 24 h dopo SE; i ratti dal gruppo acuto) sono video monitorati per 5 giorni (linea blu), poi dei video-EEG monitorati per valutare la frequenza delle crisi e la durata nelle loro gabbie casa (linea verde). Per l'esperimento di microdialisi, il controllo di non-epilettici epilettico e rispettivo ratti vengono trasferiti a un altro EEG impostare attrezzata con gabbie di cilindro in 24h prima della sessione di microdialisi e ancora video-EEG monitorato (linea verde). Le linee verticali rosse rappresentano le sessioni di dialisi a diversi intervalli di tempo di sviluppo della malattia epilettica. Le linee rosse orizzontali rappresentano i diversi gruppi di animali epilettici (e rispettivi animali non-epilettici), dove la freccia indica l'ultimo giorno della microdialisi e il giorno della morte dell'animale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Nella figura 4. Recupero in vitro di due sonde dialisi. Dire in vitro recupero (%) di aspartato e glutammato utilizzando due diverse sonde di microdialysis commercialmente disponibili (entrambi dotati di membrana di dialisi a lungo di 1 mm) a (A) 2 μL/min e (B) 3 µ l/min di portata. I dati sono la media ± SEM di 3 esperimenti indipendenti eseguite in triplici copie. Non ci sono differenze statisticamente significative tra l'efficienza delle varie sonde (studente di spaiati t-prova, p < 0,05). Utilizzando un portata 2 μL/min che il recupero di glutammato aumentato di circa il 5% rispetto al 3 µ l/min di portata, così il tasso di flusso più lento è stato utilizzato per esperimenti di microdialisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Le registrazioni di EEG illustrative dall'ippocampo ventrale di attività paraoxystic come può essere visto in fase cronica in ratti controllo ed epilessia. (A) rappresentante due tracce registrate in ratti non-epilettici salini due trattati. (B) le tracce registrate in due ratti epilettici. Scarichi epileptiform corrispondono con i grippaggi del comportamento di classe 3 in questi ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Corso di tempo dell'effetto di stimolazione di potassio sul rilascio di glutammato da ippocampo del ratto. Risultato rappresentativo dell'esperimento microdialysis esibito in 6 controllo (cerchi aperti) e 6 ratti epilettici cronici (cerchi neri). Il grafico mostra le variazioni temporali della concentrazione di glutammato del dializzato nel corso di esperimenti di microdialisi e durante la stimolazione K+ altezza 100 mM. Il tempo di stimolo di alta K+ (10 min) è indicato con la barra nera sulla parte inferiore del grafico. I dati sono il mezzo ± SEM di 6 animali per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Illustrazione di cromatogrammi. Cime note sono etichettati. Tracce rosa: cromatogramma della soluzione di Ringer senza ammine intenzionalmente aggiunto dopo derivatizzazione OPA/5-ME (campione in bianco). Blu traccia: cromatogramma del campione del dializzato dopo derivatizzazione mostrando le vette degli aminoacidi: aspartato (tR min 4,80), glutammato (tR min 6,75) e glutamina (tR min 9,19) e il picco di IS L-omoserina (2,5 µM, tempo di ritenzione, t R 9,83 min). Traccia rossa: cromatogramma di standard di aspartato (2,5 µM) e glutammato (2,5 µM) in soluzione di Ringer. Fondo azzurro e giallo degli stand foto per fase mobile A (azure) e mobile fase parte B (giallo) utilizzata per l'eluizione di analiti. Un rettangolo rosso indicato zona (tR 10,41 min e ulteriormente) Mostra i picchi di sostanze sconosciute e prodotti di degradazione di OPA. Tutti i volumi di iniezione erano 20 µ l. I derivati sono stati separati ad una portata di 0,8 mL/min Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Immagine rappresentativa di posizionamento elettrodo-sonda combinata all'interno dell'ippocampo ventrale. (A) fotografia mostra lo spavento a sinistra con la punta del dispositivo in dettaglio (freccia nera). (B) schematica illustrazione delle posizioni di punta di elettrodo-sonda all'interno dell'ippocampo ventrale impiantato di 12 ratti. I quadrati pieni (qualche sovrapposizione) indicano suggerimenti correttamente localizzata sonda elettrodo. Piazze aperte indicano suggerimenti erroneamente localizzata sonda elettrodo in animali esclusi dallo studio (n = 3). Fette della corona del cervello contenenti sonde e registrazione siti sono stati elaborati dopo gli esperimenti per l'analisi istologica. I numeri sopra l'illustrazione mostrano la distanza dal Bregma (secondo Pellegrino et al. 1979 Atlante del cervello del ratto; naso bar + 5,0 mm, coordina impiegate: A-3,40 mm, L + 5,4 mm; P + 7,5 mm dal dura). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analita c (μmol/l) k q r2 LOD (pmol/l)
Glutammato 0.25-2.5 5,215 1043.79 0,999 19,4
Aspartato 0.25-2.5 2,258 1994.72 0,998 31,7

Tabella 1. Caratteristiche di quantificazione del metodo HPLC utilizzato per la determinazione degli amminoacidi. Concentrazione terreni gamma di standard (c), pendenza (k), intercetta (q), coefficiente di determinazione (r2) e limite di rilevabilità (LOD) che descrive la taratura ottenuta con soluzioni standard di glutammato e aspartato (0,25, 0,5, 1,0 e 2,5 µM ) e L-omoserina standard interna (2,5 µM) utilizzando il metodo descritto di HPLC con rilevazione di spectrofluorometric.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo lavoro, vi mostriamo come una registrazione video-EEG continua accoppiata con microdialisi può essere eseguita in un modello sperimentale di TLE. Vengono utilizzate tecniche di registrazione video-EEG per diagnosticare correttamente le diverse fasi di progressione della malattia negli animali e la tecnica della microdialisi è usata per descrivere i cambiamenti nel rilascio di glutammato che si verificano nel tempo (i cambiamenti non sono stati trovati per aspartato in un studio precedentemente pubblicato2). Si consiglia l'uso di un singolo dispositivo/impianto per eseguire tali operazioni sia in ogni animale per i motivi discussi nell'introduzione.

Ogni volta che è disponibile, radiotelemetria dovrebbe essere preferito a sistemi tethered per registrazione EEG cronica quanto riduce al minimo le interferenze con comportamento e riduce il rischio di danno e sofferenza per gli animali54. Tuttavia, la registrazione EEG tethered è molto meno costosa di telemetria.

Nel nostro laboratorio, usiamo i connettori al EEG registrazione sistema e microdialisi tubi in parallelo, tale che tubi e fili sono collegati a due diversi snodi. Questa è la questione più critica per questi esperimenti: i cavi e i tubi tendono ad attraversare frequentemente a causa dei movimenti dell'animale. Pertanto, utilizziamo connettori e tubi abbastanza a lungo per lasciare l'animale inseguire la propria coda (un comportamento che si osserva tipicamente con stimolazione di potassio) o cadere e rollio durante i grippaggi epilettici generalizzati. È consigliabile per consolidare ulteriormente le cannule di microdialysis inserite nella loro guida da argilla di modellistica, al fine di rafforzare il loro contatto con la guida (a volte, microdialisi cannule sono urtati contro le pareti della gabbia durante i grippaggi generalizzati e può scivolare fuori). D'altra parte, si consiglia di tenere il tubo più corto possibile, per ridurre al minimo il ritardo tra neurochimici e tempo di raccolta. Ciò è particolarmente importante quando periodi di raccolta sono brevi. In generale, la microdialisi della tubazione deve essere di lunghezza adeguata e capacità per garantire che il tempo di campionamento non superi il tempo tra dialisi outlet e raccolta. È stato osservato che i soluti tendono a diffondere più tra alcuni tappi se il tempo morto della tubazione è superiore al tasso campionamento55. Pertanto, il tempo/volume morto sperimentale di microdialysis tubazione dovrebbe essere ridotto il più possibile e determinato con precisione al fine di correlare i dati di neurochimica con comportamento dell'animale. Infine, è importante notare che entrambi gli snodi ed elettrodi accoppiati con cannula per studi EEG e microdialisi combinati sono disponibili in commercio. Pertanto, quando possibile, impostare il sistema di EEG con la possibilità di eseguire gli esperimenti di microdialisi.

Le raccomandazioni minori sono: (i) prima di iniziare qualsiasi esperimento, controllare che l'EEG registrazione di sistema e/o impostato il microdialysis funzionino correttamente e risolvere qualsiasi problema; Suggeriamo che, avendo una riserva impostata pronto (un'altra pompa con siringhe montato su e completata del tubo riempito con soluzioni di lavoro) quando effettua l'esperimento, così come un numero sufficiente di pronti all'uso per microdialisi sonde per cambiare rotta ones; (ii) durante il trasferimento degli animali nella gabbia lavoro EEG-microdialysis che è utile avere una seconda persona che assiste e iniziando le acquisizioni; (iii) assicurarsi che che la colonna e l'autocampionatore raggiunto temperature appropriate prima di cromatografia; Inoltre, utilizzare standard e costruire le trame di calibrazione prima di eventuali campioni di dializzato sono iniettati nella colonna cromatografica; (v) ogni volta che necessario, cercare di sviluppare il cromatografica o altro metodo di analisi per misurare analiti multipli allo stesso tempo.

Alterazioni nella neurotrasmissione hanno implicazioni in molti disordini dello SNC (tra cui l'epilessia) e c'è stato un grande interesse nel corso dei decenni per quantificare questi cambiamenti durante la progressione da un sano ad un fenotipo malato. Oggi, solo alcune tecniche permettono la misurazione dei cambiamenti nei livelli del neurotrasmettitore per giorni o mesi. Microdialisi sono una di queste tecniche. In un gran numero di casi, come quello qui descritto, è eseguita in animali liberi di muoversi e accoppiato a saggi analitici offline convenzionali come la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o elettroforesi capillare (CE), con cui raggiunge 5-30 min risoluzione temporale31,56. Chiaramente, questi intervalli di campionamento non riflettono il neurotrasmettitore rapido dinamica nelle vicinanze della sinapsi, ma potrebbe essere utile per alcune applicazioni di microdialysis di lungo termine (ad es., lo sviluppo della malattia o studi di effetto del farmaco) che richiedono accoppiamento del neurochemical, EEG e dati comportamentali. Tuttavia, altri studi sono principalmente interessati con la misurazione in tempo reale o vicino le modifiche in tempo reale nel neurotrasmettitore rilascio. Per questi, la tecnica della microdialisi deve essere raffinata per aumentare la velocità di campionamento (diminuendo quindi i volumi di campione). Infatti, la tecnica della microdialisi classico è spesso criticata per la sua scarse temporale (minuti) e la risoluzione spaziale (la sonda convenzionale è molto più grande delle sinapsi)9,21,56, 57. Tuttavia, è la sensibilità del metodo analitico di massa accoppiato per microdialisi ciò che determina la risoluzione temporale di microdialisi (cioè, la risoluzione è uguale al tempo necessario per avere abbastanza campione possa essere rilevata da un analitico tecnica56). Così, quando il microdialysis produce piccole quantità di campioni, deve essere aumentata la sensibilità delle tecniche di quantificazione. Ad oggi, tali miglioramenti nella risoluzione temporale della tecnica della microdialisi seguito 3 diverse linee. Uno di questi è rappresentato dalla miniaturizzazione delle colonne e/o cellule di rilevazione dei classici metodi HPLC; Questi sono chiamati tecniche UHPLC (ultra-performante HPLC) e permettono di ottenere 1-10 min tempo risoluzione58,59,60. Un altro approccio è quello di accoppiare un classico HPLC a spettrometria di massa (MS) o in tandem (MS/MS) per analisi multiplex di neurotrasmettitori nel cervello dializzato. Le analisi di HPLC-MS combinate hanno un'eccellente sensibilità e raggiungono circa 1-5 min tempo risoluzione56,61,62,63. Una terza linea di miglioramento esiste nelle modifiche di elettroforesi capillare (CE). Se CE usi laser indotta rilevazione della fluorescenza (CE-LIFD), permette la determinazione delle concentrazioni submicromolar di vari neurotrasmettitori in nanolitro frazioni ottenute ogni 5 min55,64,65 o anche a 10 s intervalli56. Un chiaro vantaggio che emerge da UHPLCs o approcci analitici avanzati CEs è che il campionamento può essere fatto in muoversi liberamente gli animali, senza compromettere gli esperimenti in cui comportamento spontaneo deve essere osservata e analizzata. D'altra parte, ci sono metodi che consente il campionamento del dializzato di cervello alle anche centinaia di millisecondi risoluzione temporale (ad esempio, il reattore di enzima basato saggi on-line o raccolta di goccia del dializzato accoppiato alle tecniche MS), ma queste sono in genere utilizzato in animali trattenuto66 o sotto anestesia generale67,68,69, non permettendo di microdialysis coppia con studi comportamentali.

Quando si considera la seconda più importante debolezza di microdialisi, vale a dire relativamente bassa risoluzione spaziale a causa delle dimensioni di membrana (spesso circa 0,5 mm di diametro e lunghezza di 1-4 mm), un'alternativa potrebbero essere le microsonde sviluppate con basso flusso campionamento di push-pull. Queste sonde è costituito da silice due capillari (del OD 200 µm e 20 µm ID) fuse by-side e inguainato con un tubi polimerici. Durante l'esperimento, questi capillari sono perfusi a portate molto basse, tale fluido è tirato fuori uno vaso capillare e un campione è estratto dall'altro presso la stessa portata. Poiché il campionamento avviene solo alla punta della sonda, la risoluzione spaziale è maggiore con la sonda per microdialisi70. Un'altra possibilità è passare da sonde miniaturizzate a microelettrodi (biosensori) per la valutazione in tempo reale del neurotrasmettitore. Diverse tecniche elettrochimiche (basate principalmente su voltammetria o amperometria) permettono di analita campionamento molto vicino la sinapsi (scala di micron) e in meno di 1 s31,70,71. Questi dispositivi possono misurare la concentrazione di più analiti da regioni multiple del cervello. Tuttavia, richiedono anche alcuni perfezionamenti, ad esempio per evitare artefatti e un relativamente rapido deterioramento.

Considerando gli ultimi progressi in vivo del neurochemical monitoraggio, sembra probabile che i metodi di campionamento diverso trasmettitore si combineranno in un unico sensore nel prossimo futuro. Il lavoro su sonde di campionamento microfabbricati ha già iniziato, e crediamo che ulteriori progressi nelle tecnologie di microfabbricazione insieme ai progressi analitici faciliterà ulteriormente in vivo del neurochemical indagine monitoraggio. In questo momento, tuttavia, il microdialysis convenzionale correlato all'EEG rimane un metodo valido per molte applicazioni di neuroscienze.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Anna Binaschi, Paolo Roncon ed Eleonora Palma per il loro contributo ai manoscritti pubblicati in precedenza.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

Tags

Neuroscienze problema 141 microdialisi glutammato aspartato epilessia modello di pilocarpina chirurgia stereotassica stimolazione di potassio elettroencefalografia cromatografia liquida
Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Falcicchia, C.,… More

Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter