Summary
这里概述的协议描述了免疫荧光分析, 生物细胞素恢复和高质量的重建海马 ca2 神经元后, 细胞内电生理记录在体外, 允许神经元特征, 并最终精细的神经元解剖进行研究。
Abstract
皮质网络活动如何处理信息, 对大量的基础和临床科学问题具有重要意义。此处描述的协议标识了此电路的基本构建块。对皮质区域的深入研究最终将为其他科学家提供所需的电路组件, 以了解大脑如何获取、处理和存储信息, 以及在电生理方面出现的疾病而形态数据被计算神经科学家广泛用于构建探索信息处理的模型网络。这里概述的协议描述了如何在海马 ca2 区域记录的生物素填充细胞被恢复, 然后在3d 中重建。此外, 该协议描述了钙结合蛋白或肽含量的演示记录的间神经元。
Introduction
皮层和海马体是如此复杂的结构, 神经元亚型 1,2, 3,4, 它们之间的连接图 5,6,7.,8,9,10,11以及这种电路如何支持认知功能的 12、13、14、15仍在紧张研究中, 并一直在争论中。例如, 要了解电路的细节和复杂性, 并协调从许多不同研究中获得的数据, 能够定义和描述组件是非常有帮助的, 但争论有多少不同的问题仍然是一个值得商榷的问题神经元的类存在, 甚至是否有可能将所有神经元定义为属于特定类。目前正在开发能够构建和测试具有不同复杂程度的电路的计算工具, 但这些努力的核心是需要对细胞类型进行详细研究以及它们之间连接的属性。已经收集了大量关于成年大鼠大鼠大皮层局部电路的信息, 这里描述的协议是10、19、20、21,22. 虽然 "接线图" 远未完成, 但出现了一些明确的模式或规则。此外, 虽然有些细节不同, 但这些规则是两个哺乳动物物种 (老鼠和猫) 所共有的, 跨越了几个新皮层区域, 可以开发出可能同样适用于人类新皮层的基本组成部分。这里描述的技术是用来扩大我们对皮质电路功能图的理解, 通过识别突触前和突触后神经元参与连接的区域, 以前没有详细研究过, 使用的协议可以在成人脑组织中进行良好的组织保存和显著的染色恢复。利用这种方法, 将细胞内电生理记录 (与尖锐微电极配对) 与生物细胞素填充相结合, 收集了 ca2 局部电路和该子领域神经元特性的数据,免疫荧光, 组织学程序和高度详细的神经元重建, 允许直接比较与邻近的 ca 地区23,24,25。
多年来, 本文所述的技术得到了详细的神经元解剖, 使细胞的正确分类和高质量和准确的重建, 他们的树突状和轴突乔木, 数据可以是与使用尖锐电极配对录音中收集的电生理数据相关。组织学方案已进行优化, 以保持神经元的超微结构, 并获得良好的恢复树突 (包括刺) 和轴突乔木。例如, 双固定技术的原理是首先浸入固定溶液中, 其次是在四氧化铬的固定后, 从而为光学显微镜26提供了很好的对比度。按照先前研究27的建议,在固定液中加入少量戊二醛和吡咯酸溶液, 以增强抗体的渗透, 并保持细胞的超微结构。采用冻融法与蔗糖 (蔗糖) (而不是传统洗涤剂) 相结合的冷冻保护方法, 使大脑切片具有渗透性, 也为记录细胞的详细形态分析提供了最佳的组织保存。此外, 通过使用过氧化氢 (h2o2) 和硼氢化钠 (nbh4) 进行孵育, 减少背景染色, 提高了非常精细结构的可视化效果.在辣根过氧化物酶 (hrp)反应中加入氯化镍 (ncl 2) 以获得黑色色素反应产物也能增加对比度。
下面的协议描述了用于确定优秀的组织保存和高度详细的神经元3d 重建后, 细胞内记录在体外的程序。以前曾报道过我们实验室使用的切片制剂、使用尖锐电极的细胞内配对记录和随后的组织学程序的描述.尽管该协议适用于在450-500μm 厚的切片中充满生物环素的细胞, 但在整个细胞记录后, 也可以使用相同的协议。但是, 使用较薄的切片将导致细胞的重建不那么完整。
Protocol
在整个研究过程中使用的所有程序都是根据英国内政部关于1986年《动物科学程序法》的条例进行的。
1. 电生理记录和生物环素填充后神经元内钙结合蛋白或蛋白质含量的测定及生物细胞素可视化
注: 在电生理记录结束时, 含有生物素填充细胞的切片在组织学程序前被固定一夜。如果在另一天进行其余的手术, 固定溶液将被更换为 0.1 m 磷酸盐缓冲液的一次变化, 以防止组织损伤。固定溶液 (4% 对甲醛、0.2% 饱和皮克酸溶液、0.025 戊二醛溶液在 0.1 m 磷酸盐缓冲液 (pb) 中) 必须在录音当天制成新鲜, 以获得最佳效果。
- 在电生理记录结束时, 用画笔小心地拿起含有记录细胞的切片, 并将其放入含有人工脑脊液 (acsf) 的锅中。
注: 以前已经描述了用于切片制备和使用尖锐电极的细胞内记录的协议的详细信息。 - 在通风柜中, 用画笔小心地拿起大脑切片, 将其卷到一小块优质滤纸上。将另一张潮湿的滤纸放在切片上, 并将两张湿滤纸放入一个装有5-10 毫升固定溶液的小塑料罐中, 并在4°c 下隔夜存放在冰箱中。
- 在蒸馏水中制备明胶溶液。将20毫升蒸馏水放入烧杯上的烧杯中, 加热至60°c。在水中逐渐加入2.4 克的明胶, 等到溶解后再冷却至 35–40°c, 然后再使用, 以防止组织损伤。
- 将固定溶液替换为 0.1 m pb 的2毫升。将切片放入培养皿中, 用手术刀刀片切掉多余的组织。将修剪后的组织放入 petri 培养皿中 (直径为9厘米, 高度为1.4 厘米), 确保其平躺, 没有褶皱或折痕, 并使用干画笔去除多余的缓冲液。
- 用温暖的明胶溶液覆盖组织, 并将培养皿放在冷冻块上, 以快速冷却溶液。
- 使用一个角度稳重的灯, 以提供对比, 通过菜的一侧, 并保持切片平使用光压力从一个精细的画笔, 直到明胶开始设置。
注: 明胶可以重新熔化, 如果组织不躺在平。由于在画笔凝固过程中去除画笔而导致的任何缺陷, 都可以通过将灯泡靠近表面几秒钟来轻轻融化表面层, 从而消除。 - 将设置明胶的盘移到冰箱上, 在4°c 下离开30-60。
- 在烟罩中, 使用手术刀刀片切下一个小块 (~ 1 x 1 厘米), 其中包含盘子中的明胶嵌入组织, 使用小铲子提起, 并小心地将其放入相同但新鲜的固定溶液中, 用于在4°c 下固定切片至少30分钟.
- 将明胶块在 0.5 ml 中清洗三次, 用一张纸的纸巾擦干, 然后用超级胶将块侧向上粘 (即, 将组织放在顶部) 粘在振动块上。
- 用一张滤纸去除多余的胶水, 然后使用手术刀刀片将方块的角剪掉, 留下钻石形状。
- 使用振动体以50微米的厚度切片切片, 并将每个切片小心地放入含有10% 蔗糖的玻璃瓶中。
- 小心地从小瓶中拿起一个部分, 把它平放在一个培养皿盖。使用解剖显微镜和新鲜的手术刀刀片, 从切片周围取出明胶, 并将该部分返回到含有2毫升新鲜10% 蔗糖的小瓶中
注: 在这一阶段去除尽可能多的明胶是至关重要的, 以减少脱水步骤中的组织收缩 (步骤 1.37)。 - 在室温下, 通过在10% 蔗糖溶液中孵育10分钟、20% 蔗糖-6% 甘油溶液中20分钟、30% 蔗糖-12% 甘油溶液两次以下 20分钟, 以确保 0.1 mb pbc 基蔗糖-甘油溶液中的切片, 并在室温下保护其30分钟。不断的激动。
- 使用画笔将部分平放在一个小矩形的锡箔上。从部分中取出多余的液体, 小心地将锡箔折叠成一个包裹。
- 将包裹靠近液氮表面, 不接触表面 30秒, 然后让部分完全解冻约 30秒, 再重复两次冻融。
- 用画笔取出所有部分, 并将其放入含有2毫升 0.1 m pb 的玻璃瓶中, 不断搅拌, 以洗掉多余的蔗糖。
- 用巴斯德移液器取出 pb, 在1% 水 h 2o2 的2毫升中孵育切片 30分钟 , 在 0.1 mL pb 3x 5分钟的2毫升中清洗切片。
- 用巴斯德移液器取出 0.1 m pb, 并在 0.1 m pb 中添加1% 的硼氢化钠 (nabh4)。
注: 不要盖上小瓶, 因为 nbh4 溶液释放出氢气. - 用巴斯德移液器取出硼氢化钠, 在 0.1 m pb 5x 5分钟的2毫升中彻底清洗切片。
- 用 0.1 m pb 中10% 的正常山羊血清 (ngs) 取代 0.1 m pb, 时间为30分钟。
- 去除山羊血清, 在4°c 时, 在 abc 溶液中组成的小鼠单克隆和兔多克隆抗体中孵育切片。
注: 以前研究中使用的主要抗体清单见 botcher 等人的表 1 .(2014年)29岁 - 在黑暗中, 在带有荧光标记的二级抗体混合物中将这些部分培养 2小时 (材料表)。
- 将部分安装在安装介质中的幻灯片上, 并用盖板覆盖。
- 拍摄40x 放大倍率下的荧光标记图像 (图 1bb)。
- 荧光成像后, 将幻灯片放入含有 pbs 的玻璃培养皿中, 并小心地取出盖板。然后使用巴斯德移液器中的 pbs 柔和的脉冲清洗滑梯上的部分。将部分放入含有 pbs 的干净玻璃小瓶中。
- 首先在 abc 中孵育至少2小时的切片来扩增 hrp 反应产物, 以进行 avindin-hrp 反应。
- 在5毫升的蒸馏水中加入一片, 制备 3, 5 二胺苯并胺 (dab) 溶液。
- 用 pbs 清洗切片三次, 10分钟, 然后用 tris 缓冲液两次, 10分钟. 最后一次清洗后取出 tris 缓冲液。
- 快速将8% 的镍氯2解决方案添加到 dab 解决方案中, 将溶液移入和移出混合, 并在各部分快速添加1毫升的此解决方案。将 DAB/NiCl2溶液中的切片加氢15分钟。
- 在 dab 溶液中加入10μl 的 1% h2o2.允许反应在黑暗中持续约1至2分钟的搅拌, 并用解剖显微镜监测填充细胞的标签。
- 通过去除 DAB/NiCl2/h2o2溶液停止反应, 并用 tris 缓冲液清洗切片两次5分钟。
- 在通风罩中, 将一小圈滤纸放入培养皿中, 并用 0.1 m pb 将其弄湿。使用画笔一次从玻璃小瓶中提起一个部分, 并将其小心地平铺在纸上。
- 用滤纸的另一个湿润圆圈覆盖部分, 并通过轻轻触摸纸巾表面来去除多余的缓冲液。
- 在 0.1 m pb 中使用8-9 滴 1% 的四氧化二铬, 覆盖盘, 并在烟罩中保留至少 30分钟, 但不超过1小时。
- 打开培养皿, 提起上面的滤纸。用画笔小心地将部分各部分每次抬起, 放入玻璃瓶中, 并在蒸馏水中冲洗两次。
- 适当处理四氧化铬废物。冲洗所有一次性设备, 并将其放置在适当的垃圾桶中。
- 将每个部分平放在玻璃滑梯上, 并将部分覆盖。将滑梯转移到培养皿中, 在盖板上放置一个空的玻璃小瓶, 将其保留在适当的位置, 并用50% 的酒精覆盖。15分钟后, 从解决方案中取出幻灯片, 并从幻灯片中删除部分。将部分放回滑梯上, 然后将滑梯放入70% 的酒精中 15分钟, 用95% 的酒精溶液重复同样的过程, 最后是100% 的酒精溶液。
- 在脱水步骤之后, 将部分转移到一个玻璃小瓶中, 在通风柜中的振动台上含有100% 的酒精。将酒精溶液更换为环氧丙烷 (c3h6o), 并清洗三次5分钟。最后清洗后, 将约2毫升的环氧丙烷保存在小瓶中, 并添加树脂 (1:1 比)。确保树脂被溶解, 并保持部分在恒定的搅拌30分钟。
- 将每个部分放置在含有环氧树脂的铝板中, 使用木棍进行隔夜孵化。
注: 不要将树脂中的部分留在超过24小时的地方, 以避免损坏部分的风险。 - 将木板放在热板上大约 10分钟, 用木棍拿起每个部分, 放在干净的滑梯上。使用解剖显微镜保持每个部分的方向一致。在上面放一张被单。在56°c 的温度下将滑块放入烤箱48小时进行固化。
2. 3d 神经重建
注: 使用神经透明质软件。下面提供的说明仅适用于特定的神经元重建系统 (材料表)。在使用显微镜进行重建之前, 从切割中获得的切片进行匹配。
- 在舞台上放置一张幻灯片, 用舞台剪辑固定, 然后打开神经元重建软件。单击 "获取"选项卡, 然后选择"实时图像"。
- 使用100x 油物镜测量每个截面的厚度。记下每个截面顶部和底部的 z 表上的值, 并将截面厚度计算为两个值的差异。
- 使用低放大倍率目标将焦点放在包含细胞体的"主页" 部分。然后使用100x 目标, 将重点放在细胞体上, 然后在中心单击以标记参考点。
- 从 "跟踪" 选项卡中, 选择 "串行节管理器"。然后在"串行节管理器" 窗口中选择"创建新节(+ 图标)"。输入节的数量。按正确的 z 顺序命名每个部分, 并输入步骤2.2 中测量的切割厚度。
- 要使用100x 目标在3d 中跟踪 soma, 请从 "跟踪" 选项卡中选择"轮廓" , 然后选择 "细胞体轮廓"。使用操纵杆将焦点移动到细胞体的最顶端。通过单击当前处于焦点的零件的周长来放置点。右键单击并选择 "关闭轮廓"以完成第一个轮廓。在不同的 z 位置重复此过程, 直到到达细胞体的底部 (图 2)。
注: 在"跟踪"选项卡中选择"3d 可视化", 以3d 方式显示细胞主体。 - 要使用100x 目标在2d 中跟踪细胞体, 请从"跟踪" 选项卡的 "神经元" 菜单中选择"细胞体" . 通过单击单元体的周长来放置点。要完成细胞体, 请右键单击并选择"完成细胞体"。
- 要跟踪树突乔木, 请在神经元菜单中选择树突或星状树状.首先, 使用鼠标滚轮对每个枝晶进行短的初始段跟踪, 以调整光标的直径, 使其与枝晶的直径相匹配。跟踪沿每个树突使用操纵杆在剖面和鼠标滚轮中移动, 以调整跟踪的直径。
- 检查跟踪与现场显微镜图像的对齐方式, 并在必要时进行调整, 尤其是在使用操纵杆移动后。在 "跟踪" 选项卡中, 选择"对齐跟踪", 单击 "跟踪", 然后单击正确的位置。
- 当到达树中的节点时, 右键单击并从下拉菜单中选择"分叉节点" 或"分叉节点"。
- 到达分支的末尾后, 从"神经元" 菜单的下拉菜单中选择一个结束。选择正确的结束类型,即 "高结尾"、"正常结尾" 或 "low 结尾", 以便于跨节进行匹配。
- 在追踪到当前部分中的所有树突后, 减少显微镜上的放大倍率, 选择 "快乐自由" 选项卡, 然后移动到与完成部分正上方或下方匹配的部分。
- 若要在与已完成部分匹配的部分中标识树突之间的匹配点, 请单击 "移动" 选项卡, 然后选择 "匹配点"。选择需要匹配的点数 (首选三个或更多点), 然后按"确定"。单击已完成分支的结尾, 然后单击该分支。对每个匹配点重复此操作。在100x 放大倍率下重复此过程, 以确保准确匹配。
- 通过右键单击结尾, 将匹配的分支直接添加到上一节。当分支与已完成的跟踪分支对行并按照前面所述跟踪时, 选择"添加到结束" 。
- 一旦每个部分的所有树突都被追踪到, 通过从神经元菜单中选择axon , 使用相同的过程追踪轴突。
- 转到 "主页" 部分, 将重建与实时显微镜图像重新对齐, 然后从 "跟踪" 选项卡中选择"轮廓" . 选择预定义的轮廓层边界区域边框, 然后单击以沿轮廓进行跟踪。选择 "结束打开轮廓"。跟踪所有所需的图层和区域轮廓。
- 使用 "跟踪"选项卡中的3d 可视化在3d 中可视化重建。
- 要录制3d 重建的视频 (视频 1), 请打开3d 重建并打开 "创建影片"。设置文件目标和所需的旋转速度。建议将旋转设置为270°。选择"开始录制", 录制几秒钟, 然后单击 "自动旋转"。选择 "在需要时停止录制" 。使用视频编辑软件 (材料表) 编辑视频。
- 要将文件导出到 tiff 或 jpeg 文件中, 请选择"文件"出口业务将跟踪导出为图像。选择μm/像素比率, 然后选择"适合"。选择背景色, 然后选择"文件"。命名文件, 选择 tiff 或 jpeg, 然后按"保存"。要将文件导出到矢量文件中, 请选择"文件"出口业务将跟踪导出为矢量文件。
- 使用神经元重建分析软件进行形态分析。
- 要分析树突状树并获得树状图, 请在神经资源管理器中打开该文件。选择"分析"结构, 然后从下拉菜单中选择树形图(图 3)。
- 要对三维重建 (分支复杂度、分支和 somas 的体积、表面积) 进行全面的形态分析, 请在软件中打开该文件。在 "视图" 选项卡中, 单击 "全选"。选择 "分析" 选项卡。然后选择"结构和分支结构分析"。
3. 故障排除
- 更改相机设置。为了获得最佳效果, 请将曝光时间设置为小于100毫秒, 并尽可能接近0的增益和偏移量。
- 如果神经元重建软件在"跟踪" 选项卡中的3d可视化中没有自动将跟踪的轮廓显示为3d 单元体, 请在"跟踪" 选项卡中选择 "选择对象", 按住键盘上的ctrl键, 然后单击所有绘制的轮廓, 右键单击, 然后在下拉菜单中选择 "设置单元体" 。
- 若要调整单个分支的 z 参数, 请选择树 (在"跟踪"选项卡中选择对象), 并通过右键单击菜单下拉菜单设置所有点的 z 调整。选择"修改 z 位置", 然后选择 "移位 z" 值并输入所需的值。
- 当需要在跟踪上移动较大距离时, 使用 "移动" 选项卡中的 "转到" 重新调整重建。
- 在重建过程中的任何时间点添加其他节点。选择要将节点放置到的分支 (在"跟踪" 选项卡中选择对象, 然后单击该分支), 右键单击, 然后选择 "将节点插入到选定的树中"。然后单击分支上的正确位置。
- 在重建复杂的神经元时, 分别和后期将匹配的分支拼接, 以便于识别分支。单独跟踪新节中的分支, 然后将这些分支附加到上一节上的匹配分支, 方法是将这些分支悬停在要拼接的分支的结束上, 右键单击并选择"拼接", 然后将鼠标悬停在该结束上。分支将被拼接到并单击。
- 如果在错误的树类型下跟踪分支, 请选择该树, 右键单击并选择 "更改树类型", 然后选择正确的树类型。
- 如果点放置不正确, 请执行ctrl + z, 或单击 "跟踪"菜单中的"撤消"按钮以删除最后一个点。但是, 如果在尝试删除点之前使用操纵杆在整个部分中移动, 则此过程将不起作用。在这种情况下, 当分支结束时, 可能会删除该点。选择分支 (按"选择对象" , 然后单击该分支), 将鼠标悬停在要删除的点上, 右键单击并选择删除点。
- 如果不确定两个分支是否匹配, 则 1) 在"跟踪"选项卡中使用3d 可视化检查分支是否在 z 平面中匹配, 或者 2) 使用 "串行节管理器" 中的"显示侧翼"功能立即显示节在当前部分的上方和下方的灰色。
- 如果某个部分被翻转, 请转到"跟踪" 选项卡中的"工具". 选择"调整 xy 缩放", 然后将 x 轴更改为-1。然后选择"更正 z 收缩"并将 z 轴更改为-1。然后像往常一样跟踪分支。当移动到具有原始方向的部分时, 请记住撤消这些更改。更改 x 轴和 z 轴不会更改分支结束标签, 因此在拼接时要注意使用正确的结尾。
- 如果截面切割厚度与所测量的安装厚度有显著差异, 则可以纠正正确的 z 收缩。在 "跟踪" 选项卡中, 选择 "工具", 然后选择 "更正 z 收缩", 然后输入 z 轴的收缩系数, 作为切割厚度除以安装厚度的十进制表示形式。
Representative Results
海马 ca2 的神经元经电生理记录后充满了生物细胞素 (图 1ac, ad和1Ac, bd)。这些切片在录音后一夜之间固定, 并按照这里描述的协议揭示神经元的神经化学和形态特征。
填充间神经元的钙结合蛋白或蛋白质含量是通过先用原代抗体孵育切片, 然后用荧光标记的二级抗体来测定的。在记录过程中, 神经元间的发射特征将决定使用的主要抗体的选择。采用 aviedi-amca 对充满生物素的神经间素和抗小鼠荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 和山羊抗兔德州红 (tr) 进行了神经间神经化学特征 (图 1bb) 的表征。
在荧光可视化之后, 使用 hrp 协议来揭示生物细胞素 (图 1ab)。然后使用神经元重建软件 (图 2和图 3a) 以三维方式绘制 ca2 间神经元的详细解剖。在 ca2 中记录和填充的篮子单元的3d 重建视频显示在视频中。如果树突乔木和轴向乔木都被限制在450-500μm 切片的深度内, 则神经重建被认为是完整的。不良轴突乔木染色是通过在切片顶部或底部有开放的结束的截断分支的存在或仅限于轴突初始段和非常近端分支的染色来评估的。图 4显示了生物素可视化后的良好和不良 hrp 染色的例子。
三维重建的形态分析 (图 3) 可以用来证明树枝的复杂性、soma 表面积以及树突状和轴向乔木的表面积和体积。
图 1:海马 ca2 区记录和填充两种篮子细胞的神经元重建及细胞内记录后获得的相关电生理数据在体外。这一数字已从以往的研究23、24 中加以修改。so stratum oriens, sp stratum pyramidale, sr stratum; slm stratum Lacunosum muleculare。(a) aa:a: 使用拉拔管 (1000x) 重建具有受限树突和轴突乔木的 ca2 篮子细胞。树突是黑色的, 轴突是红色的。ab: 按照这里描述的 avindin-hrp 协议填充生物素的篮子细胞的图像。c: 具有受限树突和轴向乔木的 ca2 篮子细胞超极化和去极化电流注入的电压响应的代表性痕迹。广告: 使用尖锐电极记录的用于缩小乔木篮单元连接的 ca2 金字塔示例。综合兴奋突触后电位 (epsp) 平均值显示, 在对三个尖峰列车的反应中, 列车短暂抑郁明显。(b) ba: 使用拉拔管 (1000x) 重建具有宽树突状和轴向乔木的 ca2 篮子细胞的2d。这个篮子细胞的树突树 (黑色) 在 ca2 区域的所有层径向延伸, 并在 ca2 和 ca3 区域的 so 和 sp 水平延伸。一个水平枝晶也到达 ca1 区域。轴突 (红色) 延伸到 ca3 和 ca1 区域。bb: 充满生物环素 (amca 染色) 的篮子细胞是 pv 免疫阳性 (fitc 染色) 和 cb 免疫免疫调节 (texas-red 染色)。bc: 具有宽树突状和轴向乔木的 ca2 篮子细胞超极化和去极化电流注入的电压响应的代表性痕迹。bd: 复合 epsp 平均值显示, 在响应三个峰值的列车时, 列车的便利性很明显。在 ca2 中记录的其他类型的间神经元的例子可以在以前的研究25,30中找到。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 3d 细胞体重建.(a) 细胞体的3d 跟踪。在通过细胞体聚焦的同时, 在不同的 z 位置上跟踪不同轮廓的视图。(b) 不同等高线的3d 视图。(c) 以不同角度对细胞体进行3d 视图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 三维神经元重建的形态分析。(a) ca2 窄乔木篮单元的3d 重建。每个树突分支都用一种颜色 (绿色、蓝色、红色和粉色) 表示, 轴突是浅蓝色的。(b) 篮子细胞的树状图, 表示树突状分支的数量和与 soma 同心的球体中每个部分的长度, 间隔为100μm。树状图上的颜色与 a. (c) 对 ca2 锥体细胞进行形态分析的例子 (改编自先前的研究23) 中的树突颜色相对应。根据 ca2 锥体细胞与 soma 的距离绘制树突状分支的数量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 良好 (a) 和差 (b) hrp 染色的例子.(a) 生物环素的恢复显示 ca2 中充满非常好的神经间。细胞体 (cb) 是暗色染色, 并有明确的轮廓。树突是珠子, 并显示一些刺 (由红星代表)。轴突乔木 (a) 致密, 呈现小块。(b) ca2 中2个锥体细胞的树突状和轴突染色不良的例子。cb 的染色是微弱的, 没有明确的轮廓。染色不良通常与较短的电生理记录有关, 导致很少有充满生物素的分支。请点击这里查看此图的较大版本.
视频 1:具有受限树突乔木 (也称为 ca2 窄乔木篮细胞) 的 ca2 篮子细胞的三维神经元重建, 其 soma 位于金字塔层、ca2 层金字塔中的所有层和轴突层, 这些树顶细胞位于层层、树突层和轴突层。和辐射.很少有分支到达近端 ca3 地层和 ca3 地层金字塔。该细胞在电生理记录后充满了生物环素, 并按照本文所述的协议用 avindi-hrp 对切片进行处理。由于切片, 只回收了切片深度内的轴突, 尽管树突是完整的。树突是深粉色和轴突白色。在视频的开头添加了图层和区域边界。由格鲁吉亚经济的3d 重建-3d 视频由斯文贾法尔克。视频是用步骤2.17 中所述的神经元重建软件录制的, 并使用视频编辑软件进行了编辑。链接到视频:30。请点击此处下载此视频.
| 使用的解决方案 | 组成说明 |
| 固定解决方案 | 4% 聚甲醛, 0.2% 饱和皮克酸溶液, 0.25% 戊二醛溶液在 0.1 m 磷酸盐缓冲液 (pb) |
| 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7。6 | 在900毫升蒸馏水中加入100毫升的库存 1 m 磷酸盐缓冲 |
| 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) ph 值7.4/7。5 | 加入0.1m 磷酸盐缓冲液的10毫升、0.2 克的 kcl 和8.76 克的氯化钠至990毫升的蒸馏水 |
| tris 缓冲液 ph 值7。5 | 在50毫升蒸馏水中溶解5.72 克盐酸 tris 和 1.66 g tris 碱。然后用蒸馏水做1升。 |
| 缓冲戊二醛和聚甲醛固溶体 | 4% 聚甲醛, 0.2% 饱和皮克酸溶液, 0.025 戊二醛溶液在 0.1 m 磷酸盐缓冲液中。 |
| abc 解决方案 | 在使用前至少30分钟从 abc 套件中解决问题。在 pbs 的 2.5 ml 中加入1滴溶液 a 和1滴溶液 b。 |
| 杜库安环氧树脂: | 制造20个锅: 组件 a 20 克、组件 b 20 克、c 组件0.6 克和 d-组件0.4 克。 |
| 用一圈滤纸覆盖板, 保护天平不发生溢出。按照上述比例仔细称量试剂制成三杯烧杯。用两根木棍大力搅拌, 搅拌至少 5分钟, 彻底搅拌。混合物应成为均匀密度深棕色的颜色。将烧杯放入烤箱中, 在 ~ 50°c 处, 最多 10分钟, 以去除尽可能多的气泡。注: 如果将烧杯放在烤箱中的时间超过 10分钟, 树脂将开始固化. 将树脂放入塑料罐或5毫升注射器中, 与它们约会, 并存放在-20°c 的冰柜中, 准备使用。 |
表 1: 解决方案表。
Discussion
体外电生理记录 (图 1 ac,d和bc, d), 结合组织化学和免疫组织化学程序, 使详细的形态, 钙结合蛋白的含量和被记录的成人皮质间质的身份。在 ca2 区域, 这项技术首次允许研究局部电路, 并揭示了以前在 ca1 或 ca3 中没有描述过的神经元间亚类: 宽树突状细胞和轴向乔木篮细胞 (图 1 b),细胞化和 sp-sr 间神经元间。
这里描述的协议已经优化, 以保持神经元的超微结构, 并获得良好的恢复树突 (包括刺) 和轴突乔木。关键的步骤包括使用双固定技术来增强光显微镜26的对比度, 并在固定溶液中添加戊二醛和丙酸溶液, 以增强抗体渗透和保护神经元超微结构27。温和的冻融渗透能更好地保存精细结构, 而渗透和树脂嵌入减少 z 平面收缩 28.此外, 通过孵育 h2o2 和 nbh4 的切片, 减少背景染色, 可以改善非常精细结构 (例如带有小球团的精细轴突)的可视化.在 hrp 反应中加入 ncl 2 也可以增加对比度。
这里详细介绍的组织学过程在重现性和可靠性方面提供了出色的结果。然而, 电生理记录的持续时间将决定生物环/荧光染色的质量, 较短的记录通常与不良的轴突染色有关。记录协议的选择 (使用尖锐电极与全细胞贴片夹紧的细胞内录音) 也可能影响生物环素的保留和精细解剖的保存。
虽然在这里描述的组织学处理过程中在保持精细结构方面遇到的困难以及在100x 放大倍率 (1到4周取决于轴突的复杂性) 下重建所需的时间得到了赞赏, 但这种方法给出了树突状和轴突直径的精确表示。使用要求较低的协议来揭示生物素标签是可以理解的, 然而, 这些往往排除了精细轴突分支的清晰可视化。洗涤剂, 促进阿维丁-hrp 进入, 以揭示生物素和抗体, 往往是必要的厚截面, 但可以破坏精细的结构。神经学家不断寻找半自动重建方法, 但目前, 特别是轴突, 人工重建的生物细胞蛋白-hrp 仍然是金本位31。
高度详细的神经元重建, 特别是轴突和节的精确绘图, 髓鞘的存在或不存在, 更普遍的是完整的轴突乔木的绘制, 其沿轴径的精确变化的表示长度, 为准确识别不同类型的神经元间神经提供进一步的信息。虽然许多神经元间可能不完全适合于特定的类, 但上面描述的技术提供了有关神经元电生理特性的相关数据, 以及与特定类型的连接相关的短期可塑性和详细的神经元重建, 允许接线图, 在 ca2 区域, 例如, 详细研究。
在计算模型中, 精细、详细的结构通常是简化的。这虽然可以理解, 但却导致信息丢失, 而这些信息可能在未来证明是至关重要的。通过对具有并行突触数据的详细三维重建进行分析, 可以增加进一步的神经元间分类标准。数据可以存储在公共存储库中, 并由建模器用于探索轴突直径的零星变化和肌权对动作电位传播的计算结果。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了诺华制药 (巴塞尔) 和医学研究委员会的资助, 该委员会授予欧洲联盟生理学会生物技术和生物科学研究理事会 (bbsrc-bbp/16639/1) 的亚历克斯·汤姆森教授。根据720270具体赠款协定 (人脑项目 sga1) 和根据785907号具体赠款协议 (人脑项目 sga2) 制定的地平线2020研究和创新框架方案。我们非常感谢亚历克斯·汤姆森教授在其他皮质地区建立了协议, 获得了资金, 并为这一项目提供了持续的支持。帮助优化恢复协议和重建 ca2 神经元的实验室成员所作的贡献得到了感谢: j. deuchars, h. Pawelzik, d. i. hughes, a. p. bannister, k. eastlake, h. trigg, n. a. botcher。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
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