Summary
Den protokol, der er skitseret her beskriver immunofluorescens analyse, biocytin opsving og høj kvalitet rekonstruktioner af hippocampus CA2 interneurons efter den intracellulære elektrofysiologiske optagelser in vitro tillader neuronal karakterisering og i sidste ende fine neuronal anatomi undersøges.
Abstract
Hvordan kortikale netværksaktivitet behandler er oplysninger af betydning for en lang række grundlæggende og kliniske videnskabelige spørgsmål. Protokollen beskrevet her identificerer de grundlæggende byggesten i dette kredsløb. De grundige undersøgelser af kortikale regioner vil i sidste ende giver andre forskere med kredsløb komponenter nødvendig for en forståelse af hvordan hjernen erhverver, behandler og lagrer oplysninger og hvad der går galt i sygdom, mens den elektrofysiologiske og morfologiske data er almindeligt anvendt af computational neuroforskere i konstruktionen af modellen netværk, at udforske informationsbehandling. Den protokol, der er skitseret her beskriver hvordan biocytin-fyldte celler indspillet i regionen CA2 i hippocampus er genvundet og derefter rekonstrueret i 3D. Derudover beskriver protokollen demonstration af calcium bindende protein eller peptid indhold i registrerede interneurons.
Introduction
Cortex og hippocampus er strukturer af sådanne kompleksitet, klassificering af neuronal undertyper1,2,3,4, kort forbindelser mellem dem5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 og hvordan dette kredsløb understøtter kognitive funktioner12,13,14,15 er stadig under intens undersøgelse og genstand for fortsatte debat. For eksempel, forstår de detaljer og kompleksiteten af kredsløb og koordinere data fra mange forskellige undersøgelser, det er ekstremt nyttigt at være i stand til at definere og beskrive komponenterne, men det stadig diskuteres hvordan mange forskellige klasser af neuroner findes, eller selv om det er muligt at definere alle neuroner som tilhører en bestemt klasse. Beregningsmæssige redskaber, der kan bygge og teste kredsløb med varierende grader af kompleksitet bliver udviklede16,17,18, men centralt for disse bestræbelser er behovet for detaljerede undersøgelser af celletyper og egenskaber for forbindelser mellem dem. En stor mængde oplysninger om den lokale kredsløb af neocortex af voksne rotter er allerede blevet indsamlet ved hjælp af protokollen beskrevet her10,19,20,21, 22. selvom "ledningsdiagrammet" er langt fra komplet, nogle klare mønstre eller reglerne er opstået. Desuden, selv om nogle detaljer varierer, disse regler er i fælles for to pattedyrarter (rotte og kat) og på tværs af flere neocortical regioner, giver mulighed for udvikling af grundlæggende byggesten, der er tilbøjelige til at være lige så anvendelig til humane neocortex. Den teknik beskrevet her bruges til at udvide vores forståelse af den funktionelle kort af kortikale kredsløb ved at identificere de præsynaptiske og postsynaptiske neuroner involveret i forbindelser i de regioner, der ikke er blevet undersøgt i detaljer før, ved hjælp af en protokol der giver mulighed for fremragende væv bevarelse og bemærkelsesværdige farvning opsving i voksen hjernevæv. Data på den lokale kredsløb i CA2 og neuronal egenskaber i dette underfelt er blevet indsamlet med denne metode ved at kombinere intracellulære elektrofysiologiske optagelser (parrede optagelser med skarpe microelectrodes) med biocytin påfyldning, immunfluorescens, histologiske procedurer og meget detaljeret neuronal rekonstruktioner, giver mulighed for direkte sammenligning med de tilstødende CA regioner23,24,25.
Den teknik, der er beskrevet i denne artikel er blevet udviklet i de år at opnå detaljerede neuronal anatomi tillader det korrekt klassificering af celler og høj kvalitet og nøjagtige rekonstruktioner af både deres dendritiske og cytoskeletale dorne, data, der kan være korreleret med elektrofysiologiske data indsamlet fra parret optagelser ved hjælp af skarpe elektroder. Den histologiske protokol er blevet optimeret for at bevare ultrastruktur af neuroner og opnå fremragende inddrivelse af både dendritiske (herunder pigge) og cytoskeletale Dorne. F.eks. princippet om dobbelt fiksering teknik ved for det første nedsænkning i en Fikseringsvæske løsning og for det andet efter fastsættelse i osmium dinitrogentetraoxid giver en god kontrast til lysmikroskopi26. En lille mængde af glutaraldehyd og picrinsyre syre løsningen føjes til den Fikseringsvæske løsning ved at styrke antistof penetration og bevare celler ultrastruktur som foreslået i en tidligere undersøgelse27. Permeabilization af hjernen skiver ved hjælp af metoden fryse-tø kombineret med cryo-beskyttelse med saccharose, snarere end en traditionel vaskemiddel, også giver optimal bevarelse af væv til detaljerede morfologisk analyse af de optagne celler. Derudover er visualisering især af meget fine strukturer forbedret ved at reducere baggrund farvning med inkubationer med hydrogenperoxid (H2O2) og natriumborhydrid (Kristian4). Tilføje nikkel chlorid (NiCl2) med peberrodsperoxidase (HRP) øger reaktion at få en sort pigment reaktionsprodukt også kontrasten.
Følgende protokol beskriver de procedurer, der anvendes til at fastslå fremragende væv bevarelse og meget detaljerede neuronal 3D rekonstruktioner efter intracellulære optagelser i vitro. Beskrivelse af skive forberedelse, intracellulære parrede optagelser ved hjælp af skarpe elektroder og efterfølgende histologisk procedurer anvendes i vores laboratorium har været tidligere rapporteret28. Selv om protokollen gælder for cellerne fyldt intracellulært med biocytin i 450-500 μm tykke skiver, anvendes samme protokol efter hele-celle optagelser. Men brug af tyndere skiver vil resultere i mindre komplet rekonstruktioner af cellerne.
Protocol
Alle procedurer, der anvendes i hele denne undersøgelse blev udført ifølge de britiske Home Office forordninger med hensyn til dyr videnskabelige procedurer Act 1986.
1. bestemmelse af Calcium bindende Protein eller proteinindhold i Interneurons og Biocytin visualisering efter elektrofysiologiske optagelser og Biocytin fyldning
Bemærk: For enden af de elektrofysiologiske optagelser udsnit, der indeholder biocytin-fyldte celler er faste natten før histologiske procedurer. Fikseringsvæske løsningen vil blive erstattet med en enkelt ændring af 0,1 M fosfat buffer næste morgen, hvis resten af proceduren er udført på en anden dag, for at forhindre vævsskade. Fiksering løsning (4% PARAFORMALDEHYD, 0,2% mættet picrinsyre syre opløsning, 0.025% glutaraldehyd løsning i 0,1 M fosfat-buffer (PB)) skal gøres frisk på dagen for optagelserne for de bedste resultater.
- For enden af den elektrofysiologiske optagelse omhyggeligt afhente det udsnit, der indeholder de indspillede celler med en pensel og placere det i en gryde, der indeholder kunstige cerebral-spinalvæske (ACSF).
Bemærk: Oplysninger om den protokol, der bruges til skive forberedelse og intracellulære optagelser ved hjælp af skarpe elektroder har været beskrevet tidligere28. - I et stinkskab, omhyggeligt afhente hjernen skive med en pensel og rulle det på et lille stykke af fine kvalitet filtrerpapir. Læg et andet stykke fugtet filtrerpapir ind på skive og placere de to stykker af våde filterpapir i en lille plastikbeholder, der indeholder 5-10 mL af Fikseringsvæske løsning og opbevares i køleskab natten over ved 4 ° C.
- Der fremstilles en opløsning af gelatine i destilleret vand. Anbringes 20 mL destilleret vand i et bægerglas på en varm tallerken og varme det til 60 ° C. Tilsættes gradvist 2,4 g gelatine til vand, vent indtil opløst og lad det køle til 35-40 ° C før brugen for at forhindre vævsskade.
- Erstatte den Fikseringsvæske løsning med 2 mL af 0,1 M PB. Placer skive i en petriskål og skære væk overskydende væv med en skalpel klinge. Placer de klippede væv i en petriskål (diameter 9 cm, højde på 1,4 cm), at sikre, at det ligger flad uden folder og folder, og fjerne den overskydende buffer ved hjælp af en tør pensel.
- Dække væv med varm gelatine løsningen og placere petriskål på en frossen blok hurtigt afkøles løsningen.
- Ved hjælp af en vinkel-poise lampe for at give kontrast, ser gennem siden af skålen og holde skive flad med let tryk fra en fin pensel, indtil gelatine begynder at indstille.
Bemærk: Gelatine kan være re smeltet hvis vævet ikke lyver flad. Ethvert skønhedsfejl på overfladen af gelatine forårsaget af fjernelse af pensel som det størkner kan fjernes ved at smelte overflade lag forsigtigt ved at flytte pære lampe tæt på overfladen i et par sekunder. - Flytte parabol af indstillingen gelatine til køleskabet og forlade ved 4 ° C i 30-60 min.
- I et stinkskab, skåret ud af en lille blok (~ 1 x 1 cm) indeholdende gelatine-embedded væv af fadet ved hjælp af en skalpel klinge, løfte blok med en lille spatel og omhyggeligt placere den i den samme men friske Fikseringsvæske løsning bruges til at lave skiver i mindst 30 min. ved 4 ° C .
- Vask gelatine blok i 5 mL af 0,1 M PB tre gange, tør det ved hjælp af et stykke papir væv og stick blok side op (dvs.med væv i toppen) ind på en vibratome chuck bruger superlim.
- Fjern overskydende lim med et stykke filtrerpapir og bruge en skalpel blade for at afskære hjørner af blokken, forlader en diamantform.
- Afsnit skive på 50 µm tykkelse ved hjælp af en vibratome og læg hver sektion omhyggeligt i et hætteglas, som indeholder 10% saccharose.
- Omhyggeligt afhente en sektion fra hætteglasset, læg det fladt i en petriskål låg. Bruger et dissekere mikroskop og en frisk skalpel klinge, fjerne gelatine fra omkring sektionen og returnere afsnittet til et hætteglas indeholdende 2 mL frisk 10% saccharose
Bemærk: Det er vigtigt at fjerne så meget gelatine som muligt på dette stadium at reducere væv krympning under trinnet dehydrering (trin 1,37). - Cryo-beskytte sektioner i 0,1 M PB-baserede saccharose-glycerol løsning ved stuetemperatur ved at inkubere dem i 10 min i 10% rørsukkeropløsning, 20 min på 20% saccharose - 6% glycerol løsning to gange og endelig 30 min i 30% saccharose - 12% glycerol løsning to gange under konstant uro.
- Placer sektioner fladt på en lille rektangel i sølvpapir ved hjælp af et paintbrush. Fjern overskydende væske fra afsnittene og forsigtigt fold sølvpapir i en parcel.
- Hold parcel tæt på overfladen af flydende nitrogen uden at berøre overfladen for 30 s og derefter tillade sektioner at tø helt for ca. 30 s. Gentag fryse-tø en anden to gange.
- Fjerne alle sektioner med en pensel og placere dem i et glas hætteglas indeholdende 2 mL af 0,1 M PB under konstant omrøring til at vaske væk overskydende saccharose.
- Fjerne PB med Pasteur pipette og inkuberes sektioner i 2 mL 1% vandig H2O2 for 30 min. vask sektioner i 2 mL af 0,1 M PB 3 x 5 min.
- Fjern 0,1 M PB med Pasteur pipette og tilsæt 1% natriumborhydrid (Kristian4) i 0,1 M PB.
Bemærk: Ikke cap hætteglas, som Kristian4 løsning giver off brintgas. - Fjerne natriumborhydrid med Pasteur pipette og vaske afsnittene grundigt i 2 mL af 0,1 M PB 5 x 5 min.
- Erstatte 0,1 M PB med 10% normalt ged serum (NGS) i 0,1 M PB i 30 min.
- Fjerne ged serummet og inkuberes sektioner natten over ved 4 ° C i en blanding af musen monoklonale og kanin polyklonale antistoffer består i ABC løsning.
Bemærk: En liste over primære antistoffer bruges i tidligere undersøgelser vises i tabel 1 i Botcher et al. (2014) 29. - Inkuber sektioner i 2 timer i mørke i en blanding af fluorescently mærket sekundære antistoffer (Tabel af materialer).
- Montere sektioner på dias i montering medium og dække med en coverslip.
- Tage billeder af fluorescens mærkning på 40 X forstørrelse (figur 1Bb).
- Efter fluorescens imaging, placere diasset i et glas petriskål indeholdende PBS og fjern forsigtigt coverslip. Derefter vask sektioner væk fra diaset, ved hjælp af blide impulser af PBS fra Pasteur pipette. Placere sektionerne i en ren hætteglas indeholdende PBS.
- Udføre begærlighed-HRP reaktion ved for det første inkubere sektioner i ABC i mindst 2 timer til at forstærke HRP reaktionsprodukt.
- Forberede 3,5 diaminobenzidine (DAB) løsning ved at føje én tablet til 5 mL destilleret vand.
- Vask sektioner med PBS tre gange i 10 min og derefter med Tris bufferen to gange i 10 min. Fjern Tris buffer efter den sidste vask.
- Hurtigt tilføje en dråbe af 8% NiCl2 løsning til DAB løsningen, afpipetteres løsning ind og ud for at blande og hurtigt tilføje 1 mL af denne opløsning over sektionerne. Inkuber sektioner i DAB/NiCl2 løsning for 15 min.
- Tilsæt 10 µL 1% H2O2 til DAB løsningen. Tillad reaktion at fortsætte i mørke under konstant omrøring i ca 1-2 min. og overvåge mærkning af de udfyldte celler med en dissekere mikroskop.
- Reaktionen standses ved at fjerne DAB/NiCl2h2O2 løsning og vaske sektioner med Tris bufferen to gange i 5 min.
- Placer en lille kreds af filtrerpapir i en petriskål i et stinkskab, og dæmpe det med 0,1 M PB. Ophæve afsnittene med én ad gangen fra glasset vial ved hjælp af et paintbrush, og placere dem omhyggeligt flade på papiret.
- Dække sektioner med en anden fugtede cirkel filtrerpapir og fjerne overskydende buffer ved forsigtigt at trykke silkepapir til overfladen.
- Anvende 8 – 9 dråber 1% osmium dinitrogentetraoxid i 0,1 M PB til toppen papir, Dæk fadet og fastholde i stinkskab for mindst 30 min., men ikke mere end 1 h.
- Åbn petriskålen og løft det øverste filtrerpapir. Ophæve afsnittene omhyggeligt en ad gangen med en pensel, lægge dem i et hætteglas og skyl dem i destilleret vand to gange.
- Bortskaffe osmium dinitrogentetraoxid affald korrekt. Skyl alle disponible udstyr og placere dem i passende placeringer.
- Placer hvert afsnit fladt på et glas dias og coverslip i afsnit. Overføre diasset i en petriskål, skal du placere en tom hætteglasset over coverslip at beholde det på plads og dække med 50% alkohol. Efter 15 min, Fjern diasset fra opløsningen og fjerne afsnittene fra diaset. Sted i afsnit tilbage på diaset og derefter placere lysbillede i 70% alkohol i 15 min. Gentag den samme proces med 95% og 100% alkoholopløsning.
- Efter dehydrering trin, skal du overføre sektionerne til et hætteglas, som indeholder 100% alkohol på en shaker i et stinkskab. Erstatte alkoholopløsning med propylenoxid (C3H6O) og vaskes tre gange i 5 min. Efter den sidste vask, holde ~ 2 mL af propylenoxid i hætteglasset og tilføje harpiks (1:1 ratio). Sikre at harpiksen er opløst og holde sektioner under konstant omrøring i 30 min.
- Hver sektion i en aluminium planchette indeholdende epoxyharpiks ved hjælp af en træpind og inkuberes natten over.
Bemærk: Lad ikke sektioner i harpiks, der er længere end 24 timer til at undgå risikoen for at beskadige sektionerne. - Planchette over en varmeplade i ca 10 min. afhente hver sektion med en træpind og placere dem på en ren dias. Holde retningen af hver sektion konsekvent ved hjælp af en dissekere mikroskop. Placer en coverslip over sektionerne. Placer diaset i ovnen i 48 timer ved 56 ° C for at kurere.
2. 3D Neuronal rekonstruktioner
Bemærk: Neurolucida software er brugt. Instruktionerne nedenfor gælder kun for en bestemt neuronsygdomme genopbygning system (Tabel af materialer). Afsnittene fra skæring matches før rekonstruktioner ved hjælp af et mikroskop.
- Placere et dias på scenen og fastgør med scenen klippet og åbne neuron genopbygning software. Klik på erhverve fanen og vælg levende billede.
- Måle tykkelsen af hvert afsnit ved hjælp af 100 X olie mål linse. Notere værdien på z-meter på toppen og bunden af hver sektion og beregne snittykkelse som forskellen mellem de to værdier.
- Brug en lav forstørrelse mål for at fokusere på den hjem afdeling indeholder cellen kroppen. Brug derefter et 100 x mål, fokusere på cellen kroppen og klik i midten til at markere referencepunktet.
- Vælg Serie sektionsleder, under fanen spor . Vælg derefter Opret ny sektion (+ ikon) i den Serie Afsnit Bestyrer rude. Angiv antallet sektioner. Navngiv hvert afsnit i den korrekte rækkefølge, Z og Indtast cut tykkelse målt i trin 2.2.
- For at spore soma i 3D ved hjælp af 100 X mål, vælge kontur fra fanen Trace og vælg cellen kroppen konturen. Brug joysticket til at flytte fokus til toppen af cellen kroppen. Placer punkterne ved at klikke på omkring omkredsen af den del, der er i fokus. Højreklik og vælg Tæt kontur til at afslutte denne første skitse. Gentag denne proces på forskellige z positioner, indtil bunden af cellen kroppen er nået (figur 2).
Bemærk: Vælg 3D visualisere i Trace under fanen til at visualisere cellen kroppen i 3D. - For at spore celle organ i 2D bruger 100 X mål, skal du vælge cellen kroppen fra menuen Neuron i fanen spor . fokus på midten af cellen kroppen. Placer punkterne ved at klikke på langs kanten af cellen kroppen. Til at udfylde cellen kroppen, højreklik og vælg Udfør cellen kroppen.
- For at spore de dendritiske arbor, Vælg dendrit eller Apikale dendrit i menuen Neuron . Først spore en korte, indledende segment for hver dendrit, med musens rullehjul til at justere markøren til at matche diameteren af dendrit diameter. Spore langs hver dendritter bruger joysticket til at flytte hele afsnittet og musens rullehjul til at justere diameteren af vektoriseringen.
- Kontroller justeringen af sporing med live mikroskop billede og Juster om nødvendigt, især efter bevæger sig ved hjælp af joysticket. I fanen spor Vælg Juster sporing, klik på sporing og derefter klikke på den korrekte placering.
- Når en node i træet er nået, højreklik og vælg Bifurcating Node eller Trifurcating Node fra drop-down menuen.
- Når slutningen af en gren er nået, skal du vælge en slutning fra drop-down menuen i menuen Neuron . Vælg den rigtige slutter, i.e., høje slutter, normale afslutning eller low slutter at lette matchende på tværs af sektioner.
- Reducere forstørrelse på mikroskopet, når alle dendritter i den aktuelle sektion har været spores, Vælg fanen Glæde gratis og flytte til et afsnit, der matcher umiddelbart over eller under det færdige afsnit.
- For at identificere matchende point mellem dendritter i et afsnit, der matcher den færdige afsnit, skal du klikke på fanen flytte og vælg Match Point. Vælg antallet point, der kræves for at blive matchet (tre eller flere punkter er at foretrække), og tryk derefter på OK. Klik på afslutningen af en udfyldt gren og derefter klikke på grenen. Gentag dette for hver match point. Gentag denne proces på 100 X forstørrelse at sikre nøjagtig matchning.
- Tilføje matchende grene til den forrige afsnit direkte ved at højreklikke på slutter. Vælg Tilføj til slutning , når grenen linjer med udfyldte røbestof gren og spor som tidligere beskrevet.
- Når alle dendrites af hvert afsnit har været spore, spore axon ved hjælp af den samme proces ved at vælge Axon menuen Neuron .
- Gå til afsnittet hjem at tilpasse genopbygning med live mikroskop billedet og vælg konturer Trace tab. Vælg en foruddefineret kontur/lag grænseregion/kant og klik på at spore langs en kontur. Vælg slutningen åben kontur. Spore alle ønskede lag og regionen konturer.
- Bruge 3D visualisere i Trace under fanen til at visualisere rekonstruktioner i 3D.
- At optage videoer af 3D rekonstruktioner (Video 1), Åbn den 3D rekonstruktion og åbne Opret film. Angive en fil destination og ønskede rotationshastighed. Det anbefales at indstille rotationen til 270°. Vælg starte optagelsen, post i et par sekunder, og derefter klikke på Auto-rotere. Vælg skal stoppe indtaling, når det kræves. Redigere video med videoredigering software (Tabel af materialer).
- For at eksportere filer til Tiff eller JPEG filer, Vælg fil | Eksportere | Eksport sporing som billede. Vælg en µm/pixel forholdet og passe. Vælg en baggrundsfarve og vælge filen. Navngiv filen, Vælg Tiff eller JPEG og tryk på Gem. For at eksportere filer til vektorfiler, Vælg fil | Eksportere | Eksport sporing som vektorfiler.
- Bruge en neuron genopbygning analyse software til at udføre morfometrisk analyser.
- For at analysere dendritiske træer og få en dendrogram, skal du åbne filen i Neurolucida Explorer. Vælg analysere | Struktur og vælg Dendrogram i drop-down menuen (figur 3).
- For at udføre en omfattende morfometrisk analyse af de 3D rekonstruktioner (gren kompleksitet, mængder af grene og svovldepositioner, areal), skal du åbne filen i softwaren. I fanen Vis skal du klikke på Marker alt. Vælg fanen analyser . Vælg derefter struktur og Gren struktur analyse.
3. fejlfinding
- Ændre kameraindstillingerne. For de bedste resultater, indstille eksponering til mindre end 100 ms og få og udligne så tæt på 0 som muligt.
- Hvis neuron genopbygning software ikke viser automatisk spores konturerne som en 3D cellen kroppen i 3D visualisere i Trace under fanen, Vælg Marker objekter i Trace under fanen, hold Ctrl -tasten på tastaturet og Klik på alle tegnede konturerne, højreklik og vælg derefter indstille cellen kroppen på den henlægge-nede menu.
- For at justere z-parametrene for en enkelt gren, Vælg træet (Vælg objekter i Trace under fanen) og indstille rullemenu z-justering af alle punkter via højreklik-menuen. Vælg Rediger z position, og derefter vælge Skift z værdi og Angiv den ønskede værdi.
- Justere rekonstruktioner ved hjælp af 'Gå til' under fanen ' flytte' når det er nødvendigt at flytte en stor afstand over vektoriseringen.
- Tilføje yderligere noder på ethvert tidspunkt under genopbygningsprocessen. Vælg den gren, hvor noden er at blive placeret i (Vælg objekt i Trace under fanen og klik på grenen), højreklik, og vælg Indsæt Node i udvalgte træ. Klik derefter på den rigtige placering på grenen.
- Når rekonstruere en kompleks neuronsygdomme, spore matchende grene individuelt og senere splejse dem for lettere identifikation af grene. Spore filialer i den nye sektion individuelt og derefter knytte disse grene til de matchende grene på det foregående afsnit af svævende over ophøret af filialen at blive splejset, højreklik og vælg splejsning, så svæver over slutter, grenen er at blive splejset til og klik.
- Hvis en gren er spores under den forkerte træ type, Vælg træet, højreklik og vælg Skift træ Type, og vælg den korrekte træ.
- Hvis et punkt er forkert placeret, udføre Ctrl + Zeller klikke på knappen Fortryd i menuen spor til at fjerne det sidste punkt. Denne procedure fungerer dog ikke, hvis joysticket bruges til at flytte på tværs af afsnittet før du forsøger at fjerne et punkt. I dette tilfælde kan punktet fjernes når branchen er afsluttet. Vælg grenen (tryk på Vælg objekt og klik på grenen), svæve over punktet at blive fjernet, højreklik og vælg Fjern punkt.
- Hvis du er usikker om to grene er matchet, enten 1) bruge 3D Visualiser i Trace under fanen til at kontrollere sektioner om grenene match i z-plan, eller 2) bruge Vis flankerende funktion i seriel Afsnit Bestyrer for at få vist straks ovenfor og nedenfor den aktuelle sektion i grå.
- Hvis et afsnit er vendt, gå til værktøjer under fanen spor Vælg Juster XY skalering og ændre x-aksen til -1. Derefter vælge korrekte Z-krympning og ændre z-akse til -1. Derefter spore grene som sædvanlig. Husk at vende disse ændringer, når du flytter til en sektion, der havde den oprindelige orientering. Ændre x - og z - aksen vil ikke ændre gren slutter etiketter, så vær forsigtig, når splicing, at den rigtige slutninger der anvendes.
- Korrekte Z-svind kan rettes, hvis der er en betydelig forskel mellem afsnittet skære tykkelse og monteret tykkelse måles. Vælg værktøjerog derefter rette Z-svindi fanen spor , og skriv svind faktor til z-aksen som Decimalrepræsentation cut tykkelsen divideret med den monterede tykkelse.
Representative Results
Neuroner i hippocampus CA2 var fyldt med biocytin efter elektrofysiologiske optagelser (tal 1Ac, Ad og 1Bc, Bd). Skiver var fastsatte natten efter optagelserne og neurochemistry og morfologiske karakterisering af neuroner blev afsløret efter protokollen beskrevet her.
Calcium bindende protein eller proteinindhold fyldt interneurons blev fastsat ved at inkubere skiver først med primære antistoffer og derefter med fluorescently mærket sekundære antistoffer. Fyring Karakteristik af interneurons under optagelserne vil diktere valget af primær antistoffer bruges. Avidin-AMCA blev brugt til at visualisere biocytin-fyldte interneuron og anti-mus fluorescein isothiocyanat (FITC) og ged anti-kanin Texas rød (TR) blev brugt til at karakterisere interneuronal neurochemistry (figur 1Bb).
Efter fluorescens visualisering anvendtes en HRP-protokollen til at afsløre biocytin (figur 1Ab). Den fine detaljerede anatomi af CA2 interneurons blev derefter tegnet i 3D ved hjælp af en neuron genopbygning software (figur 2 og figur 3a). En video af en 3D rekonstruktion af en kurv celle registreres og udfyldt CA2 vises i Video. Neuronal rekonstruktioner blev betragtet som fuldstændig, hvis begge dendritiske og cytoskeletale Dorne var begrænset i dybden af 450-500 μm skive. Dårlig cytoskeletale arbor farvning blev vurderet af afkortede grene med åbne slutninger på toppen eller bunden af skive eller af en farvning tilstedeværelse, der var begrænset til axon indledende segment og meget proksimale grene. Figur 4 repræsenterer eksempler på en god og en dårlig HRP farvning følgende biocytin visualisering.
Kan foretages morfometrisk analyse af 3D rekonstruktioner (figur 3) for at demonstrere gren kompleksitet, soma areal og overfladeareal og volumen af dendritiske og cytoskeletale Dorne.
Figur 1 : Neuronal rekonstruktioner af to typer af kurv celler registreres og fyldt i regionen hippocampus CA2 og korreleret elektrofysiologiske data opnået følgende intracellulære optagelser i vitro. Dette tal er blevet ændret fra tidligere undersøgelser23,24. SÅ Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: rekonstruktion af en CA2 kurv celle med begrænset dendritiske og cytoskeletale arbor ved hjælp af en tegning tube (1000 X). Dendrites er i sort, og axon er i rødt. AB: Billede af cellen biocytin-fyldte kurv efter begærlighed-HRP protokollen beskrevet her. AC: Repræsentative spor af spænding svar til hyperpolarizing og depolariserende nuværende injektion af en CA2 kurv celle med begrænset dendritiske og cytoskeletale arbor. Annonce: Eksempel på en CA2 pyramide til at indsnævre arbor kurv celle forbindelser registreret ved hjælp af skarpe elektroder. Sammensatte excitatoriske post synaptic potentiale (EPSP) gennemsnit Vis kort tog depression tilsyneladende under svar til togene i tre spikes. (B) Ba: 2D rekonstruktion af en CA2 kurv celle med bredt dendritiske og cytoskeletale Dorne ved hjælp af en tegning tube (1000 X). Denne kurv celle (i sort) dendritiske træ udvidet radialt gennem alle lag af CA2 region og vandret i klagepunktsmeddelelsen og SP af CA2 og CA3 regioner. En vandret dendrit også nået CA1 region. Axon (i rødt) udvidet til CA3 og CA1 regioner. BB: Biocytin-fyldt (AMCA farvning) kurv celle var PV-immunopositive (FITC farvning) og CB-immunonegative (Texas-rød farvning). BC: Repræsentative spor af spænding svar til hyperpolarizing og depolariserende nuværende injektion af en CA2 kurv celle med bredt dendritiske og cytoskeletale arbor. BD: Composite EPSP gennemsnit Vis kort tog lettelse tilsyneladende under svar til togene i tre spikes. Eksempler på andre typer af interneurons indspillet i CA2 kan findes i tidligere undersøgelser25,30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : 3D cellen kroppen genopbygning. (A) 3D sporing af cellen kroppen. Visning af forskellige konturer spores på forskellige z positioner, mens fokus gennem cellen kroppen. (B) 3D-visning af de forskellige konturer. (C) 3D-visning af cellen kroppen på en anden vinkel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Morfometri analyser af 3D neuronal rekonstruktioner. (A) 3D rekonstruktion af en CA2 smalle arbor kurv celle. Hver dendritiske gren er repræsenteret af en farve (grøn, blå, rød og lyserød) og axon i lyseblå. (B) Dendrogram af cellen kurv der repræsenterer antallet af dendritiske grene og længden af hvert segment indeholdt i kugler koncentrisk med soma og 100 μm mellemrum fra soma. Farverne på dendrogram svarer til dendritter i A. (C) eksempel på morfometrisk analyse udført på CA2 pyramideformet celler (tilpasset fra en tidligere undersøgelse23). Antallet af dendritiske grene var plottes afstanden fra soma CA2 pyramideformet celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Eksempler på god (A) og dårlige (B) HRP farvning. (A) Biocytin recovery afslørede en meget godt fyldt interneuron i CA2. Cellen kroppen (CB) er mørkt farvet og har klare konturer. Dendrites er beaded og vises nogle pigge (repræsenteret af røde stjerner). Den cytoskeletale arbor (A) er tætte og præsenterer lille boutons. (B) eksempel på en dårlig dendritiske og cytoskeletale farvning af 2 pyramideformet celler i CA2. Farvning af CB er svag med ingen klare omrids. Dårlig farvning er ofte forbundet med kortere elektrofysiologiske optagelser resulterer i overværelse af meget få fyldt med biocytin grene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: 3D neuronal rekonstruktion af en CA2 kurv celle med begrænset dendritiske arbor (også benævnt CA2 smalle arbor kurv celle) med dens soma i stratum pyramidale, dendritter spænder over alle lag og axon i CA2 stratum pyramidale og tilstødende stratum oriens og radiatum. Meget få filialer nåede proksimale CA3 stratum oriens og CA3 stratum pyramidale. Denne celle var fyldt med biocytin efter elektrofysiologiske optagelser og sektioner blev behandlet med begærlighed-HRP efter protokollen beskrevet her. På grund af udskæring, blev kun axon i dybden af skive genfundet, selvom dendritter er intakt. Dendritter er i mørk pink og axon i hvid. Lag og regionen grænser er blevet tilføjet i begyndelsen af videoen. 3D rekonstruktion af Georgia Economides-3D video af Svenja Falk. Videoen blev optaget med en neuron genopbygning software som angivet i trin 2.17 og redigeret med en videoredigeringsprogrammer. Link til video:30. Venligst klik her for at downloade denne video.
| Løsninger, der anvendes | Sammensætning/vejledning |
| Fiksering løsning | 4% PARAFORMALDEHYD, 0,2% mættet picrinsyre syre løsning, 0.025% glutaraldehyd løsning i 0,1 M fosfat-buffer (PB) |
| 0,1 M fosfat Buffer pH 7,6 | Tilsættes 100 mL af stock 1 M fosfat Buffer til 900 mL destilleret vand |
| Phosphat bufferet saltvand (PBS) pH 7,4/7.5 | Der tilsættes 10 mL af 0,1 M fosfat buffer, 0,2 g af KCl og 8.76 g NaCl til 990 mL destilleret vand |
| TRIS buffer pH 7,5 | Opløse 5,72 g af Tris hydrochlorid og 1.66 g af Tris Base i 50 mL destilleret vand. Derefter gøre op til 1 L med destilleret vand. |
| Glutaraldehyd og PARAFORMALDEHYD Fikseringsvæske bufferopløsning | 4% PARAFORMALDEHYD, 0,2% mættet picrinsyre syre løsning, 0.025% glutaraldehyd løsning i 0,1 M fosfat-buffer. |
| ABC løsning | Løsningen skal foretages mindst 30 min før brug fra ABC kit. Tilføj 1 dråbe af opløsning A og 1 dråbe opløsning B til 2,5 mL PBS. |
| Durcupan epoxyharpiks: | At gøre 20 gryder: 20 g af komponent A, 20 g af komponent B, 0,6 g af komponent C og 0,4 g af komponent D - |
| Beskytte restbeløbet fra spild ved at dække pladen med en cirkel filtrerpapir. Omhyggeligt afvejes reagenser i et tripour bæger i proportionerne anført ovenfor. Blandes grundigt ved energisk omrøring ved hjælp af to træpinde i mindst 5 min. Blandingen bør blive en ensartet tæthed mørk brun farve. Bægerglasset anbringes i ovnen ved ~ 50 ° C i højst 10 min at fjerne så mange luftbobler som muligt. Bemærk: Harpiksen vil begynde at helbrede hvis du forlader bægerglas i ovnen længere end 10 min. Decant harpiks i plastic Potter eller 5 mL sprøjter, dato dem og gemme i-20 ° C fryser klar til brug. |
Tabel 1: Oversigt over løsninger.
Discussion
Elektrofysiologiske optagelser i vitro (figur 1 Ac,d og Bc, d) kombineret med histokemiske og immunhistokemiske procedurer aktiverer detaljeret morfologi, calcium bindende proteinindhold og identitet af voksen kortikale interneurons registreret til at blive afsløret. I regionen CA2, denne teknik tilladt studiet af den lokale kredsløb for første gang og afslørede underklasser til interneurons, der ikke havde været tidligere beskrevet i CA1 eller CA3: bredt dendritiske og cytoskeletale arbor kurv celler (figur 1B), bistratified celler og SP-SR interneurons.
Protokollen beskrevet her er blevet optimeret for at bevare ultrastruktur af neuroner og opnå fremragende inddrivelse af både dendritiske (herunder pigge) og cytoskeletale Dorne. Kritiske trin omfatter brugen af dobbelt fiksering teknik til at øge kontrasten for lysmikroskopi26 og tilsætning af glutaraldehyd og picrinsyre syre løsning til Fikseringsvæske løsningen at styrke antistof penetration og bevarer de neuronal ultrastruktur27. Blid fryse-tø permeabilization giver bedre bevarelse af fine struktur, mens osmication og integrering af harpiks reducerer z-plane svind28. Derudover er visualisering af meget fine strukturer (fine axoner med små boutons for eksempel) forbedret ved at inkubere sektioner med H2O2 og Kristian4 at reducere baggrund farvning. Kontrast kan også blive øget med tilføjelse af NiCl2 til HRP reaktion.
Den histologiske procedure detaljeret her tilbyder fremragende resultater med hensyn til reproducerbarhed og pålidelighed. Varigheden af de elektrofysiologiske optagelser vil imidlertid bestemme kvaliteten af biocytin/fluorescens farvning, med kortere optagelser som regel forbundet med dårlig cytoskeletale farvning. Valget af optagelse protokoller (intracellulære optagelser ved hjælp af skarpe elektroder vs hele-celle patch opspænding) kan også påvirke biocytin opbevaring og bevarelse af fine anatomi.
Mens de vanskeligheder i bevare fine struktur under histologisk bearbejdning beskrevet her, og den tid, det tager at rekonstruere på 100 X forstørrelse (1-4weeks afhængigt af kompleksiteten af axon) er værdsat, denne metode giver en nøjagtig repræsentation af dendritiske og cytoskeletale diametre. Brugen af mindre krævende protokoller til at afsløre biocytin-mærkning er forståeligt, men disse udelukker ofte klart visualisering af fine cytoskeletale grene. Rengøringsmidler, at fremme indførelsen af begærlighed-HRP at afsløre biocytin og antistoffer, er ofte nødvendigt i tyk sektioner, men kan forstyrre den fine struktur. Neuroforskere Søg konstant for semiautomatisk metoder til genopbygning, men for nu og for axoner især, biocytin-HRP med manuel genopbygning er fortsat guldstandarden31.
Meget detaljerede neuronal rekonstruktioner, især nøjagtige tegninger af cytoskeletale boutons og noder, tilstedeværelse eller fravær af myelin og mere generelt tegning af komplet cytoskeletale arbor, med repræsentation af nøjagtige axon-diameter ændrer langs dens længde, give yderligere oplysninger til nøjagtig identifikation af en særskilt type af interneurone. Selv om mange interneurons ikke kan passe nøjagtigt ind i en bestemt klasse, indeholder den teknik beskrevet ovenfor korrelerede data om neuronal elektrofysiologiske egenskaber, kortsigtede plasticitet er forbundet med en bestemt type af forbindelse og detaljerede neuronal rekonstruktioner, så ledningsdiagrammet i CA2 region, for eksempel, kan studeres i detaljer.
Fine, detaljerede struktur er ofte forenkles i computational modeller. Mens forståeligt, resulterer dette i tab af de oplysninger, der kunne vise sig kritisk i fremtiden. Analyse af detaljerede 3D rekonstruktioner med parallelle synaptic data vil tillade tilføjelsen af yderligere kriterier for interneuronal klassificering. Data kan deponeres i offentlige arkiver og bruges af modeludviklere for at undersøge resultatet af sporadiske ændringer i axon diameter og myelination på aktionspotentialet formering beregningsmæssigt.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning har modtaget støtte fra Novartis Pharma (Basel) og det medicinske Forskningsråd tildelt Prof Alex Thomson, bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), den fysiologiske samfund, EUs Horizon 2020 rammeprogram for forskning og Innovation under specifikke aftale nr. 720270 (menneskelige hjerne projekt SGA1) og under specifikke aftale nr. 785907 (menneskelige hjerne projekt SGA2). Vi er meget taknemmelige for Prof Alex Thomson for opsætning af protokollen i andre kortikale regioner, sikring af midler og for sin fortsatte støtte til dette projekt. Bidrag fra lab-medlemmer, der har hjulpet optimering recovery-protokollen og rekonstrueret CA2 neuronernes anerkendes taknemmeligt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
- Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
- Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
- Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
- Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
- Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
- Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
- Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
- Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
- Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
- Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
- Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
- Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
- West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
- Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
- Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
- Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
- Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
- Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
- Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
- Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
- Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
- Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).
