Den protokol, der er skitseret her beskriver immunofluorescens analyse, biocytin opsving og høj kvalitet rekonstruktioner af hippocampus CA2 interneurons efter den intracellulære elektrofysiologiske optagelser in vitro tillader neuronal karakterisering og i sidste ende fine neuronal anatomi undersøges.
Hvordan kortikale netværksaktivitet behandler er oplysninger af betydning for en lang række grundlæggende og kliniske videnskabelige spørgsmål. Protokollen beskrevet her identificerer de grundlæggende byggesten i dette kredsløb. De grundige undersøgelser af kortikale regioner vil i sidste ende giver andre forskere med kredsløb komponenter nødvendig for en forståelse af hvordan hjernen erhverver, behandler og lagrer oplysninger og hvad der går galt i sygdom, mens den elektrofysiologiske og morfologiske data er almindeligt anvendt af computational neuroforskere i konstruktionen af modellen netværk, at udforske informationsbehandling. Den protokol, der er skitseret her beskriver hvordan biocytin-fyldte celler indspillet i regionen CA2 i hippocampus er genvundet og derefter rekonstrueret i 3D. Derudover beskriver protokollen demonstration af calcium bindende protein eller peptid indhold i registrerede interneurons.
Cortex og hippocampus er strukturer af sådanne kompleksitet, klassificering af neuronal undertyper1,2,3,4, kort forbindelser mellem dem5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 og hvordan dette kredsløb understøtter kognitive funktioner12,13,14,15 er stadig under intens undersøgelse og genstand for fortsatte debat. For eksempel, forstår de detaljer og kompleksiteten af kredsløb og koordinere data fra mange forskellige undersøgelser, det er ekstremt nyttigt at være i stand til at definere og beskrive komponenterne, men det stadig diskuteres hvordan mange forskellige klasser af neuroner findes, eller selv om det er muligt at definere alle neuroner som tilhører en bestemt klasse. Beregningsmæssige redskaber, der kan bygge og teste kredsløb med varierende grader af kompleksitet bliver udviklede16,17,18, men centralt for disse bestræbelser er behovet for detaljerede undersøgelser af celletyper og egenskaber for forbindelser mellem dem. En stor mængde oplysninger om den lokale kredsløb af neocortex af voksne rotter er allerede blevet indsamlet ved hjælp af protokollen beskrevet her10,19,20,21, 22. selvom “ledningsdiagrammet” er langt fra komplet, nogle klare mønstre eller reglerne er opstået. Desuden, selv om nogle detaljer varierer, disse regler er i fælles for to pattedyrarter (rotte og kat) og på tværs af flere neocortical regioner, giver mulighed for udvikling af grundlæggende byggesten, der er tilbøjelige til at være lige så anvendelig til humane neocortex. Den teknik beskrevet her bruges til at udvide vores forståelse af den funktionelle kort af kortikale kredsløb ved at identificere de præsynaptiske og postsynaptiske neuroner involveret i forbindelser i de regioner, der ikke er blevet undersøgt i detaljer før, ved hjælp af en protokol der giver mulighed for fremragende væv bevarelse og bemærkelsesværdige farvning opsving i voksen hjernevæv. Data på den lokale kredsløb i CA2 og neuronal egenskaber i dette underfelt er blevet indsamlet med denne metode ved at kombinere intracellulære elektrofysiologiske optagelser (parrede optagelser med skarpe microelectrodes) med biocytin påfyldning, immunfluorescens, histologiske procedurer og meget detaljeret neuronal rekonstruktioner, giver mulighed for direkte sammenligning med de tilstødende CA regioner23,24,25.
Den teknik, der er beskrevet i denne artikel er blevet udviklet i de år at opnå detaljerede neuronal anatomi tillader det korrekt klassificering af celler og høj kvalitet og nøjagtige rekonstruktioner af både deres dendritiske og cytoskeletale dorne, data, der kan være korreleret med elektrofysiologiske data indsamlet fra parret optagelser ved hjælp af skarpe elektroder. Den histologiske protokol er blevet optimeret for at bevare ultrastruktur af neuroner og opnå fremragende inddrivelse af både dendritiske (herunder pigge) og cytoskeletale Dorne. F.eks. princippet om dobbelt fiksering teknik ved for det første nedsænkning i en Fikseringsvæske løsning og for det andet efter fastsættelse i osmium dinitrogentetraoxid giver en god kontrast til lysmikroskopi26. En lille mængde af glutaraldehyd og picrinsyre syre løsningen føjes til den Fikseringsvæske løsning ved at styrke antistof penetration og bevare celler ultrastruktur som foreslået i en tidligere undersøgelse27. Permeabilization af hjernen skiver ved hjælp af metoden fryse-tø kombineret med cryo-beskyttelse med saccharose, snarere end en traditionel vaskemiddel, også giver optimal bevarelse af væv til detaljerede morfologisk analyse af de optagne celler. Derudover er visualisering især af meget fine strukturer forbedret ved at reducere baggrund farvning med inkubationer med hydrogenperoxid (H2O2) og natriumborhydrid (Kristian4). Tilføje nikkel chlorid (NiCl2) med peberrodsperoxidase (HRP) øger reaktion at få en sort pigment reaktionsprodukt også kontrasten.
Følgende protokol beskriver de procedurer, der anvendes til at fastslå fremragende væv bevarelse og meget detaljerede neuronal 3D rekonstruktioner efter intracellulære optagelser i vitro. Beskrivelse af skive forberedelse, intracellulære parrede optagelser ved hjælp af skarpe elektroder og efterfølgende histologisk procedurer anvendes i vores laboratorium har været tidligere rapporteret28. Selv om protokollen gælder for cellerne fyldt intracellulært med biocytin i 450-500 μm tykke skiver, anvendes samme protokol efter hele-celle optagelser. Men brug af tyndere skiver vil resultere i mindre komplet rekonstruktioner af cellerne.
Elektrofysiologiske optagelser i vitro (figur 1 Ac,d og Bc, d) kombineret med histokemiske og immunhistokemiske procedurer aktiverer detaljeret morfologi, calcium bindende proteinindhold og identitet af voksen kortikale interneurons registreret til at blive afsløret. I regionen CA2, denne teknik tilladt studiet af den lokale kredsløb for første gang og afslørede underklasser til interneurons, der ikke havde været tidligere beskrevet i CA1 eller CA3: bredt dendritiske og cytoskeletale arbor kurv celler (figur 1B), bistratified celler og SP-SR interneurons.
Protokollen beskrevet her er blevet optimeret for at bevare ultrastruktur af neuroner og opnå fremragende inddrivelse af både dendritiske (herunder pigge) og cytoskeletale Dorne. Kritiske trin omfatter brugen af dobbelt fiksering teknik til at øge kontrasten for lysmikroskopi26 og tilsætning af glutaraldehyd og picrinsyre syre løsning til Fikseringsvæske løsningen at styrke antistof penetration og bevarer de neuronal ultrastruktur27. Blid fryse-tø permeabilization giver bedre bevarelse af fine struktur, mens osmication og integrering af harpiks reducerer z-plane svind28. Derudover er visualisering af meget fine strukturer (fine axoner med små boutons for eksempel) forbedret ved at inkubere sektioner med H2O2 og Kristian4 at reducere baggrund farvning. Kontrast kan også blive øget med tilføjelse af NiCl2 til HRP reaktion.
Den histologiske procedure detaljeret her tilbyder fremragende resultater med hensyn til reproducerbarhed og pålidelighed. Varigheden af de elektrofysiologiske optagelser vil imidlertid bestemme kvaliteten af biocytin/fluorescens farvning, med kortere optagelser som regel forbundet med dårlig cytoskeletale farvning. Valget af optagelse protokoller (intracellulære optagelser ved hjælp af skarpe elektroder vs hele-celle patch opspænding) kan også påvirke biocytin opbevaring og bevarelse af fine anatomi.
Mens de vanskeligheder i bevare fine struktur under histologisk bearbejdning beskrevet her, og den tid, det tager at rekonstruere på 100 X forstørrelse (1-4weeks afhængigt af kompleksiteten af axon) er værdsat, denne metode giver en nøjagtig repræsentation af dendritiske og cytoskeletale diametre. Brugen af mindre krævende protokoller til at afsløre biocytin-mærkning er forståeligt, men disse udelukker ofte klart visualisering af fine cytoskeletale grene. Rengøringsmidler, at fremme indførelsen af begærlighed-HRP at afsløre biocytin og antistoffer, er ofte nødvendigt i tyk sektioner, men kan forstyrre den fine struktur. Neuroforskere Søg konstant for semiautomatisk metoder til genopbygning, men for nu og for axoner især, biocytin-HRP med manuel genopbygning er fortsat guldstandarden31.
Meget detaljerede neuronal rekonstruktioner, især nøjagtige tegninger af cytoskeletale boutons og noder, tilstedeværelse eller fravær af myelin og mere generelt tegning af komplet cytoskeletale arbor, med repræsentation af nøjagtige axon-diameter ændrer langs dens længde, give yderligere oplysninger til nøjagtig identifikation af en særskilt type af interneurone. Selv om mange interneurons ikke kan passe nøjagtigt ind i en bestemt klasse, indeholder den teknik beskrevet ovenfor korrelerede data om neuronal elektrofysiologiske egenskaber, kortsigtede plasticitet er forbundet med en bestemt type af forbindelse og detaljerede neuronal rekonstruktioner, så ledningsdiagrammet i CA2 region, for eksempel, kan studeres i detaljer.
Fine, detaljerede struktur er ofte forenkles i computational modeller. Mens forståeligt, resulterer dette i tab af de oplysninger, der kunne vise sig kritisk i fremtiden. Analyse af detaljerede 3D rekonstruktioner med parallelle synaptic data vil tillade tilføjelsen af yderligere kriterier for interneuronal klassificering. Data kan deponeres i offentlige arkiver og bruges af modeludviklere for at undersøge resultatet af sporadiske ændringer i axon diameter og myelination på aktionspotentialet formering beregningsmæssigt.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning har modtaget støtte fra Novartis Pharma (Basel) og det medicinske Forskningsråd tildelt Prof Alex Thomson, bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), den fysiologiske samfund, EUs Horizon 2020 rammeprogram for forskning og Innovation under specifikke aftale nr. 720270 (menneskelige hjerne projekt SGA1) og under specifikke aftale nr. 785907 (menneskelige hjerne projekt SGA2). Vi er meget taknemmelige for Prof Alex Thomson for opsætning af protokollen i andre kortikale regioner, sikring af midler og for sin fortsatte støtte til dette projekt. Bidrag fra lab-medlemmer, der har hjulpet optimering recovery-protokollen og rekonstrueret CA2 neuronernes anerkendes taknemmeligt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |