Summary
Le protocole décrit ici décrit immunofluorescence analyse, récupération de la biocytine et reconstitutions de haute qualité d’hippocampe CA2 interneurones suivant le permettant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vitro, neuronale caractérisation et finalement fine anatomie neuronale à étudier.
Abstract
Comment l’activité réseau cortical traite information est d’importance pour un grand nombre de questions scientifiques fondamentales et cliniques. Le protocole décrit ici identifie les éléments de base de ce circuit. Les études approfondies des régions corticales fournira finalement autres scientifiques avec les composants du circuit nécessaires pour comprendre comment le cerveau acquiert, traite et stocke les informations et ce qui ne va pas dans la maladie, tandis que l’électrophysiologiques et les données morphologiques sont largement utilisées par les chercheurs en neurosciences computationnelles dans la construction de réseaux de modèle qui explorent le traitement de l’information. Le protocole décrit ici décrit comment les cellules remplies de la biocytine recensés dans la région CA2 de l’hippocampe sont récupérés et reconstruits ensuite en 3D. En outre, le protocole décrit la démonstration de calcium liaison protéique ou peptidique contenu dans des interneurones enregistrés.
Introduction
Le cortex et l’hippocampe sont des structures d’une telle complexité que la classification des neurones sous-types1,2,3,4, cartes des inter-connexions5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 et comment ce circuit prend en charge les fonctions cognitives12,13,14,,15 sont encore à l’étude intense et l’objet de poursuite du débat. Par exemple, pour comprendre les détails et la complexité des circuits et de coordonner les données obtenues à partir de nombreuses études différentes, il est extrêmement utile d’être capable de définir et de décrire les composants, mais il reste matière à débat comment beaucoup d’autres classes de neurones existent, ou même s’il est possible de définir tous les neurones comme appartenant à une classe spécifique. Outils informatiques qui peuvent construire et tester des circuits avec des degrés de complexité sont développés16,17,18, mais centrale de ces efforts est la nécessité pour des études détaillées des types de cellules et des propriétés des connexions entre eux. Une grande quantité d’informations sur les circuits locaux du néocortex de rats adultes ont déjà été collectée en utilisant le protocole décrit ici10,19,20,21, 22. bien que le « schéma de câblage » est loin d’être achevée, certains clairement motifs ou règles sont apparues. En outre, bien que certains détails varient, ces règles sont communes aux deux espèces de mammifères (rat et chat) et dans plusieurs régions néocorticales, permettant le développement de modules de base qui sont susceptibles de s’appliquer également au néocortex humain. La technique décrite ici permet d’étendre nos connaissances sur le plan fonctionnel des circuits corticaux en identifiant les neurones présynaptiques et postsynaptiques impliqués dans les connexions dans les régions qui n'ont pas été étudiées en détail avant, à l’aide d’un protocole qui permet la préservation des tissus excellent et remarquable reprise de coloration dans les tissus du cerveau adulte. Données sur les circuits locaux Ca2 et propriétés neuronales dans ce sous-domaine ont été recueillies grâce à cette méthode en combinant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires (enregistrements appariés avec des microélectrodes pointus) avec la biocytine remplissage, immunofluorescence, procédures histologiques et reconstitutions neuronales très détaillées, ce qui permet une comparaison directe avec les voisins CA régions23,24,25.
La technique décrite dans cet article a été mis au point au cours des années pour obtenir l’anatomie détaillée neuronal permettant le classement correct des cellules et de haute qualité et des reconstructions précises des deux leurs arbres dendritiques et axonales, données qui peuvent être en corrélation avec données électrophysiologiques des enregistrements appariés à l’aide d’électrodes pointus. Le protocole histologique a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir excellente récupération de dendritiques (y compris épines) et tonnelles axonales. Par exemple, le principe de la technique de double fixation par tout d’abord en plongeant dans une solution de fixation et deuxièmement après fixation au tétroxyde d’osmium donne un bon contraste pour la microscopie photonique,26. Une petite quantité de solution d’acide picrique et de glutaraldéhyde sont ajoutés à la solution de fixation pour améliorer la pénétration de l’anticorps et de préserver l’ultrastructure des cellules comme suggéré dans une précédente étude27. La perméabilisation des tranches de cerveau en utilisant la méthode de gel-dégel, combinée à la cryo-protection avec saccharose, plutôt qu’un détergent classique, fournit également une préservation optimale des tissus pour une analyse morphologique détaillée des cellules enregistrées. En outre, la visualisation en particulier de très beaux structures est améliorée en réduisant à la coloration de fond, avec les incubations avec peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le borohydrure de sodium (NaBH4). Ajout de chlorure de nickel (NiCl2) à la peroxydase de raifort (HRP) réaction pour obtenir un produit de réaction du pigment noir augmente également le contraste.
Le protocole suivant décrit les procédures utilisées pour s’assurer la préservation des tissus excellent et très détaillées reconstructions 3D neuronales après des enregistrements intracellulaires in vitro. La description de la préparation de la tranche, enregistrements intracellulaires de paires à l’aide de tranchant électrodes et les procédures suivantes histologiques utilisés dans notre laboratoire ont été rapportées antérieurement28. Bien que le protocole s’applique aux cellules remplis dans les cellules de la biocytine en tranches épaisses de 450 à 500 μm, le même protocole peut être utilisé après les enregistrements de cellules entières. Cependant, l’utilisation de plus minces tranches entraînera des reconstructions moins complètes des cellules.
Protocol
Toutes les procédures utilisées tout au long de cette étude ont été effectués conformément à la réglementation du Home Office britannique en ce qui concerne la Loi de procédures scientifiques Animal 1986.
1. détermination du Calcium Binding Protein ou teneur en protéines des interneurones et visualisation de la biocytine suite enregistrements électrophysiologiques et remplissage de la biocytine
Remarque : À la fin des enregistrements électrophysiologiques, tranches qui contiennent des cellules remplies de la biocytine sont fixés pendant la nuit avant des procédures histologiques. La solution de fixation sera remplacée par un simple changement de tampon phosphate 0,1 M le lendemain matin, si le reste de la procédure est réalisée sur un autre jour, afin d’éviter des lésions tissulaires. La solution de fixation (paraformaldéhyde à 4 %, solution de l’acide picrique saturée de 0,2 %, solution de glutaraldéhyde 0.025 % dans un tampon phosphate 0,1 M (PB)) il faut frais le jour des enregistrements pour des résultats optimaux.
- À la fin de l’enregistrement électrophysiologique, soigneusement ramasser la tranche contenant les cellules enregistrées avec un pinceau et placez-la dans un pot contenant le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF).
Remarque : Les détails du protocole utilisé pour la préparation de tranches et enregistrements intracellulaires utilisant des électrodes pointus ont été décrites précédemment28. - Sous une hotte, soigneusement ramasser la tranche de cerveau avec un pinceau et rouler sur un petit morceau de papier filtre de qualité fine. Placez un autre morceau de papier de filtre humide sur la tranche et placez les deux morceaux de papier filtre mouillé dans un petit pot en plastique contenant 5 à 10 mL de solution de fixation et les stocker dans le réfrigérateur pendant une nuit à 4 ° C.
- Préparer une solution de gélatine dans l’eau distillée. Introduire 20 mL d’eau distillée dans un bécher sur une plaque de cuisson et chauffer à 60 ° C. Ajoutez progressivement 2,4 g de gélatine dans l’eau, attendre jusqu'à dissolution et laissez-le refroidir jusqu'à 35 – 40 ° C avant utilisation pour éviter d’endommager les tissus.
- Remplacer la solution de fixation avec 2 mL de 0.1 M PB. Placer la tranche dans une boîte de Pétri et couper n’importe quel tissu excédentaire avec une lame de bistouri. Placer le tissu coupé dans une boîte de Pétri (diamètre de 9 cm, hauteur de 1,4 cm), veiller à ce qu’il se trouve à plat sans plis ni plis et enlever l’excès de tampon à l’aide d’un pinceau sec.
- Couvrir le tissu avec la solution de gélatine chaude et placer le plat de Pétri sur un bloc congelé de refroidir rapidement la solution.
- À l’aide d’une lampe d’angle-poise pour offrir un contraste, regarder à travers le côté du plat et garder la tranche plate à l’aide d’une légère pression d’un pinceau fin jusqu'à ce que la gélatine commence à définir.
Remarque : La gélatine peut être re-fondue, si le tissu ne se trouve pas plat. Toutes les imperfections sur la surface de la gélatine causée par la suppression de la brosse comme elle se solidifie sont révocables par la fonte de la couche de surface doucement en déplaçant l’ampoule de la lampe près de la surface pendant quelques secondes. - Déplacer la capsule de gélatine mise au réfrigérateur et laisser à 4 ° C pendant 30-60 min.
- Une hotte aspirante, découper un petit bloc (~ 1 x 1 cm) contenant du tissu de gélatine incorporé du plat à l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton, soulevez le bloc à l’aide d’une petite spatule et placer soigneusement dans la solution de fixation identique, mais fraîche utilisée pour fixer les tranches pendant au moins 30 min à 4 ° C .
- Laver le bloc de gélatine dans 5 mL de 0.1 M PB trois fois, séchez-le à l’aide d’un morceau de mouchoir en papier et le bâton, le côté du bloc vers le haut (c'est-à-dire, avec le tissu en haut) sur un vibratome mandrin à l’aide de colle.
- Enlever l’excès de colle avec un morceau de papier filtre et utiliser une lame de bistouri pour couper les coins du bloc, laissant une marque biconique.
- Section de la tranche à 50 µm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome et placer chaque section soigneusement dans un flacon en verre contenant 10 % de sucrose.
- Soigneusement, ramasser une section à partir du flacon, placez-le à plat dans un couvercle de boîte de Pétri. À l’aide d’un microscope à dissection et une lame de bistouri fraîches, retirer les feuilles de gélatine d’autour de la section et renvoyer l’article dans un flacon contenant 2 mL de frais 10 % de saccharose
Remarque : Il est essentiel de supprimer autant gélatine possible à ce stade pour réduire le rétrécissement du tissu pendant l’étape de déshydratation (étape 1,37). - Cryo-protéger les sections dans une solution 0,1 M PB base de saccharose-glycérol à température ambiante en incubant les pendant 10 min dans une solution de saccharose, 20 min dans une solution de glycérol de saccharose à 6 % 20 % 10 % deux fois et enfin 30 min dans une solution de glycérol pour le saccharose - 12 % 30 % deux fois sous agitation constante.
- Placez les sections plat sur un petit rectangle de papier d’aluminium à l’aide d’un pinceau. Enlever tout excès de liquide provenant des sections et incorporez délicatement le papier d’aluminium une parcelle.
- Maintenez la parcelle proche de la surface de l’azote liquide sans toucher la surface pendant 30 s, puis laissez les sections à décongeler complètement pendant environ 30 s. répéter le gel-dégel, un autre deux fois.
- Enlever toutes les sections avec un pinceau et placez-les dans un flacon en verre contenant 2 mL de 0,1 M PB sous agitation constante laver la saccharose excédentaire.
- Retirez le PB avec une pipette Pasteur et incuber les sections dans 2 mL de 1 % aqueux H2O2 pendant 30 min. Lavez les sections dans 2 mL de PB de 0,1 M 3 x 5 min.
- Supprimez le PB de 0,1 M avec une pipette Pasteur et le borohydrure de sodium 1 % (4de NaBH) dans 0,1 M PB.
Remarque : Ne pas boucher le flacon, comme NaBH4 solution dégage du gaz d’hydrogène. - Retirez le borohydrure de sodium avec une pipette Pasteur et laver les sections bien dans 2 mL de PB de 0,1 M 5 x 5 min.
- Remplacer le PB de 0,1 M avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) en PB de 0,1 M pendant 30 min.
- Retirez le sérum de chèvre et incuber les sections pendant la nuit à 4 ° C dans un mélange d’anticorps monoclonaux de souris et d’anticorps polyclonaux de lapin composés en solution ABC.
NOTE : Une liste des anticorps primaires utilisés dans les études précédentes s’affiche dans le tableau 1 en Botcher et al. (2014) 29. - Incuber les sections pendant 2 h dans le noir dans un mélange d’anticorps secondaires marqué fluorescent (Table des matières).
- Monter les sections sur les diapositives de milieu de montage et recouvrir d’un lamelle couvre-objet.
- Prendre des images de fluorescence étiquetage au grossissement X 40 (Figure 1 b,b).
- Après la fluorescence imaging, placez la lame dans un verre de Pétri contenant du PBS et retirez délicatement la lamelle. Laver ensuite les sections hors de la diapositive à l’aide d’impulsions de PBS d’une pipette Pasteur. Placez les sections dans un flacon de verre propre contenant du PBS.
- Effectuer la réaction de l’avidine-HRP en incubant tout d’abord les sections de l’ABC au moins 2 h pour amplifier le produit de réaction HRP.
- Préparer la solution de 3,5 diaminobenzidine (DAB) en ajoutant un comprimé à 5 mL d’eau distillée.
- Laver les sections avec PBS trois fois pendant 10 min et puis avec un tampon Tris deux fois pour 10 min. Retirez le tampon Tris après le dernier lavage.
- Rapidement, ajouter une goutte de solution de2 NiCl 8 % à la solution DAB, déposer la solution in et out pour mélanger et rapidement ajouter 1 mL de cette solution sur les sections. Incuber les sections dans la DAB/NiCl2 solution pendant 15 minutes.
- Ajouter 10 µL de 1 % H2O2 dans la solution DAB. Permettre la réaction aller de l’avant dans l’obscurité sous agitation constante pendant environ 1 à 2 min et surveiller le marquage des cellules remplies avec un microscope à dissection.
- Arrêter la réaction en enlevant la solution DAB/NiCl2/h2O2 et laver les sections avec un tampon Tris deux fois pendant 5 min.
- Sous une hotte, placer un petit cercle de papier filtre dans une boîte de Pétri et mouillez-les avec 0,1 M PB. Soulever les sections un à la fois du verre flacon à l’aide d’un pinceau et les placer soigneusement à plat sur le papier.
- Couvrir les sections avec un autre cercle humecté de papier filtre et enlever l’excès de tampon en appuyant doucement sur papier de soie à la surface.
- Appliquer 8 – 9 gouttes de 1 % le tétroxyde d’osmium dans 0,1 M PB sur le haut de la page papier, couvrir le plat et conserver dans la hotte de laboratoire pour au moins 30 min, mais pas plus de 1 h.
- Ouvrez la boîte de Pétri et soulever le haut de la page papier filtre. Soulever les sections soigneusement un à la fois avec un pinceau, placez-les dans un flacon en verre et les rincer à l’eau distillée deux fois.
- Éliminer correctement les déchets de tétroxyde d’osmium. Rincer tout le matériel jetable et placez-les dans des bacs appropriés.
- Placer chaque section plate sur une lame de verre et de la lamelle couvre-objet les sections. Transférer la diapositive dans une boîte de Pétri, placer un flacon en verre vide sur la lamelle couvre-objet de le maintenir en place et la couverture avec 50 % d’alcool. Après 15 min, retirer la lame de la solution et supprimer les sections de la diapositive. Place les sections de retour sur la diapositive et ensuite placer la lamelle à l’alcool à 70 % pendant 15 min. Répétez le même processus avec 95 % et enfin la solution d’alcool à 100 %.
- Après l’étape de déshydratation, transférer les sections un flacon en verre contenant de l’alcool sur un agitateur sous une hotte de 100 %. Remplacer la solution d’alcool avec l’oxyde de propylène (C3H6O) et laver trois fois pendant 5 min. Après le dernier lavage, garder environ 2 mL d’oxyde de propylène dans le flacon et ajoutez la résine (ratio 1:1). Veiller à ce que la résine est dissoute et garder les sections sous agitation constante pendant 30 min.
- Chaque section dans une planchette d’aluminium contenant de la résine époxy, à l’aide d’un bâton en bois et incuber pendant la nuit.
Remarque : Ne pas laisser les sections dans la résine plue de 24h pour éviter le risque d’endommager les sections. - Place la planchette sur une plaque chauffante pendant environ 10 mn chacune ramasser l’article avec un bâton en bois et les placer sur une lame propre. Maintenir l’orientation de chaque section conformément à l’aide d’un microscope à dissection. Placez un lamelle couvre-objet sur les sections. Placez la lame dans l’étuve pendant 48 h à 56 ° C pendant le durcissement.
2. 3D Reconstructions neuronales
Remarque : Le logiciel Neurolucida est utilisé. Instructions fournies ci-dessous ne s’appliquent qu’à un système de reconstruction de neurone spécifique (Table des matières). Les sections obtenues de la découpe sont comparées avant les reconstructions à l’aide d’un microscope.
- Placez une lame sur la scène et fixer avec clip de scène et ouvrez le logiciel de reconstruction de neurone. Cliquez sur l’onglet Acquire , puis sélectionnez l’image en direct.
- Mesurer l’épaisseur de chaque section à l’aide de 100 X objectif de pétrole. Prenez note de la valeur sur le z-mètre en haut et en bas de chaque section et calculer l’épaisseur de coupe comme la différence des deux valeurs.
- Un objectif de faible grossissement permet de se concentrer sur la section page d’accueil contenant le corps de la cellule. Puis utilisez un objectif 100 x, se concentrer sur le corps de la cellule et cliquez au Centre pour marquer le point de référence.
- Dans l’onglet de la Trace , sélectionnez Gestionnaire de la Section série. Sélectionnez ensuite Créer un nouvel article (+ icône) dans la fenêtre Gestionnaire de Section de série . Entrez le nombre de sections. Nommez chaque section dans l’ordre Z, puis entrez l’épaisseur de coupe mesurée au point 2.2.
- Pour tracer le soma en 3D à l’aide de 100 X, objectif, sélectionnez le Contour de l’onglet de la Trace et sélectionnez le contour du corps cellulaire . Utilisez le joystick pour déplacer le focus vers le haut du corps cellulaire. Placer les points en cliquant sur le périmètre de la partie qui est actuellement en discussion. Faites un clic droit et sélectionnez Des rase-mottes à la fin de cette première ébauche. Répétez ce processus à des positions différentes z jusqu'à atteindre le bas du corps cellulaire (Figure 2).
Remarque : Sélectionnez 3D visualiser dans l’onglet Trace permet de visualiser le corps de la cellule en 3D. - Pour retrouver le corps de la cellule en 2D à l’aide de 100 X, objectif, sélectionnez le corps cellulaire dans le menu de neurone dans l’onglet traces mettant l’accent sur le milieu du corps de la cellule. Placer les points en cliquant sur le périmètre du corps cellulaire. Pour compléter le corps de la cellule, faites un clic droit et sélectionnez terminer le corps cellulaire.
- Pour tracer l’arbre dendritique, sélectionnez Dendrite ou Dendrite apicale dans le menu de neurone . Tout d’abord tracer un segment court, initial pour chaque dendrite à l’aide de la molette de défilement de la souris pour ajuster le diamètre du curseur pour correspondre au diamètre de la dendrite. Remonter le long de chaque dendrites à l’aide de la manette à traverser la section et la molette de défilement de la souris pour ajuster le diamètre de la vectorisation.
- Vérifier l’alignement de la vectorisation avec l’image microscopique direct et ajuster si nécessaire, en particulier après le déplacement à l’aide de la manette. Dans l’onglet de la Trace , sélectionnez Aligner traçage, cliquez sur le calque et cliquez ensuite sur l’emplacement correct.
- Lorsqu’un nœud de l’arborescence est atteinte, faites un clic droit et sélectionnez Nœud bifurquant ou Trifurcating dans le menu déroulant.
- Lorsque l’extrémité d’une branche a été atteint, sélectionnez une fin dans le menu déroulant dans le menu de neurone . Sélectionnez le type de fin correct, i.e., haute fin, fin normale ou lOE se terminant pour faciliter le jumelage des chapitres.
- Réduire le grossissement du microscope une fois tous les dendrites dans la présente section ont été tracés, cliquez sur l’onglet de Joie libre et passer à une section qui correspond à immédiatement au-dessus ou au-dessous de la section achevée.
- Pour identifier les points correspondants entre les dendrites dans un article qui correspond à la section achevée, cliquez sur l’onglet déplacer et sélectionner des points de Match. Sélectionnez le nombre de points nécessaires pour être mis en correspondance (trois points ou plus est préférable), puis appuyez sur OK. Cliquez sur la fin d’une branche dûment remplie et cliquez ensuite sur la branche. Répétez cette opération pour chaque point de match. Répétez ce processus à un grossissement de X 100 pour garantir une correspondance exacte.
- Ajouter les branches correspondants à la section précédente directement en cliquant à droite sur la fin. Sélectionnez Ajouter à la fin lorsque la branche est alignée avec la direction tracée dûment remplie et de la trace comme décrit précédemment.
- Une fois que tous les dendrites de chaque section ont été tracés, tracer l’axone suivant le même processus en sélectionnant des axones dans le menu de neurone .
- Allez à la section de la maison , ré-aligner la reconstruction avec l’image microscopique direct et sélectionner les Contours de l’onglet Trace sélectionner une bordure de région frontalière/contour/couche prédéfinis et cliquez sur tracer le long d’un contour. Sélectionnez fin Contour ouvert. Retrouver tous les couches désirés et les contours de la région.
- Utiliser 3D visualiser dans l’onglet de la Trace pour visualiser les reconstructions en 3D.
- D’enregistrer des vidéos de reconstructions 3D (vidéo 1), ouvrez la reconstruction 3D et ouvrez créer films. Définir une destination de fichier et désiré de vitesse de rotation. Il est recommandé de définir la rotation à 270°. Sélectionnez Démarrer l’enregistrement, record pendant quelques secondes, puis cliquez sur rotation automatique. Sélectionnez arrêter l’enregistrement si nécessaire. Modifier la vidéo avec une vidéo éditant le logiciel (Table des matières).
- Pour exporter les fichiers en fichiers Tiff ou JPEG, sélectionnez fichier | Export | Traçage d’exportation comme image. Choisissez un µm/pixels et sélectionnez ajuster. Sélectionnez une couleur d’arrière-plan, puis sélectionnez fichier. Nommez le fichier, sélectionnez Tiff ou JPEG, puis appuyez sur Enregistrer. Pour exporter les fichiers en fichiers vectoriels, sélectionnez fichier | Export | Traçage d’exportation sous forme de fichiers vectoriels.
- Utiliser un logiciel d’analyse de reconstruction neurone pour effectuer des analyses morphométriques.
- Pour analyser les arbres dendritiques et obtenir un dendrogramme, ouvrez le fichier dans l’Explorateur de Neurolucida. Sélectionnez analyser | Structure et sélectionnez dendrogramme dans le menu déroulant (Figure 3).
- Pour effectuer une analyse complète morphométriques des reconstructions 3D (Direction générale de la complexité, volumes de branches et de somas, superficie), ouvrez le fichier dans le logiciel. Dans l’onglet affichage , cliquez sur Sélectionner tout. Sélectionnez l’onglet analyse . Puis sélectionnez Structure et Analyse de la direction générale de la Structure.
3. Dépannage
- Modifier les paramètres de la caméra. Pour de meilleurs résultats, définir la durée d’exposition à moins de 100 ms et gagner et compenser aussi proche de 0 que possible.
- Si le logiciel de reconstruction de neurone n’affiche pas automatiquement les contours tracés comme un corps cellulaire 3D en 3D visualiser dans l’onglet suivi , choisissez Sélectionner les objets dans l’onglet de la Trace , maintenez enfoncée la touche Ctrl du clavier et Cliquez sur tous les contours dessinés, clic droit et sélectionnez définir le corps cellulaire dans le menu déroulant.
- Pour ajuster les paramètres-z d’une branche des individuelle, sélectionnez l’arbre (Sélectionner des objets dans l’onglet de Trace ) et définir le z-réglage de tous les points via le menu déroulant. Sélectionnez modifier position de z, puis valeur de décalage z et entrez la valeur requise.
- Réaligner les reconstructions utilisant «Go To» dans l’onglet « déplacer» lorsqu’il est nécessaire de déplacer une grande distance sur le traçage.
- Ajouter des nœuds supplémentaires à tout moment pendant le processus de reconstruction. Sélectionnez la branche où le nœud doit être placé en (Sélectionner un objet dans l’onglet Trace et cliquer sur la branche), faites un clic droit et sélectionnez Insérer un nœud dans l’arborescence sélectionnée. Cliquez ensuite sur le bon emplacement sur la branche.
- Lorsque la reconstruction d’un neurone complexe, tracer individuellement les branches correspondants et plus tard les épissures pour faciliter l’identification des branches. Tracez les branches dans la nouvelle section individuellement et Fixez ensuite ces branches aux branches correspondants à la section précédente, en plaçant le curseur sur la fin de la branche à être épissé, faites un clic droit et sélectionnez coller, puis planant au-dessus de la fin qui la branche doit être raccordée à, puis cliquez sur.
- Si une branche est tracée sous le type de mauvais arbre, sélectionnez l’arborescence, faites un clic droit et sélectionnez Modifier le Type d’arbreet sélectionnez le type d’arbre correct.
- Si un point est mal placé, effectuer Ctrl + Zou cliquez sur le bouton Annuler dans le menu Trace pour supprimer le dernier point. Toutefois, cette procédure ne fonctionnera pas si le joystick sert à se déplacer dans l’ensemble de la section avant de retirer un point. Dans ce cas, le point peut être retiré lorsque la branche est terminée. Sélectionnez la branche (appuyez sur Sélectionner un objet et cliquez sur la branche), placez le curseur sur le point d’être supprimé, faites un clic droit et sélectionnez Supprimer le point.
- En cas de doute, que si les deux branches sont mises en correspondance, soit 1) utilisez visualiser 3D onglet Trace pour vérifier si les branches correspondent dans le plan z, ou si 2) Montrer flanquant fonctionnalité dans le gestionnaire de Section de la série pour afficher les sections immédiatement au-dessus et au-dessous de la section en cours en gris.
- Si une section est renversée, allez dans Outils dans l’onglet Trace sélectionnez Ajuster XY mise à l’échelle et changer axe x-1. Sélectionnez Z-rétrécissement correcte , puis remplacez l’axe z-1. Puis tracer des branches comme d’habitude. N’oubliez pas d’inverser ces changements lors du passage à une section qui avait l’orientation d’origine. Changer les axes x et z ne changeront branche se terminant étiquettes, afin de prendre soin lors de l’épissage que les terminaisons correctes sont utilisées.
- Z-rétrécissement correct peut être corrigé, s’il y a une différence significative entre la section couper l’épaisseur et l’épaisseur monté mesurée. Dans l’onglet Trace , sélectionnez Outils, puis corriger Z-rétrécissementet entrez le facteur de rétrécissement pour l’axe z comme une représentation décimale de l’épaisseur de coupe divisée par l’épaisseur monté.
Representative Results
Neurones dans l’hippocampe CA2 étaient remplis de la biocytine suite à des enregistrements électrophysiologiques (Figures 1Ac, Ad et 1Bc, Bd). Les tranches ont été fixées pendant la nuit après les enregistrements et la neurochimie et caractérisation morphologique des neurones ont été révélés suivant le protocole décrit ici.
La protéine calcium ou la teneur en protéines des interneurones remplis a été déterminée en incubant les tranches tout d’abord avec des anticorps primaires, puis avec des anticorps secondaires fluorescent étiquetés. Les caractéristiques de mise à feu des interneurones durant les enregistrements vont dicter le choix des anticorps primaires utilisés. L’avidine-AMCA a été utilisé pour visualiser les interneurones remplis de la biocytine et anti-souris fluorescéine isothiocyanate (FITC) et anti-lapin de chèvre Texas Red (TR) ont été utilisées pour caractériser la neurochimie interneuronales (Figure 1).
Après la visualisation de la fluorescence, un protocole HRP fut utilisé pour révéler la biocytine (Figure 1Ab). La fine anatomie détaillée des interneurones CA2 a été ensuite dessiné en 3D à l’aide d’un logiciel de reconstruction de neurone (Figure 2 et Figure 3 a). Une vidéo d’une reconstruction 3D d’une cellule de panier enregistré et renseigné CA2 apparaît dans la vidéo. Les reconstructions neuronales étaient considérées comme complet si les deux axes dendritiques et axonales ont été confinés dans la profondeur de la tranche de 450-500 μm. Arbor axonale mauvaise coloration a été évaluée par la présence de branches tronquées avec des terminaisons ouverts en haut ou en bas de la tranche ou par une coloration qui se limitait au segment initial de l’axone et des branches très proximales. La figure 4 représente les exemples d’une bonne et une mauvaise visualisation de la biocytine suivante coloration de HRP.
Analyse morphométrique des reconstructions 3D (Figure 3) peut être effectuée afin de démontrer la complexité de la branche, superficie soma et la surface et le volume de l’arbres dendritiques et axonales.
Figure 1 : Reconstructions neuronales des deux types de cellules de panier enregistrement et remplis dans la région de l’hippocampe CA2 et corrélation des données électrophysiologiques obtenues suite à des enregistrements intracellulaires in vitro. De précédentes études23,24, ce chiffre a été modifié. Oui Stratum Oriens, SP strate Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM strate Lacunosum Moleculare. (A) Aa : Reconstruction d’une cellule de panier CA2 avec restreint arbor dendritique et axonale à l’aide d’un tube à dessin (1000 X). Les dendrites sont en noir, et l’axone est en rouge. AB : Image de la cellule de panier rempli de la biocytine suivant le protocole de l’avidine-HRP décrit ici. AC : Trace représentative des réponses de la tension à hyperpolarisant et dépolarisantes injection de courant d’une cellule de panier CA2 avec restreint arbor dendritique et axonal. Ad : Exemple d’une pyramide de CA2 d’étroites relations de cellule pour le panier arbor enregistrées à l’aide d’électrodes pointus. Composite potentiel post-synaptique excitateur (PPSE) moyennes montrent train brève dépression apparente lors de réponses aux trains de trois crampons. (B) Ba : reconstruction 2D d’une cellule de panier CA2 avec tonnelles large dendritiques et axonales à l’aide d’un tube à dessin (1000 X). L’arbre dendritique de cette cellule de panier (en noir) étendu radialement à travers toutes les couches de la région CA2 et horizontalement en SO SP des régions CA2 et CA3. Une dendrite horizontale a également atteint la région CA1. L’axone (en rouge) étendu aux régions CA3 et CA1. BB : Les remplis de la biocytine (AMCA tachant) panier cellule était PV-immunopositifs (FITC coloration) et CB-immunonegative (coloration rouge-Texas). BC : Trace représentative des réponses de la tension à hyperpolarisant et injection de courant d’une cellule de panier CA2 avec large dendritique et axonal arbor de dépolarisation. BD : Composite RPEB moyennes montrent train bref facilitation apparent lors de réponses aux trains de trois crampons. On trouvera des exemples d’autres types d’interneurones enregistrés en CA2 dans précédentes études25,30. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Reconstruction 3D du corps cellulaire. (A) le suivi 3D du corps cellulaire. Affichage des contours différents tracés à des positions différentes z tout en mettant l’accent à travers le corps de la cellule. (B) vue 3D des différents contours. (C) la vue 3D du corps cellulaire à un angle différent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyses de morphométrie des reconstructions neuronales 3D. (A) la reconstruction 3D d’une cellule de panier CA2 arbor étroit. Chacune des branches dendritiques sont représenté par une couleur (vert, bleu, rouge et rose) et axon est en bleu clair. Dendrogramme (B) de la cellule de panier qui représente le nombre de ramifications dendritiques et la longueur de chaque segment contenu dans les sphères concentriques avec soma et à 100 μm intervalles de soma. Les couleurs sur le dendrogramme correspondent à celles des dendrites en a. (C) exemple d’analyse morphométrique effectuée sur des cellules pyramidales CA2 (adaptés d’une précédente étude23). Le nombre de ramifications dendritiques a comploté contre la distance entre le soma des cellules pyramidales CA2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Exemples de bon (A) et pauvres (B) HRP piqueté. (A) la biocytine récupération a révélé un interneurone très bien remplie en CA2. Le corps de la cellule (CB) est taché de sombre et a des contours clairs. Les dendrites sont perlés et affichent quelques épines (représentées par des étoiles rouges). L’arbre axonale (A) est dense et présente de petits boutons. (B) exemple d’une mauvaise dendritiques et axonales coloration des 2 cellules pyramidales Ca2. La coloration de la CB est faible avec aucun contour clair. Coloration pauvre est souvent associée liée des enregistrements électrophysiologiques plus courtes résultant en présence de très peu la biocytine remplis de branches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Reconstruction neuronale 3D d’une cellule de panier CA2 avec arbor dendritique restreint (également dénommée cellule de panier étroit arbor CA2) avec ses soma de strate pyramidale, dendrites s’étendant sur tous les calques et axone en CA2 stratum pyramidale et strate adjacentes oriens et radiatum. Branches très peu atteint la proximale CA3 strate oriens et CA3 strate pyramidale. Cette cellule a été remplie de la biocytine suite enregistrements électrophysiologiques et sections ont été traitées avec l’avidine-HRP, suivant le protocole décrit ici. En raison de tranchage, seulement l’axone dans la profondeur de la tranche a été retrouvé, bien que les dendrites sont intacts. Dendrites sont en rose foncé et axone en blanc. Limites de couche et de la région ont été ajoutées au début de la vidéo. Reconstruction 3D par Georgia Economides-3D vidéo Svenja Falk. La vidéo a été enregistrée avec un logiciel de reconstruction de neurone, comme indiqué dans l’étape 2.17 et éditée avec un logiciel de montage vidéo. Lien vers la vidéo :30. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
| Solutions utilisées | Composition/Instructions |
| Solution de fixation | paraformaldéhyde à 4 %, 0,2 % saturé de solution d’acide picrique, solution de glutaraldéhyde 0.025 % dans un tampon phosphate 0,1 M (PB) |
| 0,1 M tampon Phosphate pH 7,6 | Ajouter 100 mL de stock tampon 1 M Phosphate dans 900 mL d’eau distillée |
| Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4/7.5 | Ajouter 10 mL de tampon phosphate 0,1 M à 0,2 g de KCl et 8,76 g de NaCl à 990 mL d’eau distillée |
| Tampon TRIS pH 7.5 | Dissoudre 5,72 g de chlorhydrate de Tris et 1,66 g de Tris Base dans 50 mL d’eau distillée. Ensuite, faire à 1 L avec de l’eau distillée. |
| Solution tampon glutaraldéhyde et paraformaldéhyde fixateur | paraformaldéhyde à 4 %, 0,2 % saturé de solution d’acide picrique, solution de glutaraldéhyde 0.025 % dans un tampon Phosphate 0,1 M. |
| Solution de l’ABC | Solution à apporter au moins 30 min avant utilisation de la trousse de l’ABC. Ajouter 1 goutte de la solution A et 1 goutte de solution B à 2,5 mL de PBS. |
| Résine époxy de Durcupan : | Pour faire 20 pots : 20 g de composant A, 20 g de composant B, 0,6 g de composant C et 0,4 g de composant D - |
| Protéger l’équilibre contre les déversements en recouvrant la plaque avec un cercle de papier filtre. Soigneusement peser les réactifs dans un bécher de tripour dans les proportions indiquée ci-dessus. Bien mélanger en remuant vigoureusement à l’aide de deux bâtons de bois pendant au moins 5 min. Le mélange doit devenir une couleur brun foncé de densité uniforme. Placer le bécher dans le four à environ 50 ° C pendant un maximum de 10 min pour enlever les bulles d’air autant que possible. Remarque : La résine commence à guérir, si vous laissez le bol dans le four de plus de 10 min. décanter la résine dans des pots en plastique ou des seringues de 5 mL, dater et stockez dans le congélateur-20 ° C prêt à l’emploi. |
Tableau 1 : Tableau des solutions.
Discussion
Des enregistrements électrophysiologiques in vitro (Figure 1 Ac,d et Bc, d) combiné avec histochimiques et immunohistochemical procédures permettent la morphologie détaillée, la teneur en calcium binding protein et identité des interneurones corticaux adultes enregistrés pour être révélé. Dans la région CA2, cette technique a permis l’étude des circuits locaux pour la première fois et a révélé des sous-classes des interneurones qui n’avaient pas été précédemment décrits dans CA1 ou CA3 : cellules de panier large dendritiques et axonales arbor (Figure 1 b), les cellules bistratified et interneurones SP-SR.
Le protocole décrit ici a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir excellente récupération de dendritiques (y compris épines) et tonnelles axonales. Étapes critiques comprend l’utilisation de la technique de fixation double pour renforcer le contraste pour la microscopie photonique26 et l’addition de solution de glutaraldéhyde et d’acide picrique à la solution de fixation pour améliorer la pénétration de l’anticorps et de préserver les neurones l’ultrastructure27. Doux gel-dégel perméabilisation donne meilleure préservation de la structure fine, tandis qu’osmication et résine enrobage réduisent rétrécissement plan z28. En outre, la visualisation des mêmes structures fines (fine des axones avec petits boutons par exemple) est améliorée en incubant les sections avec H2O2 et de NaBH4 afin de réduire la coloration de fond. Contraste peut également être augmentée avec l’ajout de NiCl2 à la réaction de HRP.
La procédure histologique détaillée ici donne d’excellents résultats en termes de fiabilité et de reproductibilité. Toutefois, la durée des enregistrements électrophysiologiques déterminera la qualité de la biocytine/fluorescence coloration, avec des enregistrements plus courts habituellement associés aux pauvres coloration axonale. Le choix de l’enregistrement des protocoles (enregistrements intracellulaires utilisant des électrodes pointus vs cellule entière patch serrage) peut-être influencer également la biocytine rétention et la préservation de l’anatomie fine.
Alors que les difficultés rencontrées en préservant la structure fine pendant traitement histologique décrits ici et le temps pris pour reconstruire au grossissement X 100 (1-4 semaines selon la complexité de l’axone) sont appréciés, cette méthode donne une représentation précise des diamètres dendritiques et axonales. L’utilisation de moins exigeants des protocoles pour révéler la biocytine-étiquetage est compréhensible, ceux-ci empêchent cependant souvent visualisation claire des fines branches axonales. Détergents, afin de faciliter l’accès de l’avidine-HRP pour révéler la biocytine et anticorps, sont souvent nécessaires en épaisseur importante, mais peuvent perturber la structure fine. Neuroscientifiques recherche constamment des méthodes semi-automatiques de reconstruction, mais, pour aujourd'hui et pour les axones en particulier, la biocytine-HRP avec reconstruction manuelle demeure l' étalon-or31.
Très détaillées des reconstructions neuronales, notamment des dessins précis de boutons axonales et nœuds, la présence ou l’absence de myéline et plus généralement le dessin d’arbor axonale complet, avec la représentation d’axone-diamètre exact change le long de ses longueur, fournir des informations pour identifier avec précision d’un type distinct d’interneurone complémentaires. Bien que nombreux interneurones peuvent ne pas correspondre exactement à une classe spécifique, la technique décrite ci-dessus fournit des données corrélées sur propriétés électrophysiologiques neuronales, la plasticité à court terme associées à un type de connexion spécifique et détaillée reconstructions neuronales, permettant ainsi le schéma de câblage, dans la région CA2, par exemple, d’étudier en détail.
Structure fine et détaillée est souvent simplifiée dans des modèles de calcul. Bien que compréhensible, cela se traduit par la perte de l’information qui pourrait s’avérer cruciale dans l’avenir. Analyse des reconstructions 3D détaillées avec données synaptiques en parallèle permettra l’ajout d’autres critères de classification interneuronales. Données peuvent être déposées dans les dépôts publics et utilisées par les modélisateurs pour découvrir le résultat de changements sporadiques dans le diamètre de l’axone et la myélinisation sur la propagation des potentiels d’action par le calcul.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a reçu un financement de Novartis Pharma (Bâle) et le Medical Research Council, adjugé à Prof Alex Thomson, Biotechnology and de Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la société de physiologie, l’Union européenne Horizon 2020 Programme-cadre pour la recherche et l’Innovation au titre de la subvention spécifique contrat n° 720270 (Human Brain Project SGA1) et au titre de la subvention spécifique contrat n° 785907 (Human Brain Project SGA2). Nous sommes extrêmement reconnaissants à Prof Alex Thomson pour la mise en place du protocole dans d’autres régions corticales, d’obtenir des fonds et pour son soutien continu pour ce projet. Contributions de lab-membres, qui a contribué à l’optimisation du protocole de récupération et reconstruit CA2 neurones sont tient à reconnaître : J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
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