Summary
扫描电镜分析是帮助物种鉴定或表型鉴别的有效方法。该协议描述了检查三种具有代表性的生物体的具体形态细节的方法, 并将广泛适用于检查许多组织和组织类型的特征。
Abstract
扫描电子显微镜 (sem) 是一种广泛使用的技术, 已被应用于研究生物标本, 从单个蛋白质到细胞, 组织, 细胞器, 甚至整个生物体。该协议侧重于两种化学干燥方法, 六甲基二硅烷 (hmds) 和 t-丁醇 (tba), 及其在原核生物和真核生物的成像使用 sem。在这篇文章中, 我们描述了如何固定, 洗涤, 脱水, 干燥, 安装, 溅射外套, 和图像三种类型的生物体: 蓝藻(toxifilum mysicida, golenkina sp., 和一个未知的 sp), 两种黄酮类化合物属单诺莫诺莫莫莫莫尼卡(金银花和假花蝇) 和果蝇 (果蝇)。本协议的目的是描述一种快速、廉价和简单的方法, 以获取有关样品的结构、大小和表面特性的详细信息, 这些信息可广泛应用于大量生物的形态评估。成功完成此协议将允许其他人使用 sem 通过将这些技术应用于他们的系统来可视化样本。
Introduction
扫描电子显微镜 (sem) 使用高能电子的聚焦束从二次电子中生成显示样本1的形态和地形的图像。sem 可用于直接确定样品的物理尺寸、表面结构和三维形状, 并提供更大的分辨率和更大的景深相比, 光显微镜。另一种形式的电子显微镜 (em), 透射电子显微镜 (tem) 使用聚焦电子通过样品, 产生图像与内部结构的细节。虽然 tem 的分辨率高于光或 sem, 可用于解析单个原子这样小的结构, 但它有三个主要缺点: 广泛的样品制备、一个小的视野和一个浅景深 2,3。虽然其他可视化协议存在使用 sem 来检查特定的细胞, 细胞器,或组织4,5,6, 7, 8,9,10 、该协议的独特之处在于, 我们描述了可广泛应用于大量生物进行形态评估的方法。
sem 在研究无机材料方面有着广泛的应用, 包括纳米粒子11、12、聚合物13,以及在地质、工业和材料科学14 中的众多应用. 15,16。在生物学中, sem 长期以来一直被用作检测从单个蛋白质到整个生物体的生物样本的方法 17,18。扫描电镜具有特殊的价值, 因为形态表面细节可以用来为科学发现提供信息。sem 分析是一种快速、廉价、简单的方法, 可以获得关于各种生物样品的结构、大小和表面特性的详细信息。
由于 sem 通常在高真空 (10-6 torr 最小值) 下工作, 以支持高速电子的相干束, 因此样品室中不允许使用液体 (水、油、醇), 因为液体可防止真空形成。因此, 使用 sem 检测的所有样品都必须脱水, 通常使用分级乙醇系列, 然后采用干燥过程来去除乙醇。有几种方法来干燥生物组织用于扫描电镜, 包括空气干燥, 冻干, 使用临界点干燥 (cpd) 装置, 或使用 t-丁醇 (tba) 或六甲基二硅烷 (hmds)化学干燥19,20,21,22. 大多数情况下, 选择干燥方法是经验性的, 因为每个生物样本对每个干燥方法的反应可能不同。对于任何给定的示例, 所有这些方法都可能是适当的, 因此比较每种方法的优缺点对于选择适当的方法很有用。
虽然在室温或干燥炉 (60°c) 下空气干燥样品是最简单的方法, 但大多数生物样品显示干燥引起的损伤, 如枯萎和塌陷, 导致样品变形。冷冻干燥的过程也会去除样品中的水 (或冰), 但需要将样品进行闪存冷冻,并置于真空下, 通过升华过程去除冰, 从而有可能对样品造成损害。此外, 用户必须有权访问冻干机。sem 脱水样品最常用的方法是临界点干燥 (cpd)。在 cpd 中, 样品中的乙醇被液体二氧化碳 (co2) 所取代, 在被称为临界点的特定温度和压力条件下 (31.1°c 和 1, 073 psi), co2在不产生表面张力的情况下蒸发, 从而产生表面张力, 从而有效地保持样品的形态和结构特征。虽然 cpd 通常是标准方法, 但它有几个缺点。首先, 这一过程需要使用临界点干燥器, 这不仅昂贵, 而且还需要使用液体二氧化碳。其次, 可以干燥的样品的大小仅限于临界点干燥机的腔体大小。第三, 在 cpd 过程中液体的交换会导致湍流, 从而损坏样品。
与 cpd 相比, 化学干燥具有许多优势, 并可作为一种合适的替代品, 在 sem 样品制备中得到广泛应用。使用 tba 和 hmds 等化学脱水剂为其他方法提供了快速、廉价和简单的替代方法, 同时仍然保持样品的结构完整性。我们最近发现, 在成人嗜酸性视网膜组织23中使用 cpd 或 tba 作为干燥方法时, 组织的完整性或最终图像的质量没有差异.与 cpd 不同, tba 和 hmds 不需要干燥仪器或液体co2 , 也不限制要干燥的样品的大小。除了获得这些化学品外, 完成干燥过程只需标准的化学烟罩和适当的个人防护设备 (手套、实验室涂层和安全护目镜) 即可完成。虽然 tba 和 hmds 都是易燃的, 但 tba 的毒性和成本都比 hmds 低, 成本也更低 (约为 hmds 成本的 1.5倍)。
在这篇文章中, 我们描述了如何固定, 洗涤, 脱水, 干燥, 安装, 溅射外套, 和图像三种类型的生物体: 蓝藻(toxifilum mysicida, golenkina sp., 和一个未知的 sp), 两种黄酮类化合物属单诺莫诺莫莫莫莫尼卡(金银花和假花蝇) 和果蝇 (果蝇)。这些生物体的大小 (0.5μm 至4毫米) 和细胞多样性 (单细胞到多细胞) 范围很广, 但所有生物体都很容易适应 sem 分析, 只需进行样品制备所需的微小变化。该协议描述了使用化学脱水和扫描电镜分析来检查三种生物的形态细节的方法, 并将广泛适用于检查许多组织和组织类型。
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Protocol
1. 准备和固定
- 准备蓝藻。
- 在14:10 小时的光暗循环中,在24°c 的温度下在 f/2 介质中生长单藻培养物。将足够的培养物转移到 1.5 ml 的微离心管中, 使细菌颗粒在10分钟内沉淀后, 其大小约为0.05 毫升。取出培养基, 更换1.5 毫升的固剂 (1.25 戊二醛, 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.0), 轻轻反转数次, 并在4°c 下孵育过夜。
- 根据电池的大小, 用玻璃移液器将固定单元转移到装有25mm 的聚碳酸酯25毫米过滤器的10毫升过滤器中.用橡胶塞子密封侧臂和漏斗, 以包含漏斗中的培养。取下两个塞子后, 在过滤瓶上用温和的真空去除固定装置。
注意: 如果聚碳酸酯滤清器上的电池密度不是最佳的, 请调整使用的起始培养量。
- 准备单细胞藻类 (黄酮类化合物)。
- 在 af-6 介质26中生长单藻培养物, 在 14:10小时的浅暗循环温度下, 在介质中添加150毫升 l-1 的商业上可用的土壤-水介质。用玻璃移液器将低密度 (od600 < 0.5) 培养的2毫升转移到装有8μm 毛孔的聚碳酸酯25毫米过滤器的10毫升过滤装置 (图 1) 中。用橡胶塞子密封侧臂和漏斗, 以包含漏斗中的培养。
注意: 如果聚碳酸酯滤清器上的电池密度不是最佳的, 请调整使用的起始培养量。 - 将三滴四氧化二铬直接放入培养物中, 并允许孵育 30分钟, 在取出两个塞子后, 在过滤瓶上轻轻吸尘。
注: oso4是一种急性毒素 (皮肤、口腔和吸入途径), 对皮肤有腐蚀性, 对眼睛有害, 并具有呼吸增敏剂。oso4应使用适当的个人防护设备 (包括手套、实验室涂层和眼睛保护) 在化学烟罩中进行处理。
- 在 af-6 介质26中生长单藻培养物, 在 14:10小时的浅暗循环温度下, 在介质中添加150毫升 l-1 的商业上可用的土壤-水介质。用玻璃移液器将低密度 (od600 < 0.5) 培养的2毫升转移到装有8μm 毛孔的聚碳酸酯25毫米过滤器的10毫升过滤装置 (图 1) 中。用橡胶塞子密封侧臂和漏斗, 以包含漏斗中的培养。
- 准备果蝇(果蝇)23。
- 使用100% 的二氧化碳对成年苍蝇进行麻醉。将麻醉成人 (约10至30苍蝇) 放入小型塑料螺帽小瓶或 1.5 ml 离心管中。
- 浸泡麻醉剂在4°c 下在1毫升的固定物 (1.25 戊二醛, 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.2) 下 2小时 (或隔夜) 飞行。如果苍蝇漂浮在固定物的表面, 加入几滴2.5% 的聚乙二醇叔八烷基苯醚, 以削弱固定剂的表面张力, 从而使组织完全浸入。使用玻璃管拆卸固定装置。
2. 清洗和脱水
- 清洗蓝藻并使其脱水。
- 用5毫升 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.0 在室温下每次10分钟清洗固定样品3次。保持烧瓶和漏斗塞住, 以保持清洗。取下两个塞子后, 用过滤瓶上的温和真空取下每次清洗。
- 在使用分级乙醇系列保持连续浸泡的同时, 在漏斗中保持10分钟的体积, 使样品脱水。分级乙醇浓度为: 25%、50%、75%、95% 和 2% 100% 乙醇变化。保持烧瓶和漏斗塞住, 以控制漏斗中的乙醇, 防止通过蒸发和通过过滤器的被动流动造成损失。
- 在取下两个塞子后, 在过滤瓶上用温和的真空去除乙醇。将滤清器/样品转移到一次性铝制称重盘中, 该片仅含有100% 乙醇, 可在干燥前覆盖样品。
- 清洗单细胞藻类 (黄酮类化合物) 并使其脱水。
- 在室温下用5毫升的去离子水清洗固定样品三次, 每次10分钟。保持烧瓶和漏斗塞, 以包含在漏斗中的清洗。取下两个塞子后, 用过滤瓶上的温和真空取下每次清洗。
- 在漏斗中使用分级乙醇系列在5毫升的体积中, 在保持连续浸泡10分钟的同时, 使样品脱水。分级乙醇浓度为: 25%、50%、75%、95% 和 2% 100% 乙醇变化。保持烧瓶和漏斗塞住, 以控制漏斗中的乙醇, 防止通过蒸发和通过过滤器的被动流动造成损失。
- 在取下两个塞子后, 在过滤瓶上用温和的真空去除乙醇。将滤清器/样品转移到一次性铝制称重盘中, 该片仅含有100% 乙醇, 可在干燥前覆盖样品。
- 清洗果蝇(果蝇) 并使其脱水。
- 用1毫升 0.1 m 磷酸盐缓冲液 ph 7.2 在室温下在 1.5 ml 微离心管中清洗固定样品 3次, 时间为10分钟。用玻璃移液器取下每次洗碗, 注意不要取出苍蝇。
- 使用分级乙醇系列使样品脱水, 在微泡管中的体积为1毫升, 为10分钟。乙醇浓度为: 25%、50%、75%、80%、95%、100%。用玻璃移液器去除乙醇, 注意不要取出苍蝇。
- 在干燥前, 用足够的100% 乙醇将样品保留在 1.5 ml 微离心管中。
3. 干燥
- 使用 t-丁醇 (tba)进行化学干燥27。
- 将100% 乙醇溶液更换为1:1 的 tba 溶液和100% 乙醇溶液 20分钟. 将1:1 溶液更换为 100% tba 20分钟. 重复两次。将溶液保持在 37°c, 这样 tba 就不会冻结。
注: 100% tba 的冰点为 25.5°c;1: 1 解决方案在室温下不会冻结。tba 是易燃的, 引起严重的眼睛刺激, 吸入是有害的, 并可能导致呼吸道刺激, 嗜睡, 或头晕。tba 应使用适当的个人防护设备 (包括手套、实验室涂层和护目镜) 在化学烟罩中进行处理。 - 将 tba 中的样品 (如果在 1.5 ml 微离心管中) 转移到一次性铝称重盘中。一旦进入铝称重盘, 取出 tba, 并更换足够新鲜的 100% tba 覆盖样品。在4°c 下冻结 tba 10分钟。
- 转移到真空干燥器 (钟罐) 与冷冻凝胶包, 以保持 tba 冷冻。用旋转泵排出并保持真空, 使样品通过冷冻 tba 的真空升华干燥至少3小时或一夜。
- 将100% 乙醇溶液更换为1:1 的 tba 溶液和100% 乙醇溶液 20分钟. 将1:1 溶液更换为 100% tba 20分钟. 重复两次。将溶液保持在 37°c, 这样 tba 就不会冻结。
- 使用六甲基二硅烷 (hmds)20进行化学干燥。
- 将100% 乙醇溶液更换为1:2 溶液的 hmds, 将100% 乙醇溶液更换 20分钟. 用2:1 溶液和100% 乙醇溶液更换1:2 溶液, 用2:1 溶液更换2:1 溶液, 用 100% hmds 更换 20分钟. 重复一次。
注: hmds 是易燃的, 是一种急性毒素 (皮肤途径)。hmds 应使用适当的个人防护设备 (包括手套、实验室涂层和眼睛保护) 在化学烟罩中进行处理。 - 将 hmds 中的样品 (如果在 1.5 ml 微离心管中) 转移到一次性铝称重盘中。一旦进入铝称重盘, 将100% 的 hmds 替换为足够新鲜的 100% hmds 来覆盖样品。
- 将样品转移到塑料或玻璃非真空干燥剂与新鲜干燥剂 (5-6 厘米深), 并放置在化学烟罩。或者, 将样品直接放在化学烟罩中, 用宽松的盖子 (如盒子) 干燥, 以防止碎片落在样品上。让样品干燥12至24小时。
- 将100% 乙醇溶液更换为1:2 溶液的 hmds, 将100% 乙醇溶液更换 20分钟. 用2:1 溶液和100% 乙醇溶液更换1:2 溶液, 用2:1 溶液更换2:1 溶液, 用 100% hmds 更换 20分钟. 重复一次。
4. 安装
- 安装蓝藻和黄酮类化合物。
- 标记12或25毫米铝安装存根的底部, 以指示顶部放置的内容。如果使用12毫米存根, 则用干净的剃须刀片或手术刀将用干燥的细胞将聚碳酸酯滤清器切割成宿舍, 如果使用25毫米的存根, 则将整个滤清器放入宿舍。
- 将每个过滤器放在固定在存根顶部的粘合剂或碳粘合剂标签上。
- 果蝇 (果蝇)。
- 在铝安装存根的底部贴上标签, 以表明顶部放置的是什么。
将干燥的苍蝇放置在胶粘剂或碳粘合剂标签上的所需位置, 用精密的推子固定在存根的顶部。 - 在存根的外缘周围涂上银导电胶粘剂,即银漆。使用牙签将银漆连接到苍蝇上, 以确保导电性。不要让油漆接触所需的成像区域。
- 将存根放在存根支架盒中, 并将打开的存根支架盒放在干燥器中。让银漆干燥至少3小时或夜间, 以获得最佳效果。
- 在铝安装存根的底部贴上标签, 以表明顶部放置的是什么。
5. 喷射式涂层
- 通过4至5次燃烧氩气准备溅射涂层设备。如果湿度高 (即,房间空气感觉潮湿, 通常约50% 的相对湿度), 执行六到七次冲洗。推杆按照制造商的说明涂上存根。
- 基于使用的样品的涂层样品:
- 对于带有蓝藻的过滤器, 将定时器设置为180秒的溅射涂层。
- 对于具有真核藻类的过滤器,即优格伦特, 将定时器设置为 120 s 的溅射涂层, 然后在45°角的三面上的20秒。
- 对于大型样品,即飞头, 将定时器设置为飞溅涂层, 直接为 60秒, 然后在45°角的每一侧30秒。
注意: 涂层完成后, 存根的颜色应为浅灰色。
6. 成像
- 使用包括二次电子 (se) 检测器的扫描电子显微镜的图像样本。
- 对于蓝藻, 请应用以下设置: 3-5 kv 加速器电压 (ac)、20-30 探头电流 (pc) 和 5 mm 工作距离 (wd)。对于黄酮类化合物, 请使用 3 kv ac、30 pc 和 5 mm wd。对于苍蝇, 请使用 5 kv ac、30 pc 和5至10毫米 wd。
- 根据要可视化的细节或对象的大小调整放大倍率。调整柱头、光圈和焦点, 直到产生清晰的图像。根据制造商的 sem 说明, 使用高分辨率设置捕获图像。
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Representative Results
蓝藻是对全球碳、氧和氮循环28、29至关重要的原核生物群。在估计的6000种蓝藻中, 大多数有粘液鞘, 覆盖和连接细胞和其他结构31, 连同形状, 可以通过显微镜下解决32。细胞大小、形状和色素存在区分个别物种和水生栖息地, 可以想象为蓝藻 "开花"28。现代蓝藻分类结合了光显微镜、透射电镜和扫描电镜以及分子数据33可能的所有形态特征。类似于蓝藻的粘液鞘, 卵光素物种的颗粒带有助于系统发育的测定。类胡萝卜素是具有大量形态和行为多样性的水生鞭毛, sem 分析已被证明在对不同物种进行分类方面很有用。具体而言, 黄酮类化合物在其质膜下具有新的结构, 由平行的蛋白质带和微管组成, 称为微囊34,35,36。球穗带的数量、排列和大小是重要的形态比较器, 并与分子系统发育数据一起构建了 euglenozoa 37 的系统发育.
制备蓝藻和黄酮类化合物的第一步是从其生长介质中过滤生物体, 并通过组装过滤装置来完成 (图 1 a)。吸气是用来拉介质通过聚碳酸酯过滤器, 留下的生物在过滤器的表面。应选择聚碳酸酯滤清器的孔径, 使完整的生物体不会通过 (图 1 b和1B)。图 2显示了三种不同的蓝藻属的代表性结果。两个是淡水, 一个是海洋。细胞的细节, 包括表面的形状和纹理是可见的, 以及细胞的粘液或突起的鞘。图 3说明了如何使用 sem 来可视化两种不同的黄体类植物的球囊条。在比较单体时, 在后端合并形成系统发育的尾状条 (图 3a和3A) 与单体假阵 (图 3 a 和 3A) 时, 其螺旋排列。图 3 c 和3C)。
除了识别物种的形态特征外, 果蝇等模型生物的外部形态还可用于利用构成该化合物的光感受器神经元来识别遗传改性剂。食心人眼38。由于眼睛是苍蝇中的非必需组织, 因此可以在视网膜细胞中表达有毒蛋白质, 并使用 sem 来检查基因改造对眼睛的形态变化。正常的苍蝇眼睛的特点是有秩序的刷毛和镜片阵列 (图 4a), 然而与阿尔茨海默氏症相关的蛋白质表达创造了所谓的 "粗糙的眼睛" 表型 (图 4A)。抑制 (图 4c) 或增强粗糙眼睛表型 (图 4C) 的基因可能在疾病进展中发挥生理作用, 并有可能以39药物为目标.图 4中还显示了需要避免的潜在陷阱示例, 其中包括因不正确的干燥技术 (图 4e) 而导致眼睛折叠的结构的示例 (图 4e), 以及在图像采集 (图 4f和4F)。
图 1: 聚碳酸酯过滤器的过滤装置和扫描电镜的原理图表示.(a) 本仪器用于将蓝藻和黄酮类生物等小型或单细胞生物与其生长介质分离。对烧瓶侧臂的应用会将漏斗的内容通过聚碳酸酯滤清器拉入过滤瓶的底部, 使过滤器表面的生物离开。(b) 由于处理不当而丢失样品的0.8 微米孔隙过滤器的扫描电镜。刻度棒 = 20μm. (c) 含有蓝藻的0.8 微米孔隙过滤器的 sem。刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 蓝藻扫描电镜.(A、 B)来自科罗拉多州的丝状淡水物种, 有明显的粘液鞘 (m)。鳞片棒 = 5μm (c, d) 来自俄亥俄州的淡水golenkina sp。单个细胞有时由一层薄薄的粘液 (m) 组成菌落。类似丝状突起 (白色箭头) 延伸到单个细胞。比尺条 = 10μm (e, f) 来自德州沿海水域高盐度河口的未知丝状物种。单个单元格 (黑色箭头) 和分割单元格 (白色箭头) 是可见的。面板 e = 2μm 中的刻度条. 面板 f = 1μm 中的刻度条. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 两种黄酮类化合物的球囊条的扫描电镜.(A、 B)莫诺莫斯莫斯尼吉马蒂卡。(a) 整个单元的低放大倍率图像。刻度杆 = 5μm. (b) 后端的高放大倍率。刻度杆 = 3μm. (c, d)单体假假。(c) 整个单元的低放大倍率图像。刻度杆 = 10μm. (d) 后端的高放大倍率。刻度栏 = 5μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:嗜德维拉眼表型修饰的扫描电镜分析.与正常的外部外观的有序阵列的刷毛和镜片的飞眼 (a), 有毒蛋白 tau 的表达导致死亡的光感受器神经元, 产生 "粗糙的眼睛" 表型 (b)。基因改性剂的表达, 无论是抑制 (c) 或增强 (d) 的牛粗糙的眼睛提供的证据, 可能在 tau 神经毒性的作用。干燥步骤中的不正确技术可能导致眼睛结构 (e) 的塌陷, 而样品涂层不足会导致充电, 在图像采集过程中显示为白色 (f) 或黑色 (g) 波段,如箭头所示。刻度栏 = 400μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个协议使用 sem 来获取有关三种生物的外部形态特征的详细信息, 其他生物可以应用于检查许多类型的生物体或组织的特征。在协议的每个步骤中, 都可能出现潜在的误差点, 下文将对此进行详细讨论。
虽然这里给出的固定和洗涤量是具体的, 但一般来说, 固定和洗涤的体积应该是样品体积的5-10x。所有的固定、清洗和脱水时间都是基于我们的经验, 如果出现问题, 例如样品的萎缩, 您可能需要在脱水或干燥的每一步增加时间。根据您的单个细胞样本, 您可能需要同时进行戊二醛固定和四氧化铬的后固定。如果在蓝藻程序的步骤1.1.2 后需要进行决斗固定, 则在同一缓冲液中覆盖相同数量为 2% oso4 , 并从单细胞程序的步骤1.2.2 开始。从这里没有显示的工作中, 我们发现, 嗜德维沙肉可以在麻醉后直接放入固定剂中, 也可以在-20°c 的微泡管中无限期冷冻, 以后再放入固定剂中, 完成后没有任何区别图像质量。
在洗涤和脱水步骤中, 必须缓慢地通过分级乙醇系列, 而不跳过注意到的浓度。如果样品脱水过快, 它将对组织中的底层结构成分产生负面影响, 试样会枯萎、枯萎或塌陷。组织塌陷的一个例子如图 4e所示。此外, 为了防止引入人工制品, 如聚集和扁平的形态特征, 关键是要留下足够的乙醇, 以覆盖在脱水和干燥之间的步骤之间的样品。
使用过滤器时, 基座上的一滴水将在组装时将过滤器固定在适当的位置。此外, 过滤器应放置与有光泽的一面向上, 所有液体应轻轻添加, 小心处理过滤器, 以防止清洗样品。虽然我们发现使用 hmds 或 tba 干燥的结果是同等质量的, 但我们建议使用 tba: 虽然 hmds 和 tba 都是易燃的, 但 tba 的成本和毒性约为 hmds 的三分之一。
在安装过程中, 使用银导电胶粘剂 (也称为银漆) 时, 请小心, 因为您的样品可以很容易地覆盖 (埋在) 油漆中, 从而模糊了形态上的细节。喷射器涂层时间可能因您的样品而异, 此处给出的值取决于我们的经验。溅射涂层不足的一个潜在的负面结果是一种称为充电的现象, 在最终图像中, 这种现象通常表现为白色或黑色线 (有时是闪光灯) (例如, 请参见图 4f和g )。如果观察到的充电量最小, 则可以通过调整各种显微镜参数来减轻影响, 例如降低加速电压或光束电流、提高冷凝器透镜强度, 或使用较小的目标光圈。大多数用于生物样本的 sm 都有二级电子探测器, 但一些 sm 也可能配备背散射探测器或环境二次电子探测器, 所有这些都可以进行调整, 以减少或消除最小的影响。充电。如果充电效果更为明显, 则可能是样品接地不良或溅射涂层太少, 无法产生二次电子, 导致带电电子在样品中积聚并自发释放, 产生在采集过程中图像中的失真。发音充电通常是用较厚的涂层或更好的银漆接地来解决的。由于太多和太少的溅射涂层会对图像质量产生负面影响, 因此最好通过调整溅射机的时间变量 (10 至 180秒) 和压力 (70 至 150 mtorr) 来优化涂布量, 以达到最佳效果。涂层。由于涂层一旦应用到样品上就无法去除, 因此建议在对所有样品进行涂层之前, 先使用单个样品进行测试运行。
sem 参数, 如加速电压 (kv), 探头电流 (pc), 和工作距离 (wd) 必须调整, 以获得最佳图像可能, 因为这里给出的设置是根据我们的经验建议启动参数。虽然样品的质量取决于准备时的注意程度, 但最终图像的质量取决于 sem 操作员的经验和技能。因此, 我们建议您与 sem 技术人员合作, 或花时间开发您自己的 sem 技能。本文所展示的所有数据 (包括样品制备和成像) 都是由 cmu 生物显微镜课程的本科生在教职员工和显微镜技师的指导下生成的。
这里描述的议定书包括使用潜在的有害化学品, 应始终遵守适当的安全措施, 以保护用户, 特别是可能正在处理这些化学品的学生。虽然协议规定了首次使用时与每种化学品有关的安全问题, 但用户应始终: (1) 使用化学烟罩, (2) 可使用紧急洗眼和安全淋浴, (3) 使用适当的个人防护设备, 包括丁腈手套、实验室涂层和眼睛保护, 以及 (4) 知道在哪里可以找到书面安全程序, 包括处理程序、指定的使用区域、溢漏程序、去污程序和废物处理程序。
总之, 这些生物体说明了关于每个生物的外部表面的三维地形的信息如何有助于系统发育分组或改性剂分析。对于蓝藻, 从扫描电镜确定的特征可与来自光学显微镜、透射电镜和分子研究的附加数据结合使用, 以识别、表征和命名蓝藻。对于黄酮类化合物, 可将球囊条的数量、宽度、排列 (螺旋或直) 和装饰 (如果存在) 与其他形态数据一起使用, 如有必要, 还可与分子数据一起使用, 以识别、表征和命名黄酮类化合物。此外, 还可以以类似的方式制备和检查其他类型的单细胞藻类和原生动物或微无脊椎动物, 以确定外部形态特征, 如鞭毛、喂养结构、外部装饰或细节。在微无脊椎动物的情况下附属物。最后, sem 有广泛的应用来检查形态学细节, 如模型系统果蝇的眼睛, 以表征遗传修饰性的疾病病理。这里描述的协议利用在复杂性方面差异很大的生物体, 但所有的生物都可以进行 sem 分析, 以收集有用的形态信息, 这些信息对于跨越许多不同子学科的科学发现至关重要。生物学。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的资金来自中央密歇根大学研究和研究生办公室对 mls 的资助和对 mak 的暑期学者奖。蓝藻是由 zimba 和浮游生物实验室提供的, 该实验室是德克萨斯 a & m 大学科珀斯克里斯蒂海岸研究中心的一部分。优化子碱是由密歇根州立大学的 triemer 实验室提供的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given - see link |
| AF6 media | Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given - see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given - see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE |
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References
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
- Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
- Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A.
- Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
- Shulman, J. M., Feany, M. B.
- Reinecke, J. B., et al.
