Summary
في إعدادات السريرية، يتم استخدام عينة من كبد لتقييم مراحل غير الكحولية steatohepatitis (ذلك والتهاب وتتمثل تضخم وتليف). نحن هنا، لتوضيح البقاء خزعة كبد في الفئران التي يمكن استخدامها لإجراء تحاليل نسيجية للتمكين من تقييم العوامل العلاجية بطريقة أكثر مواءمة مع التجارب السريرية.
Abstract
التجارب السريرية تقييم العلاجات للعلاج غير الكحولية steatohepatitis (ناش) تنطوي خط الأساس ونهاية الدراسة الكبد خزعة، وتقييم التحسن في النهاية المرض، غالباً ما تنعكس كنسبة مئوية من كل ذراع العلاج أن تتحسن، سوءا أو ظلت دون تغيير. دراسات القوارض السريرية التقليدية المفترضة ناش العلاجات غالباً محدودة بسبب عدم معرفة مستوى الكبد مرض/ناش الحالية في بدء التدخل العلاجي، بدلاً من التعشئه مجموعات العلاج في النهاية يمكن قياسها بسهولة مثل وزن الجسم، وحالة التمثيل الغذائي أو ما شابه ذلك. وهنا يصف لنا تقنية خزعة كبد في الناجمة عن النظام الغذائي ناش الفأر نموذجا، لتقييم أمراض الكبد الأساس بغية استبعاد الفئران التي لا تظهر التليف وتوزيعها بالتساوي مع التليف مماثلة بين مجموعات معاملة الحيوانات. يمكن بعد ذلك مقارنة هذه المستويات إلى مستويات المحطة الطرفية، بعد التدخل لفهم أصدق للتأثيرات الدوائية المجراة في ومما يعكس بشكل أدق استراتيجيات تصميم التجربة السريرية. الماوس بشكل صحيح تخديره وإعدادها لعملية جراحية باستخدام ظروف معقمة. يتم إجراء شق صغير في الجزء العلوي من البطن ويتم كشفها الفص الجانبي الأيسر للكبد. آسفين الكبد هو إزالتها جراحيا، وهو وضع قطعة مماثلة الحجم من الجيلاتين قابلة للامتصاص في مكان عمله لوقف أي نزيف. الماوس جراحيا خياطة وتدبيس مغلقة وسوف تسترد مرة أخرى إلى طبيعتها خلال يوم 1. تستغرق العملية كاملة 5-10 دقيقة للماوس. هنا نحن تجسد مدى فائدة هذا الإجراء بالاستفادة من خزعة قبل دراسة لتقييم تأثير مثل الجلوكاجون الببتيد-1 (GLP-1) مستقبلات مؤثر liraglutide في النهاية ناش في الفئران.
Introduction
عدم الكحولية steatohepatitis (ناش) هو مرض كبد تدريجيا، وشكلاً أكثر حدة من مرض الكبد الدهني (NAFLD)، التي أصبحت أكثر انتشارا بسبب ارتباطه بالسمنة ومرض السكري من النوع 2. هناك لا العلاجات المعتمدة ل NAFLD/ناش، أو المؤشرات الحيوية المعتمدة لتقييم تطور المرض سهولة. يتم تشخيص ناش الأشيع بتقييم التهاب، فائض الدهن الكبدي (ذلك) وتتمثل في تضخم وتليف1،2،،من34. في التجارب السريرية، ويتم تقييم هذه النهاية قبل الدراسة في عينة كبد التي جمعت عن طريق خزعة، ومن خزعة كبد ثانية بعد فترة زمنية معينة من علاج. وهكذا، تقييم فعالية عامل الاختبار عن طريق التغيير في أمراض الكبد في المواضيع مع الكمية المحددة مسبقاً (أي، ثبت في خزعة) ناش التي هي عشوائية لمجموعات العلاج. غالباً ما تستخدم هذه النهاية النسجية ذاتها في القوارض نماذج تقييم إمكانية التداوي ناش في الدراسات السريرية، ولكن فقط في الأنسجة الطرفية من الفئران euthanized وهكذا دون فهم لدرجة الفعالية في خط الأساس، وعدم القدرة للتحكم في وجود اختلافات بين مجموعات العلاج في حالة المرض الأساس.
على الرغم من أن 25% بالغين مع نافلد يفترض أن يكون ناش استناداً إلى مستويات aminotransferase المصل مرتفعة، توجد أية أساليب نهائية بديلة لتأكيد ناش خلاف الأدلة النسيجي4. أساليب موسع، مثل طرائق الإشعاعي (الموجات فوق الصوتية والتصوير المقطعي والتصوير بالرنين المغناطيسي) قد وضعت للكشف عن ذلك الكبد، ولكن هذه الأساليب لا يمكن تشخيص ناش أو تحديد مرحلة التليف. الاستوجرافي عابر يوفر طريقة غير الغازية واعدة لقياس صلابة الكبد. فقد ثبت أن تكون دقيقة في التفريق بين مراحل التليف. ومع ذلك، الدقة تتناقص مع ارتفاع مؤشر كتلة الجسم (BMI) والأنسجة الدهنية. 5 وهذه مشكلة نظراً لغالبية المرضى ناش يجري يعانون من السمنة المفرطة. تتجاوز أهمية سريرية لهذه النهج، تستخدم أيا من هذه الطرائق في الدراسات الإكلينيكية.
للتغلب على هذا، كانت المجموعة البحثية للدكتور جوناثان روث أول تنفيذ إجراء خزعة كبد في نموذج ناش6،،من78الماوس ناش أميلين (أملن). ووصفوا المصدوقية التنبؤية خزعة بدرجة من المرض ناش وترابط مع الأمراض الأيضية. هنا يصف لنا بالتفصيل الإجراء خزعة الكبد في نموذج أملن ناش وفائدتها في إعداد علاجية، على وجه التحديد لتقييم فعالية ليراجلوتيدي.
Protocol
أجريت جميع التجارب المجراة في وفقا لسياسات "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) ميديموني، شركة ذات مسؤولية محدودة وبالاتفاق مع الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والطبعة الثامنة (2011). ووضعت C57BL6J الفئران الذكور على النظام الغذائي أملن عالية من الدهون، وسكر الفاكهة عالية، والكوليسترول العالية. وتم إجراء خزعات الكبد بعد 26 أسبوعا في النظام الغذائي، 3 أسابيع قبل بدء التدخل الدوائي.
1-الحصول على وإعداد المواد الجراحية
- اﻷوتوكﻻف الصكوك العقيمة (صغيرة تلميح إلى المقص والملقط نصيحة فظة، مسحات القطن، الساحات شاش، مقاطع 7 ملم دبابيس/الجرح ودباسة).
- الحصول على أو خياطة العقيمة لإغلاق جدار البطن (5-0 خياطة الامتصاص المغلفة بإبرة PC-1 مناسبة) والإسفنج الجيلاتين الامتصاص مضغوطة (لاستخدامها لأغراض مرقئ) والستائر العقيمة وقفازات، فرك المستندة إلى اليود و 70% إيثانول مسحات/مناديل ، البوبرينورفين (0.05-0.1 مغ/كغ الجرعة الواحدة الماوس؛ وعلى الأقل 3 جرعات كل الماوس) والعين الجراحية مرهم/تزييت.
- إعداد المبخر للتخدير بملء مع إيسوفلوراني.
- قم بتشغيل معقم حبة، للتعقيم أداة سريعة بين الحيوانات.
- بدوره على سطح الاحترار أو وسادة التدفئة، لاستخدامها لاسترداد الحيوان.
- دون مناسبة معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) (أي، قناع، ثوب، بونيه الشعر، قفازات).
2-مرحلة ما قبل الجراحية التحضير
- ضع الماوس في قاعة توجيهي مع تدفق isoflurane 2-3% للتأثير.
- ملاحظة الماوس حتى يؤكد عدم الاستجابة رشة تو عمق التخدير المناسب.
- استخدام مرهم عين لمنع جفاف القرنية المرتبطة بالتخدير.
- إدارة البوبرينورفين تحت الجلد (0.05-0.1 مغ/كغ).
- يحلق موقع الجراحية والذيلية فورا عملية الرهابه، استخدام مقص الحيوان.
- حرك الماوس على سطح ساخن (37 درجة مئوية) وبعد الحلاقة موقع الجراحية. ضع الماوس في مثل هذه طريقة حيث أن السطح الظهرية إلى الأسفل، ويتم كشفها في البطن. إدراج آنف الماوس في مخروط الآنف التخدير تسهيل إيصال إيسوفلوراني بمعدل تدفق من 2-3%.
- تنظيف الموقع الجراحي بالتناوب مسحات من تدين والايثانول 70% (3 مرات).
- فتح وإعداد الأدوات الجراحية المعقمة.
- إزالة القفازات واستبدال مع القفازات الجراحية المعقمة.
3-الجراحة
- جعل شق طولي بالمقص (1-2 سم)، والذيلية فورا عملية الرهابه وقليلاً على الجانب الأيسر للماوس، في جلد البطن.
- بلانت تشريح الجلد بعيداً عن جدار البطن باستخدام الملقط، والمقص.
- الكشف عن جدار البطن ووضع تصور للكبد تحتها.
- استخدام تكوين شفرة مشرط معقم شق (1-2 سم) في جدار البطن لتصور الفص الجانبي الأيسر (التعلم مدى الحياة) في الكبد.
ملاحظة: أن تكون متسقة في جميع أنحاء الدراسة. هي الأخرى الفصوص المشتركة لمصلحة حق الآنسي الفص (RML) والفص الأيسر الآنسي (حب حياتي). - تخريج الفص الجانبي الأيسر من خلال الشق.
- الخيار 1: طفيفة تدليك البطن بالإبهام والسبابة لفضح جزء من التعلم مدى الحياة.
- الخيار 2: مكان مسحه القطن معقمة تحت التعلم مدى الحياة بلطف سحب جزء معرضة.
- ضع قطعة شاش تحت التعلم مدى الحياة للسماح لسطح العقيمة ورطب للكبد على الاستلقاء على عقيمة غارقة في المياه المالحة.
- قص قطعة على شكل آسفين من الكبد من التعلم مدى الحياة بإجراء تخفيضات اثنين مع مقص معقم.
ملاحظة: الحجم التقريبي للكبد تجري إزالته 30-50 مغ (< 5% الكبد في الفئران). - قص قطعة من الأسفنج الجيلاتين مماثلة في حجم إلى آسفين قطعة من الكبد. إدراج الأسفنج إلى قطع جزء من الكبد باستخدام الملقط.
- عقد الأسفنج في المكان مع الملقط والبقاء على اتصال مع الكبد حتى أنها تلتزم بسطح الكبد والارقاء ويتحقق.
- مكان قطعة خزعة الكبد في أنبوب مناسب (أي المجمدة، مثبت، إلخ.).
- بلطف ضع الكبد مرة أخرى في تجويف البطن، مع الحرص على عدم إزعاج الأسفنج.
- خياطة جدار البطن مع 5-0 المغلفة خياطة الامتصاص تبدأ وتنتهي مع عقده مربعة كاملة.
- إغلاق الجلد مع 7 ملم الجرح مقاطع (أو المواد الغذائية الأساسية).
- فحص القصاصات الجرح التأكد من أن هناك إغلاقاً كاملا للشق.
- إزالة الماوس من مخروط الآنف ووضعه في قفص نظيف على سطح ساخن.
- أدوات المكان إلى المطهر حبة بين الفئران 10-20 س. تأكد من يجب إزالة جميع المواد العضوية من الصكوك استخدام المحلول الملحي المعقم قبل وضع في التعقيم حبة الزجاج.
4-بعد العمليات الجراحية الرعاية
- رصد الماوس حتى يستعيد وعيه ويمكن الحق نفسه.
- تسجيل الملاحظات بعد العمليات الجراحية، والتحقق من الفئران يوميا ل dehiscence.
- إدارة جرعة الثانية والثالثة من البوبرينورفين (0.05-0.1 مغ/كغ) ح 6-8 تحت الجلد ما بعد الجراحة والجراحة بعد 24 ساعة مرة أخرى.
- إزالة مقاطع الجرح في 7-10 أيام بعد الجراحة.
Representative Results
لهذه الدراسة، كانت عشوائية الفئران إلى مجموعات العلاج (n = 12/مجموعة) استناداً إلى عينة الدراسة ما قبل التليف الصف ووزن الجسم. كانت تدار من الفئران مركبة (PBS) أو ليراجلوتيدي (نمول 5/كغ) لمدة 42 يوما (السيارة أو المركبة التي تدار 10 مل/كغ جرعة وحدة التخزين، تحت الجلد، مرة واحدة يوميا). في يوم 42، قد euthanized الفئران (عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 ) في الدولة غير صامت، والكبد اقتطعت وتجهيزها لعلم الأنسجة.
ثم البارافين الكبد خزعة والمحطة الطرفية القطع كانت ثابتة بين عشية وضحاها في الفورمالين 10%، جزءا لا يتجزأ والمجهزة الهيماتوكسيلين ويوزين و "الأحمر سيريوس"، تلطيخ عبر البروتوكولات القياسية9. أقسام الأنسجة قيمت بشكل أعمى بأخصائي وفقا لنظام سجل النشاط ناش (NAS)1،2. الناس يعكس درجة المرض لذلك والتهاب مفصص وتتمثل تضخم (كل معلمة تعطي درجة من 0-3) كما هو موضح سابقا9.
إدراج عينة من كبد في تصميم هذه الدراسة يسمح لدرجة تليف (خزعة قبل) خط أساس. كان ما مجموعة 118 الفئران فحص بعد 26 أسبوعا حمية ناش وتليف الكبد وذلك سجل لكل عينة (الشكل 1). استبعدت الفئران 49 من هذه الفئران 118، استناداً إلى انخفاض التليف التليف عالية (درجة صفر)، (نقاط من 4، التي أظهرت علم الأمراض غير طبيعي)، وفقدان الوزن غير طبيعي أو التئام الجروح. تركت هذه معايير الاستبعاد يسمح للفئران 69 لتعيين مجموعات الدراسة والبحث عن تحسينات في النمط الظاهري ناش بعد المعالجة (الشكل 1).
وعولج الفئران مع السيارة أو liraglutide مؤثر GLP-1R (نمول 5/كغ) لمدة 6 أسابيع. في المجموعة المعالجة بالمركبات، الماوس 1 المشاركة تفاقم التليف و 4 الفئران أظهرت تدهور ناس درجة (الشكل 2 أ-ب). وكانت معاملة Liraglutide المقترنة مع تحسين شامل التليف (الشكل 2)، 17% من تحسين مجموعة العلاج و 83% المتبقية دون تغيير. وبالمثل، تحسن معاملة liraglutide ناس عموما نقاط (الشكل 2D)، مع 66 في المائة المجموعة التي تحسنت درجة ناس و 33% ظلت دون تغيير.
بالإضافة إلى ذلك، تحسنت المعاملة liraglutide التهاب، مع 75% المجموعة وجود انخفاض درجة التهاب ونسبة 25 في المائة ما زال دون تغيير (الشكل 3B). معاملة مركبة تفاقم الالتهاب، مع 17% مجموعة لها أعلى درجة التهاب و 83% لم يتغير (الشكل 3A). سجل ذلك لم يتغير من خط الأساس لإنهاء الدراسة في كل مركبة و liraglutide معاملة المجموعات (الشكل 3 أ، ب). قبل مقابل خزعة بعد إجراء مقارنات للفئران الفردية على التهاب وتضخم المعلمات كما تظهر (الشكل 3-F).
رقم 1: الفحص المسبق تليف الكبد خزعة ونقاط ناس . (أ) تمثيل جميع الفئران 118 التي تم فرزهم التليف، عن طريق خزعة الكبد. (ب وج) تظهر التليف الأساس ونقاط ناس، على التوالي، بعد أن تم فرز الفئران المؤهلة إلى مجموعات الدراسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التليف وناس نقاط، خزعة قبل وبعد التدخل. تحليل نسبة المستجيب للمركبات (أ، ج) أو (ب د) يعامل liraglutide الفئران، مقاسا من خزعة الكبد الأساس لوضع حد لمن عينة الدراسة الكبد لمرحلة التليف (أ، ب) وناس (ج، د). لكل مجموعة، يتم الإشارة إلى التغيير من مرحلة ما قبل الدراسة إلى عينة الدراسة بعد انتهاء خط. النقاط في كل خطوة التهديف هو إزاحة قليلاً للسماح بفصل مرئي من الحيوانات، وهذا هو فقط لأغراض التصور ولا تعكس أي اختلاف في نقاط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ذلك والتهاب وتضخم وخزعة قبل وبعد التدخل. تحليل نسبة المستجيب للمركبات (A, C, E) أو (ب، د، و) يعامل liraglutide الفئران، مقيسا من خزعة الكبد الأساس لوضع حد لمن عينة الدراسة الكبد لذلك نقاط (أ، ب)، التهاب (ج، د) وتضخم (ه، و). لكل مجموعة، يتم الإشارة إلى التغيير من مرحلة ما قبل الدراسة إلى عينة الدراسة بعد انتهاء خط. النقاط في كل خطوة التهديف هو إزاحة قليلاً للسماح بفصل مرئي من الحيوانات، وهذا هو فقط لأغراض التصور ولا تعكس أي اختلاف في نقاط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هنا يصف لنا بالتفصيل الإجراء خزعة الكبد الماوس أولاً وصف المصفق et al.10، وتجسد فائدتها في طراز ماوس ناش، مماثلة للتقارير السابقة6،9. الإجراء خزعة الكبد أداة قيمة لتقييم النمط الظاهري ناش قبل وبعد العلاج، بطريقة مشابهة للتي يؤديها في التجارب العلاجية السريرية. الخزعة يسمح للمقارنة المباشرة لكل موضوع، أي الفئران نفسها يمكن أن تستخدم لكل من النقاط الزمنية. كما نبدي إمكاناتها متعدية الجنسيات. في التجارب سريرية في مواضيع ناش خزعة-ثبت، أثارت liraglutide نسبة 39% استجابة (المرضى مع تحسن) في ناس، بينما لاحظنا في دراستنا بمعدل 66% مستجيب لناس محسنة. وعلاوة على ذلك، كان 26 في المائة مرضى درجة التليف تحسين مع 9 ٪ سوءا، مقابل 14 في المائة و 36 في المائة في الذراع الغفل، على التوالي11. لقد لاحظنا في دراستنا، بمعدل 17% تحسن مع العلاج ليراجلوتيدي. تسليط الضوء على سلطة خزعة الكبد الأساس هذه المقارنات وتأكيد التفاهم متعدية الجنسيات المحتملة، على الأقل لهذه الفئة من العلاجية.
أنها حاسمة بالنسبة لحصاد قطعة كبيرة بما يكفي من أنسجة الكبد أثناء إجراء خزعة لتحليل الميزات النسيجي بشكل صحيح، ولكن أيضا ليست كبيرة جداً من قطعة من الكبد بخرق وظيفة الكبد. لاحظنا بمعدل وفيات صفر مع هذه الجراحة، والحيوانات وبدأ تعافي تماما في يوم واحد مع استئناف السلوك العادي للأكل. هكذا، الوقت بين خزعة والشروع في الدراسة تدخل محدودة لا باسترداد الحيوان ولكن من المرجح بالوقت الذي يستغرقه تجهيز العينات والتحليل والعشوائية اللاحقة.
استخدام الإجراء خزعة الكبد كطريقة لتأكيد التليف قبل التدخل ساعد على الحد من تقلب في دراستنا، مما يسمح لنا باستبعاد الفئران التي لم تتطور تماما درجة التليف الكبدي نتيجة النظام الغذائي الذي يحفز ناش أملن. وعلاوة على ذلك، فإنه تعزيز قدرتنا على فهم أفضل لأثر التدخلات الممكنة تحسين ناش، مقابل فقط الحصول على عينة الكبد المحطة الطرفية ونقاط ناش. حتى يتم مواصلة استكشاف تقنيات جديدة غير الغازية ومقبولة على نطاق واسع، خزعة الكبد هو فقط ثبت طريقة لتحديد ناش.
Disclosures
س وس. ر. من الموظفين الحاليين و/أو الأسهم من ميديموني/استرا زينيكا. وكان الينابيع الموظف والأسهم من ميديموني/استرا زينيكا في الوقت أجريت هذه التجارب.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بامتنان مساعدة هولي كولكيبيك ولي سالي للخبرة في مجال تجهيز الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري. كما يشكر المؤلفون دونا جولدستين وموظفي "المختبر الموارد الحيوانية" (ميديموني، غايثرسبيرغ، دكتوراه في الطب) لمساعدتها مع الإجراءات التقنية وتربية الحيوانات والرعاية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
