Summary
在临床环境中, 肝脏活检用于评估非酒精性脂肪性肝炎 (脂肪变性、炎症、肝细胞膨胀和纤维化) 的各个阶段。在这里, 我们说明了小鼠的可存活肝活检, 可用于组织学分析, 以便能够以更符合临床试验的方式评估治疗药物。
Abstract
评估治疗非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 疗法的临床试验涉及一个基线和研究结束肝脏活检, 并评估疾病终点的改善, 往往反映为每个治疗臂改善的百分比,恶化或保持不变。传统的临床前啮齿类动物研究假定的 nash 疗法往往受到限制, 因为它不知道治疗干预开始时存在的肝病/nash 的水平, 而不是在容易测量的终点上随机治疗组, 如体重、代谢状况或类似。在这里, 我们描述了肝脏活检技术在饮食诱导的 NASH 小鼠模型, 评估基线肝病, 以排除小鼠不表现出纤维化, 并平等分布与类似纤维化的动物之间的治疗组。然后, 这些水平可以与终端、干预后的水平进行比较, 以便更真实地了解体内的药理作用, 从而更准确地反映临床试验设计策略。使用无菌条件对小鼠进行适当麻醉, 并为手术做好准备。上腹部有一个小切口, 肝脏的左侧叶暴露。一个肝脏的楔子被手术切除, 并放置在它的地方, 以阻止任何出血类似大小的可吸收明胶。对鼠标进行手术缝合, 并将其缝合关闭, 并将在1天内恢复正常。整个过程需要5-10 每只鼠标。在这里, 我们通过利用研究前活检来评估胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 受体激动剂利拉鲁肽对小鼠 NASH 终点的影响, 以此说明这一程序的效用。
Introduction
非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 是一种进行性肝病, 也是一种更严重的非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD), 由于与肥胖和2型糖尿病有关, 这种疾病正变得越来越普遍。目前还没有批准的 nafdwnash 疗法, 也没有经批准的生物标志物来随时评估疾病进展情况。通过评估炎症、过多的肝脏脂质 (脂肪变性)、肝细胞膨胀和纤维化1、2、3、4进行组织学诊断。在临床试验中, 这些终点在研究之前在通过活检收集的肝脏样本中进行评估, 并在一定的治疗期之后进行第二肝活检。因此, 通过对先前被随机诊断为治疗组的 NASH 进行定量 (即生物经证实的) 的受试者肝脏病理改变来评估检测剂的有效性。这些相同的组织学终点经常用于在早期研究中评估潜在的 NASH 疗法的啮齿类动物模型中, 但只用于安乐死小鼠的终末期组织, 因此不了解基线的疗效程度和无能控制治疗组之间基线疾病状态的差异。
虽然25% 的 NAFLD 成年人被认为是基于血清氨基转移酶水平升高而患有 NASH, 但除了组织学证据4之外, 没有其他明确的方法来确认 NASH.非侵入性方法, 如放射学方法 (超声, 计算机断层扫描和磁共振成像) 已开发用于检测肝脂肪变性, 但这些方法不能诊断 NASH 或确定纤维化的阶段。瞬态弹性成像为测量肝脏僵硬提供了一种很有前途的非侵入性方法。它已被证明是准确的区分纤维化阶段。然而, 精度随着体重指数 (BMI) 和脂肪组织的增加而降低。5由于大多数 nash 患者肥胖, 这是有问题的。除了这些方法的临床相关性之外, 这些方法都没有用于临床前研究。
为了克服这一问题, 乔纳森·罗斯博士的研究小组率先在 nash 6、7、8的淀粉 nash (amln) 小鼠模型中实施了肝脏活检程序。他们描述了与 NASH 疾病程度有关的活检的预测有效性以及与代谢疾病的相关性。在这里, 我们详细描述了在 AMLN 模型的 NASH 肝脏活检程序及其在治疗环境中的效用, 特别是评估利拉鲁肽的疗效。
Protocol
所有体内实验都是根据 MedImmune 机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的政策进行的, 并符合《实验动物护理和使用指南》第8版 (2011年)。雄性 C57BL6J 小鼠被放置在高脂肪、高果糖、高胆固醇的 AMLN 饮食中。在开始药物干预前 3周, 在饮食26周后进行肝脏活检。
1. 获得和准备手术材料
- 高压灭菌器 (小尖剪刀、钝尖钳、棉签、纱布方块、7毫米订书夹和订书机)。
- 获得关闭腹壁的无菌缝合线 (5-0 涂层可吸收缝合线与 PC-1 针是合适的), 可吸收的明胶压缩海绵 (用于止血目的), 无菌窗帘和手套, 碘基擦洗和70% 乙醇 swabsabs/湿巾, 丁丙诺非 (每只小鼠 0.05-0.1 mg/kg 剂量; 每只小鼠至少3剂) 和手术眼肌动/润滑。
- 用异氟醚填充, 为麻醉准备蒸发器。
- 打开珠子灭菌器, 以便在动物之间快速进行仪器灭菌。
- 打开加热面或加热垫, 用于动物回收。
- 适当的个人防护设备 (如面膜、长袍、头罩、手套)。
2. 手术前准备
- 将鼠标放入具有2-3% 异氟烷流动的感应室中生效。
- 观察小鼠, 直到缺乏对脚趾捏的反应, 确认麻醉的深度是适当的。
- 使用眼药膏, 以防止与麻醉相关的角膜干燥。
- 皮下药丁酮非诺芬 (0.05-0.1 mg/kg)。
- 用动物钳立即将手术部位的过程倒出。
- 剃须后, 将鼠标移动到加热表面 (37°c)。放置鼠标在这样的方式, 使背表面向下, 腹部暴露。将小鼠的鼻子插入麻醉鼻锥, 以促进在2-3% 的流速下传递异氟醚。
- 用 betadine 和70% 乙醇的交替棉签清洁手术部位 (3次)。
- 打开并设置无菌手术器械。
- 取下手套, 更换无菌手术手套。
3. 手术程序
- 用剪刀做一个纵向切口 (1-2 厘米), 立即尾状的过程, 稍微到老鼠的左侧, 在腹部皮肤。
- 钝器用钳子和剪刀解剖皮肤远离腹壁。
- 暴露腹壁, 想象下面的肝脏。
- 使用无菌手术刀刀片在腹壁做一个切口 (1-2 厘米), 以显示肝脏的左外侧叶 (LLL)。
请注意:在整个研究过程中保持一致。其他常见的兴趣叶是右内侧叶 (RML) 和左内侧叶 (爱我的生活)。 - 通过切口使左外侧叶外部化。
- 选项 1: 用拇指和食指轻轻按摩腹部, 露出 LLL 的一部分。
- 选项 2: 将无菌棉签放置在 LLL 下方, 轻轻拉出一部分以暴露。
- 在 LLL 下面放置一块不育的盐水浸透的纱布, 让肝脏有一个无菌和水合的表面。
- 用无菌剪刀从 LLL 切出一块楔形的肝脏。
请注意:被切除的肝脏的大约大小是30-50 毫克 (& lt;5% 的肝脏在小鼠)。 - 切一块与肝脏楔块大小相似的明胶海绵。用钳子将海绵插入肝脏的切割部分。
- 用钳子固定海绵, 保持与肝脏的接触, 直到它粘附在肝脏表面, 止血。
- 将肝脏活检片放入适当的试管 (即冷冻、固定等)。
- 轻轻地将肝脏放回腹腔, 注意不要打扰海绵。
- 用5-0 涂层可吸收缝合线缝合腹壁, 开始和结束时有一个完整的正方形结。
- 用7毫米伤口夹 (或订书针) 关闭皮肤。
- 检查伤口夹, 确保切口完全闭合。
- 将鼠标从鼻锥中取出, 放入加热表面的干净保持架中。
- 将仪器放入小鼠之间的珠子灭菌器中, 在放置玻璃珠消毒器之前, 请确保所有有机物质都应使用无菌盐水从仪器中取出。
4. 术后护理
- 监视鼠标, 直到它恢复意识, 并可以权利自己。
- 记录术后观察, 并每天检查小鼠的裂开。
- 术后6-8 和手术后 24小时, 在皮下再次服用第二和第三剂丁丙诺非 (0.05-0.1 mg/kg)。
- 术后7-10 取出伤口夹。
Representative Results
在本研究中, 根据活检前的纤维化程度和体重, 将小鼠随机分为治疗组 (n = 12 组)。给小鼠给药 42天 (PBS) 或利拉鲁肽 (5 nmolp) (车辆或化合物给药 10 mL/kg 剂量体积, 皮下注射, 每日一次)。第42天, 小鼠在非禁食状态下进行安乐死 (通过二氧化碳吸入), 并对肝脏进行组织学处理。
活检和终末肝块被固定在10% 福尔马林, 然后石蜡嵌入和处理的血红素和 eosin, 和天狼星红, 染色通过标准协议 9。根据 nash 活动评分 (nas) 系统1,2, 病理学家以盲目的方式评估组织切片。NAS 反映了脂肪变性、小叶炎症和肝细胞膨胀 (每个参数的得分为 0-3) 的疾病程度, 如前面所述的9。
将肝脏活检纳入本研究的设计, 可以得出基线 (活检前) 纤维化得分。在 MASH 饮食26周后, 共对118只小鼠进行了活检, 每次活检均可进行肝纤维化和脂肪变性评分 (图 1)。在这118只小鼠中, 49只小鼠被排除在低纤维化 (评分为 0)、高纤维化 (4 分, 病理异常)、体重减轻异常或伤口愈合等方面。这些排除标准允许69只小鼠分配到研究小组, 并在治疗后寻找 NASH 表型的改进 (图 1)。
用车辆或 GLP-1R 激动剂 liragllitytit (5 nmolg/kg) 对小鼠进行了6周的治疗。在车辆治疗组, 1只小鼠表现出纤维化恶化, 4只小鼠表现出 NAS 评分恶化 (图 2A-B)。利拉鲁肽治疗与纤维化的整体改善有关 (图 2c), 17% 的治疗组改善, 83% 保持不变。同样, 利拉鲁肽治疗提高了总的 NAS 评分 (图 2d), 66% 的组的 nas 评分得到改善, 33% 保持不变。
此外, 利拉鲁肽治疗改善了炎症, 75% 的组炎症评分较低, 25% 保持不变 (图 3B)。车辆治疗加剧了炎症, 17% 的人群炎症得分较高, 83% 保持不变 (图 3 a)。在车辆和利拉格肽治疗组的研究结束期间, 脂肪变性评分保持不变 (图 3a, b)。还显示了单个小鼠在炎症和膨胀参数方面的活检前与活检后比较 (图 3c-f)。
图 1: 筛查前肝活检纤维化和 NAS 评分.(A) 通过肝活检, 对所有118只接受纤维化筛查的小鼠进行观察。(B和c) 分别显示合格小鼠分组后的基线纤维化和 nas 评分。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 纤维化和 NAS 评分、活检前和干预后.车辆 (a, c) 或利拉鲁肽治疗小鼠 (b, d)的百分比应答分析, 从基线肝活检到研究结束肝样本纤维化阶段 (a, b) 和 nas (c, d) 测量。对于每一组, 从研究前活检到研究后活检的变化都是用一条线表示的。每个得分步骤的积分都稍有变化, 允许动物的视觉分离, 这只是为了可视化目的, 并不反映分数上的任何差异。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 脂肪病、炎症和膨胀、活检前和干预后.车辆 (a、c、e) 或利拉鲁蒂治疗 (b, d, f)小鼠的百分比应答分析, 从基线肝活检到研究结束的肝脏样本测量, 用于脂肪病评分 (a、b)、炎症 (c, d) 和膨胀 (e, f)。对于每一组, 从研究前活检到研究后活检的变化都是用一条线表示的。每个得分步骤的积分都稍有变化, 允许动物的视觉分离, 这只是为了可视化目的, 并不反映分数上的任何差异。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在这里, 我们详细地描述了第一次由克拉珀等人. 10 描述的小鼠肝脏活检程序, 并举例说明了它在鼠标 nash 模型中的效用, 类似于以前的报告6,9。肝脏活检程序是评估 NASH 表型的一个有价值的工具, 治疗前和治疗后, 其方式类似于临床治疗试验中的做法。活检允许对每个对象进行直接比较, 即相同的老鼠可以在这两个时间点上使用。我们还展示了它的平移潜力。在生物验证 nash 研究对象的临床试验中, liraglutit 在 NAS 中获得了39% 的反应率 (改善的患者), 而在我们的研究中, 我们观察到对改进的 NAS 的反应率为66%。此外, 26% 的患者纤维化评分改善, 恶化 9%, 而安慰剂手臂分别为14% 和 36%.在我们的研究中, 我们观察到利拉鲁肽治疗的改善率提高了17%。这些比较突出了基线肝活检的力量, 并确认潜在的翻译理解, 至少对于这类治疗。
在活检过程中采集足够大的肝组织, 以正确分析组织学特征, 但也不能太大的一块肝脏, 以损害肝脏的功能, 这是至关重要的。我们观察到这种手术的死亡率为零, 随着正常饮食行为的恢复, 这些动物在1天内出现完全恢复。因此, 从活检到启动干预研究之间的时间不受动物恢复的限制, 而是可能受到样本处理、分析和随后随机化所需时间的限制。
利用肝活检程序作为干预前确认纤维化的方法, 有助于减少我们研究中的变异性, 使我们能够排除由于 AMLN nash 诱导饮食而没有完全发育到一定程度的肝纤维化的小鼠。此外, 它还增强了我们更好地了解可能的 nash 改进干预措施的影响的能力, 而不是只有终末肝样本和 NASH 评分。在新的非侵入性技术被进一步探索和广泛接受之前, 肝脏活检是唯一被证明的确定 NASH 的方法。
Disclosures
S. o. 和 c. r. 是 medimaeee·astreneca 的现任雇员和/股东。在进行这些实验时, JLT 是 Medavome/acstraeneca 的雇员和股东。
Acknowledgments
作者感谢萨莉·李和霍莉·科尔克贝克在组织处理和免疫组织化学方面的专业知识。作者还感谢 Donna Goldsteen 和实验动物资源工作人员 (马里兰州盖瑟斯堡的 Medimune) 在技术程序、畜牧业和护理方面提供的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
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