Summary
I kliniske indstillinger bruges en leverbiopsi til at vurdere stadier af ikke-alkoholiske steatohepatitis (steatose, betændelse, hepatocyt ballooning og fibrose). Her viser vi en overleves leverbiopsi i mus, som kan bruges til histologisk analyser vurdering af terapeutiske agenter på en måde, der er mere på linje med kliniske forsøg.
Abstract
Kliniske forsøg vurderer terapier til behandling af ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH) indebærer en baseline og slutningen af undersøgelse lever biopsi, samt vurdering af forbedring i sygdommen slutpunkter, ofte til udtryk som en procent af hver behandling arm, der forbedres, blevet værre eller uændret. Traditionelle prækliniske gnaver undersøgelser for formodede NASH behandlinger er ofte begrænset af ikke at vide niveauet af leveren sygdom/NASH stede i starten af terapeutisk intervention, i stedet for randomizing behandlingsgrupper på let målelige slutpunkter såsom legemsvægt, stofskifte status eller lignende. Her, beskriver vi en leverbiopsi teknik i en kost-induceret NASH musen model, for vurdering af baseline lever sygdomme for at udelukke mus, der ikke udviser fibrose og lige så distribuere dyr med lignende fibrose mellem behandlingsgrupper. Disse niveauer kan derefter sammenlignes med de terminal, efter intervention niveauer for en sandere forståelse af in vivo farmakologiske virkninger og dermed mere afspejler præcist kliniske forsøgsdesign strategier. Musen er korrekt bedøvede og forberedt til den kirurgi, ved hjælp af sterile forhold. Et lille snit er lavet i den øvre del af maven og venstre laterale lap af leveren er udsat. En kile af leveren fjernes kirurgisk, og en tilsvarende størrelse stykke resorberbare gelatine er sat på sin plads at standse eventuelle blødninger. Musen er kirurgisk sutureres og hæftet lukket og vil komme tilbage til normal inden for 1 døgn. Hele processen tager 5-10 min pr. mus. Her eksemplificere vi nytten af denne procedure ved at udnytte forundersøgelse biopsi for at vurdere virkningen af glukagon-lignende peptid 1 (GLP-1) receptor agonist liraglutid på NASH slutpunkter i mus.
Introduction
Ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH) er en progressiv sygdom, og en mere alvorlig form for ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD), som bliver stadig mere udbredt på grund af sin forening med fedme og type 2 diabetes. Der er ingen godkendte behandlinger for NAFLD/NASH, eller godkendte biomarkører umiddelbart vurdere sygdomsprogression. NASH er diagnosticeret histologisk ved at vurdere betændelse, overskydende hepatisk lipid (steatose), hepatocyt ballooning og fibrose1,2,3,4. I kliniske forsøg, er disse slutpunkter vurderet før undersøgelsen i en lever prøve indsamles via biopsi, og fra en anden leverbiopsi efter en bestemt behandling. Således, effektiviteten af test agent vurderes via ændring i leveren patologi hos patienter med tidligere identificeret/tal (dvs., biopsi-bevist) NASH, der er randomiseret til behandlingsgrupper. Disse samme histologiske slutpunkter anvendes ofte i gnavere modeller vurdere potentielle NASH therapeutics i prækliniske studier, men kun i terminal væv fra aflivede mus og dermed uden en forståelse af graden af effekt ved baseline og manglende evne til til kontrol for forskelle i baseline sygdom stat mellem behandlingsgrupper.
Selvom 25% af voksne med NAFLD antages at have NASH baseret på forhøjede serum aminotransferase niveauer, der findes ingen alternativ endelige metoder til at bekræfte NASH end histologisk dokumentation4. Noninvasiv metoder, såsom radiologiske modaliteter (ultralyd, CT og magnetisk resonans imaging) er blevet udviklet til at opdage hepatisk steatose, men disse metoder ikke kan diagnosticere NASH eller bestemme fase af fibrose. Forbigående elastography tilbyder en lovende non-invasiv modalitet til måling af leveren stivhed. Det har vist sig at være præcise i differentiere fibrose faser. Men nøjagtigheden aftager med højere body mass index (BMI) og fedtvæv. 5 det er problematisk på grund af fleste NASH patienter at være overvægtige. Ud over den kliniske relevans af disse tilgange, er ingen af disse bestemmelser udnyttes i prækliniske undersøgelser.
For at overvinde dette, var forskningsgruppen af Dr. Jonathan Roth først til at gennemføre en leverbiopsi procedure i Amylin NASH (AMLN) mouse model af NASH6,7,8. De beskrevne biopsi med graden af NASH sygdom og korrelation med stofskiftesygdom forudsigende gyldighed. Her beskriver vi i detaljer leverbiopsi proceduren i AMLN modellen af NASH og dens nytte i terapeutiske omgivelser, specielt til at vurdere effekten af liraglutid.
Protocol
Alle in vivo forsøg blev udført i overensstemmelse med politikker for institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af MedImmune, LLC og i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brugen af forsøgsdyr, 8. udgave (2011). Mandlige C57BL6J mus blev placeret på højt fedtindhold, high-fructose, høj-kolesterol AMLN kost. Leveren biopsier blev udført efter 26 uger på kost, 3 uger før starten af den farmakologiske interventioner.
1. indhente og forberede kirurgisk materialer
- Autoklave sterile instrumenter (lille spids saks, stump spids pincet, bomuld svaberprøver, gaze firkanter, 7 mm staples/sår klip og hæftemaskine).
- Opnå, sterile sutur for at lukke bugvæggen (5-0 belagt resorberbare sutur med en PC-1 nål er passende), resorberbare gelatine komprimeret svamp (skal bruges til hæmostatisk formål), sterilt gardiner og handsker, jod-baserede krat og 70% ethanol svaberprøver/klude , buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg dosis pr. mus; mindst 3 doser pr. mus) og kirurgisk øjet salve/smøring.
- Forbered vaporizer for anæstesi ved påfyldning med isofluran.
- Tænde en perle sterilizer, for hurtig instrument sterilisation mellem dyr.
- Tænde en opvarmning overflade eller varmepude anvendes til dyrs opsving.
- Don passende personlige værnemidler (PPE) (dvs., maske, kjole, hår motorhjelm, handsker).
2. præ-kirurgisk præparater
- Placere musen i induktion kammer med 2-3% isofluran flow til effekt.
- Observere musen, indtil manglen reaktion til tå-knivspids bekræfter dybde af anæstesi er passende.
- Brug en eye salve til at forhindre tørhed af hornhinden tilknyttet anæstesi.
- Administrere buprenorphin subkutant (0,05-0,1 mg/kg).
- Barbere operationsstedet umiddelbart caudale formet som et sværd proces, ved hjælp af animalske neglesaks.
- Flytte musen til et opvarmet overflade (37 ° C) efter barbering operationsstedet. Placer musen på en sådan måde, så den dorsale overflade er nedad, og maven er udsat. Sæt næsen af musen i anæstesi næsen kegle til at lette gennemførelsen af isofluran med en væskehastighed på 2-3%.
- Ren operationsstedet med vekslende svaberprøver af betadine og 70% ethanol (3 gange).
- Åbne og konfigurere steril kirurgiske instrumenter.
- Fjerne handsker og erstatte med steril kirurgiske handsker.
3. kirurgisk Procedure
- Gøre et langsgående snit med saks (1-2 cm), straks caudale formet som et sværd proces og lidt til musens venstre side, i den abdominal hud.
- Blunt dissekere huden væk fra den abdominale væg ved hjælp af saks og pincet.
- Udsætte bugvæggen og visualisere leveren nedenunder.
- Ved hjælp af en steril skalpel blade gøre et snit (1-2 cm) i bugvæggen for at visualisere den venstre-laterale lap (LLL) i leveren.
Bemærk: Være konsekvent i hele undersøgelsen. Andre fælles kamre af interesse er højre-mediale lap (RML) og venstre-mediale lap (elsker mit liv). - Externalize den venstre laterale lap gennem incisionen.
- Valgmulighed 1: Let massage maven med tommel- og pegefinger til at afsløre en del af LLL.
- Valgmulighed 2: Placer en steril vatpind nedenunder LLL forsigtigt trække en del ud af at blive udsat.
- Placer et sterilt saltvand-gennemblødt stykke gaze nedenunder LLL at tillade en steril og hydreret overflade til leveren til at ligge på.
- Skære et kileformet stykke af leveren fra LLL af to nedskæringer med steril saks.
Bemærk: Den omtrentlige størrelse af leveren fjernes er 30-50 mg (< 5% i leveren hos mus). - Skær et stykke af gelatine svamp svarer i størrelse til kile stykke af leveren. Indsæt svampen i den afskårne del af leveren ved hjælp af pincet.
- Holde svampen på plads med pincet og opretholde kontakt med leveren, indtil det klæber til overfladen af leveren og hæmostase er opnået.
- Sted leverbiopsi stykke ind i passende røret frosne (dvs., fiksativ, osv.).
- Anbring forsigtigt leveren tilbage ind i bughulen, tager sig ikke forstyrre svampen.
- Sutur bugvæggen med 5-0 belagt resorberbare sutur starter og slutter med en fuld firkantede knude.
- Lukke huden med 7 mm sår klip (eller hæfteklammer).
- Undersøg såret klip for at sikre en fuldstændig lukning af incisionen.
- Fjerne musen fra næsen kegle og anbringes i en ren bur på en opvarmet overflade.
- Sted instrumenter perle sterilizer mellem mus for 10-20 s. Sørg for alt organisk materiale bør fjernes fra de instrumenter, ved hjælp af sterilt saltvand forud for markedsføring i glas perle sterilizer.
4. postoperativ pleje
- Overvåge musen, indtil det kommer til bevidsthed og kan lige selv.
- Registrere postoperativ observationer og kontrollere mus dagligt for opspringning.
- Administrere en anden og tredje dosis af buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) subcutaneously 6-8 h efter operationen og igen 24 timer efter operationen.
- Fjern sår klip på 7-10 dage efter operationen.
Representative Results
For denne undersøgelse, mus blev randomiseret til behandlingsgrupper (n = 12/gruppe) baseret på forundersøgelse biopsi fibrose grade og kropsvægt. Mus blev administreret køretøj (PBS) eller liraglutid (5 nmol/kg) i 42 dage (køretøj eller sammensatte administreret 10 mL/kg dosis volumen, subkutant, én gang dagligt). Dag 42, blev mus aflivet (via CO2 inhalation) i ikke-fastende tilstand, og leveren skåret ud og forarbejdet til histologi.
Biopsi og terminal leveren stykker blev fastsatte natten over i 10% formalin, paraffin derefter integrerede og forarbejdede for hæmatoxylin og eosin og Sirius rød, farvning via standardprotokoller9. Væv sektioner blev vurderet i en blindet mode ved en patolog NASH aktivitet Scoring (NAS) system1,2. NAS afspejler graden af sygdom for steatose, dråbeformede betændelse og hepatocyt ballooning (hver parameter givet en score på 0-3) som tidligere beskrevet9.
Indarbejde en leverbiopsi i udformningen af denne undersøgelse, der er tilladt for en baseline (pre biopsi) fibrose score. I alt 118 mus var biopsi efter 26 ugers NASH kost og leverfibrose og steatose blev scoret for hver biopsi (figur 1). Af disse 118 mus, 49 mus blev udelukket baseret på lav fibrose (score på 0), høj fibrose (score på 4, som udstillede unormal patologi), og unormal vægttab eller sårheling. Disse udelukkelseskriterier, der er tilladt for 69 mus venstre at tildele i studiegrupper og lede efter forbedringer i NASH fænotype efter behandling (figur 1).
Mus blev behandlet med køretøjet eller GLP-1R agonist liraglutid (5 nmol/kg) i 6 uger. I gruppen køretøj-behandlede 1 mus udstillede forværret fibrose og 4 mus viste forværret NAS score (Figur 2A-B). Liraglutid behandling var forbundet med en generel forbedring af fibrose (figur 2 c), 17% af behandling gruppe forbedring og 83% forbliver uændret. Ligeledes liraglutid behandling forbedret den overordnede NAS score (figur 2D), med 66% af gruppen har forbedret NAS score og 33% forblev uændret.
Derudover liraglutid behandling forbedret betændelse, med 75% af gruppen har en lavere betændelse score og 25% forblev uændret (figur 3B). Køretøjet behandling forværredes betændelse, med 17% af gruppen har en højere betændelse score og 83% uændret (figur 3A). Steatose scoring uændret fra baseline til at ende med undersøgelse i begge køretøj - og liraglutid-behandlede grupper (figur 3A, B). Før vs efter biopsi sammenligninger for individuelle mus på betændelse og ballooning parametre er også vist (figur 3 c-F).
Figur 1: pre screening leverbiopsi fibrose og NAS score . (A) repræsentation af alle 118 mus, der blev screenet for fibrose, via leverbiopsi. (B og C) viser baseline fibrose og NAS score, henholdsvis efter støtteberettigede mus blev sorteret i studiegrupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fibrose og NAS score, før biopsi og efter intervention. Procent responder analyse for køretøjet (A, C) eller liraglutid-behandlede (B, D) mus, målt fra grundlinje lever biopsi at afslutte undersøgelsen lever prøve for fibrose fase (A, B) og NAS (C, D). For hver gruppe, er ændringen fra den forudgående undersøgelse efter undersøgelse biopsi angivet med en linje. Point ved hver scoring skridt er lidt flyttet til visuelle adskillelse af dyrene, dette er kun for visualisering formål og afspejler ikke nogen forskel i score. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: steatose, inflammation og ballooning, før biopsi og efter intervention. Procent responder analyse for køretøjet (A, C, E) eller liraglutid-behandlede (B, D, F) mus, målt fra grundlinje lever biopsi at afslutte undersøgelsen lever prøve for steatose score (A, B), betændelse (C, D) og ballooning (E, F). For hver gruppe, er ændringen fra den forudgående undersøgelse efter undersøgelse biopsi angivet med en linje. Point ved hver scoring skridt er lidt flyttet til visuelle adskillelse af dyrene, dette er kun for visualisering formål og afspejler ikke nogen forskel i score. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her beskriver vi i detaljer mus leverbiopsi procedure først beskrevet af Clapper et al.10, og eksemplificere sin nytte i en musemodel af NASH, svarer til de tidligere rapporter6,9. Leverbiopsi procedure er et værdifuldt redskab til vurdering af NASH fænotype før og efter behandling, på samme måde som at der udføres i kliniske terapeutiske forsøg. Biopsi giver mulighed for direkte sammenligning for hvert emne, dvs. de samme mus kan bruges til begge tidspunkter. Vi viser også sit translationel potentiale. I et klinisk forsøg i biopsi-bevist NASH fag fremkaldte liraglutid 39% svarprocent (patienter med forbedring) NAS, der henviser til, at i vores undersøgelse vi observeret en 66% responder sats for forbedret NAS. Desuden, 26% af patienterne havde forbedret fibrose score med 9% forværring versus 14% og 36% i placebo arm, henholdsvis11. I vores undersøgelse observeret vi en forbedring på 17% sats med liraglutid behandling. Disse sammenligninger fremhæve strøm af baseline lever biopsi og bekræfte potentiel translationel forståelse, i det mindste for denne klasse af terapeutiske.
Det er afgørende at høste et tilstrækkelig stort stykke af levervævet under biopsi proceduren til korrekt analysere de histologiske funktioner, men også ikke alt for stort et stykke af leveren til at kompromittere funktion af leveren. Vi observerede en nul-dødelighed med denne operation, og dyrene syntes fuldt genoprettet inden for 1 dag med en genoptagelse af normale spise adfærd. Tiden mellem biopsi og iværksættelse af intervention undersøgelse er således begrænset ikke af animalske opsving, men sandsynligvis af den tid, det tager for eksempel behandling, analyse og efterfølgende randomisering.
Udnytte leverbiopsi procedure som en metode til bekræftelse af fibrose, før interventionen bidrog til at reducere variation i vores undersøgelse, så vi kan udelukke mus, der ikke fuldt udvikler en vis grad af leverfibrose som følge af den AMLN NASH-inducerende kost. Desuden, det udvidet vores evne til bedre at forstå virkningen af eventuelle forbedring af NASH tiltag, i stedet for kun at have en terminal lever prøve og NASH score. Indtil nye ikke-invasive teknikker er yderligere undersøgt og bredt accepteret, at leverbiopsi er den eneste bevist måde at bestemme NASH.
Disclosures
Klagepunktsmeddelelsen og C.R. er nuværende medarbejdere og/eller aktionærer af MedImmune/AstraZeneca. JLT var en medarbejder og grossist af MedImmune/AstraZeneca ved disse eksperimenter blev udført.
Acknowledgments
Forfatterne parlamentsarbejdet bistand fra Sally Lee og Holly Koelkebeck for ekspertise i forarbejdning af væv og Immunhistokemi. Forfatterne også takke Donna Goldsteen og Laboratory Animal ressourcer personale (MedImmune, Gaithersburg, MD) for deres hjælp med tekniske procedurer og husdyrhold og pleje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
