Summary
In klinische instellingen, wordt een lever biopsie gebruikt ter beoordeling van de stadia van niet-alkoholische steatohepatitis (steatosis, ontsteking, hepatocyte ballonvaren en fibrose). Hier, illustreren we een survivable lever biopsie in muizen die kan worden gebruikt voor histologisch analyses om beoordeling van therapeutische agenten op een manier die meer afgestemd op klinische proeven.
Abstract
Klinische beoordeling van therapieën voor de behandeling van niet-alkoholische steatohepatitis (NASH) betrekken een basislijn en einde van studie lever biopsie en beoordeling van de verbetering van de eindpunten van de ziekte, vaak te zien als een percentage van elke behandeling arm dat verbeterd, verslechterd of onveranderd gebleven. Traditionele preklinische knaagdier studies voor vermeende NASH therapieën zijn vaak beperkt door niet te weten van het niveau van de lever ziekte/NASH aanwezig aan het begin van therapeutische interventie, in plaats van randomizing behandelgroepen op gemakkelijk meetbare eindpunten, zoals lichaamsgewicht, metabole status of soortgelijk. Hier beschrijven we een lever biopsie techniek in een dieet-geïnduceerde NASH muismodel, voor de beoordeling van de basislijn lever ziekte om uit te sluiten van muizen die geen fibrose vertonen en gelijkelijk verdelen dieren met soortgelijke fibrosis tussen behandelgroepen. Deze niveaus kunnen vervolgens worden vergeleken met de niveaus van de terminal, na interventie voor een waarachtiger begrip van in vivo farmacologische werking en dus meer klinische proef ontwerpstrategieën verplaatsingsvoorstelregels precies hebt aangegeven. De muis is goed verdoofd en geprepareerd voor de operatie met behulp van steriele omstandigheden. Een kleine incisie gemaakt in de bovenbuik en de linker laterale kwab van de lever wordt blootgesteld. Een wig van de lever is operatief verwijderd en een stuk van vergelijkbare grootte van absorbeerbare gelatine is ingevoerd zijn om elke bloeden te stoppen. De muis is operatief ingehecht en geniet gesloten en zal herstellen terug naar normaal binnen 1 dag. Het hele proces duurt 5-10 min per muis. Hier illustreren we het nut van deze procedure door leveraging van de biopsie pre studie om de impact van de glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) receptor agonist liraglutide over NASH eindpunten in muizen.
Introduction
Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is een progressieve leverziekte en een meer ernstige vorm van vette lever ziekte (NAFLD), die wordt steeds meer en meer overwegend als gevolg van de vereniging met obesitas en diabetes type 2. Er zijn geen erkende therapieën voor NAFLD/NASH of goedgekeurde biomarkers te gemakkelijk het beoordelen van de progressie van de ziekte. NASH is gediagnosticeerd histologisch door beoordeling van ontsteking, overtollige hepatische lipide (steatosis), hepatocyte ballonvaren en fibrose1,,2,,3,4. Bij klinische proeven, worden deze eindpunten beoordeeld voordat de studie in een lever monster verzameld via biopsie, en van een tweede lever biopsie na een bepaalde behandelingsperiode. Dus de effectiviteit van de agent van de test wordt beoordeeld via veranderingen in de lever pathologie bij patiënten met eerder geïdentificeerd/gekwantificeerd (dat wil zeggen, biopsie-bewezen) NASH die zijn gerandomiseerde behandeling in groepen. Deze dezelfde histologische eindpunten worden vaak gebruikt in knaagdier modellen beoordeling van potentiële NASH therapeutics in preklinische studies, maar alleen in terminal weefsel van euthanized muizen, en dus zonder inzicht in de mate van werkzaamheid op basislijn en een onvermogen besturingselement voor verschillen in basislijn ziekte staat tussen behandelgroepen.
Hoewel 25% van de volwassenen met NAFLD worden geacht dat NASH op basis van verhoogde serum aminotransferase niveaus, zijn er geen alternatieve definitieve methoden te bevestigen NASH dan histologische bewijs4. Noninvasive methoden, zoals radiologische modaliteiten (echografie, computertomografie en magnetische resonantie beeldvorming) zijn ontwikkeld voor het detecteren van hepatische steatosis, maar deze methoden niet diagnosticeren NASH of bepalen van de fase van fibrose. Voorbijgaande elastography biedt een veelbelovende niet-belastende modaliteit voor het meten van de lever stijfheid. Het is aangetoond dat het nauwkeurig in het onderscheiden van fibrose stadia. Echter, vermindert de nauwkeurigheid met hogere index van de lichaamsmassa (BMI) en vetweefsel. 5 dit is problematisch als gevolg van de meerderheid van NASH patiënten zwaarlijvig. Buiten de klinische relevantie van deze benaderingen, worden geen van deze modaliteiten gebruikt in preklinische studies.
De onderzoeksgroep van Dr Jonathan Roth waren om te overwinnen, de eerste procedure toe te passen een lever biopsie in de muismodel Amylin NASH (AMLN) van NASH6,7,8. Zij beschreven de predictieve validiteit van de biopsie met mate van NASH ziekte en correlatie met stofwisselingsziekte. Hier beschrijven we in detail de lever biopsie procedure in het model van de AMLN van NASH en zijn nut in een therapeutische setting, specifiek voor het beoordelen van de werkzaamheid van liraglutide.
Protocol
Alle in vivo experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig het beleid van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van MedImmune, LLC en in overleg met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, 8ste editie (2011). Mannelijke C57BL6J muizen werden geplaatst op de hoog-vet, hoog-fructose, hoge-cholesterol AMLN dieet. Lever biopten werden uitgevoerd na 26 weken op dieet, 3 weken voor de aanvang van de farmacologische interventies.
1. Verkrijg en chirurgische materialen te bereiden
- Autoclaaf steriele instrumenten (kleine wees-tip schaar, pincet botte uiteinde, katoenen wissers, gaas pleinen, 7 mm nietjes/wond clips en nietmachine).
- Verkrijgen, steriel hechtdraad voor het sluiten van de buikwand (5-0 gecoate absorbeerbare hechtdraad met een PC-1 naald is geschikt), absorbeerbare gelatine gecomprimeerd spons (te gebruiken voor hemostatische doeleinden), steriele doeken en handschoenen, jodium gebaseerde scrub en 70% ethanol swabs/doekjes , buprenorfine (0.05-0.1 mg/kg dosis per muis; ten minste 3 doses per muis) en chirurgische oog zalf/smering.
- Bereiden vaporisator voor anesthesie door vullen met Isofluraan.
- Inschakelen van een kraal sterilisator, voor snelle instrument sterilisatie tussen dieren.
- Inschakelen van een opwarming van de aarde oppervlak of verwarming pad, dat moet worden gebruikt voor dierlijke herstel.
- Don passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) (dat wil zeggen, masker, jurk, haar motorkap, handschoenen).
2. pre-chirurgische preparaten
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in de bedwelmingsruimte inductie met 2-3% Isofluraan stroom daartoe.
- Observeer de muis totdat het gebrek aan respons op Teen-snuifje bevestigt dat de diepte van de verdoving is passend.
- Gebruik een oog zalf te voorkomen van droogheid van hoornvlies anesthesie is gekoppeld.
- Beheren van buprenorfine subcutaan (0.05-0.1 mg/kg).
- Scheren van de chirurgische site onmiddellijk caudal van de xiphoid proces, met behulp van dierlijke tondeuse.
- Verplaats de muis naar een verwarmd oppervlak (37 ° C) na het scheren van de chirurgische site. Plaats de muis op een zodanige wijze zodat het dorsale oppervlak naar beneden is, en de buik is blootgesteld. Plaats de neus van de muis in de neus van de anesthesie te vergemakkelijken van de levering van Isofluraan op een debiet van 2-3%.
- Reinig de chirurgische site met wisselende swabs van betadine en 70% ethanol (3 keer).
- Open en steriele chirurgische instrumenten ingesteld.
- Handschoenen te verwijderen en te vervangen met steriele chirurgische handschoenen.
3. de chirurgische Procedure
- Maak een longitudinale incisie met een schaar (1-2 cm), onmiddellijk caudal van de xiphoid process en iets naar de linker kant van de muis, in de buikhuid.
- Bot ontleden de huid van de buikwand met behulp van Tang en schaar.
- Bloot van de buikwand en lever onder visualiseren.
- Met behulp van een steriel scalpel blad maakt een incisie (1-2 cm) in de buikwand te visualiseren de links-laterale kwab (LLL) van de lever.
Opmerking: Worden consistent de studie. Andere gemeenschappelijke lobben van belang zijn recht-mediale kwab (RML) en links-mediale kwab (hou van mijn leven). - Belichamen de linker laterale kwab via de incisie.
- Optie 1: Massage licht de buik met de duim en wijsvinger om een gedeelte van de LLL bloot te stellen.
- Optie 2: Plaats een steriele wattenstaafje onder de LLL te Trek voorzichtig een deel uit worden blootgesteld.
- Plaats een steriele zoutoplossing doordrenkte stuk gaas onder de LLL om een steriele en gehydrateerde oppervlak voor de lever op te liggen.
- Knip een wigvormig stukje van de lever uit de LLL doordat twee sneden met een steriele schaar.
Opmerking: De geschatte grootte van de lever wordt verwijderd is 30-50 mg (< 5% van de lever bij muizen). - Knip een stukje van gelatine spons vergelijkbaar in grootte aan de wig stuk van lever. Plaats de spons in de gesneden deel van de lever met pincet.
- De spons met een tang op zijn plaats te houden en onderhouden van contact met de lever, totdat zij zich aan het oppervlak van de lever houden en hemostase is bereikt.
- Plaats de lever biopsie stuk in de passende buis bevroren (d.w.z., fixeer, enz.).
- Voorzichtig plaats de lever terug in de buikholte, verzorgen de spons niet te verstoren.
- Suture de buikwand met 5-0 gecoate absorbeerbare hechtdraad beginnend en eindigend met een volledige vierkante knoop.
- Sluit de huid met 7 mm wond clips (of nietjes).
- Inspecteer de wond clips om ervoor te zorgen dat er een volledige stopzetting van de incisie.
- Verwijder de muis uit de neus kegel en leg in een schone kooi op een verwarmd oppervlak.
- Plaats instrumenten in kraal sterilisator tussen muizen voor 10-20 s. Zorg ervoor dat alle organisch materiaal uit de instrumenten met behulp van steriele zoutoplossing voorafgaand aan plaatsen in de glazen kraal sterilisator moet worden verwijderd.
4. post-operatieve zorg
- Controleren de muis totdat het bewustzijn herwint en zelf recht kan.
- Postoperatieve opmerkingen vastleggen en controleren van de muizen dagelijks voor dehiscentie.
- Beheren van een tweede en derde dosis van buprenorfine (0.05-0.1 mg/kg) subcutaan 6-8 h na chirurgie en opnieuw 24u na chirurgie.
- Verwijder wond clips op 7-10 dagen na chirurgie.
Representative Results
Voor deze studie, waren muizen gerandomiseerde de behandeling in groepen (n = 12/groep) op basis van voorstudie biopsie fibrose rang en het lichaamsgewicht. Muizen werden toegediend voertuig (PBS) of liraglutide (5 nmol/kg) gedurende 42 dagen (voertuig of samengestelde door de overheid gereguleerde 10 mL/kg dosis volume, subcutaan, eenmaal daags). Op dag 42, waren muizen euthanized (via CO2 inademing) in de niet-gevast staat, en de lever weggesneden en verwerkt voor histologie.
Biopsie en terminal lever stukken werden 's nachts vastgesteld in 10% formaline, paraffine vervolgens ingesloten en verwerkte voor Sirius rood, kleuring via standaardprotocollen9haematoxyline en eosine. Weefselsecties werden beoordeeld in een geblindeerde mode door een patholoog volgens de NASH-activiteit scoren (NAS) systeem1,2. De NAS weerspiegelt de mate van ziekte voor steatosis, lobulair ontsteking en hepatocyte ballonvaarten (elke parameter gegeven een score van 0-3) als eerder beschreven9.
Het opnemen van een lever biopsie in het ontwerp van deze studie die is toegestaan voor een basislijn (pre biopsie) fibrose score. Een totaal van 118 muizen waren biopsied na 26 weken van NASH dieet en lever fibrose en steatosis werden gescoord voor elke biopsie (Figuur 1). Van deze 118 muizen, 49 muizen werden uitgesloten op basis van lage fibrose (score van 0), hoge fibrose (score van 4, die tentoongesteld abnormale pathologie), en abnormale gewichtsverlies of wondgenezing. Deze uitsluitingscriteria toegestaan voor 69 muizen overgelaten aan toewijzen in studiegroepen en zoek naar verbeteringen in NASH fenotype na behandeling (Figuur 1).
Muizen werden behandeld met voertuig of de GLP-1R agonist liraglutide (5 nmol/kg) gedurende 6 weken. In de voertuig-testgroep, 1 muis tentoongestelde verslechterde fibrose en 4 muizen toonde verslechterde NAS score (Figuur 2A-B). Liraglutide behandeling werd geassocieerd met een algehele verbetering van fibrose (figuur 2C), met 17% van de verbetering van de groep van de behandeling en 83% blijven ongewijzigd. Evenzo, liraglutide behandeling verbeterd de algehele NAS score (figuur 2D), met 66% van de groep hebben verbeterd NAS score en 33% bleef onveranderd.
Bovendien, liraglutide behandeling verbeterd ontsteking, met 75% van de groep met een lagere score van de ontsteking en 25% bleef onveranderd (figuur 3B). Voertuig behandeling verslechterd ontsteking, met 17% van de groep met een hogere score van de ontsteking en 83% bleef onveranderd (figuur 3A). Steatosis scoren bleef ongewijzigd ten opzichte van de basislijn tot het beëindigen van de studie in beide de voertuig - en liraglutide-behandelde groepen (figuur 3A, B). Pre vs. Na biopsie vergelijkingen voor individuele muizen op ontsteking en ballonvaren parameters staan ook (Figuur 3 c-F).
Figuur 1: vooraf screenen fibrose van de lever biopsie en NAS score . (A) vertegenwoordiging van alle 118 muizen die waren gescreend voor fibrose, via lever biopsie. (B en C) tonen de basislijn fibrose en de NAS de score, het respectievelijk, na het in aanmerking komende muizen werden ingedeeld in studiegroepen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: fibrose en NAS scoren, pre biopsie en na interventie. Percentage-responder analyse voor het voertuig (A, C) of de liraglutide-behandeld (B, D) muizen, zoals gemeten van basislijn lever biopsie einde van studie lever monster voor fibrose fase (A, B) en NAS (C, D). Voor elke groep, wordt de wijziging van de pre-studie na studie biopsie aangegeven door een lijn. De punten bij elke scoren stap is enigszins verschoven zodat visuele scheiding van de dieren, dit is alleen ter informatie visualisatie en weerspiegelt niet enig verschil in score. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Steatosis, ontsteking en ballonvaren, pre biopsie en na interventie. Percentage-responder analyse voor het voertuig (A, C, E) of liraglutide-behandeld (B, D, F) muizen, zoals gemeten van basislijn lever biopsie einde van studie lever monster voor steatosis score (A, B), ontsteking (C, D) en ballonvaren (E, F). Voor elke groep, wordt de wijziging van de pre-studie na studie biopsie aangegeven door een lijn. De punten bij elke scoren stap is enigszins verschoven zodat visuele scheiding van de dieren, dit is alleen ter informatie visualisatie en weerspiegelt niet enig verschil in score. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hier beschrijven we in detail de muis lever biopsie procedure eerst beschreven door klepel et al.10, en zijn nut in een muismodel van NASH, vergelijkbaar met de vorige verslagen6,9te illustreren. De lever biopsie-procedure is een waardevol instrument voor de beoordeling van NASH fenotype pre- en post-behandeling, op een wijze vergelijkbaar met die in klinische therapeutische proeven uitgevoerd. De biopsie voorziet in directe vergelijking voor elk onderwerp, dat wil zeggen dat het dezelfde muizen kunnen worden gebruikt voor beide tijdstippen. We tonen ook zijn translationeel potentieel. In een klinische proef in biopsie-bewezen NASH onderwerpen ontlokte liraglutide een 39% respons (patiënten met verbetering) in NAS, overwegende dat de in onze studie nageleefd wij een 66%-responder tarief voor verbeterde NAS. Bovendien, 26% van de patiënten had verbeterde fibrose score met 9% verslechtering, tegenover 14% en 36% in de placebo-arm, respectievelijk11. In onze studie zien we een 17% verbetering ten opzichte van de liraglutide behandeling. Deze vergelijkingen markeert u de kracht van basislijn lever biopsie en bevestigen van potentiële translationeel begrip, ten minste voor deze klasse van therapeutische.
Het is cruciaal voor de oogst van een groot genoeg stuk van leverweefsel tijdens de biopsie procedure goed analyseren de histologische kenmerken, maar ook niet te groot van een stukje lever tot compromissen van de functie van de lever. We waargenomen een nul-sterftecijfer met deze operatie, en de dieren binnen 1 dag met de hervatting van de normale eten gedrag volledig herstelde verschenen. Dus, de tijd tussen de biopsie en tijdens het initiëren van de interventie studie is niet beperkt door dierlijke herstel maar waarschijnlijk door de tijd die nodig is voor de steekproef verwerking, analyse en latere randomisatie.
Voordat interventie hielp verminderen variabiliteit in onze studie, waardoor we uit te sluiten van muizen die een zekere mate van fibrose van de lever als gevolg van het dieet AMLN NASH-inducerende volledig niet deed ontwikkelen, gebruik makend van de lever biopsie-procedure als een methode van bevestiging van fibrose. Verder, verbeterd het ons vermogen om de impact van mogelijke NASH-verbetering van de ingrepen, in tegenstelling tot alleen met een terminal lever monster en NASH score beter te begrijpen. Totdat de nieuwe niet-invasieve technieken zijn verder onderzocht en algemeen aanvaard, de lever biopsie is de enige manier om te bepalen van NASH bewezen.
Disclosures
S.O. en C.R. zijn huidige werknemers en/of aandeelhouders van MedImmune/AstraZeneca. JLT was een werknemer en aandeelhouder van MedImmune/AstraZeneca op het moment dat deze experimenten werden uitgevoerd.
Acknowledgments
De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de hulp van Sally Lee en Holly Koelkebeck voor expertise in weefsel verwerking en immunohistochemistry. De auteurs worden Donna Goldsteen en het laboratorium dier middelen personeel (MedImmune, Gaithersburg, MD) ook bedanken voor hun hulp met technische procedures en de veehouderij en zorg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
