Summary
Nelle regolazioni cliniche, una biopsia del fegato viene utilizzata per valutare le fasi della steatoepatite non alcolica (steatosi, infiammazione, dell'epatocita in mongolfiera e fibrosi). Qui, vi illustriamo una survivable biopsia del fegato nei topi che può essere utilizzato per le analisi istologiche per consentire la valutazione degli agenti terapeutici in maniera più in linea con studi clinici.
Abstract
Test clinici che valutano le terapie per il trattamento della steatoepatite non alcolica (NASH) coinvolgono una linea di base e fine di studio del fegato biopsia e la valutazione del miglioramento nei punti finali della malattia, che spesso si riflette come una percentuale di ciascun braccio di trattamento che migliorato, ha peggiorato o è rimasta invariata. Gli studi del roditore preclinici tradizionali per terapie presunte NASH sono spesso limitati non sapendo il livello di fegato malattia/NASH presenti all'inizio dell'intervento terapeutico, invece di randomizzazione gruppi di trattamento sugli endpoint facilmente misurabili come peso corporeo, stato metabolico o simili. Qui, descriviamo una tecnica di biopsia del fegato in un modello murino NASH indotto da dieta, per la valutazione della malattia epatica al basale al fine di escludere i topi che non esibiscono fibrosi e di distribuire equamente gli animali con fibrosi simile tra i gruppi di trattamento. Questi livelli possono essere confrontati ai livelli terminali, post-intervento per una comprensione più vera degli effetti farmacologici in vivo e quindi più riflettere accuratamente le strategie di sperimentazione clinica di progettazione. Il mouse è correttamente anestetizzato e preparato per la chirurgia usando condizioni di sterilità. Viene praticata una piccola incisione nell'addome superiore ed il laterale del lobo sinistro del fegato è esposto. Un cuneo del fegato viene rimosso chirurgicamente, e un pezzo di dimensioni simili di gelatina assorbibile è messo al suo posto per bloccare qualsiasi emorragia. Il mouse è suturato chirurgicamente e pinzato chiuso e verrà ripristinato alla normalità entro 1 giorno. L'intero processo richiede 5-10 min per topo. Qui abbiamo esemplificano l'utilità di questa procedura sfruttando la biopsia pre-studio per valutare l'impatto del glucagone-come peptide-1 (GLP-1) recettore agonista liraglutide sugli endpoint di NASH in topi.
Introduction
Steatoepatite non alcolica (NASH) è una malattia epatica progressiva e una forma più severa di affezione epatica grassa non alcolica (NAFLD), che sta diventando sempre più diffuso grazie alla sua associazione con l'obesità e il diabete di tipo 2. Ci sono terapie approvate per NAFLD/NASH, o approvati biomarcatori valutare facilmente la progressione di malattia. NASH è diagnosticato istologicamente valutando l'infiammazione, l'eccesso lipidico epatico (steatosi), degli epatociti in mongolfiera e fibrosi1,2,3,4. Negli studi clinici, questi endpoint vengono valutati prima dello studio in un campione di fegato raccolto tramite biopsia e da una seconda biopsia del fegato dopo un certo periodo di trattamento. Così, viene valutata l'efficacia dell'agente prova via cambiamento nella patologia epatica in soggetti con precedentemente identificato/quantificato (cioè, biopsia-provata) NASH che sono stati randomizzati ai gruppi di trattamento. Questi stessi endpoint istologico sono spesso utilizzati nei modelli del roditore valutare potenziali terapie NASH negli studi preclinici, ma soltanto nel tessuto terminale da topi eutanasizzati e così senza una comprensione del grado di efficacia al basale e l'incapacità al controllo per le differenze nello stato di malattia basale tra gruppi di trattamento.
Anche se 25% degli adulti con NAFLD sono presunti per avere NASH basato su livelli sierici elevati di aminotransferasi, non esistono metodi alternativi definitivi per confermare NASH diverso da prova istologica4. Metodi non invasivi, come ad esempio le modalità radiologiche (ecografia, tomografia computerizzata e risonanza magnetica) sono state sviluppate per rilevare la steatosi epatica, ma tali metodi non possono diagnosticare NASH o determinare lo stadio della fibrosi. Elastography transitorio offre una modalità di promessa non invasivo per misurare la rigidezza del fegato. Essa ha dimostrato di essere precisi nella differenziazione delle fasi di fibrosi. Tuttavia, la precisione diminuisce con il più alto indice di massa corporea (BMI) e tessuto grasso. 5 questo è problematico dovuto la maggior parte dei pazienti con NASH essere obesi. Oltre la rilevanza clinica di questi approcci, nessuna di queste modalità viene utilizzata negli studi preclinici.
Per ovviare a questo, il gruppo di ricerca del Dr. Jonathan Roth furono i primi a implementare una procedura di biopsia del fegato nel modello del topo di Amylin NASH (AMLN) di NASH6,7,8. Hanno descritto la validità predittiva della biopsia con grado di malattia NASH e correlazione con la malattia metabolica. Qui descriviamo in dettaglio la procedura di biopsia del fegato nel modello AMLN di NASH e la sua utilità in un setting terapeutico, in particolare per valutare l'efficacia di liraglutide.
Protocol
Tutti gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le condizioni istituzionali Animal Care ed uso Committee (IACUC) di MedImmune, LLC e d'intesa con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8a edizione (2011). Topo C57BL6J maschio sono stati disposti sulla dieta ad alta percentuale di grassi, alto contenuto di fruttosio, ricca in colesterolo AMLN. Le biopsie del fegato sono state eseguite dopo 26 settimane di dieta, 3 settimane prima dell'inizio dell'intervento farmacologico.
1. ottenere e preparare materiali chirurgici
- Strumenti sterili autoclave (piccole forbici punta-punta, forcipe punta smussata, tamponi di cotone, garza piazze, clip 7 mm staples/ferita e cucitrice).
- Ottenere, sutura sterile per la chiusura della parete addominale (5-0 suturare assorbibile rivestito con un ago di PC-1 è adatto), spugna di gelatina assorbibile compresso (per essere utilizzato a scopo emostatico), teli sterili e guanti, scrub a base di iodio e 70% etanolo tamponi/salviette , la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg dose per topo; almeno 3 dosi per topo) e chirurgico occhio unguento/lubrificazione.
- Preparare il vaporizzatore per anestesia riempiendolo con isoflurano.
- Accendere uno sterilizzatore della perla, per la sterilizzazione rapida strumento tra gli animali.
- Girare su una superficie scaldavivande o rilievo di riscaldamento, da utilizzare per il recupero degli animali.
- Don appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (cioè, maschera, Abito, capelli cofano, guanti).
2. pre-operatoria preparazioni
- Posizionare il mouse nella camera di induzione con 2-3% isoflurane flusso a effetto.
- Osservare il mouse fino a quando la mancanza di risposta a punta-pizzico conferma che la profondità dell'anestesia è appropriata.
- Utilizzare un unguento oculare per prevenire la secchezza della cornea associata con l'anestesia.
- Somministrare per via sottocutanea buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg).
- Radere il sito chirurgico immediatamente caudale del processo xifoideo, utilizzando Tosatrici per animali.
- Spostare il mouse a una superficie riscaldata (37 ° C) dopo la rasatura, il sito chirurgico. Posizionare il mouse in modo in modo che la superficie dorsale è verso il basso, e l'addome è esposto. Inserire il naso del mouse il cono di naso di anestesia per facilitare la consegna di isoflurane ad una portata di 2-3%.
- Pulire il sito chirurgico con tamponi alternati di betadine e 70% di etanolo (3 volte).
- Aprire e configurare gli strumenti chirurgici sterili.
- Rimuovere i guanti e sostituire con guanti chirurgici sterili.
3. intervento chirurgico
- Praticare un'incisione longitudinale con le forbici (1-2 cm), immediatamente caudale del processo xifoideo e leggermente a sinistra del mouse, nella pelle addominale.
- Blunt sezionare la pelle lontano dalla parete addominale utilizzando pinze e le forbici.
- Esporre la parete addominale e visualizzare il fegato sotto.
- Utilizzo di una marca di lama bisturi sterile un'incisione (1-2 cm) nella parete addominale per visualizzare il lobo di sinistra-laterale (LLL) del fegato.
Nota: Essere coerenti in tutto lo studio. Altri comuni lobi di interesse sono destra-mediale lobo (RML) e lobo di sinistra-mediale (LML). - Esternare il lobo laterale sinistro attraverso l'incisione.
- Opzione 1: Leggermente massaggiare l'addome con il pollice e il dito indice per esporre una parte della formazione permanente.
- Opzione 2: Posizionare un tampone di cotone sterile sotto il LLL per estrarre delicatamente una porzione di essere esposti.
- Posizionare un pezzo imbevuta di soluzione fisiologica sterile di garza sotto il LLL per consentire una superficie sterile e idratata per il fegato a mentire su.
- Tagliare un pezzo a forma di Cuneo del fegato dal LLL facendo due tagli con forbici sterili.
Nota: La dimensione approssimativa del fegato viene rimosso è 30-50 mg (< 5% del fegato nei topi). - Tagliare un pezzo di spugna di gelatina dimensioni simili al pezzo di Cuneo del fegato. Inserire la spugna la parte tagliata del fegato usando il forcipe.
- Tenere la spugna con il forcipe e mantenere il contatto con il fegato finché non aderisce alla superficie del fegato ed emostasi.
- Posto il pezzo di biopsia del fegato nel tubo appropriato (cioè congelati, fissativo, ecc.).
- Posizionare delicatamente il fegato indietro nella cavità addominale, avendo cura di non disturbare la spugna.
- Suturare la parete addominale con il 5-0 suturare assorbibile rivestito iniziando e terminando con un nodo quadrato pieno.
- Chiudere la pelle con 7mm ferita clip (o graffette).
- Ispezionare la ferita clip per assicurarsi che ci sia una chiusura completa dell'incisione.
- Rimuovere il mouse dal cono di naso e collocare in una gabbia pulita su una superficie riscaldata.
- Strumenti posto nello sterilizzatore a perlina tra topi per 10-20 s. Assicurarsi che tutto il materiale organico deve essere rimosso dagli strumenti utilizzando soluzione salina sterile prima di mettere nello sterilizzatore di perlina di vetro.
4. post-operatorio
- Monitorare il mouse finché riprende conoscenza e può giusto per sé.
- Registrare le osservazioni post-operatorie e controllare i topi al giorno per deiscenza.
- Somministrare una seconda e la terza dose di buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea 6-8 h post-chirurgia e nuovamente 24h post-chirurgia.
- Rimuovere le graffe di ferita alla post-chirurgia 7-10 giorni.
Representative Results
Per questo studio, i topi sono stati randomizzati ai gruppi di trattamento (n = 12/gruppo) basata sulla biopsia pre-studio fibrosi grado ed il peso corporeo. Topi sono stati amministrati veicolo (PBS) o liraglutide (5 nmol/kg) per 42 giorni (veicolo o composto amministrato 10 mL/kg volume, la dose per via sottocutanea, una volta al giorno). Il giorno 42, i topi sono stati eutanasizzati (tramite inalazione di CO2 ) nello stato non a digiuno e fegato asportata ed elaborati per l'istologia.
Quindi di fegato biopsia e terminal pezzi sono stati corretti durante la notte in formalina al 10%, paraffina embedded e trasformati per ematossilina ed eosina e Sirius Red, colorazione tramite protocolli standard9. Sezioni di tessuto sono state valutate in cieco da un patologo secondo la NASH attività Scoring (NAS) sistema1,2. Il NAS riflette il grado di malattia per la steatosi, infiammazione lobulare e dell'epatocita in mongolfiera (ogni parametro dato un punteggio di 0-3) come descritto in precedenza9.
Incorporare una biopsia del fegato nel progetto di questo studio ha permesso per un punteggio di fibrosi (pre-biopsia) di riferimento. Un totale di 118 topi sono stati biopsiati dopo 26 settimane di dieta di NASH e steatosi e fibrosi del fegato sono stati segnati per ogni biopsia (Figura 1). Questi 118 topi, 49 topi sono stati esclusi basato su bassa fibrosi fibrosi alta (Punteggio pari a 0), (Punteggio di 4, che ha esibito la patologia anormale) e la perdita di peso anormale o la guarigione della ferita. Questi criteri di esclusione ammessi per 69 topi lasciato per assegnare in gruppi di studio e cercare miglioramenti nel fenotipo di NASH dopo il trattamento (Figura 1).
Topi sono stati trattati con il veicolo o il liraglutide agonista GLP-1R (5 nmol/kg) per 6 settimane. Nel gruppo trattato con veicolo, 1 mouse esposta fibrosi peggiorata e 4 topi ha mostrati peggioramento NAS segno (Figura 2A-B). Trattamento con liraglutide è stata associata con un miglioramento complessivo della fibrosi (Figura 2), con il 17% del gruppo di trattamento, il miglioramento e l'83% rimanendo invariata. Allo stesso modo, trattamento con liraglutide migliorato il generale NAS score (Figura 2D), con il 66% del gruppo avendo migliorato il Punteggio NAS e il 33% è rimasto invariato.
Inoltre, il trattamento di liraglutide ha migliorato l'infiammazione, con il 75% del gruppo avendo un basso punteggio di infiammazione e 25% è rimasto invariato (figura 3B). Trattamento del veicolo ha peggiorato l'infiammazione, con il 17% del gruppo che ha un più alto punteggio di infiammazione e l'83% è rimasto invariato (Figura 3A). Punteggio di steatosi è rimasto invariato dal basale alla fine dello studio in entrambi i gruppi trattati con veicolo e liraglutide (Figura 3A, B). Pre-vs confronti post-biopsia per topi individuali sull'infiammazione e parametri di volo in mongolfiera sono anche di colore (Figura 3-F).
Figura 1: pre-screening fibrosi del fegato biopsia e NAS Punteggio . (A) rappresentazione di tutte le 118 topi che sono stati sottoposti a screening per fibrosi, tramite biopsia del fegato. (B e C) mostrano la fibrosi basale e Punteggio di NAS, rispettivamente, dopo topi ammissibili sono stati ordinati in gruppi di studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Punteggio di fibrosi e NAS, pre- biopsia e post-intervento. Analisi dei responder per cento per il veicolo (A, C) o i topi trattati con liraglutide (B, D), come misurato dalla biopsia epatica al basale alla fine del campione di studio del fegato per la fase di fibrosi (A, B) e NAS (C, D). Per ogni gruppo, il passaggio dallo pre-studio a biopsia post-studio è indicato da una linea. I punti ad ogni passo notante è leggermente spostato per consentire la separazione visiva degli animali, questo è solo per scopi di visualizzazione e non riflette alcuna differenza nel punteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: steatosi, infiammazione e in mongolfiera, pre- biopsia e post-intervento. Analisi dei responder per cento per il veicolo (A, C, E) o i topi trattati con liraglutide (B, D, F), come misurato dalla biopsia epatica al basale alla fine del campione di studio del fegato per steatosi Punteggio (A, B), l'infiammazione (C, D) e ballooning (E, F). Per ogni gruppo, il passaggio dallo pre-studio a biopsia post-studio è indicato da una linea. I punti ad ogni passo notante è leggermente spostato per consentire la separazione visiva degli animali, questo è solo per scopi di visualizzazione e non riflette alcuna differenza nel punteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui descriviamo in dettaglio la procedura di biopsia del fegato del mouse in primo luogo descritto da Clapper et al.10ed esemplificano la sua utilità in un modello murino di NASH, simile ai precedenti rapporti6,9. La procedura di biopsia del fegato è uno strumento prezioso per la valutazione del fenotipo di NASH pre- e post-trattamento, in un modo simile a quello effettuato negli studi clinici terapeutici. La biopsia permette per un confronto diretto per ogni soggetto, cioè che i topi stessi possono essere utilizzati per entrambi i punti di tempo. Inoltre dimostriamo il suo potenziale traslazionale. In uno studio clinico in soggetti di NASH biopsia-provata, liraglutide ha suscitato un tasso di risposta del 39% (pazienti con miglioramento) in NAS, considerando che nel nostro studio abbiamo osservato un tasso di risposta del 66% per una migliore NAS. Inoltre, il 26% dei pazienti ha avuto fibrosi migliorata Punteggio con 9% peggioramento, rispetto al 14% e il 36% nel braccio placebo, rispettivamente11. Nel nostro studio, abbiamo osservato un tasso di miglioramento del 17% con trattamento con liraglutide. Questi confronti evidenziare il potere della biopsia epatica al basale e confermano potenziali traslazionale comprensione, almeno per questa classe di terapeutica.
È fondamentale per raccogliere un pezzo abbastanza grande di tessuto del fegato durante la procedura di biopsia per analizzare correttamente le caratteristiche istologiche, ma anche non troppo grande di un pezzo di fegato a compromettere la funzione del fegato. Abbiamo osservato un tasso di mortalità a zero con questo intervento chirurgico, e gli animali è apparso completamente recuperati entro 1 giorno con la ripresa del normale comportamento di mangia. Così, il tempo tra la biopsia e l'inizio dello studio di intervento è limitato non di recupero degli animali ma probabilmente dal tempo impiegato per il trattamento dei campioni, l'analisi e successiva randomizzazione.
Prima di intervento ha contribuito a ridurre la variabilità nel nostro studio, che ci permette di escludere i topi che non hanno pienamente sviluppato un certo grado di fibrosi epatica come conseguenza la dieta d'induzione AMLN NASH, utilizzando la procedura di biopsia del fegato come metodo di conferma della fibrosi. Inoltre, migliorato la nostra capacità di comprendere meglio l'impatto di possibili interventi di miglioramento NASH, invece di avere solo un campione epatico terminale e NASH punteggio. Fino a nuove tecniche non invasive sono ulteriormente esplorate e ampiamente accettate, la biopsia del fegato è l'unico modo dimostrato di determinare NASH.
Disclosures
S.O. e C.R. sono dipendenti attuali e/o azionisti di MedImmune/AstraZeneca. JLT era un dipendente e azionista di MedImmune/AstraZeneca nel momento in cui che questi esperimenti sono stati condotti.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine l'assistenza di Sally Lee e Holly Koelkebeck per la competenza nella lavorazione del tessuto e immunohistochemistry. Gli autori ringraziano anche Donna Goldsteen e il personale di laboratorio animale risorse (MedImmune, Gaithersburg, MD) per la loro assistenza con procedure tecniche e la zootecnia e la cura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
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