Summary
In klinischen Umgebungen ist eine Leberbiopsie verwendet, um Phasen der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (Steatose, Entzündung, Hepatozyten, Ballonfahren und Fibrose) zu bewerten. Hier zeigen wir eine überlebensfähige Leberbiopsie bei Mäusen die histologische Analysen verwendet werden kann, zur Bewertung von Therapeutika in gewissem Sinne mehr ausgerichtet mit klinischen Studien zu ermöglichen.
Abstract
Klinische Bewertung von Therapien für die Behandlung von nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) beinhalten eine Basislinie und Ende der Studie Leber-Biopsie und Beurteilung der Verbesserung der Krankheit Endpunkte, oft darüber nachgedacht, als Prozentsatz der jede Behandlung-Arm, der verbessert, verschlechtert oder blieb unverändert. Traditionelle Nagetier Vorklinik für vermeintliche NASH Therapien sind oft durch nicht zu wissen, das Niveau der Leber Krankheit/NASH anwesend zu Beginn der therapeutischen Intervention statt randomizing Behandlungsgruppen auf leicht messbare Endpunkte wie begrenzt Körpergewicht, Stoffwechsellage oder ähnliches. Hier beschreiben wir eine Leberbiopsie Technik in einem Diät-induzierten NASH Maus-Modell für die Bewertung der Grundlinie Leber Krankheit um Mäuse auszuschließen, die keine Fibrose aufweisen und Tiere mit ähnlichen Fibrose zwischen den Behandlungsgruppen gleichmäßig zu verteilen. Diese Werte können dann gegenüber dem terminal, nach Intervention Niveau für ein genaueres Verständnis der in-vivo pharmakologischen Effekte und somit mehr widerspiegeln klinischen Studie Design-Strategien. Die Maus ist richtig betäubt und der Eingriff unter sterilen Bedingungen vorbereitet. Ein kleiner Einschnitt erfolgt im Oberbauch und die Links laterale Leberlappen ausgesetzt ist. Ein Keil der Leber operativ entfernt wird, und ein ähnlicher Größe Stück resorbierbare Gelatine an seiner Stelle um eine Blutung zu stoppen. Die Maus ist operativ vernäht und geheftet geschlossen und wird zurück zu normal innerhalb von 1 Tag erholen. Der gesamte Vorgang dauert ca. 5-10 min per Mausklick. Hier veranschaulichen wir die Nützlichkeit dieses Verfahren durch die Nutzung der Vorstudie Biopsie zur Bewertung der Auswirkungen von Glucagon-Like Peptid 1 (GLP-1) Rezeptor Agonist Liraglutid auf NASH Endpunkte bei Mäusen.
Introduction
Nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH) ist eine fortschreitende Erkrankung der Leber und eine schwere Form der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD), das aufgrund seiner Verbindung mit Übergewicht und Typ-2-Diabetes zunehmend häufiger ist. Es gibt keine zugelassenen Therapien für NAFLD/NASH oder genehmigten Biomarker ohne weiteres Fortschreiten der Erkrankung zu bewerten. NASH Diagnose histologisch durch die Bewertung Entzündung, überschüssige hepatische Lipid (Steatose), Hepatozyten, Ballonfahren und Fibrose1,2,3,4. In klinischen Studien werden diese Endpunkte vor Beginn der Studie in einer Leber Probe via Biopsie und aus einem zweiten Leber-Biopsie nach einer gewissen Behandlungszeit beurteilt. Somit die Wirksamkeit des Test-Agents bemisst sich über Veränderungen in der Leber Pathologie bei Patienten mit zuvor identifiziert/quantifiziert (z. B. Biopsie nachgewiesen) NASH, die Behandlung Gruppen randomisiert werden. Diese gleichen histologischen Endpunkte sind in Nager-Modelle der Beurteilung potenzieller NASH Therapeutika in präklinischen Studien, sondern nur im terminal Gewebe aus euthanasierten Mäuse und somit ohne ein Verständnis für den Grad der Wirksamkeit bei Baseline und der Unfähigkeit häufig benutzt. zur Steuerung für Unterschiede in den Basiszustand Krankheit zwischen den Behandlungsgruppen.
Obwohl NASH haben erhöhte Aminotransferase-Serumspiegel basierend auf 25 % der Erwachsenen mit NAFLD vermutet wird, gibt es keine definitive Alternativmethoden NASH als histologischen Nachweis4bestätigen. Nicht-invasive Methoden, wie z. B. radiologische Modalitäten (Ultraschall, Computertomographie und Kernspintomographie) wurden entwickelt, um die hepatische Steatose erkennen, aber diese Methoden nicht diagnostizieren NASH oder bestimmen die Bühne der Fibrose. Transiente Elastographie bietet eine vielversprechende nichtinvasive Modalität für die Messung von Leber Steifigkeit. Es hat sich gezeigt, genau bei der Unterscheidung von Fibrose Stadien zu sein. Allerdings nimmt die Genauigkeit mit höheren Body mass Index (BMI) und Fettgewebe. 5 Dies ist problematisch wegen der Mehrzahl der NASH-Patienten als fettleibig. Über die klinische Relevanz dieser Ansätze sind keiner dieser Modalitäten in präklinischen Studien genutzt.
Um dies zu überwinden, waren die Forschungsgruppe von Dr. Jonathan Roth die ersten, eine Leber-Biopsie-Verfahren zu implementieren, im Mausmodell Amylin NASH (AMLN) NASH6,7,8. Sie beschrieben die prädiktive Gültigkeit der Biopsie mit NASH Krankheit und Korrelation mit Stoffwechselerkrankung. Hier beschreiben wir ausführlich das Leber-Biopsie-Verfahren im AMLN-Modell von NASH und seine Nützlichkeit in einer therapeutischen Einstellung, speziell auf die Wirksamkeit von Liraglutid zu beurteilen.
Protocol
All-in-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Politik der institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) von MedImmune, LLC und im Einvernehmen mit der Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8. Auflage (2011) durchgeführt. Männliche C57BL6J Mäuse wurden die fettreichen, High-Fructose, cholesterinreiche Diät AMLN aufgesetzt. Leberbiopsien wurden nach 26 Wochen auf Diät, 3 Wochen vor Beginn der pharmakologischen Intervention durchgeführt.
1. besorgen Sie und bereiten Sie chirurgische Materialien
- Autoklaven sterilen Instrumenten (kleine wies-Tip Schere, stumpfe Spitze Pinzette, Wattestäbchen, Gaze Plätze, 7 mm Heftklammern/Wunde Clips und Hefter).
- Zu erhalten, sterile Naht für den Abschluss Bauchdecke (5-0 beschichtete resorbierbaren Naht mit einer PC-1-Nadel ist geeignet), Schwamm, resorbierbare Gelatine komprimiert (um blutstillende Zwecken verwendet werden), sterilen Tüchern und Handschuhe, jodhaltiges Gestrüpp und 70 % Ethanol Tupfer/Tücher , Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg-Dosis pro Maus; mindestens 3 Dosen pro Maus) und chirurgische Augen Salbe/Schmierung.
- Bereiten Sie Vaporizer für die Anästhesie durch Füllung mit Isofluran.
- Schalten Sie eine Perle-Sterilisator für schnelle Instrument Sterilisation zwischen Tieren.
- Schalten Sie eine wärmende Fläche oder Heizkissen für Tiere Wiederherstellung verwendet werden.
- Don geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) (d. h. Maske, Kleid, Haare Haube, Handschuhe).
2. präoperative Vorbereitungen
- Platzieren Sie den Mauszeiger in die Induktion-Kammer mit 2-3 % Isofluran Flow Effekt.
- Beobachten Sie die Maus, bis das Ausbleiben einer Reaktion zu Fuß-Prise bestätigt, dass die Tiefe der Narkose angebracht ist.
- Verwenden Sie eine Augensalbe, um Trockenheit der Hornhaut, verbunden mit Narkose zu verhindern.
- Buprenorphin subkutan verabreichen (0,05-0,1 mg/kg).
- Rasieren der Operationsstelle sofort kaudalen über den Xiphoid Prozess, mit tierischen Clippers.
- Bewegen Sie die Maus auf einer beheizten Fläche (37 ° C) nach der Rasur der Operationsstelle. Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Weise, so dass die dorsale Oberfläche nach unten, und der Bauch ausgesetzt ist. Stecken Sie die Nase der Maus in die Bugnase Anästhesie auf Lieferung von Isofluran bei einer Durchflussmenge von 2 bis 3 % zu erleichtern.
- Reinigen der Operationsstelle mit wechselnden Abstriche von Betadine und 70 % Ethanol (3 Mal).
- Öffnen Sie und richten Sie sterile chirurgische Instrumente.
- Entfernen Sie Handschuhe zu und ersetzen Sie durch sterile OP-Handschuhe.
(3) chirurgischen Eingriff
- Machen Sie einen längs-Schnitt mit der Schere (1-2 cm), sofort kaudalen Xiphoid Prozeß und leicht auf der linken Seite der Maus in die Bauchhaut.
- Blunt sezieren die Haut weg von der Bauchwand mit Zange und Schere.
- Aussetzen der Bauchwand und Leber unter visualisieren.
- Verwenden eine steriles Skalpell Klinge machen einen Einschnitt (1-2 cm) in der Bauchdecke, um die Links-lateralen Leberlappen (LLL) zu visualisieren.
Hinweis: Seien Sie konsequent während der gesamten Studie. Andere gemeinsame Lappen von Interesse sind rechts-medialen Lobe (RML) und links-medialen Lappen (LML). - Den linken seitliche Lappen durch die Inzision zu externalisieren.
- Option 1: Massieren Sie leicht den Bauch mit Daumen und Zeigefinger, einen Teil der LLL verfügbar zu machen.
- Option 2: Legen Sie einen sterilen Wattetupfer unter der LLL, einen Teil ziehen Sie vorsichtig freigelegt werden.
- Legen Sie eine sterile Kochsalzlösung getränkten Stück Gaze unterhalb der LLL erlauben eine sterile und hydratisiert Oberfläche für die Leber auf liegen.
- Geschnitten Sie ein keilförmiges Stück der Leber aus dem LLL durch zwei Einschnitte mit einer sterilen Schere.
Hinweis: Die ungefähre Größe der Leber entfernt wird ist 30-50 mg (< 5 % von der Leber in den Mäusen). - Schneiden Sie ein Stück Gelatine Schwamm ähnlich groß wie der Keil Stück Leber. Legen Sie den Schwamm in der geschnittenen Teil der Leber mit Pinzette.
- Halten Sie den Schwamm mit der Pinzette und halten Sie Kontakt mit der Leber, bis es an der Oberfläche der Leber haftet und Blutstillung erreicht.
- Ort der Leberbiopsie Stück in das entsprechende Röhrchen (d.h. eingefroren, Fixiermittel, etc..).
- Legen Sie die Leber vorsichtig zurück in die Bauchhöhle, kümmert sich um den Schwamm nicht zu stören.
- Naht der Bauchwand mit 5: 0-beschichtete resorbierbaren Naht beginnend und endend mit einem vollen Kreuzknoten.
- Schließen Sie die Haut mit 7 mm Wunde Clips (oder Klammern).
- Überprüfen Sie die Wunde-Clips, um sicherzustellen, dass es eine komplette Schließung des Schnittes.
- Entfernen Sie die Maus aus die Bugnase und in einen sauberen Käfig auf einer beheizten Fläche legen.
- Instrumente in Perle Sterilisator zwischen Mäusen für 10-20 s. sicherstellen, dass alle organischen Materials von den Instrumenten, die mit steriler Kochsalzlösung vor dem Einsetzen in das Glas Bead Sterilisator entfernt werden sollte.
4. postoperative Pflege
- Überwachen Sie die Maus, bis es Bewusstsein gewinnt und kann sich direkt.
- Notieren Sie postoperative Beobachtungen und überprüfen Sie die Mäuse täglich für Dehiszenz.
- Verwalten eine zweite und dritte Dosis von Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) subkutan 6-8 h nach der Operation und wieder 24 h nach der Operation.
- Wunde Clips bei 7-10 Tage nach der Operation zu entfernen.
Representative Results
Für diese Studie Mäuse wurden randomisiert und den Behandlungsgruppen (n = 12/Gruppe) basierend auf Vorstudie Biopsie Fibrose Grad und Körpergewicht. Mäuse wurden verabreicht Fahrzeug (PBS) oder Liraglutid (5 Nmol/kg) für 42 Tage (Fahrzeug oder zusammengesetzte verabreichten 10 mL/kg Volumen, subkutan, Dosis einmal täglich). Am Tag 42 wurden Mäuse (über CO2 Inhalation) in den Staat nicht gefastet und Leber herausgeschnitten und bearbeitet für Histologie eingeschläfert.
Biopsie und Terminal Leber, die Stücke über Nacht in 10 % Formalin fixiert waren dann paraffin eingebettete und verarbeiteten für Sirius rot, über Standardprotokolle9Färbung Hämatoxylin und Eosin. Gewebeschnitte wurden in einer verblindeten Mode von einem Pathologen nach NASH Aktivität Scoring (NAS) System1,2bewertet. Das NAS spiegelt den Grad der Krankheit bei Steatose, lobuläres Entzündungen und Hepatozyten Ballonfahren (jeden Parameter gegeben eine Punktzahl von 0-3) als zuvor beschriebenen9.
Einbeziehung einer Leberbiopsie in das Design dieser Studie für eine Basislinie (Pre-Biopsie) Fibrose-Score erlaubt. Nach 26 Wochen der NASH Diät waren insgesamt 118 Mäuse biopsiert und Leberfibrose und Steatose für jede Biopsie (Abbildung 1) erzielt wurden. Dieser 118 Mäuse 49 Mäuse wurden ausgeschlossen, basierend auf geringe Fibrose (Wert 0), hohe Fibrose (Score von 4, die abnorme Pathologie ausgestellt), und abnorme Gewichtsabnahme oder Wundheilung. Diese Ausschlusskriterien für 69 Mäuse erlaubt links weisen zu Studiengruppen und suchen nach Verbesserungen in NASH Phänotyp nach Behandlung (Abbildung 1).
Mäuse wurden mit Fahrzeug oder die GLP-1R Agonist Liraglutid (5 Nmol/kg) für 6 Wochen behandelt. In der Fahrzeug-behandelten Gruppe 1 Maus ausgestellten verschlechterten Fibrose und 4 Mäuse zeigten schlechtere NAS-Score (Abbildung 2A-B). Liraglutid Behandlung war verbunden mit einer allgemeinen Verbesserung der Fibrose (Abbildung 2), mit 17 % die Behandlung Gruppe zu verbessern und 83 % unverändert bleibt. In ähnlicher Weise Liraglutid Behandlung verbessert die allgemeine NAS score (Abb. 2D), mit 66 % der Gruppe mit verbesserter NAS-Score und 33 % unverändert.
Darüber hinaus Liraglutid Behandlung verbessert Entzündung, mit 75 % der Gruppe mit einem niedrigeren Entzündung Partitur und 25 % blieb unverändert (Abb. 3 b). Fahrzeug-Behandlung verschlechtert Entzündung mit 17 % des Arbeitskreises haben eine höhere Punktzahl Entzündung und 83 % unverändert (Abb. 3A). Steatose erzielte unverändert gegenüber dem Ausgangswert bis Ende der Studie in beiden Fahrzeug und Liraglutid-behandelten Gruppen (Abb. 3A, B). Pre vs. Post-Biopsie Vergleiche für individuelle Mäuse auf Entzündungen und Ballonfahren Parameter (Abbildung 3-F) auch gezeigt werden.
Abbildung 1: pre-screening Leberbiopsie Fibrose und NAS-Score . (A) Darstellung der alle 118 Mäuse, die Fibrose, über Leber-Biopsie untersucht wurden. (B und C) zeigen die Grundlinie Fibrose und NAS-Score, bzw. nach förderfähigen Mäuse in Gruppen sortiert wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Fibrose und NAS-score, Pre-Biopsie und nach dem Eingriff. Prozent-Responder-Analyse für das Fahrzeug (A, C) oder Liraglutid behandelten (B, D) Mäuse, gemessen von Grundlinie Leber-Biopsie zu Ende der Studie Leber Probe für Fibrose Stadium (A, B) und NAS (C, D). Für jede Gruppe ist der Wechsel von der Vorstudie zur Post-Studie Biopsie durch eine Linie angezeigt. Die Punkte bei jedem scoring Schritt ist leicht verschoben, um visuelle Trennung der Tiere zu ermöglichen, dies ist nur für Visualisierung und spiegelt nicht keinen Unterschied in der Partitur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Steatose, Entzündungen und Ballonfahren, Pre-Biopsie und nach dem Eingriff. Prozent-Responder-Analyse für das Fahrzeug (A, C, E) oder Liraglutid behandelten (B, D, F) Mäuse, gemessen von Grundlinie Leber-Biopsie zu Ende der Studie Leber Probe für Steatose Punkten (A, B), Entzündungen (C, D) und Ballonfahren (E, F). Für jede Gruppe ist der Wechsel von der Vorstudie zur Post-Studie Biopsie durch eine Linie angezeigt. Die Punkte bei jedem scoring Schritt ist leicht verschoben, um visuelle Trennung der Tiere zu ermöglichen, dies ist nur für Visualisierung und spiegelt nicht keinen Unterschied in der Partitur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Hier beschreiben wir ausführlich das Maus-Leber-Biopsie-Verfahren zunächst von Klöppel Et Al.10beschrieben, und veranschaulichen ihre Nützlichkeit in einem Mausmodell der NASH, ähnlich wie die früheren Berichte6,9. Die Leber-Biopsie-Verfahren ist ein wertvolles Werkzeug für die Beurteilung der NASH Phänotyp vor- und Nachbehandlung, in gewissem Sinne ähnlich dem in Klinische Therapiestudien durchgeführt. Die Biopsie ermöglicht direkten Vergleich für jedes Thema, d.h., dass die gleichen Mäuse zu beiden Zeitpunkten verwendet werden können. Wir zeigen auch die translationale Potential. In einer klinischen Studie in Biopsie nachgewiesen NASH Fächern entlockte Liraglutid 39 % Rücklaufquote (Patienten mit Verbesserung) in NAS, während wir in unserer Studie eine 66 % Responder-Rate für verbesserte NAS beobachtet. Darüber hinaus hatten 26 % der Patienten verbesserte Fibrose-Score mit 9 % Verschlechterung im Vergleich zu 14 % und 36 % in der Placebo-Arm bzw.11. In unserer Studie haben wir eine Verbesserung um 17 % Rate mit Liraglutid Behandlung beobachtet. Diese Vergleiche die Macht der Grundlinie Leber-Biopsie und bestätigen potenzielle translationale Verständnis, zumindest für diese Klasse von therapeutischen.
Es ist entscheidend für ein genug großes Stück Lebergewebe während der Biopsie-Verfahren richtig analysieren die histologischen Merkmale zu ernten, aber auch nicht zu groß, ein Stück Leber beeinträchtigen die Funktion der Leber. Beobachteten wir eine Null-Sterblichkeit bei dieser Operation, und die Tiere erschienen vollständig wiederhergestellten innerhalb eines Tages mit der Wiederaufnahme des normalen Essverhalten. Somit ist die Zeit zwischen Biopsie und Einleitung der Interventionsstudie durch tierische Erholung nicht begrenzt, aber wahrscheinlich durch den Zeitaufwand für die Probenverarbeitung, Analyse und anschließende Randomisierung.
Die Nutzung der Leber-Biopsie-Verfahren als Methode zur Bestätigung der Fibrose vor Intervention ermöglichte eine Reduzierung der Variabilität in unserer Studie, so dass wir Mäuse ausschließen, die nicht voll, ein gewisses Maß an Leberfibrose durch die AMLN NASH-induzierende Diät entwickeln. Darüber hinaus verbessert es unsere Fähigkeit, besser zu verstehen, die Auswirkungen von möglichen Verbesserung der NASH Interventionen im Gegensatz nur ein terminal Leber Muster und NASH Partitur. Bis neue nicht-invasive Techniken werden weiter untersucht und wird allgemein akzeptiert, die Leberbiopsie die einzige Möglichkeit festzustellen, NASH bewiesen.
Disclosures
S.O. und C.R sind aktuelle Mitarbeiter und/oder Aktionäre von MedImmune/AstraZeneca. JLT war ein Mitarbeiter und Anteilseigner der MedImmune/AstraZeneca zum Zeitpunkt dieser Experimente durchgeführt wurden.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen dankbar die Hilfe von Sally Lee und Holly Koelkebeck für Kompetenz in der Verarbeitung von Gewebe und Immunohistochemistry. Die Autoren danken auch Donna Goldsteen und das Labor Tier Ressourcen-Personal (MedImmune, Gaithersburg, MD) für ihre Unterstützung bei der technischen Verfahren und Tierhaltung und Pflege.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
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