Summary
臨床上, 肝生検を使用して、非アルコール性脂肪性肝炎 (脂肪変性、炎症、肝細胞の風船、線維症) の段階を評価します。ここでは、我々 は臨床試験で整列方法より多くの治療薬の評価を有効にする組織学的解析の使用ことができるマウスで存続可能肝生検を示しています。
Abstract
非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) の治療のための治療法を評価する臨床試験を含むベースラインと研究肝生検と病エンドポイント、しばしば改善、各処置の腕の % として反映の改善の評価の終了悪化または変わらずに残った。伝統的な臨床齧歯動物に関する推定ナッシュ療法肝疾患/ナッシュ存在など簡単に測定可能なエンドポイント上の治療グループをランダムではなく、治療的介入の開始時のレベルを知ることで限られています。体重, 代謝状態または類似。ここでは、食事誘発ナッシュ マウス モデルで、ベースラインの肝疾患の線維症を示さないマウスを除外するためと治療グループ間似たような線維症の動物を均等に配布するの評価のため肝生検手法について述べる。体内薬理効果の真実理解のターミナル、後の介入レベルにこれらのレベルを比較しことができるおよび従ってより正確に臨床試験のデザイン戦略を反映します。マウスは正しく麻酔、滅菌条件を使用して手術の準備します。小切開は腹部であり、肝臓の左葉外側が公開されます。肝臓のウェッジは摘出し、吸収性ゼラチンの同様のサイズの作品を任意の出血を停止するために場所に置きます。マウスは外科的縫合、ホチキス止め閉じて正常に戻って 1 日以内に回復します。全体のプロセスは、マウスあたり 5-10 分します。ここでマウスでナッシュ エンドポイントでグルカゴン様ペプチド 1 (GLP-1) 受容体アゴニストのリラグルチドの影響を評価する事前調査生検を活用してこの手順の有用性を実証します。
Introduction
非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) は、進行性の肝疾患と非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD) 肥満と 2 型糖尿病との関連によりますます普及しているなっているのより深刻な形です。NAFLD/ナッシュ、または承認されたバイオ マーカーが容易に病気の進行を評価するために承認された治療法はありません。NASH の診断は病理組織学的炎症を評価することによって肝脂質 (脂肪)、熱気球、肝細胞および線維症1,2,3,4を超過。臨床試験は、これらのエンドポイントは肝生検を介して 2 つ目の肝生検から一定の治療期間後に収集サンプルの調査の前に評価されます。したがって、患者の肝臓の病理の変化を介してテスト エージェントの有効性が評価される以前識別/定量化 (すなわち、生検実績) 治療群に無作為に割り付け、ナッシュ。これらの同じ組織学的エンドポイントは潜在的なナッシュ治療前臨床試験において、ベースラインおよび無力で効果の度合いを理解していないとこの安楽死させたマウスからターミナルの組織でのみ評価する齧歯動物モデルで頻繁に使用します。試験治療グループ間基準病気の状態の違いを制御します。
NAFLD の成人の 25% は血清アミノトランスフェラーゼに基づいてナッシュを持っていると推定されるが以外の組織学的証拠4ナッシュを確認する決定的な方法がないです。脂肪肝を検出する放射線モダリティ (超音波、コンピューター断層撮影、磁気共鳴イメージ投射) などの非侵襲的方法が開発されているが、これらのメソッドがナッシュを診断または線維化のステージを決定できません。一時的なエラストグラフィでは、肝の剛性を測定するための有望な非侵襲的なモダリティを提供しています。それは、線維化の段階を区別する場合に正確であると示されています。ただし、精度は高いボディマス指数 (BMI) と脂肪減少します。5これは肥満 NASH 患者の大半が原因問題です。これらのアプローチの臨床関連性を超えてこれらの様式のどれもは前臨床試験で利用されています。
これを克服するためには、博士ジョナサン ・ ロスの研究グループは最初にナッシュ6,7,8アミリン ナッシュ (AMLN) マウス モデルにおける肝生検の手順を実装するをされました。彼らはナッシュの病気の程度と生検および代謝性疾患との相関関係の予測的妥当性を説明します。ここでナッシュの AMLN モデルにおける肝生検の手順とリラグルチドの有効性を評価するために具体的には、治療上の設定のユーティリティ詳細に述べる.
Protocol
すべての生体実験をケアと第 8 版 (2011) 実験動物の使用のため機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) MedImmune、LLC とガイドとの契約の方針に基づき行った。男性の C57BL6J マウスは、高脂肪、高果糖液糖、高コレステロール AMLN ダイエットに置かれました。26 週間の食事療法の薬理学的介入の開始前に 3 週間後肝生検を行った。
1. 取得および手術材料の準備
- オートクレーブ滅菌器 (先のとがった先端のハサミ、鈍い先端の鉗子、綿棒、ガーゼの正方形、7 mm ステープル/傷クリップ、ホッチキス)。
- 滅菌縫合閉鎖を腹壁 (5-0 被覆 PC 1 針縫合は適した)、(止血目的に使用) に圧縮された吸収性ゼラチン スポンジ、滅菌ドレープ、手袋、ヨウ素系のスクラブと 70% エタノール綿棒/ワイプを入手します。、ブプレノルフィン (0.05 0.1 mg/kg マウスあたり; マウスあたり少なくとも 3 用量) と手術眼軟膏/潤滑。
- 充填とイソフルレン麻酔の気化器を準備します。
- 動物との間の迅速な機器の滅菌用のビーズ殺菌装置を入れます。
- 地球温暖化の表面または加熱パッド、動物の回復に使用するオンにします。
- ドン適切な個人用保護具 (PPE) (すなわち、マスク、ガウン、髪ボンネット、手袋)。
2. 術前準備
- 効果が 2-3% イソフルラン流誘導チャンバーにマウスを配置します。
- つま先ピンチに反応の欠如は、麻酔の深さが適切なを確認するまでは、マウスを観察します。
- 麻酔に関連付けられている角膜の乾燥を防ぐためには、眼軟膏を使用します。
- 皮下ブプレノルフィンを管理 (0.05 0.1 mg/kg)。
- 動物クリッパーズを使用して剣状突起の尾側すぐに手術部位を剃る。
- 手術部位を髭剃り後に加熱された表面 (37 ° C) にマウスを移動します。背側表面下方と腹部が公開されるように、このような方法でマウスを配置します。2-3% の流量にイソフルランの配信を容易にする麻酔鼻の円錐形にマウスの鼻を挿入します。
- きれい betadine と 70% のエタノールの交互の綿棒と手術部位 (3 回)。
- 開き、滅菌手術機器をセットアップします。
- 手袋を外すし、滅菌手術用手袋に置き換えます。
3. 手術の手順
- はさみ (1 ~ 2 cm)、剣状突起とマウスの左側には、腹部の皮膚にわずかにすぐに尾の縦切開を確認します。
- 鈍鉗子、はさみを使用して腹壁から肌を分析します。
- 腹壁を公開し、下に肝臓を視覚化します。
- 腹部壁の生殖不能のメス刃を切開 (1 ~ 2 cm) を使用して、肝左外側葉 (LLL) を可視化します。
注:研究を通して一貫しています。興味の他の一般的な葉、右内側葉 (RML) と内側左葉 (私の人生を愛する)。 - 切開して左葉外側を外部化します。
- オプション 1: は、親指と人差し指、LLL の一部を公開すると腹部を軽くマッサージします。
- オプション 2: 場所を部分をそっと抜く LLL の下に滅菌綿棒を公開します。
- 肝臓の上に横に生殖不能および水和の表面をように LLL の下にガーゼの滅菌生理食塩水に浸したの作品を配置します。
- 滅菌ハサミで 2 つのカットを行い、LLL から肝臓のくさび状の部分をカットします。
注:削除されている肝臓のおおよそのサイズは 30-50 mg (< マウスにおける肝臓の 5%)。 - 肝臓のくさびの部分にサイズで類似したゼラチン スポンジの部分をカットします。鉗子を用いた肝臓の切口の部分にスポンジを挿入します。
- 場所にスポンジを鉗子押しまで肝臓の表面に付着した、止血、肝臓との接触を維持します。
- 場所適切なチューブに肝生検部分 (すなわち、冷凍固定液等。)。
- スポンジを邪魔しないように世話、腹腔内に肝臓をそっと置きます。
- 5-0 コーティング縫合による正方形の結び目で開始および終了と腹壁を縫合します。
- 7 mm 傷クリップ (またはホッチキス) 皮膚を閉じます。
- 切開部を完全に閉鎖されるように傷クリップを確認します。
- 鼻の円錐形からマウスを削除し、加熱面にきれいなケージに配置します。
- 10-20 s. マウスの間にビーズ滅菌に場所機器ガラス ビーズ滅菌器で配置される前に滅菌生理食塩水を用いて楽器からすべての有機材料を削除することを確認します。
4. 手術後のケア
- それは意識を取り戻すし、自体を右することができますまでは、マウスを監視します。
- 術後観察を記録し、裂開のために毎日マウスを確認します。
- ブプレノルフィンの 2 番目と 3 番目に投与 (0.05 0.1 mg/kg) 皮下 6 ~ 8 h 手術後、もう一度 24 時間後手術。
- 7-10 日後手術で傷のクリップを取り外します。
Representative Results
この研究のためマウス治療群に無作為に割り付けられた (n = 12/グループ) 事前調査生検線維症グレードと体重に基づきます。マウスが投与された車両 (PBS) または (車両または化合物投与の 10 mL/kg 1 日 1 回皮下、ボリュームを線量) 42 日間リラグルチド (5 nmol/kg)。42 日マウスは非絶食状態と肝臓を摘出し、組織学のため処理 (CO2吸入) 経由で安楽死されました。
作品は 10% ホルマリンで一晩固定された生検およびターミナルの肝臓には、埋め込み、ヘマトキシリンとエオシン、シリウス赤染色標準プロトコル9を介しての加工、パラフィンします。ティッシュ セクションは、盲ナッシュ活動得点 (NAS) システム1,2によると病理学者によって評価しました。NAS は、上記9としての脂肪、乳腺炎症や肝細胞 (0-3 のスコアを指定された各パラメーター) を膨れ上がる病気の程度を反映します。
肝生検を基準 (前生検) 線維化スコアを許可この研究デザインに組み込みます。118 マウスの合計ナッシュ ダイエットの 26 週間後生検、肝線維化および脂肪変性各生検 (図 1) をスコア化しました。これらの 118 のマウスの 49 のマウスは、低線維化に基づく除外された (0 のスコア)、高線維症 (異常な病理を表わした 4 のスコア)、異常な体重減少や創傷治癒します。69 マウスで使用できるこれらの除外基準は研究グループに割り当てるし、ナッシュ表現の改善のための治療 (図 1) 世話を残しました。
マウスは、6 週間の車両や GLP-1R アゴニスト リラグルチド (5 nmol/kg) と扱われました。溶媒投与群では、1 はマウス展示悪化した線維化および悪化の NAS スコアを示した 4 マウス (図 2 a B)。リラグルチド治療は線維症 (図 2) の全体的な改善、治療グループの改善の 17% と変わらず 83% 関連付けられました。同様に、リラグルチド治療改善全体的な NAS (図 2 D) をスコア、グループの 66% と NAS のスコアと 33% の改善を有する変わらず。
また、リラグルチド治療炎症の改善、群の 75% と低い炎症スコアと 25% 残った変更 (図 3 b)。車両治療には、高い炎症スコアを持つグループの 17%、83% を維持している (図 3 a)、炎症が悪化しました。最後にベースラインから変わらずに残った脂肪得点車両とリラグルチド投与群 (図 3 a, B) の研究。炎症と膨れ上がるパラメーターに関する個々 のマウスにも表示されます (図 3-F) の後生検の比較対前。
図 1: 線維症肝生検と NAS スコアを事前審査.(A) 肝生検による線維化のため上映すべての 118 マウスの表現。(BとC) 基準線維化および NAS のスコア、それぞれ後表示対象マウスが研究グループに分類されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 線維症および NAS のスコアは、前と後の介入します。車両 (A、C) または終了するベースライン肝生検で測定された (B D) リラグルチド投与マウスに対するパーセント レスポンダー分析調査肝線維化ステージ (a, B) のためのおよび NAS (C, D)。各グループの事前調査から研修後生検への変更は、行で示されます。段階的な得点ポイントが少し動物の視覚分離を許可するようにシフト、これは可視化のためだけに、スコアの違いを反映していません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脂肪変性、炎症、熱気球、前生検および後の介入します。車両 (A、C、E) または終了するベースライン肝生検で測定された (B、D、F) リラグルチド投与マウスのパーセント レスポンダー解析研究肝脂肪変性のサンプル スコアが (A, B)、炎症 (C, D) と (E, F) は膨れ上がる。各グループの事前調査から研修後生検への変更は、行で示されます。段階的な得点ポイントが少し動物の視覚分離を許可するようにシフト、これは可視化のためだけに、スコアの違いを反映していません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ここで述べるマウス肝生検の手順はまずクラッパーら10、によって記述され、ナッシュ、以前レポート6,9と同様のマウス モデルにおけるその有用性を実証します。肝生検の手順は、前処理および後処理、臨床治療試験で実行されると同様に、ナッシュの表現型を評価するための貴重なツールです。生検は、直接比較のため各科目すなわち両方の時点で同じマウスを使用できます。またその可能性を並進を示します。生検で実証されたナッシュの科目で臨床試験にリラグルチドは、我々 の研究で改良された NAS の 66% レスポンダー レートを認め NAS では、39% の応答速度 (改善患者) を引き出した。さらに、26% の患者は悪化、14%、プラセボ アームは 36% とそれぞれ119% 改善された線維化スコアを持っていた。本研究でリラグルチド治療 17% の改善率を観察しました。これらの比較は、ベースラインの肝生検の力を強調表示し、治療のこのクラスの少なくとも潜在的な並進理解を確認します。
重要な組織学的特徴を正しく分析する生検の手順中に肝組織の十分に大きい部分を収穫するも大きすぎない肝臓の機能を妥協する肝臓の部分です。我々 はこの手術でゼロ死亡率を観察し、動物登場と通常の食事動作の再開 1 日以内に完全に回復しました。したがって、生検と介入研究の開始間の時間は動物の回復によって制限されるサンプルの処理、解析、およびその後のランダム化に要する時間によって可能性が高い。
線維化の確認の方法として肝生検の手順を利用して介入を助けた AMLN ナッシュ誘導ダイエットの結果として肝線維化の程度を十分に開発しなかったマウスを除外することができ、我々 の研究の可変性を減らす前に。さらに、ターミナル肝臓サンプルとナッシュのスコアを持つだけではなく、ナッシュ改善介入の可能性の影響を理解する当社の能力が強化されました。まで、新しい非侵襲的技術をさらに検討され、広く受け入れられて、肝生検は、ナッシュを決定する方法を証明だけです。
Disclosures
サポート オフィスと c. R. は、現在の従業員または MedImmune/アストラゼネカの株主です。JLT 当時従業員と株主 MedImmune/アストラゼネカのこれらの実験を行った。
Acknowledgments
作者は感謝してティッシュの処理および免疫組織化学の専門知識のためのサリー ・ リーとホリー koelkebeck 氏の援助を認めます。著者も技術的な手順と畜産のケアと援助のドナ Goldsteen と (MedImmune、ゲイサーズバーグ、MD) 実験動物資源のスタッフに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
