Summary
Em ambientes clínicos, uma biópsia do fígado é usada para avaliar estágios de esteatohepatite não-alcoólica (esteatose hepática, inflamação, fibrose e hepatócito Balonismo). Aqui, podemos ilustrar uma survivable biópsia do fígado nos ratos que pode ser usado para análise histológica para permitir a avaliação de agentes terapêuticos, de uma forma mais alinhada com os ensaios clínicos.
Abstract
Ensaios clínicos avaliando terapias para o tratamento da esteatohepatite não-alcoólica (NASH) envolvem uma linha de base e final da biópsia hepática de estudo e avaliação da melhoria em pontos de extremidade de doença, muitas vezes refletida como um por cento de cada braço do tratamento que melhorou, piorou ou permaneceu inalterada. Estudos pré-clínicos tradicionais do roedores para terapias de NASH putativos muitas vezes são limitados por não saber o nível de fígado doença/NASH presente no início da intervenção terapêutica, em vez de randomizar grupos de tratamento em pontos de extremidade facilmente mensuráveis, tais como peso corporal, estado metabólico ou similar. Aqui, descrevemos uma técnica de biópsia do fígado em um induzida por dieta NASH modelo do rato, para a avaliação da doença hepática de base a fim de excluir os ratos que não exibem fibrose e distribuir igualmente animais com fibrose semelhante entre os grupos de tratamento. Estes níveis então podem ser comparados com os terminais, pós-intervenção níveis para uma compreensão mais verdadeira de efeitos farmacológicos in vivo e, portanto, mais refletem com precisão a estratégias de design experimental clínico. O mouse é devidamente anestesiado e preparado para a cirurgia usando condições estéreis. É feita uma pequena incisão no abdômen superior e no lateral esquerdo do fígado é exposto. Uma cunha do fígado é removida cirurgicamente, e um pedaço de tamanho semelhante de gelatina absorvível é colocado em seu lugar para parar qualquer sangramento. O mouse é cirurgicamente suturado e grampeado fechado e vai se recuperar volta ao normal dentro de 1 dia. O processo todo leva 5-10 min por rato. Aqui podemos exemplificar a utilidade deste procedimento, aproveitando a biópsia de estudo preliminar para avaliar o impacto do glucagon-like peptídeo-1 (GLP-1) do receptor agonista liraglutide em pontos de extremidade NASH em camundongos.
Introduction
Esteatohepatite não-alcoólica (NASH) é uma doença progressiva do fígado e uma forma mais grave de não-alcoólica esteatose hepática (NAFLD), que está se tornando cada vez mais prevalente devido à sua associação com a obesidade e diabetes tipo 2. Não há nenhum terapias aprovadas para DHGNA/NASH, ou biomarcadores aprovados facilmente avaliar a progressão da doença. NASH é diagnosticada histologicamente avaliando a inflamação, excesso de lipídios hepático (esteatose), hepatócito Balonismo e fibrose1,2,3,4. Em ensaios clínicos, esses pontos de extremidade são avaliados antes do estudo em uma amostra de fígado coletada através de biópsia e de uma segunda biópsia hepática após um determinado período de tratamento. Assim, a eficácia do agente de teste é avaliado através da mudança na patologia hepática em indivíduos com anteriormente identificado/quantificada (ou seja, biópsia comprovada) NASH que são randomizados para grupos de tratamento. Esses pontos de extremidade histológicos mesmos são frequentemente usados em modelos de roedores avaliação terapêutica de NASH potencial em estudos pré-clínicos, mas apenas no tecido terminal de eutanásia de ratos e, portanto, sem uma compreensão do grau de eficácia na linha de base e uma incapacidade para controlar as diferenças no estado de doença de base entre os grupos de tratamento.
Embora 25% dos adultos com DHGNA se presume ter NASH com base em elevados de aminotransferase sérica, não há nenhum métodos alternativos definitivos para confirmar a NASH que não sejam evidências histológicas4. Métodos não-invasivos, como modalidades radiológicos (ultra-som, tomografia computadorizada e ressonância magnética) têm sido desenvolvidos para detectar a esteatose hepática, mas esses métodos não é possível diagnosticar NASH ou determinar a fase de fibrose. Elastography transiente oferece uma promissora modalidade não-invasiva para medir a rigidez do fígado. Isso tem demonstrado ser precisos em diferenciar os estágios da fibrose. No entanto, a precisão diminui com maior índice de massa corporal (IMC) e tecido adiposo. 5 isto é problemático devido a maioria dos pacientes de NASH ser obeso. Além da relevância clínica dessas abordagens, nenhuma dessas modalidades são utilizadas em estudos pré-clínicos.
Para superar isso, o grupo de pesquisa do Dr. Jonathan Roth foram os primeiros a implementar um procedimento de biópsia hepática no modelo do rato de amilina. o NASH (idiota) de NASH6,7,8. Eles descreveram a validade preditiva da biópsia com grau de doença de NASH e correlação com doenças metabólicas. Aqui descrevemos detalhadamente o procedimento de biópsia hepática no modelo idiota de NASH e sua utilidade em um ambiente terapêutico, especificamente para avaliar a eficácia do Liraglutida.
Protocol
Todos os experimentos in vivo foram realizados em conformidade com as políticas do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da MedImmune, LLC e de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, 8ª edição (2011). Camundongos machos C57BL6J foram colocados sobre a dieta de alto teor de gordura, frutose, colesterol idiota. Biópsias hepáticas foram realizadas após 26 semanas na dieta, 3 semanas antes do início da intervenção farmacológica.
1. obter e preparar materiais cirúrgicos
- Instrumentos esterilizados de autoclave (pequena tesoura ponta, pinça de ponta romba, cotonetes, gaze praças, clipes grampos/ferida de 7 mm e grampeador).
- Obter, esterilizados para suturas para fechamento da parede abdominal (5-0 sutura absorvível revestido com uma agulha de PC-1 é adequado), esponja de gelatina absorvível comprimida (para ser usado para fins hemostáticos), cortinas estéril e luvas, esfoliante à base de iodo e 70% etanol cotonetes/lenços , a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg dose por rato; pelo menos 3 doses por rato) e pomada de olho cirúrgico/lubrificação.
- Prepare o vaporizador para anestesia de enchimento com isoflurano.
- Ligue um esterilizador do grânulo, para esterilização de instrumentos rápida entre animais.
- Transformar-se em uma superfície de aquecimento ou uma almofada de aquecimento, deve ser usado para recuperação de animais.
- Don equipamento de protecção adequado (EPI) (ou seja, máscara, vestido, touca de cabelo, luvas).
2. pré-cirúrgicas preparações
- Posicione o mouse na câmara de indução com fluxo de isoflurano 2-3% para o efeito.
- Observe o mouse até que a falta de resposta ao dedo do pé-pitada confirma que a profundidade da anestesia é apropriada.
- Use uma pomada para evitar a secura da córnea associada com anestesia.
- Administrar por via subcutânea o buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg).
- Raspe o local cirúrgico imediatamente caudal do processo xifoide, usando a tosquia.
- Mova o mouse para uma superfície aquecida (37 ° C), após raspar o local cirúrgico. Coloque o mouse de forma a superfície dorsal está para baixo, e o abdômen é exposto. O nariz do mouse Insira o cone de nariz de anestesia para facilitar a entrega de isoflurano em uma taxa de fluxo de 2-3%.
- Limpe o local cirúrgico com cotonetes alternadas de betadine e etanol a 70% (3 vezes).
- Abrir e configurar instrumentos cirúrgicos estéreis.
- Remover as luvas e substitua luvas cirúrgicas estéreis.
3. ato cirúrgico
- Faça uma incisão longitudinal com tesouras (1-2 cm), imediatamente caudais do processo xifoide e ligeiramente para o lado esquerdo do mouse, na pele abdominal.
- Blunt dissecar a pele longe da parede abdominal usando fórceps e a tesoura.
- Expor a parede abdominal e visualizar o fígado por baixo.
- Usando uma marca de lâmina de bisturi estéril uma incisão (1-2 cm) na parede abdominal para visualizar o lóbulo esquerdo-lateral (LLL) do fígado.
Nota: Ser consistente ao longo do estudo. Outros lobos comuns de interesse são o lóbulo direito-medial (RML) e lóbulo esquerdo-medial (LML). - Exteriorizar o lóbulo lateral esquerdo através da incisão.
- Opção 1: Massagem levemente o abdômen com o polegar e o dedo indicador para expor uma parte da LLL.
- Opção 2: Coloque um cotonete estéril debaixo da LLL para gentilmente puxe uma porção para ser exposto.
- Coloque um pedaço de embebida em soro fisiológico estéril de gaze por baixo da LLL para permitir uma superfície estéril e hidratada para o fígado mentir sobre.
- Corte um pedaço de em forma de cunha do fígado da LLL, fazendo dois cortes com tesoura esterilizada.
Nota: O tamanho aproximado do fígado sendo removido é 30-50 mg (< 5% do fígado em ratos). - Corte um pedaço de esponja de gelatina semelhante em tamanho à parte cunha de fígado. Insira a esponja na parte cortada do fígado usando fórceps.
- Mantenha a esponja no lugar com fórceps e manter contato com o fígado até que adere à superfície do fígado e hemostasia é alcançada.
- Lugar a peça de biópsia do fígado para o tubo apropriado (ou seja, congelado, fixador, etc.).
- Coloque delicadamente o fígado volta na cavidade abdominal, tendo o cuidado de não perturbar a esponja.
- Sutura da parede abdominal com sutura absorvível revestido 5-0, começando e terminando com um nó quadrado completo.
- Feche a pele com 7mm ferida clipes (ou grampos).
- Inspecione os ferida clipes para garantir que haja um fechamento completo da incisão.
- Retire o cone de nariz o mouse e colocar em uma gaiola limpa sobre uma superfície aquecida.
- Lugar de instrumentos no esterilizador de grânulo entre ratos para 10-20 s. Certifique-se de todos os materiais orgânicos devem ser retirados os instrumentos utilizando soro fisiológico estéril, antes da colocação no esterilizador de grânulo de vidro.
4. no pós-operatório cuidados
- Monitore o mouse até que recupere a consciência e pode em si mesmo.
- Gravar observações no pós-operatório e verificar os ratos diariamente para deiscência.
- Administrar uma dose de segunda e terceira de buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via subcutânea 6-8 h pós-cirurgia e novamente 24 h pós-cirurgia.
- Remova os clipes de ferida no pós-operatório de 7-10 dias.
Representative Results
Para este estudo, os ratos foram randomizados para os grupos de tratamento (n = 12/grupo) com base no estudo preliminar biópsia fibrose grau e peso corporal. Os ratos foram administrados veículo (PBS) ou liraglutide (5 nmol/kg) para 42 dias (veículo ou composto administrado 10ml/kg por via subcutânea, a dose-volume, uma vez por dia). Dia 42, os ratos foram sacrificados (através da inalação de CO2 ) no estado não jejuou e no fígado extirpado e processados para histologia.
Biópsia e terminal fígado peças foram fixadas durante a noite em formol a 10%, então parafina incorporados e transformados por hematoxilina e eosina e Sirius vermelho, coloração através de de protocolos padrão9. Cortes de tecido foram avaliados de forma cega por um patologista de acordo com o sistema de Pontuação de atividade de NASH (NAS)1,2. NAS reflecte o grau de doença para esteatose hepática, inflamação lobular e hepatócito Balonismo (cada parâmetro atribuído uma pontuação de 0-3) como descrito anteriormente,9.
Incorporando uma biópsia do fígado para a concepção deste estudo possibilitou uma pontuação de fibrose (pre-biópsia) da linha de base. Um total de 118 ratos foram biopsiados após 26 semanas de dieta de NASH e esteatose e fibrose hepática foram marcados para cada biópsia (Figura 1). Estes ratos 118, 49 ratos foram excluídos com base na baixa fibrose fibrose elevada (Pontuação de 0), (Pontuação dos 4, que exibiu a patologia anormal) e perda de peso anormal ou cicatrização de feridas. Esses critérios de exclusão permitidos para 69 ratos deixaram a atribuir em grupos de estudo e procurar melhorias no fenótipo de NASH após o tratamento (Figura 1).
Os ratos foram tratados com o veículo ou o liraglutide de agonista GLP-1R (5 nmol/kg) por 6 semanas. No grupo tratados com veículo, 1 mouse exposta fibrose piorou e 4 ratos mostrou piorou Pontuação NAS (Figura 2A-B). Tratamento de Liraglutida foi associado com uma melhoria geral da fibrose (Figura 2), com 17% de melhorar o grupo de tratamento e 83% restantes inalterado. Da mesma forma, o tratamento com Liraglutida melhorou o global NAS partitura (Figura 2D), com 66% do grupo tendo melhorado NAS Pontuação e 33% permaneceu inalterado.
Além disso, o tratamento com Liraglutida melhorou a inflamação, com 75% do grupo, ter uma baixa pontuação de inflamação e 25% permaneceu inalterado (Figura 3B). Tratamento de veículo agravou-se a inflamação, com 17% do grupo, tendo uma maior pontuação de inflamação e 83% permanecido inalterado (Figura 3A). Esteatose marcando permaneceu inalterada em relação ao fim da linha de base do estudo em ambos os veículos e liraglutide-tratados com grupos (Figura 3A, B). Pré-vs pós-biópsia comparações para ratos individuais na inflamação e parâmetros de Balonismo também são mostrados (Figura 3-F).
Figura 1: pre-screening fibrose de biópsia hepática e pontuação NAS . (A) representação de todos os 118 ratos que foram projectados para fibrose, através de biópsia do fígado. (B e C) mostram a fibrose de linha de base e pontuação NAS, respectivamente, depois de ratos elegíveis foram classificados em grupos de estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fibrose e NAS marcar, biópsia pré e pós-intervenção. Análise de respondente por cento para o veículo (A, C) ou tratada liraglutide (B, D) ratos, medido da biópsia hepática da linha de base para acabar de amostra de estudo fígado para fase de fibrose (A, B) e NAS (C, D). Para cada grupo, a mudança do estudo preliminar para pós-estudo biópsia é indicada por uma linha. Os pontos em cada etapa de pontuação é ligeiramente deslocado para permitir uma separação visual dos animais, este é somente para fins de visualização e não reflecte nenhuma diferença no placar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: esteatose hepática, inflamação e balonismo, biópsia pré e pós-intervenção. Análise de respondente por cento para o veículo (A, C, E) ou tratada liraglutide (B, D, F) ratos, medido da biópsia hepática da linha de base para acabar de amostra de estudo fígado para esteatose marcar (A, B), inflamação (C, D) e Balonismo (E, F). Para cada grupo, a mudança do estudo preliminar para pós-estudo biópsia é indicada por uma linha. Os pontos em cada etapa de pontuação é ligeiramente deslocado para permitir uma separação visual dos animais, este é somente para fins de visualização e não reflecte nenhuma diferença no placar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui descrevemos detalhadamente o procedimento de biópsia do fígado de rato primeiro descrito por Clapper et al10e exemplificam sua utilidade em um modelo do rato de NASH, semelhante ao anterior relatórios6,9. O procedimento de biópsia do fígado é uma ferramenta valiosa para avaliar o fenótipo NASH pré e pós-tratamento, em uma maneira similar àquela realizada em ensaios clínicos terapêuticos. A biópsia permite a comparação direta para cada disciplina, ou seja, que os ratos mesmos podem ser usados para ambos os pontos de tempo. Podemos também demonstrar seu potencial translacional. Em um ensaio clínico em indivíduos de NASH biópsia comprovada, liraglutide suscitou uma taxa de resposta de 39% (pacientes com melhoria) NAS, Considerando que, em nosso estudo, observamos uma taxa de resposta de 66% para melhoria NAS. Além disso, 26% dos pacientes tiveram Pontuação melhorada fibrose com 9% de agravamento, contra 14% e 36% no braço placebo, respectivamente11. Em nosso estudo, observamos uma taxa de 17% melhora com tratamento de Liraglutida. Essas comparações destacam o poder de biópsia hepática de linha de base e confirmam o entendimento translacional potencial, pelo menos para esta classe de terapêutica.
É fundamental para colher um pedaço grande o suficiente de tecido do fígado durante o procedimento de biópsia para analisar corretamente as características histológicas, mas também não muito grande de um pedaço do fígado de comprometer a função do fígado. Observamos uma taxa de mortalidade zero com esta cirurgia, e os animais apareceram totalmente recuperados dentro de 1 dia com a retomada do comportamento normal de comer. Assim, o tempo entre a biópsia e a iniciação do estudo intervenção é não limitado pela recuperação animal mas provável do tempo de processamento da amostra, análise e posterior randomização.
Utilizando o procedimento de biópsia do fígado como um método de confirmação da fibrose antes intervenção ajudou a reduzir a variabilidade em nosso estudo, permitindo-nos excluir ratos que não desenvolveu totalmente algum grau de fibrose hepática em consequência da dieta de indução idiota NASH. Além disso, é reforçada a nossa capacidade de compreender melhor o impacto de possíveis intervenções de NASH, melhorando, ao contrário de ter apenas uma amostra de fígado terminal e o escore de NASH. Até novas técnicas não-invasivas são mais exploradas e amplamente aceito, a biópsia do fígado é a única comprovada maneira de determinar a NASH.
Disclosures
S.O. e C.R. são atuais empregados e/ou acionistas da MedImmune/AstraZeneca. JLT era um empregado e acionista da MedImmune/AstraZeneca no momento que esses experimentos foram conduzidos.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão a assistência de Sally Lee e Holly Koelkebeck pela especialização em processamento de tecido e imuno-histoquímica. Os autores também agradecer Donna Goldsteen e a equipe de recursos de animais de laboratório (MedImmune, Gaithersburg, MD) para sua assistência com procedimentos técnicos e criação de animais e cuidados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
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