Summary
간 생 검 임상 설정에서 무알코올 steatohepatitis (steatosis, 염증, 열기구, hepatocyte 및 섬유 증)의 단계를 평가 하는 데 사용 됩니다. 여기, 우리는 평가 방식으로 더 많은 치료제의 임상 시험 정렬 있도록 조직학 분석을 위해 사용 될 수 있는 쥐에 지속 가능 간 생 검을 보여 줍니다.
Abstract
무알코올 steatohepatitis (NASH)의 치료에 대 한 치료를 평가 하는 임상 시험 관련 기준 및 연구 간 생 검, 그리고 질병 끝점, 종종 개선, 각 치료 팔의 %로 반영에 있는 개선의 평가의 끝 악화 또는 변하지 않게 남아 있었다. 상 상속 내 쉬 요법에 대 한 전통적인 전 임상 설치류 연구 종종 모르고 간 질환/내 쉬 존재 같이 쉽게 측정 가능한 끝점에 치료 그룹 randomizing 대신 치료 개입의 시작의 수준에 의해 제한 됩니다. 몸 무게, 신진 대사 상태 또는 유사한. 여기, 다이어트 유발 된 내 쉬 마우스 모델에서 섬유 증을 전시 하지 않는 마우스를 제외 처리 그룹 사이 유사한 섬유 증과 동물 동등 하 게 배포 하 고 초기 간 질환의 평가 대 한 간 생 검 기술을 설명 합니다. 이 수준은 다음 vivo에서 약리 효과 대 한 진정한 이해에 대 한 터미널, 사후 개입 수준 비교 될 수 있다 따라서 더 정확 하 게 임상 시험 디자인 전략을 반영 하 고. 마우스는 제대로 취 하 고 살 균 조건을 사용 하 여 수술에 대 한 준비. 작은 절 개는 복 부 상단에 고 간 왼쪽된 측면 엽 노출. 간의 수술로 제거 하 고 비슷한 크기의 조각을 흡수 젤라틴의 어떤 출혈을 멈추게 하는 그 자리에 들어가게 된다. 마우스는 수술 봉합 하 고 붙인 폐쇄 하 고 1 일 이내 다시 정상으로 회복 됩니다. 전체 프로세스는 마우스 마다 5-10 분 걸립니다. 여기 우리는 글 루카 곤 같은 펩 티 드-1 (GLP-1) 수용 체 주 작동 근 liraglutide 쥐에 내 쉬 끝점에의 영향을 평가 하기 위해 사전 연구 생을 활용 하 여이 절차의 유틸리티를 예증.
Introduction
무알코올 steatohepatitis (NASH) 진보적인 간 질병, 그리고 무 알콜 지방 간 질병 (NAFLD), 비만과 2 형 당뇨병의 그것의 협회 때문에 점점 유행 되 고 있는의 더 심각한 형태 이다. NAFLD/NASH, 또는 승인 된 생체 쉽게 질병의 진행을 평가에 대 한 승인된 없는 요법이 있다. 내 쉬 진단 조직학 염증, 평가 하 여 간 지질 (steatosis), 열기구, hepatocyte 및 섬유 증1,2,,34를 초과. 임상 시험에서 이러한 끝점 간 샘플 수집, 생 검을 통해 두 번째 간 생 검에서 일정 치료 기간 후에 연구 전에 평가 됩니다. 따라서, 테스트 에이전트의 효율성 평가 과목에 간 병리학에서 변화를 통해 이전 식별 계량 (즉, 생 검-입증 된) 치료 그룹에 무작위로 내 쉬. 이 같은 더 끝점은 잠재적인 내 쉬 치료제 전 임상 연구, 하지만 안락사 쥐에서 그리고 이렇게 효능 기준선 및 무 능력의 정도 대 한 이해 없이 터미널 조직에만 평가 하는 설치류 모델에서 자주 사용 제어 하려면 초기 질병 상태 치료 그룹 간의 차이 대 한.
NAFLD와 성인의 25% 상승된 한 혈 청 aminotransferase 레벨에 따라 내 쉬를 추정은, 비록 조직학 증거4이외의 내 쉬를 확인 없습니다 대체 확실 한 방법이 있다. 비 침 투 적인 방법, 방사선 modalities (초음파, 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 영상) 등 간 steatosis 감지 하도록 개발 되었습니다 하지만 그 방법을 내 쉬를 진단 하거나 섬유 증의 결정 수 없습니다. 일시적인 elastography는 유망한 비-침략 적 형식 간 강성을 측정 하기 위한 제공 합니다. 그것은 차별화 섬유 증 단계에서 정확 하 게 표시 되었습니다. 그러나, 정확도 더 높은 몸 질량 색인 (BMI)와 지방 조직 감소합니다. 5 이것은 NASH 환자 비만의 대다수 때문에 문제 이다. 이러한 방법의 임상 관련성 넘어 이러한 형식은 전 임상 연구에 활용 됩니다.
이 극복 하기 위해 닥터 조나단 로스의 연구 그룹 내 쉬6,,78의 Amylin 내 쉬 (AMLN) 마우스 모델에서 간 생 검 절차를 구현 하는 첫번째 이었다. 그들은 내 쉬 질병의 학위와 함께 생 검 및 대사 질환의 예측 타당성을 설명합니다. 내 쉬의 AMLN 모델에서 간 생 검 절차 및 치료 설정에서 특히 liraglutide의 효능을 평가 하기 위해 그 유틸리티 여기 우리가 자세히 설명 합니다.
Protocol
모든 생체 조건 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) MedImmune, LLC의와 가이드와의 정책에 따라 관리 및 실험 동물의 사용, 8 판 (2011)에 대 한 실시 했다. 남성 C57BL6J 마우스는 고 지방, 고과 당, 높은 콜레스테롤 AMLN 다이어트에 배치 했다. 간 생 검 약리학 내정간섭의 시작에 앞서 3 주 다이어트, 26 주 후 수행 했다.
1. 고 수술 재료 준비
- 오토 클레이 브 멸 균 악기 (작은 지적 팁이 위, 무딘 팁 집게, 면봉, 거 즈 사각형, 7mm 스테이플/상처 클립과 스테이플러).
- 취득, 복 벽 (PC 1 바늘으로 5-0 코팅된 흡수 봉합 적당 하다), (hemostatic 목적을 위해 사용 될)을 압축 하는 흡수 젤라틴 스폰지, 무 균 커튼 및 장갑, 요오드 기반 스크럽과 70% 에탄올 면봉/물티슈를 폐쇄 살 균 봉합 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg 복용량 당 마우스, 마우스 당 적어도 3 복용량) 및 외과 눈 연 고/윤 활.
- 마 취 기화 isoflurane 함께 작성 하 여 준비.
- 동물 사이의 빠른 악기 살 균을 위해 비드 소독 기를 켭니다.
- 지구 온난화 표면 또는 동물 복구에 사용할 난방 패드를 켭니다.
- 돈 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (즉, 마스크, 가운, 머리 모자, 장갑).
2. 미리 수술 준비
- 효과 2-3 %isoflurane 흐름 유도 챔버에 마우스를 놓습니다.
- 발가락-핀치에 응답의 부족은 마 취의 깊이 적절 한 확인 될 때까지 마우스를 관찰 합니다.
- 눈 연 고를 사용 하 여 마 취와 관련 된 각 막의 건조를 방지 하기 위해.
- 피하 buprenorphine를 관리 (0.05-0.1 mg/kg).
- 즉시 동물 클리퍼 스를 사용 하 여 칼 프로세스의 꼬리 수술 부위의 면도.
- 수술 부위의 면도 후 온수 표면 (37 ° C)에 마우스를 이동 합니다. 등 쪽 표면 아래로, 그리고 복 부 노출 되도록 하는 방식에 마우스를 놓습니다. 2-3%의 유량에서 isoflurane에의 납품을 촉진 하기 위하여 마 취 코 콘에는 마우스의 코를 삽입 합니다.
- 깨끗 한 betadine과 70% 에탄올의 교체 면봉으로 수술 사이트 (3 회).
- 연 무 균 수술 도구를 설정 합니다.
- 장갑 제거 하 고 살 균 외과 장갑 바꿉니다.
3. 수술
- 가 위 (1-2 cm), 칼 과정의 고 복 부 피부에 마우스의 왼쪽에 약간 즉시 꼬리 세로 절 개를 확인 합니다.
- 무뚝뚝한 집게와가 위를 사용 하 여 복 벽에서 피부를 해 부.
- 복 부 벽 고 밑 간 시각화.
- 사용 하 여 살 균 메스 블레이드 만들기 (1-2 cm) 절 개 복 부 벽에 왼쪽 측면 엽 (LLL) 간의 시각화.
참고: 연구에 걸쳐 일관 된 수 있습니다. 관심의 다른 일반적인 돌출부는 오른쪽 중간 엽 (RML) 왼쪽 중간 엽 (내 인생을 사랑). - 절 개를 통해 왼쪽된 측면 엽 외부화
- 옵션 1: 가볍게 엄지 및 집게 손가락은 LLL의 일부를 노출 하는 복 부 마사지.
- 옵션 2: 장소 일부 꺼내 부드럽게 LLL 아래 멸 균 면봉 노출 될 수 있습니다.
- 아래에 거짓말을 간 대 한 살 균과 수산화 표면 수 있도록 LLL 거 즈의 멸 균 식 염 수에 젖은 조각을 넣으십시오.
- 살 균가 위 두 컷 하 여는 LLL에서 간 모양 조각을 잘라.
참고: 간 제거의 대략적인 크기는 30-50 밀리 그램 (< 쥐에 간 5%). - 간 쐐기 조각에 젤라틴 스폰지의 조각 크기에 비슷한 잘라. 집게를 사용 하 여 간의 컷된 부분에 스폰지를 삽입 합니다.
- 집게와 장소에 스폰지를 보유 하 고 그것의 표면에 고착 하 고 hemostasis 달성 때까지 간 접촉을 유지.
- 적절 한 관으로 간 생 검 조각 장소 (즉, 동결, 정착 액, 등.).
- 부드럽게 하도록 스펀지를 방해 하지 않는 복 부 구멍으로 다시 간 장소.
- 5-0 코팅된 흡수 봉합 시작 하 고 끝나는 전체 스퀘어 매듭으로 복 벽을 봉합.
- 7mm 상처 클립 (또는 스테이플) 피부를 닫습니다.
- 절 개의 완전 한 폐쇄는 되도록 상처 클립을 검사 합니다.
- 코 콘에서 마우스를 제거 하 고 온수 표면에 깨끗 한 케이지를 넣습니다.
- 장소 악기 구슬 소독 기 쥐 사이 10-20 미에 대 한 모든 유기 물질을 제거 하 여 유리 구슬 소독 기에 배치 하기 전에 멸 균 식 염 수를 사용 하 여 계기에서 한다 다는 것을 확인 하십시오.
4. 수술 치료
- 의식 회복 자체를 마우스 오른쪽 수 있습니다 때까지 마우스를 모니터링 합니다.
- 수술 후 관찰 기록 하 고 매일 dehiscence에 대 한 마우스를 확인.
- Buprenorphine의 두 번째 및 세 번째 복용량 관리 (0.05-0.1 mg/kg) 피하 6-8 시간 수술 후 및 다시 수술 24 시간 후.
- 수술 후 7-10 일에 상처 클립을 제거 합니다.
Representative Results
이 연구를 위해 쥐 치료 그룹에 무작위로 했다 (n = 12/그룹) 사전 연구 생 증 등급 및 몸 무게에 따라. 마우스 관리 되었다 차량 (PBS) 또는 liraglutide (nmol/5kg) 42 일 (차량 또는 복합 관리 10 mL/kg 피하, 일단 매일 볼륨을 복용량). 42 일에 쥐 비 금식 상태, 간 excised 및 조직학에 대 한 처리 (CO2 흡입)를 통해 안락사 되었다.
생 검 및 터미널 간 조각 하룻밤 10% 포 르 말린, 고정 했다 다음 hematoxylin 및 오신, 시리우스 레드, 표준 프로토콜9통해 얼룩 처리 되 고 포함 된 파라핀. 조직 섹션 내 쉬 활동 점수 (NAS) 시스템1,2에 따르면 병리학 자에 의해 멀게 방식에서 평가 됐다. NAS는 앞에서 설명한9steatosis, lobular 염증 및 hepatocyte 열기구 (0-3의 점수를 주어진 각 매개)에 대 한 질병의 정도 반영 합니다.
간 생 검을 허용 기준 (전 생 검) 섬유 증 점수에 대 한이 연구의 디자인으로 통합. 총 118 쥐 내 쉬 다이어트의 26 주 후 biopsied 되었고 간 섬유 증 및 steatosis 각 생 검 (그림 1)에 대 한 득점 했다. 이러한 118 마우스의 49 마우스는 낮은 섬유 증에 따라 제외 된 (0의 점수), 높은 섬유 증 (비정상적인 병 리 전시 4의 점수), 비정상적인 체중 감소 및 상처 치유. 69 마우스에 대 한 허용이 제외 기준 연구 그룹으로 할당 하 고 내 쉬 형 개선 치료 (그림 1) 보살을 왼쪽.
마우스는 6 주 동안 차량 또는 GLP 1R 주 작동 근 liraglutide (5 nmol/kg)로 치료 했다. 차량 처리 그룹에서 1 마우스 전시 악화 섬유 증 및 4 쥐 악화 NAS 점수를 보였다 (그림 2A-B). Liraglutide 치료 증 (그림 2C)의 전반적인 개선, 치료 그룹 개선의 17%와 변경 되지 않은 나머지 83% 연관 되었다. 마찬가지로, liraglutide 치료 향상 전반적인 NAS (그림 2D) 점수, 그룹의 66% 변동 NAS 점수와 33% 향상 된 데.
또한, liraglutide 치료 염증 개선, 그룹의 75%와 낮은 염증 점수 및 25% 변경된 (그림 3B)을 남아 있었다. 차량 치료 악화 염증, 더 높은 염증 점수를 갖는 그룹의 17%와 83% 변하지 않게 남아 있었다 (그림 3A). 베이스 라인 끝에서 변하지 않게 남아 있었다 steatosis 점수 모두 차량 및 liraglutide 처리 그룹 (그림 3A, B)에 연구. 염증 및 열기구 매개 변수 개별 마우스도 (그림 3C-F)을 표시 됩니다에 대 한 후 생 검 비교 대 사전.
그림 1: 사전 심사 간 생 검 섬유 증 및 NAS 점수 . (A) 섬유 증, 간 생 검을 통해에 대 한 검사 했다 모든 118 쥐의 표현입니다. (B 와 C) 표시 초기 섬유 증 및 NAS 점수, 각각, 후 자격이 쥐 연구 그룹으로 분류 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 섬유 증 및 NAS 점수, 사전 생 검 및 사후 개입. 차량 (A, C) 또는 liraglutide 처리 (B, D) 마우스, 기준선 간 생 검 끝에서 측정에 대 한 백분율 응답자 분석 연구 간 섬유 증 단계 (A, B)에 대 한 샘플의 및 NAS (C, D). 각 그룹에 대 한 사전 연구에서 변경 후 연구 생 검 선으로 표시 됩니다. 각 단계 마다 득점 포인트는 약간 동물의 시각적 분리 수 있도록 이동,이 시각화 용도로 점수에 어떤 차이 반영 하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Steatosis, 염증 및 열기구, 전 생 검 및 사후 개입. 차량 (A, C, E) 또는 liraglutide 처리 (B, D, F) 쥐, 기준선 간 생 검 끝에서 측정에 대 한 백분율 응답자 분석 연구 간 샘플 steatosis의 점수 (A, B), (C, D) 염증과 열기구 (E, F). 각 그룹에 대 한 사전 연구에서 변경 후 연구 생 검 선으로 표시 됩니다. 각 단계 마다 득점 포인트는 약간 동물의 시각적 분리 수 있도록 이동,이 시각화 용도로 점수에 어떤 차이 반영 하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 우리 마우스 간 생 검 절차 처음 추 외10, 설명 하 고 내 쉬, 이전 보고서6,9와 비슷한의 마우스 모델에서 자사의 유틸리티를 예증 하는 세부 사항에 설명 합니다. 간 생 검 절차는 내 쉬 형 사전 및 임상 치료에서 비슷한 방식으로 후 처리를 평가 하기 위한 유용한 도구입니다. 생 검 수 있습니다 직접 비교를 위해 각 주제에 대 한 즉, 두 시간 포인트 같은 마우스를 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 변환의 가능성을 보여 줍니다. 생 검에서 입증 된 내 쉬 과목의 임상 실험에서 liraglutide 우리의 연구에서 우리는 향상 된 NAS에 대 한 66% 응답 속도 관찰 하는 반면 NAS에 39% 응답 속도 개선 (환자)을 elicited. 또한, 환자의 26% 악화, 대 14%와 36% 위약 팔에 각각119% 향상 된 섬유 증 점수를 했다. 우리의 연구에서 liraglutide 치료 17% 향상 속도 관찰합니다. 이러한 비교 기준 간 생 검의 힘을 강조 하 고 치료의이 클래스에 대 한 잠재적인 변환 이해를 적어도 확인 합니다.
그것은 제대로 조직학 특징을 분석 하는 생 검 절차 중 간 조직의 충분히 큰 조각 수확 중요 하지만 또한 너무 큰 간 간 기능 손상에 한 조각의. 이 수술 사망률 0 관찰 그리고 정상적인 식사 행동의 재개와 함께 1 일 이내 동물 완벽 하 게 복구 된. 따라서, 생 검 및 개입 연구의 시작 사이의 시간 동물 복구 하지 제한 이지만 샘플 처리, 분석, 및 후속 랜덤 시간에 의해 가능성이.
개입 마우스를 완벽 하 게 유도 하는 AMLN 내 쉬 다이어트의 결과로 간 섬유 증의 어떤 정도 개발 하지 않았다를 제외를 우리의 연구에 있는 가변성을 감소 도움이 되기 전에 섬유 증의 확인의 방법으로 간 생 검 절차를 활용 합니다. 또한, 터미널 간 샘플 및 내 쉬 점수 반대만 가능한 내 쉬 개선 개입의 영향을 이해 하는 우리의 기능 향상. 때까지 새 비-침략 적 기술을 더 탐험 널리 허용, 간 생 검은 유일한 내 쉬를 결정 하는 방법 입증 된.
Disclosures
S.O. C.R. 있으며 현재 직원 및 주주 MedImmune/아 스 트 라의. JLT은 직원 주주 MedImmune/아 스 트 라의 당시이 실험을 실시 했다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 조직 처리 및 immunohistochemistry 전문성 샐리 리와 홀리 Koelkebeck의 도움을 인정합니다. 저자는 또한 기술 절차 및 축산 및 그들의 지원에 대 한도 나 Goldsteen 및 실험실 동물 자원 직원 (MedImmune, 버스, 메릴랜드) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
