Summary
I kliniska inställningar används en leverbiopsi för att bedöma stadier av alkoholfria steatohepatitis (steatos, inflammation, hepatocyte ballongflygning och fibros). Här, illustrera vi en survivable leverbiopsi hos möss som kan användas för histologiska analyser möjliggör bedömning terapeutiska medel på ett sätt som är mer i linje med kliniska prövningar.
Abstract
Kliniska bedömning av terapier för behandling av alkoholfria steatohepatitis (NASH) innebära en baslinje och slutet av studie levern biopsi, och bedömning av förbättring av sjukdomen slutpunkter, ofta återspeglas som en procent av varje behandlingsgrupp som förbättrats, förvärrats eller var oförändrade. Traditionella prekliniska gnagare studier för förmodad NASH terapier begränsas ofta av att inte veta nivån på lever sjukdom/NASH närvarande i början av terapeutisk intervention, i stället för randomisera behandlingsgrupperna på enkelt mätbara slutpunkter såsom kroppsvikt, metaboliska status eller liknande. Här beskriver vi en leverbiopsi teknik i en kost-inducerad NASH musmodell, för bedömning av baslinjen lever sjukdom för att utesluta möss som inte uppvisar fibros och lika fördela djur med liknande fibros mellan behandlingsgrupperna. Dessa nivåer kan sedan jämföras med de terminal, efter intervention nivåerna för en sannare förståelse för Invivo farmakologiska effekter och därmed mer speglar exakt kliniska försöksutformning strategier. Musen är ordentligt sövda och förberedda för den operation som använder sterila förhållanden. Ett litet snitt görs i övre delen av buken och den vänstra laterala LOB i levern utsätts. En kil av levern avlägsnas kirurgiskt, och en liknande storlek bit av absorberbara gelatin sätts i dess ställe att stoppa eventuella blödningar. Musen är kirurgiskt sys och häftade stängd och kommer att återställa tillbaka till det normala inom 1 dag. Hela processen tar 5-10 min per mus. Här exemplifiera vi nyttan av detta förfarande genom att utnyttja förstudie biopsi för att bedöma effekterna av den glukagonlik peptid-1 (GLP-1) receptoragonist liraglutid på NASH slutpunkter i möss.
Introduction
Alkoholfria steatohepatitis (NASH) är en progressiv leversjukdom, och en mer allvarlig form av alkoholfria fettlever (NAFLD), som blir allt vanligare på grund av dess förening med fetma och typ 2 diabetes. Det finns inga godkända behandlingar för NAFLD/NASH, eller godkända biomarkörer för att lätt bedöma sjukdomsförloppet. NASH diagnostiseras histologiskt genom att bedöma inflammation, överskott nedsatt lipid (leversteatos), hepatocyte ballongflygning och fibros1,2,3,4. I kliniska prövningar bedöms dessa slutpunkter innan studien i ett lever prov samlas in via biopsi, och från en andra leverbiopsi efter en viss behandling. Således, effektiviteten av en test-agent bedöms via förändring i levern patologin hos patienter med tidigare identifierade/kvantifieras (dvs biopsi-bevisat) NASH som är randomiserade till behandlingsgrupper. Dessa samma histologisk slutpunkter används ofta i gnagare modeller att bedöma potentiella NASH therapeutics i prekliniska studier, men endast i terminal vävnad från euthanized möss och thus utan en förståelse av graden av effekt vid studiestart och en oförmåga att kontrollera för skillnader i baslinjen sjukdomstillstånd mellan behandlingsgrupperna.
Även om 25% av vuxna med NAFLD antas ha NASH baserat på förhöjda serum ALAT-nivåer, finns det inga alternativa slutgiltiga metoder för att bekräfta NASH än histologiska bevis4. Noninvasiva metoder, såsom radiologiska modaliteter (ultraljud, datortomografi och magnetisk resonanstomografi) har utvecklats för att påvisa leversteatos, men dessa metoder kan inte diagnostisera NASH eller avgöra scenen av fibros. Transient elastografi erbjuder en lovande noninvasiv modalitet för att mäta leverns stelhet. Det har visat sig vara korrekt i differentiera fibros stadier. Dock minskar noggrannheten med högre kroppsmasseindex (BMI) och fettvävnad. 5 detta är problematiskt på grund av majoriteten av NASH patienterna att vara överviktiga. Utöver den kliniska relevansen av dessa metoder, är ingen av dessa metoder utnyttjas i prekliniska studier.
För att övervinna detta, var gruppen av Dr Jonathan Roth de första att genomföra en leverbiopsi förfarande musmodell Amylin NASH (AMLN) av NASH6,7,8. De beskrev prediktiva giltigheten av biopsi med grad av NASH sjukdom och korrelation med metabola sjukdomar. Här beskriver vi i detalj förfarandet leverbiopsi i AMLN modellen av NASH och dess nytta i en terapeutisk miljö, särskilt för att bedöma effekten av liraglutid.
Protocol
Alla in vivo experiment genomfördes i enlighet med politiken som de institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av MedImmune, LLC och i samförstånd med guiden för skötsel och användning av försöksdjur, 8: e upplagan (2011). C57BL6J hanmöss placerades på hög fetthalt, hög-fruktos, hög kolesterolhalt AMLN kosten. Leverbiopsier utfördes efter 26 veckor på diet, 3 veckor före start av farmakologisk intervention.
1. skaffa och förbereda kirurgiska material
- Autoklav sterila instrument (liten-spets sax, pincett trubbig spets, bomullspinnar, gasväv torg, 7 mm klammer/såret klipp och häftapparat).
- Erhålla, sterila suture för utgående bukväggen (5-0 belagda resorberbar sutur med en PC-1 nål är lämplig), resorberbara komprimerade gelatinsvamp (att användas för hemostatiska ändamål), sterila draperier och handskar, jod-baserade scrub och 70% etanol kompresser/våtservetter , buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg dos per mus; minst 3 doser per mus) och kirurgisk öga salva/smörjning.
- Förbereda spridare för anestesi av fyllning med isofluran.
- Slå på en pärla sterilizer, för snabb instrument sterilisering mellan djur.
- Slå på en värmande ytan eller värmedyna, skall användas för djur återhämtning.
- Don lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) (dvs, mask, klänning, hår bonnet, handskar).
2. före kirurgiska preparat
- Placera musen i induktion kammaren med 2-3% isofluran flöde till effekt.
- Iaktta musen tills bristen på svar till tå-nypa bekräftar djup anestesi är lämpliga.
- Använd en ögonsalva för att förebygga torrhet i hornhinnan som är associerad med narkos.
- Administrerar buprenorfin subkutant (0,05-0,1 mg/kg).
- Raka operationsområdet omedelbart stjärtfenan i xiphoid process, använder animaliskt clippers.
- Flytta musen till en uppvärmd yta (37 ° C) efter rakning operationsområdet. Placera musen på ett sådant sätt så att den dorsala ytan är nedåt, och buken är utsatt. Sätt näsan av musen i anestesi näsan konen att underlätta leverans av isofluran med en flödeshastighet av 2-3%.
- Rengöra den kirurgiska platsen med alternerande kompresser betadine och 70% etanol (3 gånger).
- Öppna och Ställ in sterila kirurgiska instrument.
- Ta bort handskar och ersätta med sterila operationshandskar.
3. kirurgiska ingrepp
- Gör ett längsgående snitt med sax (1-2 cm), omedelbart kaudala xiphoid processen och något till musens vänstra sida, i bukhuden.
- Blunt dissekera huden från bukväggen med pincett och sax.
- Utsätta den buk-väggen och visualisera lever under.
- Med en steril skalpell blade gör ett snitt (1-2 cm) i bukväggen för att visualisera den vänster-laterala loben (LLL) av levern.
Obs: Vara konsekventa under hela studien. Andra vanliga lober av intresse är rätt-mediala lob (RML) och vänster-mediala lob (älskar mitt liv). - Yttre den vänstra laterala loben genom snittet.
- Alternativ 1: Massera lätt buk med tummen och pekfingret för att avslöja en del av LLL.
- Alternativ 2: Placera en steril bomullspinne under den LLL försiktigt dra en del ut för att exponeras.
- Placera en steril saltlösning-indränkt bit gasbinda under den LLL att tillåta en steril och återfuktad yta för levern att ligga på.
- Skär en kilformad bit av levern från LLL genom två nedskärningar med steril sax.
Obs: Den ungefärliga storleken på levern tas bort är 30-50 mg (< 5% av levern i möss). - Skär en bit av gelatinsvamp liknande storlek till kil bit av levern. Sätt svampen i den skurna delen av levern med hjälp av tången.
- Håller svampen på plats med pincett och hålla kontakt med levern tills den fäster på ytan av levern och hemostas uppnås.
- Plats leverbiopsi lappa i lämpliga röret frysta (dvs, fixativ, etc.).
- Placera försiktigt levern tillbaka i bukhålan, noga med att inte störa svampen.
- Sutur bukväggen med 5-0 belagda resorberbar sutur börjar och slutar med en full square knut.
- Nära huden med 7 mm såret klipp (eller häftklamrar).
- Inspektera såret klippen för att säkerställa att det finns en fullständig nedläggning av snittet.
- Ta bort musen från näsan konen och lägges i en ren bur på en uppvärmd yta.
- Plats instrumenten i pärla autoklaven mellan möss för 10-20 s. Kontrollera alla organiska material bör tas bort från de instrument som med hjälp av steril koksaltlösning före utsläppande i glas pärla sterilizer.
4. postoperativ vård
- Övervaka musen tills det återfår medvetandet och kan rätt själv.
- Registrera postoperativa observationer och kontrollera möss dagligen för sårruptur.
- Administrera en andra och tredje dosen av Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) subkutant 6-8 h efter operationen och igen 24 h efter operationen.
- Ta bort såret klipp på 7-10 dagar efter operationen.
Representative Results
För denna studie randomiserades möss till behandlingsgrupperna (n = 12/grupp) baserat på förstudien biopsi fibros grade och kroppsvikt. Möss administrerades fordon (PBS) eller liraglutid (5 nmol/kg) i 42 dagar (fordonet eller sammansatta administrerade 10 mL/kg dos volym, subkutant, en gång dagligen). Dag 42, var möss euthanized (via CO2 inandning) i icke-fastande tillstånd och levern censurerade och bearbetas för histologi.
Biopsi och terminal levern bitar åtgärdades under natten i 10% formalin, paraffin sedan inbäddade och bearbetade för hematoxylin och eosin och Sirius röd, färgning via standard protokoll9. Vävnadssnitt bedömdes i en blindad mode av en patolog enligt NASH aktivitet Scoring (NAS) system1,,2. NAS återspeglar graden av sjukdom för steatos, Lobulär inflammation och hepatocyte ballooning (varje parameter ges en poäng på 0-3) som tidigare beskrivits9.
Införliva en leverbiopsi i utformningen av denna studie som tillåts för en baslinje (före biopsi) fibros poäng. Totalt 118 möss var biopsier efter 26 veckor av NASH kost och leverfibros och steatos var gjorda för varje biopsi (figur 1). Av dessa 118 möss, 49 möss exkluderades utifrån låg fibros (0 poäng), hög fibros (poäng 4, som uppvisade avvikande patologi), och onormal viktminskning eller sårläkning. Dessa uteslutningskriterier som tillåts för 69 möss kvar att tilldela studiegrupper, och leta efter förbättringar i NASH fenotyp efter behandling (figur 1).
Möss behandlades med fordon eller den GLP-1R agonist liraglutid (5 nmol/kg) i 6 veckor. I gruppen behandlade med fordon 1 mus utställda förvärrad fibros och 4 möss visade försämrade NAS poäng (Figur 2A-B). Liraglutid behandling var förenad med en övergripande förbättring av fibros (figur 2 c), med 17% av den behandling grupp att förbättra och 83% oförändrad. Likaså liraglutid behandling förbättrade övergripande NAS poäng (figur 2D), med 66% i gruppen med förbättrad NAS poäng och 33% oförändrad.
Dessutom liraglutid behandling förbättrade inflammation, med 75% av gruppen att ha en lägre inflammation poäng och 25% förblev oförändrade (figur 3B). Fordon behandling försämrade inflammation, med 17% i gruppen med högre inflammation poäng och 83% oförändrad (figur 3A). Steatos scoring oförändrad från baseline till slutet av studien i båda fordon - och liraglutid-behandlade grupper (figur 3A, B). Före vs efter biopsi jämförelser för enskilda möss på inflammation och ballongflygning parametrar visas också (figur 3 c-F).
Figur 1: pre screening leverbiopsi fibros och NAS poäng . (A) framställning av alla 118 möss som screenades för fibros, via leverbiopsi. (B och C) Visa baslinjen fibros och NAS poäng, respektive, efter stödberättigande möss var sorterade i studiegrupper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fibros och NAS poäng, före biopsi och efter intervention. Procent responder analys för fordonet (A, C) eller behandlades med liraglutid (B, D) möss, mätt från baslinjen levern biopsi till slutet av studien lever prov för fibros Stadium (A, B) och NAS (C, D). För varje grupp anges förändringen från förstudien till efter studien biopsi av en linje. Punkterna på varje scoring steg skiftas något för att tillåta visuell separation av djuren, detta är endast för visualisering och återspeglar inte någon skillnad i poäng. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: steatos, inflammation och ballongflygning, före biopsi och efter intervention. Procent responder analys för fordonet (A, C, E) eller behandlades med liraglutid (B, D, F) möss, mätt från baslinjen levern biopsi till slutet av studien lever prov för steatos poäng (A, B), inflammation (C, D) och ballongflygning (E, F). För varje grupp anges förändringen från förstudien till efter studien biopsi av en linje. Punkterna på varje scoring steg skiftas något för att tillåta visuell separation av djuren, detta är endast för visualisering och återspeglar inte någon skillnad i poäng. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här beskriver vi i detalj mus leverbiopsi förfarande först beskrivs av Clapper et al.10och exemplifiera sin verktyg i en musmodell av NASH, liknar den tidigare rapporter6,9. Förfarandet för leverbiopsi är ett värdefullt verktyg för bedömning av NASH fenotyp före och efter behandling, på ett sätt som liknar den som utförs i terapeutiska kliniska. Biopsi kan för direkt jämförelse för varje ämne, dvs samma möss kan användas för båda tidpunkter. Vi visar också dess translationell potential. I en klinisk prövning hos biopsi-bevisade NASH framkallade liraglutid en 39% svarsfrekvens (patienter med förbättring) i NAS, medan i vår studie observerade vi en 66% responsfrekvensen för förbättrad NAS. Dessutom hade 26% av patienterna förbättrad fibros poäng med 9% försämring, jämfört med 14% och 36% i placebo-armen, respektive11. I vår studie har observerat vi en 17% förbättring kurs med liraglutid behandling. Dessa jämförelser lyfta fram kraften i baslinjen levern biopsi och bekräfta potentiella translationell förståelse, åtminstone för denna klass av terapeutiska.
Det är kritiskt att skörda en tillräckligt stor bit levervävnad under förfarandet biopsi för att korrekt analysera de histologiska funktionerna, men också inte alltför stor av en bit av levern att äventyra funktionen av levern. Vi observerade en noll-dödlighet med denna operation, och djuren verkade fullt återställda inom 1 dag med ett återupptagande av normal ätbeteende. Tiden mellan biopsi och inledandet av interventionsstudie är alltså inte begränsad av animaliskt återhämtning men sannolikt av tiden för provet bearbetning, analys och efterföljande randomisering.
Utnyttja det leverbiopsi förfarandet som en metod för bekräftelse av fibros innan intervention bidragit till att minska variationen i vår studie, att tillåta oss att utesluta möss som inte fullt utvecklat viss grad av leverfibros till följd av AMLN NASH-inducerande kosten. Dessutom förstärkt det vår förmåga att bättre förstå effekterna av eventuella NASH-förbättra interventioner, i motsats till att bara ha en terminal lever prov och NASH poäng. Tills nya icke-invasiva tekniker är utforskas ytterligare och allmänt accepterat, leverbiopsi är den enda beprövat sätt att bestämma NASH.
Disclosures
S.O. och C.R. är nuvarande anställda och/eller aktieägare i MedImmune/AstraZeneca. JLT var anställd och aktieägare i MedImmune/AstraZeneca då dessa experiment utfördes.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt hjälp av Sally Lee och Holly Koelkebeck för expertis i vävnad bearbetning och immunohistokemi. Författarna också tacka Donna Goldsteen och djur Laboratorieresurser personalen (MedImmune, Gaithersburg, MD) för deras hjälp med tekniska förfaranden och djurhållning och skötsel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
