Summary
הגדרות קליני, ביופסיה של הכבד משמש כדי להעריך את שלבי steatohepatitis אלכוהוליים (steatosis, דלקת, hepatocyte מבצעים ו פיברוזיס). כאן, אנו ממחישים ביופסיה של הכבד שורדת בעכברים בהם ניתן להשתמש עבור ניתוחים היסטולוגית כדי לאפשר הערכה של סוכני טיפולית באופן יותר מיושר עם ניסויים קליניים.
Abstract
ניסויים קליניים הערכת טיפולים לטיפול steatohepatitis אלכוהוליים (נאש) לערב של הבסיס לבין סוף המחקר הכבד ביופסיה, והערכה של שיפור הקצה המחלה, שיקפה לעתים קרובות כאחוזים של כל זרוע טיפול זה משופר, החמירה. או נשאר ללא שינוי. מסורתי ללימודי טיפולים נאש בשם מכרסמים פרה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי הידיעה הרמה של הכבד המחלה/נאש נוכח בתחילתו של התערבות טיפולית, במקום סידור אקראי של קבוצות הטיפול על הקצה למדידה בקלות כגון משקל הגוף, מצב מטבולית או דומה. כאן, אנו מתארים שיטה ביופסיה של הכבד במודל של דיאטה-induced נאש עכברים, להערכה של מחלה בסיסית כבד כדי לא לכלול עכברים כי לא התערוכה פיברוזיס, לחלק לא פחות חיות עם פיברוזיס דומה בין קבוצות הטיפול. רמות אלה ואז ניתן להשוות את רמות מסוף, התערבות שלאחר להבנה אמיתי של אפקטים תרופתי ויוו, ובכך יותר לשקף באופן מדויק את אסטרטגיות עיצוב הניסיון הקליני. העכבר כראוי מרדימים, שהוכנו עבור ניתוח שימוש בתנאים סטריליים. חתך קטן עשוי בבטן העליונה, לרוחב האונה השמאלית של הכבד הוא חשוף. טריז של הכבד הוא הוסר בניתוח, חתיכה בגודל דומה של ג'לטין שנספג זה את מקומו לעצור דימום. העכבר הוא בניתוח sutured, משודכים סגור, ישחזר לקדמותו תוך יום אחד. התהליך כולו לוקח 5-10 דקות לכל העכבר. כאן אנחנו להדגים את התועלת של הליך זה על-ידי מינוף את הביופסיה מחקר מקדים כדי להעריך את ההשפעה של דמוי גלוקגון פפטיד-1 (GLP-1) קולטן אגוניסט liraglutide על נקודות קצה נאש בעכברים.
Introduction
משקאות לא אלכוהוליים steatohepatitis (נאש) היא מחלת כבד מתקדמת, צורה חמורה יותר של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), זה הופך להיות יותר ויותר נפוץ עקב שיוך השמנת יתר וסוכרת סוג 2. ישנם אין טיפולים שאושרו NAFLD/נאש, או סמנים ביולוגיים שאושרו בקלות להעריך את התקדמות המחלה. נאש מאובחנת בהיסטולוגיה על-ידי הערכת דלקת, עודף שומנים בדם הכבד (steatosis), hepatocyte מבצעים ו-3,2,1,פיברוזיס4. בניסויים קליניים, אלה נקודות הקצה הם העריכו לפני המחקר במדגם הכבד שנאספו באמצעות ביופסיה, ומתוך ביופסיה של הכבד השני לאחר תקופה מסוימת לטיפול. לפיכך, האפקטיביות של הסוכן הבדיקה שקובעת באמצעות שינוי בפתולוגיה הכבד במקצועות עם בעבר זוהו/לכמת (קרי, ביופסיה מוכחת) נאש זה הם אקראי לקבוצות טיפול. אלה נקודות קצה היסטולוגית אותו משמשים לעתים קרובות במודלים מכרסמים, הערכת פוטנציאל הרפוי נאש במחקרים פרה, אבל רק בתוך הרקמה מסוף של עכברים לאללה ובכך ללא הבנה של מידת היעילות-בסיסית וחוסר יכולת כדי לשלוט על ההבדלים במצב מחלה בסיסית בין קבוצות הטיפול.
למרות 25% מהמבוגרים עם NAFLD הם בחזקת יש נאש המבוסס על רמות aminotransferase גבוהות בסרום, קיימות אין סופית שיטות אלטרנטיביות כדי לאשר נאש מלבד עדות היסטולוגית4. פותחו שיטות לא פולשנית, כגון שיטות רדיולוגים (אולטרסאונד, טומוגרפיה ו תהודה מגנטית) כדי לזהות steatosis הכבד, אבל השיטות האלה לא ניתן לאבחן נאש או לקבוע את השלב של פיברוזיס. Elastography ארעי מציע מודאליות פולשני מבטיח למדידת קשיות בכבד. זה הוכח להיות מדויקים המבדילים פיברוזיס בשלבים. עם זאת, הדיוק פוחתת עם גבוה מדד מסת הגוף (BMI), רקמת שומן. 5 זה בעייתי בשל רוב החולים נאש שלהיות מהשמנת יתר. מעבר הרלוונטיות הקלינית של גישות אלה, אף אחד האופנים האלה מנוצלים במחקרים פרה.
כדי להתגבר על זה, קבוצת המחקר של ד ר רוט יונתן היו הראשונים ליישם הליך ביופסיה של הכבד במודל עכבר Amylin נאש (כמו אידי אמין) של נאש-6,-7,-8. הם תיארו את תוקף ניבוי של הביופסיה עם דרגת המחלה נאש, קורלציה עם מחלה מטבולית. כאן נתאר בפירוט את ההליך ביופסיה של הכבד במודל כמו אידי אמין של נאש ואת השירות שלה בסביבה טיפולית, במיוחד כדי להעריך את היעילות של liraglutide.
Protocol
כל הניסויים ויוו נערכו בהתאם למדיניות של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של MedImmune, LLC, מסכים עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, המהדורה השמינית (2011). עכברים C57BL6J זכר הונחו על הדיאטה עתירת שומן, פרוקטוז גבוהה, כולסטרול כמו אידי אמין. ביופסיות כבד בוצעו לאחר 26 שבועות בדיאטה, 3 שבועות לפני תחילת ההתערבות תרופתי.
1. להשיג ולהכין חומרים כירורגי
- אוטוקלב כלי סטרילי (מספריים הצביע-טיפ קטן, מלקחיים קצה קהה, ספוגיות כותנה, גזה ריבועים, 7 מ מ סיכות/פצע קליפים, השדכן).
- להשיג, תפירה סטריליים על סגירת דופן הבטן (5-0 בתפר שנספג מצופה עם מחט PC-1 מתאים), ספוג ג'לטין שנספג דחוס (כדי לשמש למטרות hemostatic), תחבושות חיטוי, כפפות, פילינג המבוסס על יוד ו 70% אתנול מטליות/מגבונים לחים... , הבופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג מינון לכל עכבר; לפחות 3 מנות לכל העכבר), משחה/סיכוך עין כירורגי.
- להכין מכשיר אידוי הרדמה על ידי מילוי עם איזופלוריין.
- הפעל מעקר חרוז, עבור מכשיר מהיר עיקור בין בעלי חיים.
- הפעל את התחממות משטח או כרית החימום, שישמש עבור שחזור בעלי חיים.
- דון המתאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) (קרי, מסיכה, שמלה, שיער בונט, כפפות).
2. בפגישת ההכנות
- הצב את העכבר אל החדר אינדוקציה עם 2-3% איזופלוריין זרימת אפקט.
- להתבונן על העכבר עד חוסר התגובה הבוהן-קמצוץ מאשרת שעומק ההרדמה הוא המתאים.
- השתמש משחה העין כדי למנוע יובש הקרנית הקשורים עם הרדמה.
- לנהל הבופרנורפין subcutaneously (0.05-0.1 mg/kg).
- לגלח באתר כירורגית מיידית סימטרית של הסרעפת, בעזרת קוצץ בעלי חיים.
- להזיז את העכבר על משטח מחוממת (37 מעלות צלזיוס) לאחר גילוח באתר כירורגית. המקום העכבר כך כך המשטח הגבי הוא כלפי מטה, בבטן חשופה. הכנס את האף של העכבר לתוך קונוס האף בהרדמה כדי להקל על מסירת איזופלוריין בספיקה של 2-3%.
- נקה באתר כירורגית עם מטליות מתחלפים betadine ו-70% אתנול (3 פעמים).
- לפתוח ולהגדיר כלי כירורגי סטרילי.
- להסיר כפפות ולהחליף עם כפפות כירורגי סטרילי.
3. ניתוח
- עושים חתך האורך עם מספריים (1-2 ס מ), מיד סימטרית של הסרעפת, מעט על הצד השמאלי של העכבר, בעור בטן.
- בלאנט לנתח את העור קיר הבטן בעזרת מלקחיים ומספריים.
- לחשוף את דופן הבטן והמחש הכבד מתחת.
- באמצעות יצירת בלייד האזמל סטרילי חתך (1-2 ס מ) בקיר הבטן כדי להמחיש את האונה השמאלית-לרוחב (LLL) של הכבד.
הערה: להיות עקבי לאורך כל תקופת המחקר. אונות נפוצים אחרים של עניין הם האונה הימנית-המדיאלי (RML) ו האונה השמאלית-המדיאלי (לאהוב את. החיים שלי). - להחצין האונה הלטראלי השמאלי דרך החתך.
- אפשרות 1: עיסוי בקלילות את הבטן באגודל ובאצבע לחשוף חלק LLL.
- אפשרות 2: במקום ספוגית כותנה סטרילי מתחת LLL למשוך בעדינות את חלקו החוצה להיחשף.
- מניחים חתיכת ספוג תמיסת מלח סטרילית של גזה מתחת LLL כדי לאפשר משטח רטוב וסטרילי, קורס מתקדם על הכבד-לשכב על.
- חותכים פיסת בצורת טריז הכבד של LLL על-ידי הפיכת שני חתכים עם מספריים סטרילי.
הערה: הגודל המשוער של הכבד הוסר הוא 30-50 מ ג (< 5% של הכבד בעכברים). - לחתוך חתיכה של ג'לטין ספוג דומים בגודלם על היצירה טריז של הכבד. הכנס את הספוג החלק לחתוך הכבד באמצעות מלקחיים.
- להחזיק את הספוג במקום עם מלקחיים, לשמור על קשר עם הכבד עד שיעמדו השטח של הכבד hemostasis מושגת.
- המקום החלק הכבד ביופסיה לתוך הצינור המתאים (קרי קפוא, מקבע, וכו ').
- הנח הכבד בעדינות בחזרה לתוך חלל הבטן, מקפיד לא להפריע הספוג.
- תפר לקיר הבטן 5-0 בתפר שנספג מצופה מתחילה ומסתיימת קשר מרובע מלא.
- סגור את העור עם 7 מ מ הפצע קליפים (או סיכות).
- בדוק את הקליפים הפצע כדי להבטיח כי יש סגר מוחלט של החתך.
- הסר את העכבר קונוס האף ולמקם לתוך כלוב נקי על משטח מחוממת.
- מכשירי המקום לתוך חרוז מעקר בין עכברים ס' 10-20 ודא שכל חומר אורגני יש להסיר מן הכלים באמצעות מלח סטרילית לפני הצבת המעקר חרוז זכוכית.
4. לאחר הניתוח טיפול
- לפקח על העכבר עד שהיא תשוב להכרה ישר עצמה.
- להקליט תצפיות שלאחר הניתוח וסמנו העכברים מדי יום עבור התבקעות.
- לנהל מנה שנייה ושלישית של הבופרנורפין (0.05-0.1 mg/kg) subcutaneously 6-8 שעות לאחר הניתוח, ושוב 24 שעות לאחר הניתוח.
- הסר את הפצע קליפים ב 7-10 ימים לאחר הניתוח.
Representative Results
במחקר זה, עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצות טיפול (n = 12/קבוצה) על בסיס מחקר טרום ביופסיה פיברוזיס כיתה וגוף משקל. עכברים נוהלו הרכב (PBS) או liraglutide (5 nmol/kg) 42 ימים (הרכב או תרכובת מנוהל 10 מ"ל/ק"ג מינון נפח, subcutaneously, פעם ביום). ביום 42, עכברים היו מורדמים (באמצעות אינהלציה2 CO) שאינם צמתי המדינה, ואת הכבד טוחנות ומעובדים עבור היסטולוגיה.
הכבד ביופסיה ומסוף חתיכות תוקנו במשך הלילה בפורמלין 10%, ואז שעוות פרפין מוטבע ומעובדים עבור hematoxylin אאוזין ואת סיריוס אדום, צביעת באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים9. מקטעי רקמת היו העריכו באופן עיוור על ידי פתולוג לפי הניקוד פעילות נאש (NAS) מערכת1,2. NAS משקף את מידת המחלה steatosis, דלקת lobular, hepatocyte מבצעים (כל פרמטר מקבלים ציון 0-3) כפי שתואר לעיל9.
שילוב ביופסיה של הכבד, בתכנון של מחקר זה מותרת עבור ניקוד פיברוזיס (טרום ביופסיה) בסיסית. סך של עכברים 118 ביופסיה לאחר 26 שבועות של דיאטה נאש, פיברוזיס בכבד ו steatosis היו הבקיע עבור כל ביופסיה (איור 1). של אלו עכברים 118, עכברים 49 שוחררנו בהתבסס על פיברוזיס נמוכה פיברוזיס גבוהה (ציון של 0), (ציון של 4, אשר הציג פתולוגיה חריגה), ואת אובדן משקל נורמלי או ריפוי הפצע. קריטריונים אלה אי-הכללה של המותר עבור עכברים 69 עזב להקצות לקבוצות לימוד ולחפש שיפורים פנוטיפ נאש לאחר הטיפול (איור 1).
עכברים טופלו עם הרכב או את liraglutide אגוניסט GLP-1R (5 nmol/kg) במשך 6 שבועות. בקבוצה שטופלו הרכב, 1 עכבר פיברוזיס החמיר הייצוגיים ועכברים 4 הראה החמיר את הציון NAS (איור 2 א-ב). טיפול Liraglutide היה קשור עם שיפור כללי של פיברוזיס (איור 2C), עם 17% לשפר הטיפול קבוצה 83% נותרת ללא שינוי. באופן דומה, liraglutide טיפול משופר NAS הכוללת ניקוד (איור דו-ממדי), עם 66% בקבוצה שיש שיפור הציון NAS ו-33% נשאר ללא שינוי.
בנוסף, טיפול liraglutide משופרת דלקת, עם 75% בקבוצת נתקל של דלקת ניקוד נמוך ו 25% נותר ללא שינוי (איור 3B). טיפול רכב החמיר דלקת, עם 17% בקבוצה יש ניקוד גבוה יותר של דלקת, 83% נותר ללא שינוי (איור 3 א). Steatosis הבקיע נשאר ללא שינוי מקו לסיים את המחקר בשתי הרכב, liraglutide-שטופלו הקבוצות (איור 3 א, ב'). קדם לעומת שלאחר ביופסיה השוואות עבור עכברים בודדים על דלקת ופרמטרים שהתנפח מוצגים גם (איור 3C-F).
איור 1: הקרנת טרום ביופסיה של הכבד פיברוזיס וציון NAS . (א) ייצוג כל עכברים 118 הוקרנו על פיברוזיס, באמצעות ביופסיה של הכבד. (B ו- C) מציגות את בסיסית פיברוזיס ואת הציון NAS, בהתאמה, לאחר עכברים זכאים היו מתמיינים קבוצות לימוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: פיברוזיס ו־ NAS ניקוד, ביופסיה קדם והתערבות פוסט- המגיב אחוז ניתוח של הרכב (א, ג) או מטופלים liraglutide עכברים (B, D), כפי שהיא נמדדת מ בסיסית הכבד ביופסיה כדי לסיים לימודים כבד מדגם בימתי פיברוזיס (A, B) ו־ NAS (C, D). עבור כל קבוצה, השינוי מן המחקר טרום המחקר שלאחר ביופסיה מסומן על ידי קו. הנקודות בכל שלב הניקוד הוא זז מעט כדי לאפשר הפרדה ויזואלית של בעלי החיים, זהו רק למטרות הדמיה והוא אינו משקף הבדל ציון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Steatosis, דלקת, שהתנפח, ביופסיה מראש, שלאחר ההתערבות. המגיב אחוז ניתוח של הרכב (A, C, E) או מטופלים liraglutide עכברים (B, D, F), כפי שהיא נמדדת מ בסיסית הכבד ביופסיה כדי לסיים מדגם המחקר כבד עבור steatosis ניקוד (A, B), דלקת (C, D) ומתנפחת (E, F). עבור כל קבוצה, השינוי מן המחקר טרום המחקר שלאחר ביופסיה מסומן על ידי קו. הנקודות בכל שלב הניקוד הוא זז מעט כדי לאפשר הפרדה ויזואלית של בעלי החיים, זהו רק למטרות הדמיה והוא אינו משקף הבדל ציון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
כאן נתאר בפירוט ההליך ביופסיה בכבד עכבר תחילה מתוארת על ידי זיבה ואח10, להדגים את השירות שלה במודל של עכברים של נאש, הדומה הקודם דוחות6,9. הנוהל ביופסיה של הכבד הוא כלי חשוב להערכת פנוטיפ נאש מראש, שלאחר הטיפול, בצורה דומה לזו שבוצעה בניסויים קליניים טיפולית. הביופסיה מאפשר השוואה ישירה לכל נושא, קרי שהעכברים אותו ניתן להשתמש בשתי נקודות זמן. אנחנו גם להוכיח את פוטנציאל translational שלו. ב ניסוי קליני בנושאים נאש מוכחת ביופסיה, liraglutide elicited קצב תגובה 39% (חולים עם שיפור) ב- NAS, ואילו במחקר שלנו הבחנו שיעור למגיב 66% על NAS משופרת. יתר על כן, 26% מהחולים היה הציון פיברוזיס משופרת עם 9% החמרה, לעומת 14% ו- 36% בזרוע פלצבו, בהתאמה11. במחקר שלנו, הבחנו שיעור 17% שיפור עם טיפול liraglutide. השוואות אלה להדגיש את הכוח של בסיסית הכבד ביופסיה ואשר הבנה translational פוטנציאליים, לפחות עבור מחלקה זו של טיפולי.
זה קריטי כדי לקצור חתיכה גדולה מספיק של רקמת הכבד במהלך ההליך ביופסיה לנתח היטב את התכונות היסטולוגית, אבל גם לא גדול מדי של חתיכת כבד לסכן את תפקוד הכבד. הבחנו אפס-שיעורי התמותה עם הניתוח הזה, החיות הופיע שהחלמת באופן מלא בתוך יום אחד עם חידוש התנהגות אכילה נורמלית. לכן, הזמן בין ביופסיה, חניכה של המחקר התערבות הוא לא מוגבל על-ידי שחזור בעלי חיים אבל כבר נלקח מדגם עיבוד, ניתוח של אקראיות עוקבות.
ניצול הנוהל ביופסיה של הכבד כשיטת אישור של פיברוזיס לפני התערבות עזר להפחית את השתנות במחקר שלנו, המאפשר לנו לא לכלול עכברים זה לחלוטין לא לפתח מידה מסוימת של לייפת בעקבות הדיאטה בתדר נאש כמו אידי אמין. יתר על כן, זה שיפור היכולת שלנו להבין טוב יותר את ההשפעה של אפשרות שיפור נאש התערבות, לעומת רק לאחר דגימת כבד סופנית עם הציון נאש. עד טכניקות פולשני חדשות נוספות חקר, המקובלת, ביופסית הכבד הוא היחיד שהוכח דרך לקבוע נאש.
Disclosures
החב'רה C.R. הם עובדים הנוכחית ו/או בעלי המניות של MedImmune/חברת AstraZeneca. JLT היה העובד ו מניות של MedImmune/חברת AstraZeneca בזמנו שניסויים אלה נערכו.
Acknowledgments
המחברים להכיר בהכרת תודה בסיוע לי סאלי, הולי Koelkebeck עבור המומחיות ברקמה אימונוהיסטוכימיה. המחברים גם תודה דונה Goldsteen ואת צוות מעבדה חיה משאבים (MedImmune, Gaithersburg, MD) לסיוע שלהם עם הליכים טכניים, גידול בעלי חיים וטיפול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
