Summary
En milieu clinique, une biopsie du foie est utilisée pour évaluer les stades de la stéato-hépatite non-alcoolique (stéatose, inflammation, hépatocytes montgolfière et fibrose). Ici, nous montrons une chance de survie biopsie du foie chez les souris qui peut être utilisé pour les analyses histologiques pour permettre l’évaluation des agents thérapeutiques d’une manière plus alignée sur les essais cliniques.
Abstract
Les essais cliniques évaluant les thérapies pour le traitement de stéatohépatite non alcoolique (NASH) impliquent une base et la fin de la biopsie de l’étude du foie et l’évaluation de l’amélioration des points de terminaison de la maladie, souvent traduit comme un pour cent de chaque bras de traitement améliorées, s’est aggravée ou est demeurée inchangée. Traditionnels études précliniques de rongeurs pour thérapies putatifs de NASH sont souvent limités par ne sachant pas au niveau du foie maladie/NASH présent au début de l’intervention thérapeutique, au lieu de la randomisation des groupes de traitement des paramètres facilement mesurables telles que poids corporel, statut métabolique ou similaire. Nous décrivons ici une technique de biopsie du foie dans un modèle de souris de NASH induite par l’alimentation, pour l’évaluation de la maladie du foie de base afin d’exclure les souris qui ne présentent pas de fibrose et de distribuer tout aussi les animaux atteints de fibrose similaire entre les groupes de traitement. Ces niveaux peut alors être comparées aux niveaux terminales, après l’intervention pour une compréhension plus vraie des effets pharmacologiques in vivo et donc plus fidèlement les stratégies de conception d’essais cliniques. La souris est correctement anesthésiée et préparée pour la chirurgie en utilisant des conditions stériles. Une petite incision est pratiquée dans l’abdomen supérieur et le lobe latéral gauche du foie est exposé. Un coin du foie est enlevé chirurgicalement, et un morceau de taille semblable de gélatine résorbable est remis à sa place d’arrêter tout saignement. La souris est chirurgicalement suturée et agrafée fermé et récupérera dans 1 jour retour à la normale. L’ensemble du processus prend 5-10 min par la souris. Ici nous illustrent bien l’utilité de cette procédure en s’appuyant sur la biopsie de l’étude préalable afin d’évaluer l’impact de la liraglutide le glucagon-like peptide-1 (GLP-1) récepteur agoniste sur les points de terminaison NASH chez la souris.
Introduction
Stéatohépatite non non alcoolique (NASH) est une maladie hépatique évolutive et une forme plus sévère de la stéatose hépatique non-alcoolique (SHNA), qui devient de plus en plus répandu en raison de son association avec l’obésité et le diabète de type 2. Il n’y a aucune thérapie approuvée pour la stéatose hépatique non alcoolique/NASH, ou approuvé des biomarqueurs évaluer facilement la progression de la maladie. NASH est diagnostiqué histologiquement en évaluant l’inflammation, excès de lipides hépatiques (stéatose), hépatocytes montgolfière et fibrose1,2,3,4. Dans les essais cliniques, ces points de terminaison sont évalués avant l’étude dans un échantillon du foie prélevé par biopsie et d’une deuxième biopsie du foie après une certaine période de traitement. Ainsi, l’efficacité de l’agent de test est évaluée par le biais de changements dans la pathologie du foie chez les sujets atteints précédemment identifié/quantifié (c'est-à-dire prouvée par biopsie) NASH qui sont randomisés dans les groupes de traitement. Ces mêmes paramètres histologiques sont souvent utilisés dans les modèles de rongeurs évaluer le potentiel thérapeutique de NASH dans les études précliniques, mais uniquement en tissu terminal de souris euthanasiés et donc sans comprendre le degré d’efficacité au départ et une incapacité pour contrôler des différences dans l’état de la maladie de base entre les groupes de traitement.
Bien que 25 % des adultes atteints de stéatose hépatique non alcoolique sont présumés avoir NASH basé sur les niveaux d’aminotransférases sériques élevés, il n’y a pas de méthodes alternatives définitives pour confirmer NASH sauf preuve histologique4. Méthodes non invasives, comme modalités radiologiques (échographie, tomodensitométrie et imagerie par résonance magnétique) ont été développés pour détecter une stéatose hépatique, mais ces méthodes ne peuvent pas diagnostiquer NASH ou déterminer le stade de fibrose. Elastographie transitoire offre une modalité prometteuse non invasif permettant de mesurer la rigidité du foie. Il s’est avéré être précis pour différencier les stades de fibrose. Cependant, la précision diminue avec le plus haut indice de masse corporelle (IMC) et le tissu adipeux. 5 c’est problématique en raison de la majorité des patients de NASH étant obèses. Au-delà de la pertinence clinique de ces approches, aucune de ces modalités sont utilisés dans les études précliniques.
Pour y remédier, le groupe de recherche du Dr Jonathan Roth ont été les premiers à mettre en œuvre une procédure de biopsie hépatique chez la souris amyline NASH (AMLN) de NASH6,7,8. Ils ont décrit la validité prédictive de la biopsie avec un degré de la maladie de NASH et corrélation avec les maladies métaboliques. Ici, nous décrivons en détail la procédure de biopsie hépatique dans le modèle AMLN de NASH et son utilité dans un cadre thérapeutique, plus précisément à évaluer l’efficacité du liraglutide.
Protocol
Toutes les expériences in vivo ont été menées conformément aux politiques de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de MedImmune, LLC et en accord avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, 8e édition (2011). Les souris mâles de C57BL6J ont été placés sur la diète AMLN riche en matières grasses, haute teneur en fructose, riche en cholestérol. Les biopsies hépatiques ont été réalisées après 26 semaines sur l’alimentation, 3 semaines avant le début de l’intervention pharmacologique.
1. obtenir et préparer du matériel chirurgical
- Instruments stériles de autoclave (petit embout fait ciseaux, pinces à pointe émoussée, cotons-tiges, gaze places, clips 7 mm staples/plaie et agrafeuse).
- Obtenir, pour la fermeture de la paroi abdominale (5-0 résorbable couché avec une aiguille de PC-1 convient), éponge de gélatine absorbable compressé (à utiliser à des fins hémostatiques), rideaux stérile et gants, gommage à base d’iode et 70 % éthanol écouvillons/lingettes stériles pour sutures , la buprénorphine (0,05 à 0,1 mg/kg dose par souris ; au moins 3 doses par souris) et la chirurgie ophtalmologique pommade/lubrification.
- Préparer le vaporisateur pour l’anesthésie en le remplissant d’isoflurane.
- Allumez un stérilisateur de perle, pour la stérilisation rapide instrument entre animaux.
- Tourner sur une surface de réchauffement de la planète ou un coussin chauffant, à utiliser pour la récupération de l’animale.
- Don des équipement de protection individuelle (EPI) (masque, robe, chapeau cheveux, gants).
2. pré-chirurgicale préparations
- Placez votre souris dans la chambre d’induction avec 2-3 % isoflurane débit à effet.
- Observer la souris jusqu'à ce que l’absence de réponse à orteil-pincée confirme que la profondeur de l’anesthésie est appropriée.
- Utilisez un onguent pour prévenir le dessèchement de la cornée associée à l’anesthésie.
- Administrer la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,05 à 0,1 mg/kg).
- Raser le site chirurgical immédiatement caudal du processus xiphoïde, à l’aide de tondeuses animaux.
- Déplacez la souris sur une surface chauffée (37 ° C) après le rasage du site chirurgical. Placez votre souris de telle manière afin que la surface dorsale est à la baisse, et l’abdomen est exposée. Insérez le nez de la souris dans le cône de nez d’anesthésie pour faciliter la prestation d’isoflurane à un débit de 2 à 3 %.
- Nettoyer le site chirurgical avec alternance écouvillons de Bétadine et de l’éthanol à 70 % (3 fois).
- Ouvrir et mettre en place des instruments chirurgicaux stériles.
- Retirer les gants et les remplacer par des gants chirurgicaux stériles.
3. intervention chirurgicale
- Faire une incision longitudinale avec des ciseaux (1-2 cm), immédiatement caudale du processus xiphoïde et légèrement à gauche de la souris, dans la peau abdominale.
- Blunt disséquer la peau de la paroi abdominale à l’aide de pinces et ciseaux.
- Exposer la paroi abdominale et visualiser le foie dessous.
- À l’aide d’une marque de lame de bistouri stérile une incision (1 à 2 cm) de la paroi abdominale pour visualiser le lobe latéral gauche (LLL) du foie.
Remarque : Être cohérent tout au long de l’étude. Autres lobes communs d’intérêt sont droit-côté médial lobe (RML) et lobe gauche-medial (LML). - Externaliser le lobe latéral gauche dans l’incision.
- Option 1 : Masser légèrement l’abdomen avec le pouce et l’index pour exposer une partie de la LLL.
- Option 2 : Placer un tampon de coton stérile sous le LLL à Retirez doucement une partie d’être exposés.
- Placez un morceau d’imbibé d’une solution saline stérile de gaze sous la LLL pour permettre une surface stérile et hydratée pour le foie à se coucher sur.
- Couper un morceau triangulaire du foie de la LLL en faisant deux coupes avec des ciseaux stériles.
Remarque : La taille du foie enlevé est d’environ 30-50 mg (< 5 % du foie chez la souris). - Couper un morceau d’éponge de gélatine similaire en taille à la pièce de coin du foie. Insérez l’éponge dans la partie coupée du foie avec une pincette.
- Maintenir l’éponge en place avec une pince et rester en contact avec le foie jusqu'à ce qu’il adhère à la surface du foie et l’hémostase est obtenue.
- Place la pièce de biopsie hépatique dans le tube approprié (c.-à-d. congelée, fixatif, etc..).
- Placez délicatement le foie dans la cavité abdominale, en prenant soin de ne perturbe ne pas l’éponge.
- Suturer la paroi abdominale avec 5-0 enduit résorbable commençant et se terminant par un noeud carré plein.
- Proche de la peau et pinces de plaie 7 mm (ou agrafes).
- Inspecter les clips de la plaie afin de s’assurer qu’il y a une fermeture complète de l’incision.
- Enlever la souris de la coiffe et placer dans une cage propre sur une surface chauffée.
- Place des instruments dans stérilisateur perle entre souris pour 10-20 s. Assurez-vous que toutes les matières organiques devraient être retirés des instruments à l’aide d’une solution saline stérile avant de les placer dans le stérilisateur de perle de verre.
4. soins postopératoires
- Contrôler la souris jusqu'à ce qu’il reprend conscience peut exercer et lui-même.
- Consigner les observations post-opératoire et vérifier les souris par jour pendant la déhiscence.
- Administrer une dose de deuxième et troisième de la buprénorphine (0,05 à 0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée 6 à 8 heures après la chirurgie et encore 24h post chirurgie.
- Retirez les clips de plaie à post-chirurgie de 7 à 10 jours.
Representative Results
Pour cette étude, les souris ont été randomisés pour les groupes de traitement (n = 12/groupe) basé sur la biopsie de la pré-étude fibrose grade et du poids. Des souris ont reçu véhicule (PBS) ou liraglutide (5 nmol/kg) pendant 42 jours (véhicule ou composé 10 mL/kg administrée par voie sous-cutanée, la dose volume, une fois par jour). Jour 42, les souris ont été euthanasiés (par inhalation de CO2 ) dans l’état non à jeun et le foie excisé et transformées pour histologie.
Biopsie et terminal foie morceaux ont été résolus du jour au lendemain dans 10 % de formol, paraffine puis embarqués et transformés à l’hématoxyline et éosine et Sirius, une coloration rouge via des protocoles standard9. Des sections de tissu ont été évaluées de manière aveugle par un pathologiste selon la notation de l’activité du NASH (NAS) système1,2. Le NAS reflète le degré de la maladie de stéatose, inflammation lobulaire et hépatocytes montgolfière (chaque paramètre reçoit un score de 0-3) comme décrit précédemment9.
Intégrant une biopsie du foie dans la conception de cette étude autorisée pour un score de fibrose (biopsie préalable) de base. Un total de 118 souris ont été biopsiés après 26 semaines de diète de NASH et la stéatose et la fibrose du foie ont été évalués pour chaque biopsie (Figure 1). De ces 118 souris, 49 souris étaient exclus basé sur la fibrose faible (score de 0), la fibrose haute (score de 4, qui présentaient une pathologie anormale) et perte de poids anormale ou la cicatrisation des plaies. Ces critères d’exclusion autorisées pour 69 souris gauche pour assigner dans les groupes d’étude et de chercher des améliorations dans le phénotype de NASH après traitement (Figure 1).
Souris ont été traitées avec le véhicule ou le liraglutide d’agoniste GLP-1R (5 nmol/kg) pendant 6 semaines. Dans le groupe traité véhicule, 1 souris exposées de la fibrose s’est aggravée et 4 souris a aggravé score NAS (Figure 2 a et B). Traitement de liraglutide a été associée à une amélioration globale de la fibrose (Figure 2), avec 17 % de l’amélioration de groupe de traitement et les 83 % restant inchangés. De même, liraglutide traitement amélioré le NAS global score (Figure 2D), avec 66 % du groupe ayant une partition NAS et 33 % sont demeurés inchangée.
En outre, le liraglutide traitement amélioré de l’inflammation, avec 75 % du groupe ayant une plus faible score de l’inflammation et 25 % sont restés inchangés (Figure 3 b). Traitement de véhicule aggravé l’inflammation, avec 17 % du groupe ayant un score plus élevé d’inflammation et 83 % sont demeurés inchangés (Figure 3 a). Notation de stéatose est demeuré inchangé par rapport à la fin de l’étude dans les deux les groupes traités liraglutide et véhicule (Figure 3 a, B). Avant vs après biopsies comparaisons pour souris individuels sur l’inflammation et les paramètres de montgolfière sont également indiqués (Figure 3-F).
Figure 1 : une sélection préalable la fibrose de la biopsie hépatique et score NAS . (A) représentation des 118 souris qui ont été examinés pour la fibrose, par l’intermédiaire de la biopsie hépatique. (B et C) montrent la fibrose de la ligne de base et le score NAS, respectivement, après que les souris admissibles ont été classées dans les groupes d’étude. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : score de fibrose et NAS, biopsie avant et après l’intervention. Analyse de répondeur pour cent pour le véhicule (A, C) ou le liraglutide (B, D) chez les souris traitées, telle que mesurée de biopsie hépatique de base à la fin de l’échantillon de l’étude du foie pour le stade de fibrose (A, B) et NAS (C, D). Pour chaque groupe, le changement de la pré-étude à la biopsie après l’étude est indiqué par une ligne. Les points à chaque étape de notation est légèrement décalé pour permettre une séparation visuelle des animaux, c’est uniquement à des fins de visualisation et ne reflète pas une différence dans la partition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : stéatose, inflammation et montgolfière, biopsie avant et après l’intervention. Analyse de répondeur pour cent pour le véhicule (A, C, E) ou le liraglutide (B, D, F) chez les souris traitées, telle que mesurée de biopsie hépatique de base à la fin de l’échantillon de l’étude du foie pour stéatose au score (A, B), une inflammation (C, D) et la montgolfière (E, F). Pour chaque groupe, le changement de la pré-étude à la biopsie après l’étude est indiqué par une ligne. Les points à chaque étape de notation est légèrement décalé pour permettre une séparation visuelle des animaux, c’est uniquement à des fins de visualisation et ne reflète pas une différence dans la partition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ici, nous décrivons en détail la procédure de biopsie du foie de souris tout d’abord décrit par battant Al.10et illustrent son utilité dans un modèle murin de NASH, similaire à la précédente rapports6,9. La procédure de biopsie hépatique est un outil précieux pour évaluer le phénotype NASH avant et après le traitement, d’une manière similaire à celui effectué dans les essais cliniques thérapeutiques. La biopsie permet une comparaison directe pour chaque sujet, c'est-à-dire que les mêmes souris peuvent être utilisées pour les deux points dans le temps. Nous démontrons également son potentiel translationnelle. Dans un essai clinique chez des sujets de NASH biopsie a fait ses preuves, liraglutide a suscité un taux de réponse de 39 % (patients atteints d’amélioration) dans NAS, alors que dans notre étude, nous avons observé un taux de répondeur de 66 % pour NAS améliorée. En outre, 26 % des patients avaient score de fibrose améliorée avec 9 % aggravant, contre 14 % et 36 % dans le groupe placebo, respectivement11. Dans notre étude, nous avons observé un taux de 17 % d’amélioration avec le traitement de liraglutide. Ces comparaisons mettre en évidence la puissance de la biopsie du foie de base et confirment éventuelle compréhension translationnelle, au moins pour sa classe thérapeutique.
Il est essentiel de récolter un assez grand morceau de tissu hépatique au cours de la procédure de biopsie pour analyser correctement les caractéristiques histologiques, mais aussi pas trop grand d’un morceau de foie à compromettre le bon fonctionnement du foie. Nous avons observé un taux de mortalité zéro avec cette chirurgie, et les animaux est apparu entièrement récupérés dans 1 jour avec la reprise des comportements alimentaires normaux. Le temps entre la biopsie et l’initiation de l’étude de l’intervention est donc pas limitée par la récupération de l’animale, mais probablement par le temps nécessaire pour le traitement de l’échantillon, analyse et randomisation ultérieure.
Utilisant la procédure de biopsie hépatique comme une méthode de confirmation de la fibrose avant intervention a contribué à réduire la variabilité dans notre étude, nous permettant d’exclure les souris qui n’ont pas pleinement développé à certain degré de fibrose hépatique à la suite de l’alimentation induisant AMLN NASH. En outre, elle a renforcé notre capacité à mieux comprendre l’impact des interventions de NASH-amélioration possibles, plutôt que d’avoir seulement un échantillon de foie terminal et de la partition de NASH. Jusqu'à ce que les nouvelles techniques non invasives sont approfondir et largement acceptée, la biopsie hépatique est le seul moyen de déterminer NASH éprouvé.
Disclosures
S.O. et C.R. sont employés actuels et/ou actionnaires de MedImmune et d’AstraZeneca. JLT a été employé et actionnaire de MedImmune/AstraZeneca à l’époque, que ces expériences ont été réalisées.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l’assistance de Sally Lee et Holly Koelkebeck pour expertise dans le traitement des tissus et l’immunohistochimie. Les auteurs remercient également Donna Goldsteen et le personnel de laboratoire des ressources animales (MedImmune, Gaithersburg, MD) pour l’assistance dans les procédures techniques et de l’élevage et de soins.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
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