Summary
I kliniske innstillinger brukes en leveren biopsy å vurdere stadier av ikke-alkoholholdige steatohepatitis (Steatose, betennelse, hepatocyte ballongdannelse og fibrose). Her viser vi en overlevingsdyktige leveren biopsi i mus som kan brukes for histologiske analyser aktivere vurdering av terapeutiske agenter på en måte som er mer på linje med kliniske studier.
Abstract
Kliniske studier vurdere terapi for behandling av ikke-alkoholholdige steatohepatitis (NASH) involverer en baseline og slutten av studien leveren biopsi, og vurdering av forbedring i sykdom endepunkter, ofte vises som en prosent av hver behandling arm som forbedret, forverret eller forble uendret. Tradisjonelle prekliniske gnager studier antatte NASH terapi er ofte begrenset av ikke vite hvilket leveren sykdom/NASH tilstede ved starten av terapeutisk intervensjon, i stedet for randomizing behandlingsgrupper på lett målbare endepunkter som kroppsvekt, metabolske status eller lignende. Her beskriver vi en leveren biopsi teknikk i en diett-indusert NASH musemodell for vurdering av planlagte leveren sykdom for å utelukke mus som ikke forårsaker fibrose og like distribuere dyr med lignende fibrose mellom behandlingsgrupper. Disse nivåene kan deretter sammenlignes terminal, post-intervensjon nivåer for en sannere forståelse i vivo farmakologiske effekter og dermed mer gjenspeile nøyaktig klinisk prøve design strategier. Musen er riktig anesthetized og forberedt for operasjonen bruker sterile forhold. En liten snitt lages i øvre magen og den venstre lateral flik av leveren er utsatt. En kile av leveren er kirurgisk fjernet, og en tilsvarende størrelse stykke absorberbare gelatin er satt på plass å stoppe blødninger. Musen er kirurgisk sutured og stiftes stengt og vil komme tilbake til normal innen 1 dag. Hele prosessen tar 5-10 min per musen. Her eksemplifiserer vi nytten av denne prosedyren ved å utnytte den pre-studie biopsy å vurdere virkningen av glukagon som peptid-1 (GLP-1) reseptoren Agonistiske liraglutide på NASH endepunktene i mus.
Introduction
Alkoholfrie steatohepatitis (NASH) er en progressiv leversykdom, og en mer alvorlig form for alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD), som blir stadig mer utbredt på grunn av foreningen sin med fedme og type 2 diabetes. Det er ingen godkjent terapi for NAFLD/NASH eller godkjent biomarkers lett kan vurdere sykdomsprogresjon. NASH er diagnostisert histologisk ved å vurdere betennelse, overflødig hepatic lipid (Steatose), hepatocyte ballongdannelse og fibrose1,2,3,4. I kliniske forsøk vurderes disse endepunktene før studien i en leveren prøve samlet via biopsi, og fra en andre lever biopsi etter en bestemt behandling. Dermed effektiviteten av testen agent er vurdert via endring i leveren patologi i fag med tidligere identifisert/kvantifisert (dvs. biopsi-påvist) NASH som er randomisert til behandlingsgrupper. Disse samme histologic endepunktene brukes ofte på gnager modeller vurdere potensielle NASH therapeutics i preklinisk studier, men bare i terminal vev fra euthanized mus og dermed en forståelse av hvilken effekt på grunnlinjen og en manglende evne til å kontrollere for forskjellene i planlagte sykdom tilstand behandlingsgrupper.
Selv om 25% av voksne med NAFLD antas å ha NASH basert på forhøyet serum aminotransferase, finnes det ingen alternativ definitive metoder å bekrefte NASH enn histologiske bevis4. Noninvasiv metoder, for eksempel radiologiske modaliteter (ultralyd, beregnede tomografi og magnetisk resonans imaging) er utviklet for å oppdage hepatisk Steatose, men disse metodene kan ikke diagnostisere NASH eller finne på scenen på fibrose. Midlertidig elastography tilbyr en lovende ikke-invasiv modalitet for måling av leveren stivhet. Det har vist seg å være nøyaktig i skille fibrose stadier. Men reduseres nøyaktigheten med høyere kroppsmasseindeks (BMI) og fettvev. 5 dette er problematisk på grunn av fleste NASH pasienter er overvektige. Utover disse kliniske relevans benyttes ingen av disse metoder i preklinisk studier.
For å overvinne dette, var forskningsgruppen av Dr. Jonathan Roth først til å implementere en leveren biopsiprosedyre i Amylin NASH (AMLN) musemodell av NASH6,7,8. De beskrevet prediktiv validitet av biopsi med grad av NASH sykdom og sammenheng med metabolsk sykdom. Her beskrive vi i detalj leveren biopsi prosedyren AMLN modellen NASH og dens nytte i en terapeutisk, spesielt for å vurdere effekten av liraglutide.
Protocol
Alle i vivo eksperimentene ble utført i samsvar med politikken til institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av MedImmune LLC og med guiden og bruk av forsøksdyr, 8nde edition (2011). Mannlige C57BL6J mus ble plassert på AMLN høy fett, høy fruktose, høy-kolesterol diett. Leveren biopsier ble utført etter 26 uker på kosthold, 3 uker før starten av farmakologisk intervensjon.
1. få og forberede kirurgisk materialer
- Autoclave sterilt instrumenter (liten spiss tupp saks, butt tupp tang, bomull vattpinner, gasbind ruter, 7 mm stifter/sår klipp og stifter).
- Få, sterile Sutur for å lukke bukveggen (5-0 belagt absorberbare Sutur med en PC-1 nål er egnet), absorberbare gelatin komprimert svamp (som skal brukes for hemostatic formål), sterile gardiner og hansker, jod-baserte scrub og 70% etanol vattpinner/kluter , buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg dose per mus; minst 3 doser hver musen) og kirurgisk øye ointment/smøring.
- Forberede vaporizer anestesi ved fylling med isoflurane.
- Aktivere en perle sterilisere, for rask instrument sterilisering mellom dyr.
- Slå på en oppvarming overflaten eller varmeputen, skal brukes for dyr utvinning.
- Don riktig personlig verneutstyr (PVU) (dvs. maske, kjole, hår lue, hansker).
2. pre-kirurgisk forberedelser
- Plass musen i kammeret induksjon med 2-3% isoflurane flyt til effekt.
- Observere musen til mangelen på respons til tå-klype bekrefter dybden av anestesi er riktig.
- Bruk en øye ointment for å hindre tørrhet i hornhinnen tilknyttet anestesi.
- Administrere buprenorfin subcutaneously (0,05-0,1 mg/kg).
- Barbere kirurgiske området umiddelbart caudal av xiphoid prosessen, med dyr avklipt.
- Flytte musen til en oppvarmet overflate (37 ° C) etter barbering kirurgiske området. Plass musen på en slik måte slik at dorsal overflaten er nedover og magen er utsatt. Nesen av musen inn anestesi nesen kjegle å ved isoflurane på en strømningshastighet på 2-3%.
- Rengjør kirurgiske området med vekslende vattpinner betadine og 70% etanol (3 ganger).
- Åpne og Definer sterilt Kirurgiske instrumenter.
- Fjerne hansker og erstatte med sterilt kirurgiske hansker.
3. kirurgisk prosedyre
- Gjøre en langsgående snitt med saks (1-2 cm), umiddelbart caudal xiphoid prosessen og litt musen er venstre, i abdominal huden.
- Blunt dissekere huden fra bukveggen ved hjelp av tang og saks.
- Utsette bukveggen og visualisere lever under.
- Bruke en steril skalpell bladet lage et snitt (1-2 cm) i bukveggen visualisere venstre-lateral flik (LLL) av leveren.
Merk: Være konsekvent gjennom hele studiet. Andre vanlige lobes av interesse er høyre-mediale lobe (RML) og venstre-mediale flik (elsker meg livet). - Externalize den venstre lateral lobe gjennom snittet.
- Alternativ 1: Lett massasje magen med tommelen og pekefingeren å avdekke en del av LLL.
- Alternativ 2: Plass en steril bomull swab under LLL forsiktig dra en del ut å bli utsatt.
- Plass et sterilt saltvann-gjennomvåt gasbind under LLL tillate en steril og hydrert overflate for leveren til å ligge på.
- Kuttet en kile-formet stykke leveren fra LLL ved å lage to kutt med sterilt saks.
Merk: Omtrentlig leveren fjernes er 30-50 mg (< 5% av leveren i mus). - Cut et stykke gelatin svamp lik i størrelse til kile stykke leveren. Svamp inn kuttet delen av leveren ved hjelp av pinsett.
- Holde svamp på plass med tang og opprettholde kontakt med leveren til det fester seg til overflaten av leveren og hemostasen oppnås.
- Sted leveren biopsi stykke inn i passende røret frossen (i.e., bindemiddel, etc.).
- Forsiktig plassere leveren tilbake i bukhulen, ta vare å ikke forstyrr svamp.
- Sutur bukveggen med 5-0 belagt absorberbare Sutur starter og slutter med en knute på torget.
- Lukk huden med 7 mm såret klipp (eller kramper).
- Inspisere såret klippene for å sikre at det er en komplett nedleggelse av innsnitt.
- Fjerne musen fra nesen kjegle og plasser i en ren bur på en oppvarmet overflate.
- Sted instrumenter i perle sterilisere mellom mus for 10-20 s. Kontroller alle organisk materiale bør fjernes fra instrumenter med bakteriefri saline før plassere i glass bead sterilisatoren.
4. postoperativ pleie
- Dataskjerm musen før den gjenvinner bevisstheten og kan høyre seg.
- Registrere postoperativ observasjoner og sjekk musene daglig for dehiscence.
- Administrere en andre og tredje dose av buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) subcutaneously 6-8 h etter operasjonen og 24 timer etter operasjonen.
- Fjerne såret klipp på 7-10 dager etter operasjonen.
Representative Results
For denne studien, mus ble randomisert til behandlingsgrupper (n = 12/gruppe) basert på pre-studie biopsi fibrose klasse og kropp vekt. Mus ble administrert kjøretøy (PBS) eller liraglutide (5 nmol/kg) for 42 dager (kjøretøy eller sammensatte administrert 10 mL/kg dose volum, subcutaneously, én gang daglig). På dag 42, var mus euthanized (via CO2 innånding) i ikke-fastet staten og leveren forbrukeravgift og behandlet for histology.
Biopsi og terminal leveren stykker ble løst over natten i 10% formalin, deretter parafinen er innebygd og bearbeidet for hematoxylin og eosin og Sirius rød, farging via standardprotokoller9. Vev delene ble vurdert på forblindet måte av en patologen etter NASH aktivitet Scoring (NAS) system1,2. NAS reflekterer graden av sykdom for Steatose, lobular betennelse og hepatocyte ballongdannelse (hver parameter gitt en poengsum på 0-3) som beskrevet tidligere9.
Innlemme en leveren biopsi i utformingen av denne studien tillatt for en planlagt (pre biopsi) fibrose score. Totalt 118 mus var biopsied etter 26 uker med NASH kosthold og leveren fibrosis og Steatose ble scoret for hver biopsi (figur 1). Av 118 mus 49 mus ble utelatt basert på lav fibrose (score på 0), høy fibrose (score på 4, utstilte unormal patologi), og unormale vekttap eller sårtilheling. Disse utelukkelse kriteriene tillatt for 69 mus venstre tilordne til kollokvier og se etter forbedringer i NASH fenotypen etter behandling (figur 1).
Mus ble behandlet med kjøretøy eller GLP-1R Agonistiske liraglutide (5 nmol/kg) for 6 uker. I gruppen kjøretøy-behandlet 1 mus utstilt forverret fibrose og 4 mus viste forverret NAS score (Figur 2A-B). Liraglutide behandling var assosiert med en generell forbedring av fibrose (figur 2C), med 17% av behandling gruppe forbedring og 83% uendret. Tilsvarende liraglutide behandling forbedret generell NAS score (figur 2D), med 66% av gruppen har forbedret NAS score og 33% forble uendret.
I tillegg liraglutide behandling forbedret betennelse, med 75% av gruppen har en lavere betennelse score og 25% forble uendret (figur 3B). Kjøretøy behandling forverret betennelse, med 17% av gruppen har en høyere betennelse score og 83% forble uendret (figur 3A). Steatose scoret forble uendret fra grunnlinjen til slutten av studiet i både kjøretøy - og liraglutide-behandlet grupper (figur 3A, B). Før og etter biopsi sammenligninger for individuelle mus på betennelse og ballongdannelse parametere vises også (Figur 3 c-F).
Figur 1: pre-screening leveren biopsi fibrose og NAS score . (A) representasjon av alle 118 mus som ble vist for fibrosis, via leveren biopsi. (B og C) viser planlagte fibrose og NAS score, henholdsvis etter kvalifisert mus ble sortert i kollokvier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fibrose og NAS score, pre biopsi og etter intervensjon. Prosent responder analyse for kjøretøy (A, C) eller liraglutide-behandlet (B, D) mus, målt fra planlagte leveren biopsi avslutte av studien lever utvalg for fibrosis scenen (A, B) og NAS (C, D). For hver gruppe er endringen fra pre-studie etter studie biopsi angitt med en linje. Punktene på hver scoring trinn er litt forskjøvet for å tillate synlig separasjon av dyrene, dette er bare for visualisering formål og gjenspeiler ikke noen forskjell i score. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Steatose, betennelse og ballongdannelse, pre biopsi og etter intervensjon. Prosent responder analyse for kjøretøy (A, C, E) eller liraglutide-behandlet (B, D, F) mus, målt fra planlagte leveren biopsi avslutte av studien lever utvalg for Steatose poengsummen (A, B), betennelse (C, D) og ballongdannelse (E, F). For hver gruppe er endringen fra pre-studie etter studie biopsi angitt med en linje. Punktene på hver scoring trinn er litt forskjøvet for å tillate synlig separasjon av dyrene, dette er bare for visualisering formål og gjenspeiler ikke noen forskjell i score. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her beskrive vi i detalj musen leveren biopsi prosedyren først beskrevet av Clapper et al.10og eksemplifiserer sin nytteverdi i en musemodell av NASH, ligner på tidligere rapporter6,9. Leveren biopsi prosedyren er et verdifullt verktøy for å vurdere NASH fenotypen før og etter behandling, på samme måte som det utført i kliniske forsøk er terapeutisk. Biopsy tillater direkte sammenligning for hvert emne, dvs det samme mus kan brukes for både tidspunkt. Vi viser også sitt translasjonsforskning potensial. I en klinisk studie i biopsi-bevist NASH fag vakte liraglutide en 39% svarprosent (pasienter med forbedring) i NAS, mens i vår studie observerte vi en 66% svarer sats for forbedret NAS. Videre hadde 26% av pasientene bedre fibrose score med 9% verre, 14% og 36% i placebo armen, henholdsvis11. I vår studie observerte vi en 17% forbedring rate med liraglutide behandling. Disse sammenligningene Merk kraften i planlagte leveren biopsi og bekrefte potensielle translasjonsforskning forståelse, minst for denne typen terapeutisk.
Det er viktig å høste et stort nok stykke leveren vev under biopsi prosedyren skal analysere histologiske funksjonene, men også ikke for stor for en del av leveren til å invadere funksjonen til leveren. Vi observerte en null-dødelighet med denne operasjonen, og dyrene opptrådte fullt gjenopprettede innen 1 dag med gjenopptakelse av spise normalt. Dermed er tiden mellom biopsi og initiering av intervensjon studien begrenset ikke dyr utvinning men sannsynlig ved tiden for eksempel prosessering, analyse og påfølgende tilfeldig.
Utnytte leveren biopsi prosedyren som bekreftelse på fibrose før intervensjon hjalp redusere variasjonen i vår undersøkelse, la oss utelate musene som ikke fullt utvikle noen grad av hepatic fibrose som følge av AMLN NASH-inducing diett. Videre, det forbedret vår evne til å forstå virkningen av mulige NASH-forbedre intervensjoner, i motsetning til bare å ha en terminal leveren utvalg og NASH score. Til nye ikke-invasiv teknikker er ytterligere utforsket og allment akseptert, det lever biopsi er bare god måte å finne NASH.
Disclosures
So og C.R. er gjeldende ansatte og/eller aksjonærene i MedImmune/AstraZeneca. JLT var en ansatt og aksjonær i MedImmune/AstraZeneca ved disse eksperimentene ble utført.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner takknemlig hjelp av Sally Lee og Holly Koelkebeck for kompetanse i vev behandling og immunohistochemistry. Forfatterne takker også Donna Goldsteen og laboratoriet dyr ressurser ansatte (MedImmune, Gaithersburg, MD) for deres hjelp med teknisk prosedyrer og husdyrhold og omsorg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7 mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
- Brunt, E. M., et al. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).
- Brunt, E. M. Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).
- Kleiner, D. E., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).
- Diehl, A. M., Cause Day, C. Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Golabi, P., et al. Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis. Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).
- Roth, N. C., et al. Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy. Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).
- Kristiansen, M. N., et al. Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy. World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).
- Trevaskis, J. L., et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).
- Tolbol, K. S., et al. Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).
- Clapper, J. R., et al. Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).
- Armstrong, M. J., et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).
