Her præsenterer vi en protokol om fastsættelse af en i cellulo BBB (blod-hjerne barrieren)-Minibrain polyester porøse membran kultur indsætte system for at evaluere transport af biomolekyler eller infektiøse agenser på tværs af en menneskelig BBB og deres fysiologisk indvirkning på de nærliggende hjerneceller.
Den tidlig screening af nervesystemet medicin på en relevant og pålidelig i cellulo BBB model for deres udbredelse og deres interaktion med barrieren og hjernen parenkym er stadig et udækket behov. For at udfylde dette hul, designet vi en 2D i cellulo model, BBB-Minibrain, ved at kombinere en polyester porøse membran kultur Indsæt menneskelige BBB model med en Minibrain dannet af en tri-kultur af human hjernecellerne (neuroner, astrocytter og microglial celler). BBB-Minibrain tillod os at teste transport af en neuroprotektive lægemiddelkandidat (f.eks. Neurovita), gennem BBB, at bestemme den specifikke målretning af dette molekyle til neuroner og vise, at egenskaben neuroprotektive af stoffet blev bevaret efter stoffet havde krydset BBB. Vi har også vist, at BBB-Minibrain udgør en interessant model til at opdage passage af viruspartikler i endothelial celler barriere og overvåge infektion af Minibrain af neuroinvasive viruspartikler. BBB-Minibrain er et pålideligt system, let at håndtere for forsker uddannet i celle kultur teknologi og intelligent af hjernen celler fænotyper efter behandling eller fornærmelse. Sådan interesse i cellulo test ville være dobbelt: Introduktion derisking trin tidligt i stof udvikling på den ene side og reducere brugen af dyreforsøg på den anden side.
Hjernen er adskilt fra den systemisk cirkulationen af en ikke-gennemtrængelige struktur, der begrænser udvekslinger mellem hjernen parenkym og blodet, kaldet blod – hjerne barrieren (BBB). For det meste består af cerebral endotelceller, interagerer BBB dynamisk med astrocytter, perivascular mikroglia og neuroner i den nærliggende hjernen parenkym. De tre hovedfunktioner af BBB er oprettelse og vedligeholdelse af Ioniske homøostase for neuronal funktioner, levering af hjernen med næringsstoffer og beskyttelse fra giftige skader eller optagelse af patogener1,2, som bidrager til vedligeholdelse af hjernen homøostase og dens funktioner3. Denne barriere er så effektiv, at kun få stoffer kan krydse BBB4,5. I øjeblikket består de tilgængelige metoder til at forudsige, om et molekyle vil passere BBB og diffuse ind i hjernen af ex vivo undersøgelser om obduktion materiale, billede sporing i hjernen af menneskers frivillige af Mr (magnetisk resonans imaging) eller PET (position emission tomografi) eller farmakodynamik og farmakokinetiske prækliniske undersøgelser i dyr6,7,8. Disse teknikker og modeller har nogle begrænsninger, såsom begrænset løsning af PET og Mr6,8, er vanskeligheden at kvantificere molekyler (dvs. antistof baseret molekyler for eksempel) så dårligt lav følsomhed trænge ind i hjernen7, og for de prækliniske undersøgelser deres høje omkostninger og resort i dyreforsøg.
Det sidste punkt er vigtigt, fordi ifølge 3R’s regler, (, og erstatning af dyreforsøg) de regulerende myndigheder har anmodet om, at forskerne hurtigst muligt udvikle videnskabeligt nøjagtig alternativ til dyr eksperimenter9,10,11,12,13,14,15.
I de sidste årtier, flere in vitro-modeller af BBB er blevet foreslået16,17,18 ved at dyrke på filter membran indsætter endotelceller fra forskellige arter såsom mus, rotte, kvæg og svin. Hvad angår den menneskelige art, bedt den knappe og vanskelige tilgængelighed af primærelementer forskere til at udvikle menneskelige modeller baseret på udødeliggjort hjernen endotelceller eller menneske-afledte stamceller19,20, 21. Disse hindringer er ordentlig in vitro-surrogater af BBB, forudsat at de udtrykker endotel celle markører, tight junction markører, efflux transportvirksomheder, opløste luftfartsselskaber, receptorer, og reagere på i endothelial stimuli 20. Et par BBB modeller bruger filter membran skær belagt med endotelceller og andre celletyper (dvs, astrocytter, neuroner eller pericytes22,23,24) blev analyseret. Målet med disse Co kulturer var at øge BBB fysiske egenskaber ved at drage fordel af udskillelsen af opløselige faktorer af astrocytter/neuroner eller pericytes.
Dog omfatter ingen af disse modeller hjernen parenkym for at studere og forudsige skæbnen af en lægemiddelkandidat, når det har bestået dæmningen. Derfor vores mål var at bygge en i cellulo blod/hjerne interface, BBB-Minibrain, ved at kombinere en BBB model og en kultur af blandet hjerneceller i et enkelt kit. BBB-Minibrain bruger en kultur system bestående af en porøs filter indsat i en brønd i en multiwell celle kultur plade. Filteret er belagt med hCMEC/D3 celler, en menneskehjerne endotel cellelinie, der har vist sig meget pålidelig for BBB drug test25,26,27, til at danne BBB. Minibrain, som er en co differentieret kultur menneskelige neuroner og astrocytter stammer fra NTera/Cl2.D1 celle linje28,29 blandet sammen med menneskelig microglial cellelinje CHME/Cl530 i forhold svarende til den mikroglia vs neuron-astrocytter nøgletal af hjernen31, er dyrket i bunden af pladen godt.
Udover at studere passage af lægemidler på tværs af BBB og deres skæbne i parenkym, kunne blod-hjerne-interface i cellulo model være et effektivt redskab til optagelse af patogener i hjernen (neuroinvasiveness), spredning til hjernen (neurotropisme) og toksicitet (neurovirulence) de kan udøve på hjernen parenkym celler. Neurovirulence og neuroinvasiveness undersøgelser ville drage fordel af udviklingen af en effektiv i cellulo model og være fordelagtigt at erstatte dyremodeller. Ved hjælp af BBB-Minibrain kit32, vi viste neuroinvasive Fænotypen af sjældne viral mutanter, der opsamlet i den franske Neurotropic virusstamme af gul feber Virus (dvs., FNV-YFV33,34) anvendes til at udarbejde en Udgåede levende YFV vaccine og passage af en neuroregenerative og neuroprotektive biomolekyle kaldet Neurovita (omtalt som NV fremover i håndskriftet)35. Fordi NV hverken naturligvis krydser cellemembranen eller BBB, NV var sammenvokset med den variable del (VHH) i en enkelt kæde antistof af Lama, der krydser de biologiske membraner, herunder BBB og fungerer som en celle gennemtrængende molekyle (CPM)36. Egenskaben CPM i VHH synes at afhænge af det isoelektriske punkt og længden af VHH37.
Dette i cellulo test bør gøre det muligt at sortere de molekyler, der potentielt kunne krydse BBB før udførelsen farmakokinetiske og farmakodynamik analyse i dyr, og ideelt set i samme tid at være i stand til at forudsige deres adfærd i de nervøse parenkym. Dette system er biologisk relevante og nemt at oprette og håndtere af professionelle veluddannede i celle kultur26,29,30,38. Sådan interesse i cellulo test ville være dobbelt: at reducere udgifter til prækliniske undersøgelser på den ene side og reducere brugen af dyreforsøg på anden side.
I denne artikel vi vist, hvordan man opbygger en i cellulo blod/hjerne interface, BBB-Minibrain, ved at kombinere en BBB model og en kultur af blandet hjernen cerebral celler (Minibrain) i en enkelt kit. Dette system er biologisk relevante, nemt at oprette og håndtere for eksperimentatorer veluddannede i cellekultur.
Som for alle andre in vitro-model for BBB, ville pålidelige resultater opnås hvis drastisk kontrol af tæthed af barrieren er anvendt. Skær skal testes omhyggeligt, for permea…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af indre tilskud fra Institut Pasteur herunder en skal grant (PTR 435) og af tilskud “Contrat de Soutien à la Recherche” leveret af Sanofi Pasteur til Institut Pasteur. A. da Costa støttedes Sanofi Pasteur grant og Florian Bakoa er modtager af et ph.d.-stipendium leveres af ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Vi står i gæld til Pr Pierre-Olivier Couraud og Dr Florence Miller til nyttige diskussioner.
12 well plates | Corning | 3336 | |
5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
CMC | Calbiochem | 217274 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |