Nous présentons ici un protocole décrivant la mise d’un cellulo en BBB (hémato-encéphalique)-culture polyester membrane poreuse Minibrain insérer le système afin d’évaluer le transport des biomolécules ou des agents infectieux à travers un BBB humain et leur impact physiologique sur les neurones voisins.
Le précoce dépistage de médicaments du système nerveux sur un pertinent et fiable en modèle BBB cellulo pour leur pénétration et leur interaction avec la barrière et le parenchyme du cerveau est encore un besoin non comblé. Pour combler cette lacune, nous avons conçu un 2D dans modèle de cellulo, le BBB-Minibrain, en combinant un polyester membrane poreuse culture insert BBB modèle humain avec un Minibrain formé par une tri-culture de cellules du cerveau humain (les neurones, les astrocytes et les cellules microgliales). Le BBB-Minibrain nous a permis de tester le transport d’un candidat-médicament neuroprotecteur (p. ex., Neurovita), à travers la BHE, afin de déterminer le ciblage spécifique de cette molécule aux neurones et de montrer que la propriété neuroprotectrice de la drogue a été préservée après la drogue avait traversé la BHE. Nous avons également démontré que le BBB-Minibrain constitue un modèle intéressant pour détecter le passage de particules virales à travers la barrière des cellules endothéliales et surveiller l’infection de la Minibrain de particules virales neuro-invasive. Le BBB-Minibrain est un système fiable, facile à manipuler pour les chercheurs formés dans les techniques de culture de cellules et prédictive des phénotypes des cellules cérébrales après traitement ou une insulte. L’intérêt de tels tests cellulo serait double : introduction atténuant les étapes tôt dans le développement de médicaments d’une part et la réduction de l’utilisation d’autre part l’expérimentation animale.
Le cerveau est séparé de la circulation systémique par une structure non perméable qui limite les échanges entre le parenchyme du cerveau et le sang, appelée la barrière sang – encéphalique (BHE). Composée principalement de cellules endothéliales cérébrales, la BHE dynamiquement interagit avec les astrocytes, la microglie périvasculaires et neurones du parenchyme cérébrales voisines. Les trois grandes fonctions de la BHE sont la création et le maintien de l’homéostasie ionique pour les fonctions neuronales, alimentation du cerveau avec les éléments nutritifs et protection contre les lésions toxiques ou l’entrée d’agents pathogènes1,2, qui contribuent à le maintien de l’homéostasie du cerveau et ses fonctions3. Cette barrière est tellement efficace que seulement peu de médicaments peut croiser le BBB4,5. À l’heure actuelle, les méthodes disponibles pour prédire si une molécule passerez la BHE et diffuse dans le cerveau se composent d’ex vivo études sur le suivi d’image matérielle, autopsie du cerveau de volontaires humains par IRM (imagerie par résonance magnétique) ou PET (positon emission tomographie par ordinateur) ou pharmacodynamique et pharmacocinétiques études précliniques dans animaux6,7,8. Ces techniques et les modèles ont des limites, telles que la résolution limitée du PET et la faible sensibilité de MRI6,8, la difficulté de quantifier les molécules (c’est-à-dire, les molécules d’anticorps basé par exemple) que mal pénétrer le cerveau7et pour la préclinique étudie leur coût élevé et la station balnéaire de l’expérimentation animale.
Le dernier point est important parce que, selon des 3R règles, (remplacement, réduction et raffinement d’une expérimentation animale), les administrations réglementaires ont demandé que les chercheurs développent toute urgence alternative scientifiquement exacte à l’animal expérimentation9,10,11,12,13,14,15.
Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles in vitro de BHE ont été proposées16,17,18 en cultivant sur filtre à membrane insère des cellules endothéliales de différentes espèces comme la souris, rat, bovines et porcines. Dans l’espèce humaine est, la disponibilité rare et difficile des cellules primaires a incité les chercheurs à développer des modèles humains, basés sur les cellules endothéliales immortalisées cerveau ou de cellules souches humaines issues de19,20, 21. Ces obstacles sont bon substituts in vitro de BHE à condition qu’ils expriment des marqueurs de cellules endothéliales, marqueurs de jonction serrée, transporteurs d’efflux, solutés transporteurs, récepteurs et répondre aux stimuli endothéliales 20. Quelques modèles BBB à l’aide d’inserts de membrane filtre recouvertes de cellules endothéliales et autres types de cellules (astrocytes, neurones ou péricytes22,23,24) ont été dosés. L’objectif de ces cultures co devait augmenter les caractéristiques physiques de BBB en profitant de la sécrétion de facteurs solubles par les astrocytes/neurones ou des péricytes.
Néanmoins, aucun de ces modèles inclut le parenchyme du cerveau pour étudier et prévoir le destin d’un candidat-médicament une fois qu’il a passé la barrière. Par conséquent, notre objectif était de construire un cellulo en interface hémato-encéphalique, le BBB-Minibrain, en combinant un modèle BBB et une culture de cellules cérébrales mixte dans un seul kit. Le BBB-Minibrain utilise un système de culture consistant en un filtre poreux inséré dans un puits d’une plaque de culture cellulaire multipuits. Le filtre est recouvert de cellules hCMEC/D3, une lignée de cellules endothéliales de cerveau humain qui a fait ses preuves très fiable BBB dépistage des drogues25,26,27, pour former la BHE. Le Minibrain, qui est une culture de coopération différenciée des neurones humains et astrocytes dérivés de la NTera/Cl2.D1 cellulaire ligne28,29 mélangés avec la lignée de cellules microgliales humaines CHME/Cl530 au ratio correspondant à la la microglie vs ratios de neurone-astrocytes du cerveau31, est cultivé dans la partie inférieure de la plaque bien.
Outre l’étude de passage de la drogue à travers la BHE et leur devenir dans le parenchyme, l’interface hémato-encéphalique dans cellulo modèle pourrait être un outil puissant pour traiter l’entrée d’agents pathogènes dans le cerveau (neuroinvasiveness), la dispersion dans le cerveau (neurotropisme) et la toxicité (neurovirulence) ils peuvent exercer sur les cellules de parenchyme de cerveau. Les études de Neurovirulence et neuroinvasiveness auraient bénéficier le développement d’un système efficace en cellulo modèle et est souvent préférable de remplacer les modèles animaux. À l’aide de la trousse de BBB-Minibrain32, nous avons démontré le phénotype neuro de rares mutants viraux accumulées dans la souche de virus neurotrope Français du Virus de la fièvre jaune (c.-à-d., FNV-VFJ33,34) utilisée pour préparer un arrêtée vaccin VFJ vivant et le passage d’une biomolécule neuroprotectrices et neuroregenerative appelé Neurovita (appelée NV dorénavant dans le manuscrit)35. Parce que NV ni naturellement traverse la membrane cellulaire, ni le BBB, NV a été fusionnée avec la partie variable (HHV) d’un anticorps de la seule chaîne de lamas qui traverse les membranes biologiques, y compris la BHE et fonctionne comme une cellule pénétrant la molécule (CPM)36. La propriété CPM de VHH semble dépendre le point isoélectrique et la longueur de la VHH37.
Ceci en cellulo test devrait permettre de trier les molécules qui pourraient potentiellement traverser la BHE avant exécution de pharmacocinétique et de l’analyse pharmacodynamique chez les animaux et, idéalement, dans le même temps d’être en mesure de prédire leur comportement dans le système nerveux parenchyme. Ce système est biologiquement pertinente et facile à installer et à gérer par des professionnels bien formés dans la cellule culture26,29,30,38. L’intérêt de tels tests cellulo serait double : réduire les coûts des essais précliniques d’une part et réduire l’utilisation de l’expérimentation animale en revanche.
Dans cet article nous montre comment construire un cellulo en interface hémato-encéphalique, le BBB-Minibrain, en combinant un modèle BBB et une culture de mélangé cerveau cellules cérébrales (Minibrain) dans un seul kit. Ce système est biologiquement pertinente, facile à installer et à gérer pour les expérimentateurs bien formés en culture cellulaire.
Comme pour tout autre modèle in vitro de BHE, on obtiendrait des résultats fiables si drastique contrôle de l’étanchéité d…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par des subventions internes de l’Institut Pasteur, y compris une subvention Incitative (PTR 435) et par une subvention accordée « Contrat de Soutien à la Recherche » par Sanofi Pasteur à l’Institut Pasteur. A. da Costa a été appuyée par la subvention de Sanofi-Pasteur et Florian Bakoa est récipiendaire d’une bourse de doctorat fournie par l’ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Nous sommes reconnaissants au Pr Pierre-Olivier Couraud et Dr Florence Miller pour discussions utiles.
12 well plates | Corning | 3336 | |
5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
CMC | Calbiochem | 217274 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |