Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל ממשק מוח-דם אנושי ללמוד מכשול המעברים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציה שלהם עם המוח

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ההגדרה של cellulo ב BBB (מחסום הדם-מוח)-Minibrain פוליאסטר נקבובי ממברנה תרבות להוסיף מערכת על מנת להעריך את התחבורה של מולקולות או מדבקים BBB האנושית שלהם ההשפעה הפיזיולוגית על תאי המוח שכנות.

Abstract

בתחילת ההקרנה של תרופות במערכת העצבים רלוונטי, אמין במודל BBB cellulo עבור חדירה שלהם והאינטראקציה שלהם עם מכשול ההפרדה לבין parenchyma המוח עדיין צורך. כדי למלא את הפער הזה, תיכננו 2D במודל cellulo, BBB-Minibrain, על ידי שילוב של פוליאסטר נקבובי ממברנה תרבות הוספה האנושי BBB דגם עם Minibrain נוצר על ידי tri-תרבות של תאי מוח אנושי (הנוירונים, האסטרוציטים ותאים microglial). BBB-Minibrain מאפשרת לנו לבחון את התעבורה של מועמד סמים neuroprotective (למשל, Neurovita), דרך BBB, כדי לקבוע את פילוח מסוים של מולקולה זו את הנוירונים וכדי להראות כי המאפיין neuroprotective של הסם השתמר לאחר התרופה חצה BBB. גם הראו שכל BBB-Minibrain מהווה מודל מעניין כדי לזהות את המעבר של חלקיקי וירוס על פני המכשול תאי אנדותל וכדי לפקח הזיהום של Minibrain על ידי חלקיקי וירוס neuroinvasive. BBB-Minibrain היא מערכת אמין, קל לטפל עבור חוקר מיומן בטכנולוגיית התרבות תאים, חזוי של הפנוטיפים תאי המוח לאחר טיפול או עלבון. הריבית על כך בבדיקת cellulo תהיה כפולה: היכרות עם derisking צעדים מוקדם בהתפתחות סמים מצד אחד וצמצום השימוש מצד ניסויים בבעלי חיים.

Introduction

המוח מופרדת מן הלב מחזור מערכתי במבנה שאינו חדיר המגבילה חילופי בין parenchyma במוח ובדם, קרא את מחסום הדם - מוח (BBB). בעיקר מורכב מוחי תאי אנדותל, BBB באופן דינמי אינטראקציה עם האסטרוציטים, perivascular מיקרוגלייה, הנוירונים parenchyma המוח שכנות. שלושת התפקודים העיקריים של BBB הן היצירה ואת התחזוקה של הומאוסטזיס יוניים פונקציות עצביים, אספקה של המוח עם חומרים מזינים, והגנה מפני פציעות רעילים או ערך של פתוגנים1,2, אשר תורמים שמירה על הומאוסטזיס המוח ו שלה פונקציות3. מחסום זה כל כך יעיל, כי רק מספר תרופות יכולים לחצות את BBB4,5. בזמן הנוכחי, השיטות הזמינות כדי לחזות אם מולקולה לעבור BBB, טשטוש לתוך המוח מורכב ex-vivo מחקרים על הנתיחה גשמי, תמונת מעקב במוח של מתנדבים אנושיים על ידי חיית המחמד (המיקום פליטה או MRI (הדמיית תהודה מגנטית) טומוגרפיה) או pharmacodynamics ומחקרים פרמוקוקינטיים פרה בבעלי חיים-6,-7,-8. מודלים וטכניקות אלה יש מגבלות מסוימות, כגון את הרזולוציה מוגבלת של חיית המחמד ואת הרגישות הנמוכה של6,MRI8, הקושי לכמת מולקולות (קרי, מולקולות הנוגדן מבוסס למשל) זה גרוע לחדור את המוח7, עבור פרה מחקרים שלהם עלות גבוהה, אתר הנופש של הניסויים בחיות.

הנקודה האחרונה חשוב כי, על פי של 3R כללי, (החלפת, הפחתת ועידון של הניסויים בחיות) כמקובל רגולטוריות ביקשו כי החוקרים לפתח בדחיפות חלופה מדעית מדויקת חיה ניסויים9,10,11,12,13,14,15.

בעשורים האחרונים, מספר מודלים במבחנה של BBB הוצעו16,17,18 ע י טיפוח במסנן ממברנה מוסיף תאי אנדותל של מינים שונים כגון עכבר, חולדה, שור, חזיר. מבחינת המין האנושי, הזמינות נדירה וקשה של ראשי תאים תתבקש החוקרים לפתח מודלים אנושי המבוסס על תאי אנדותל מונצחים המוח או בתאי גזע האדם, נגזר19,20, 21. מחסומים אלה הם המחליפים במבחנה נאותה של BBB ובלבד שהן מבטאות תא אנדותל סמנים, סמנים צומת חזק, מסועי בזרימת, נושאות ממס, רצפטורים, מגיבים לגירויים אנדותל 20. מספר דגמים BBB באמצעות סנן ממברנה מוסיף מצופה תאי אנדותל ואת סוגי תאים אחרים (קרי, האסטרוציטים, הנוירונים או pericytes22,23,24) היו לבדיקה. המטרה של תרבויות משנה אלה היה כדי להגדיל את המאפיינים הפיזיים BBB על ידי ניצול של ההפרשה של גורמים מסיסים האסטרוציטים/נוירונים או pericytes.

למרות זאת, אף אחד המודלים האלה כולל המוח parenchyma ללמוד ואף לנבא גורלו של מועמד סמים ברגע זה עבר את המחסום. לכן, המטרה שלנו היא לבנות את cellulo בתוך הדם/מוח ממשק, BBB-Minibrain, על ידי שילוב של מודל BBB ותרבות של תאי המוח מעורב לתוך ערכת יחיד. BBB-Minibrain משתמש במערכת התרבות המורכב מסנן נקבובי מוכנס טוב של צלחת תרבות תא multiwell. המסנן מצופה hCMEC/D3 תאים, קו תא אנדותל המוח האנושי הוכח ואמינים עבור בדיקות26,25,27, כדי ליצור BBB סמים BBB. Minibrain, וזו תרבות משותפת הבדיל של נוירונים אנושיים, האסטרוציטים נגזר28,29 קו תא NTera/Cl2.D1 מעורבבים יחד עם הקו תא microglial האנושי – יחס המקביל30 CHME/Cl5 מיקרוגלייה לעומת נוירון-האסטרוציטים יחסי של המוח31, הוא טיפח בתחתית הצלחת היטב.

מלבד לימוד מעבר של סמים מעבר BBB, גורלם ב- parenchyma, הממשק דם-מוח במודל cellulo יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לפנות את כניסתם של פתוגנים למוח (neuroinvasiveness), הפיזור למוח (neurotropism) הרעילות (neurovirulence) הם יכולים להפעיל על תאי המוח parenchyma. מחקרים Neurovirulence neuroinvasiveness להפיק תועלת פיתוח יעיל במודל cellulo, יתרון להחליף חייתיים. באמצעות את קיט BBB-Minibrain32, להדגים את פנוטיפ neuroinvasive של מוטציות ויראלי נדיר שהצטברו ב צרפתית Neurotropic וירוס מזן נגיף קדחת צהובה (קרי, FNV-YFV33,34) נהגה להכין הופסק תרכיב חי YFV ואת המעבר של biomolecule neuroregenerative, neuroprotective שנקרא Neurovita (כאל NV מעתה ואילך בכתב היד)35. כי NV גם באופן טבעי חוצה את קרום התא ולא BBB, NV היה התמזגו עם החלק המשתנה (VHH) של נוגדן שרשרת אחת לאמה חוצה את הקרומים הביולוגיים כולל BBB והוא מתפקד בתור תא חודר מולקולה (CPM)36. המאפיין CPM של VHH נראה תלויים על נקודה איזואלקטרית ואורך VHH37.

כך במבחן cellulo יהיה ניתן למיין מולקולות פוטנציאלי יכול לחצות BBB לפני ביצוע פרמוקוקינטיים וניתוח pharmacodynamics בבעלי חיים, ובאופן אידיאלי בו זמנית כדי להיות מסוגל לחזות את התנהגותם, עצבנית parenchyma. מערכת זו היא ביולוגית הרלוונטי וקל להפעלה ולשימוש לטפל על ידי אנשי מקצוע מיומן היטב תא תרבות26,29,30,38. הריבית על כך בבדיקת cellulo תהיה כפולה: הפחתת העלויות של בדיקות פרה מצד אחד וצמצום השימוש בחיות מצד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התא תרבות העבודה של Ntera/CL2. D1 להכין תרבות משותפת של פוסט-mitotic hNeurons ו- hAstrocytes (NT2-n/A)

הערה: זה המרכיב Minibrain (איור 1).

  1. Culturing את Ntera/Cl2.D1
    1. הסר בקבוקון של תאים קפוא מיכל חנקן נוזלי. לשמור על הקרח.
    2. להפשיר את התאים במהירות בתוך אמבט מים 37 º C.
    3. להעביר את התאים בשפופרת 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה (בינוני נשר שונה של Dulbecco: F-12 תערובת מזין בינוני) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), גלוטמין 2 מ מ, 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין µg 100 (קרי, שלמה DMEM F12 בינוני).
    4. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). מביצועם בגדר ב mL 2 בינוני DMEM F12 מלאה.
    5. העברת בבקבוקון תרביות רקמה T75 בפוליסטירן עם טיפול ספציפית עבור תאים חסיד רגיש (T75Cell+) המכיל 13 מיליליטר בינוני DMEM F12 מלאה.
    6. התרבות התאים בתוך אינקובטור נשמר ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות עד 90% הנהרות (קרי, בסביבות 5 ימים). לשנות בינוני כל 2-3 ימים.
  2. Subculturing את Ntera/Cl2.D1 ואת ההגברה
    1. הסר בינוני את הבקבוק.
    2. יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ ל תמיסת פוספט מאגר (PBS) בתוספת2 + Ca ו- Mg2 +.
    3. יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ"ל של EDTA פתרון (שמרו ב RT).
    4. להוסיף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% טריפסין, 0.02% EDTA), דגירה 2 דקות ב- RT.
    5. לנער את הבקבוק, ודא כי התאים ינותקו מעמוד משטח הפלסטיק.
    6. להוסיף 10 מ של מדיום מלאה DMEM F12 כדי להשבית את טריפסין, העברת צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 200 גרם -RT.
    7. מביצועם בגדר עם 10 מ"ל של מדיום מלאה ולהשתמש 1 מ"ל כדי לחסן את כל הבקבוק החדש המכיל 14 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה.
      הערה: 30 מבחנות T75 תא+ נדרשים עבור כל בידול.
    8. דגירה המבחנות-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות עד 90% הנהרות.
  3. הבידול של NTera/Cl2.D1 בתרבות שיתוף נוירון אנושי-אסטרוציט
    הערה: המרכיב העיקרי של Minibrain זה
    1. יום 0, לנתק את התאים עם טריפסין-EDTA כפי שמתואר בשלב 1.2, מביצועם בגדר התא של כל הבקבוק עם 2 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה.
    2. להוסיף 1 מ"ל של התליה תא (תואם ל- 5 x 106 תאים) 60 פטרי פלסטיק של קוטר 85 מ מ המכיל 11 מיליליטר בינוני DMEM F12 מלאה.
      הערה: התאים לא ייצמד הפלסטיק, צבירה כדי neurospheres פסאודו טופס (ראה תצלום בחלונית התחתונה של איור 1). דגירה של פטרי 60-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות ליום אחד.
    3. ב- 1 יום, להוסיף 1 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה בתוספת 130 מיקרומטר של חומצה כל טרנס Retinoic (ATRA) לכל צלחת פטרי (הריכוז הסופי ATRA 10 מיקרומטר) ולחזור על כל המנות של 37 ° C, 5% CO2 ו- 95% לחות במשך 24 שעות ביממה.
    4. יום 2, להעביר בזהירות את המדיום המכיל תא תחומי Petri Dish בכל התחתית 50 מ ל, צנטריפוגה 10 דקות ב x 50 גרם ו- RT. Dissociate בקפידה בגדר רופף עם 13 מיליליטר בינוני DMEM F12 מלאה בתוספת 10 מיקרומטר ATRA ולהוסיף th e מ 13 ל קוטר 85 מ מ חדש צלחת פטרי.
      הערה: על המעברים שונים, חשוב מאוד לשמור על הספירות צפיפות גבוהה כמו צפיפות שהושג-יום 2 (קרי, סביב צפיפות של 70%). לכן, אם צפיפות הספירה. הוא מנמיך, להפחית את המספר הכולל של צלחות פטרי לפי מספר תאים.
    5. חזור על הפעולות לעיל (שלב 1.3.4) ימים 4, 6 ו- 8.
    6. יום 10, חזור על הפעולות שלעיל אך מוסיפים את הכדורים המבחנות T75 תא+ במקום צלחות פטרי. להוסיף את התאים פטרי אחד אל אחד את הבקבוק T75 תא+ .
    7. ימים 11, 13, 15, 17, לשנות את המדיום בשימוש עם 14 מ ל F12 DMEM מלאה בתוספת 10 מיקרומטר ATRA.
    8. יום 19, לשנות בינוני עם 14 מ של שלם בינוני DMEM F12 ללא ATRA לכל את הבקבוק.
    9. בגיל 20 יום, מביצועם בעדינות את התאים עם EDTA/טריפסין כדלקמן.
      1. עבור כל הבקבוק T75 תא+ , לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS בתוספת Ca2 + ו- Mg2 +; דגירה התאים עם 4 מ של EDTA למשך 5 דקות ב- RT.
      2. הסר בזהירות את EDTA, להוסיף 2 מ של טריפסין-EDTA, דגירה 7 דקות-RT. לנער בעדינות את הבקבוק ולהוסיף בזהירות 8 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה.
      3. צנטריפוגה 10 דקות ב 160 x g ו- RT. מביצועם בגדר תא ב 13 מיליליטר בינוני DMEM F12 מלאה והעברת בבקבוקון T75 תא+ .
        הערה: הדיסוציאציה עדין מאוד עם טריפסין-EDTA יאפשר מחלים את ATRA הבדיל תאים מתאי teratocarcinoma המקורי, אשר מחוברים בחוזקה כלי פלסטיק.
    10. בגיל 21 יום, המדיום להסיר את התאים המתים. להוסיף מ 14 ל בינונית DMEM F12 מלאה בתוספת 5% FBS, גלוטמין 2 מ מ, 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין µg 100 ו- 0.5 מיקרומטר של AraC (ציטוזין β-D-arabinofuranoside) (להשלים 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. בגיל 23 ימים, 25 עד 28, החלף בשימוש בינוני עם 14 מ ל 5% FBS DMEM F12-AraC....
    12. בגיל 29 ימים עד 49 (כל יומיים), החלף בשימוש בינוני עם 14 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה בתוספת סרום שור העוברי 5%, 2 מ מ גלוטמין, 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין µg 100, 5 מיקרומטר של FudR (5-פטור-2' deoxyuridine) ו- 10 מיקרומטר Urd (Uridine) (5 מלאה % FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. ב- 50 יום, החלף בשימוש בינוני עם 14 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה בתוספת 5% FBS, גלוטמין 2 מ מ, 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין µg 100 ו- 10 מיקרומטר Urd (להשלים 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. 51 ימים עד 95 (פעמיים בשבוע), החלף בשימוש בינוני עם 14 מ"ל של שלמה 5% FBS DMEM F12-Urd.
      הערה: תאים יכולים להיות משומשים לניסויים מיום 51 אבל לא מאוחר יותר היום 95. השימוש של טורי טיפולים עם מעכבי מיטוזה מאפשר שחזור אוכלוסייה טהור של תרבות משותפת של פוסט-mitotic hNeuron ו- hAstrocytes (NT2-n/A).
    15. כדי להפיץ את התאים, להמשיך עם trypsinization עדין כמתואר במשך 20 יום.

2. תא עבודה התרבות של האדם microglial תאים CHME/Cl5

הערה: זהו הרכיב microglial של Minibrain (איור 1).

  1. Culturing microglial האנושי של תאים CHME/Cl5
    1. הסר בקבוקון של תאים קפוא למיכל חנקן נוזלי. לשמור על הקרח.
    2. הפשרת במהירות בתוך אמבט מים 37 º C.
    3. העבר את התאים בשפופרת 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום DMEM F12 מלאה בתוספת 5% סרום שור עוברית, גלוטמין 2 מ מ, 100 IU פניצילין, µg 100 סטרפטומיצין (קרי, מלאה 5% FBS DMEM F12 בינוני).
    4. Centrifuge ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב- RT. Dissociate בגדר עם 2 מיליליטר מלאה 5% FBS DMEM F12 בינוני.
    5. העברת בבקבוקון T75 תא+ המכיל 13 מיליליטר מלאה 5% FBS DMEM F12 בינוני.
    6. התרבות תאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות עד 90% הנהרות. לשנות בינוני כל 2-3 ימים.
  2. Subculturing התאים microglial אדם CHME/Cl5
    1. הסר בינוני הבקבוק.
    2. יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ"ל של PBS בתוספת Ca2 + ו- Mg2 +.
    3. יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ"ל של EDTA פתרון (שמרו ב RT).
    4. להוסיף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון, דגירה 2 דקות ב- RT.
    5. לנער את הבקבוק, ודא כי התאים ינותקו מעמוד משטח הפלסטיק.
    6. להוסיף 10 מ ל מלאה 5% FBS DMEM F12 בינוני כדי להשבית את טריפסין, העברת צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g ו- RT.
    7. מביצועם בגדר עם 10 מ"ל של מדיום מלאה ולהשתמש 1 מ"ל כדי לחסן את כל הבקבוק החדש המכיל 14 מ של שלמה 5% FBS DMEM F12 בינוני.
    8. דגירה המבחנות-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות עד 90% הנהרות.

3. תרבות עבודה עם hCMEC/D3 מעיל מוסיף נקבובי ולהכין BBB

  1. Culturing תאי אנדותל אדם hCMEC/D3 (איור 2)
    1. לדלל את סוג אני אלשין קולגן ל- 1:30 עם מים טהורים סטרילי (תא תרבות כיתה).
    2. להעביר 10 מ"ל בקבוקון T75 תא+ , דגירה 2 h ב 37 ° C, 5% CO2 ו- 95% לחות חממה.
    3. הסר את הפתרון קולגן ולהחליף אותו עם 15 מ"ל של מדיום תא אנדותל בתוספת 10 מ מ HEPES (היא כאל תא אנדותל שלם בינוני).
    4. הסר בקבוקון הקפאה של תאים למיכל חנקן נוזלי. לשמור על הקרח.
      הערה: התאים היו מבוגרים, הרבה זרע בוצע כמתואר על ידי היצרן. הקו תא מכוסה על ידי הסכם העברת חומר ביולוגי. התאים מתקבלים על המעבר מספר 25, לא אמור לשמש יותר מאשר מעבר 35.
    5. הפשרת במהירות בתוך אמבט מים 37 º C.
    6. העברת תאי הבקבוקון T75 תא+ ולהחזיר את הבקבוק-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות עבור 2-4 h.
    7. הסר את המדיום בזהירות מבלי לאבד או הסרת תאים. יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של תאי אנדותל שלם בינוני.
    8. להוסיף 15 מ"ל של תאי אנדותל שלם בינוני.
    9. התרבות תאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו לחות 95% עד 100% הנהרות (לא פחות מ-4 ימים) מבלי לשנות את המדיום.
  2. Subculturing hCMEC/D3 להכין את תותב של BBB
    1. מעיל בקבוקון T75 תא+ חדש או מוסיף עם הסוג אני עכברוש קולגן כמתואר לעיל (שלב 3.1).
    2. הסר בינוני את הבקבוק. יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ"ל של PBS בתוספת Ca2 + ו- Mg2 +.
    3. להוסיף 2 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון, דגירה 5 דקות ב 37 º C.
    4. לנער את הבקבוק, ודא כי התאים נמצאים מנותק לחלוטין מן משטח הפלסטיק.
    5. להוסיף 4 מ של תאי אנדותל שלם בינוני כדי להשבית את טריפסין.
    6. עם פיפטה פלסטיק 5 מ"ל, מכנית מביצועם התאים על ידי כ רפה בעברית ומרוקן התליה תא תוך שמירה על פיפטה 5 מ"ל לחלק התחתון של הבקבוק לפחות 5 פעמים.
    7. לספור את התאים והוספת שימוש 5 x 104 תאים/הכנס עבור תרבות ממברנה פוליאסטר טוב 12 insert ו- 2 x 106 תאים עבור בקבוקון T75 תא+ . להכין גם שלושה מסננים ללא תאים עבור הניסויים PELy (קרי, תאי אנדותל חדירות לראות לוציפר צהוב להלן פיסקה 4.2) עם התוספות תרבות ממברנה פוליאסטר.
    8. דגירה של מבחנות או מוסיף ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות עד 100% הנהרות.
    9. אל תשנה האמצעי עבור T75 תא+ את הבקבוק עד קטע חדש. ההיפך הוא הנכון עבור BBB על תרבות ממברנה פוליאסטר מוסיף: לשנות בינוני-2 ו- 4 ימים, השתמש BBB לניסויים-יום 6.

4. בנייה ובקרת איכות של BBB-Minibrain (איור 2)

  1. הגדרת פוליאסטר BBB-Minibrain של תרבות ממברנה להוסיף התקן (איור 2B)
    1. לגדל את התאים hCMEC/D3 על 12 טוב פוליאסטר ממברנה תרבות להוסיף מסננים ל-6 ימים תא אנדותל בינוני לפני השימוש לניסוי.
    2. מעיל צלחת טוב 12 עם פולי-D-ליזין (1 מ"ל/טוב, 10 µg/mL, 4 h RT) ולאחר מכן laminin (1 מ"ל/טוב, 1 µg/mL, ללון במלון RT).
    3. להסיר laminin ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום תא אנדותל בתוספת 5% FBS (תאי אנדותל 5% בינוני).
    4. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות.
    5. בעדינות trypsinize NT2-n/A (כפי שמתואר בשלב 1.3.9) ו- CHME/Cl5 (כפי שמתואר בשלב 2.2), לבטל את כדורי תא תא אנדותל מלאה בינונית.
    6. לספור את התאים, מיקס 3.6 x 105 NT2-n/A ו- 0.4 x 105 תאים CHME/Cl5/טוב וצלחת זרע 12 טוב.
    7. ב T = 24 שעות (24 שעות לאחר זריעה): לשנות את המדיום בשימוש טריים תא אנדותל מלאה בינונית (תאים Minibrain ותאי אנדותל) ולהעביר hCMEC/D3 פוליאסטר ממברנה תרבות הוספה למסנן בראש התאים Minibrain. דגירה של BBB-Minibrain-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות.
      הערה: BBB-Minibrain ואז יכלול של שכבה של תאי אנדותל אדם hCMEC/D3 במסנן לבודד את תא luminal (או "דם" תא) ושל תרבות מעורבות של תאים אנושיים hNT2-n/A ו- hCHME/Cl5 (Minibrain) בחלק התחתון של הגדרת טוב abluminal תא (או תא "המוח") (איור 2B).
  2. אימות של החדירות אנדותל של BBB-Minibrain (בקרת איכות) (איור 2C)
    1. הכנת המאגר תחבורה (TB), אשר הוא HBSS (הנקס מאוזנת תמיסת מלח) מאגר עם Ca2 + ו- Mg2 + בתוספת פירובט נתרן HEPES, 1 מ 10 מ מ.
    2. להכין 12 צלחות היטב עם 1.5 מ של התחבורה מאגר לכל טוב.
    3. ב T = 0, להפוך טריים התחבורה מאגר בתוספת 50 מיקרומטר לוציפר צהוב (LY-TB).
    4. הפוך כל סינון הפוך כדי להסיר בזהירות המדיום מבלי להשפיע על המכשול תא אנדותל.
    5. מקם את המסנן על הצלחת טוב 12 מלא ולהוסיף 0.5 מ של LY-TB.
    6. דגירה הלוחות באינקובטור 37° C, 5% CO2 ו 95% לחות.
    7. ב T = 10 דקות להעביר המסננים של טרה-בתים חדשים מלא 12 צלחות היטב ולשמור תא abluminal של צלחת הראשונה לקריאה OD.
    8. ב T = 25 דקות, חזור על השלב 4.2.7.
    9. ב T = 45 דקות, לעצור את התעבורה על-ידי הסרת המסננים הצלחות. לשמור abluminal תאים luminal אמצעים OD.
    10. העברה ב- 96 כהה ובכן צלחות הדגימות: µL 10 עם 190 µL טרה-בתים של LY-TB, התאים luminal, 200 µL מדגם עבור התאים abluminal.
    11. למדוד את זריחה של LY-טרה-בתים נוכח בדגימות שונות-λ428 nm λ535 ננומטר (אורך עירור, פליטה גלים בהתאמה).
    12. לחשב את החדירות אנדותל (Pe) לכיוון LY-TB (PeLY) על פי Siflinger-בירנבוים, A et al. (1987)39 ו דה קוסטה, A et al. (2018)34 באמצעות הנוסחה:
      1/פסי = (1/PSt) – (1/PSf) ו- PeLY= PSe/ס
      הערה: PSf הוא החדירות של המסנן ללא תאים PSt החדירות של המסנן עם תאים, פסי הוא החדירות של הזמן טפט אנדותל השטח של טפט, S. זה השטח של טפט (עבור מסנן טוב 12 = 1.12 ס"מ2 ), PeLY מתבטאת ס מ/דקה. HCMEC/D3 לתפליט הצדריLY צריך להיות בין 0.7 ו- 1.2 x 10-3 ס מ/דקה תלוי בעיקר FBS להשתמש בניסויים. חשוב: תמונה PeLY גבוה יותר 1.2 משמעה BBB אינה מספיק הדוק יכול להיות שנצפו יש דליפה. ביטול מחסומים אלה.

5. השימוש BBB-Minibrain כדי להדגיש את הנוכחות של חלקיקים נגיפיים נוירו-פולשנית דוגמאות חיסון נגד נגיף קדחת צהובה, הווירוס צרפתית Neurotropic, YFV-FNV- 34 (איור 3)

  1. חוצה BBB וכפל של קדחת צהובה וירוסים ב Minibrain
    1. השתמש BBB-Minibrain מוכן כפי שמתואר בשלב 4.1.7 24 שעות לפני התוספת של הווירוס; החלף את המדיום על ידי 2% FBS תא אנדותל בינוני.
      הערה: חשוב מאוד למנוע שינוי המדיום רק לפני הוספת את הוירוס. שינוי המדיום יכול להפעיל את תאי אנדותל אנושי, transiently לפתוח את מחסום אשר תאפשר המעבר של הנגיף. כאן המדיום השתנה 24 שעות לפני תחילת הניסוי.
    2. ב T = 0, להוסיף 3500 פלאק ויוצרים יחידות (PFU) של YFV-FNV מעורבבת עם µL 50 של 2% FBS בינוני תא אנדותל בזהירות רבה על ראש תא luminal. הפקד BBB-Minibrain הוא מחוסן עם 50 µL של 2% FBS תא אנדותל בינוני בלי וירוס. לקבוע PeLY על לוויה. טוב.
    3. דגירה של BBB-Minibrain באינקובטור 37 ° C, 5% CO2 ו 95% לחות.
    4. לאחר 24 שעות, להסיר את ההתקן סנן ממברנה פוליאסטר מוסיף תרבות לקבוע PeLY, לדוגמה 1 מ"ל של תא abluminal, titrate את הוירוס כפי שתואר על ידי א da Costa et al. (2018)34. החלף את המדיום טריים 2% FBS תא אנדותל בינוני.
    5. דגירה של BBB-Minibrain-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות.
    6. לאחר 72 h, לטעום האמצעי תא abluminal titrate את הוירוס, ו/או לחלץ את הרנ א התאים Minibrain עבור הביטוי מפענוח כפי שתואר על ידי א da Costa et al. (2018)34.
  2. הגברה של גרסאות neurotropic של YFV-FNV על Minibrain תאים על ידי מעברים טורי
    1. שימוש Minibrain תאים מצופה 12 צלחות טוב (קרי, שלבים 4.1.6 ו 4.1.7).
    2. זמן הצבע הו, להוסיף 3,500 פלאק ויוצרים יחידות של YFV-FNV מעורבבת עם µL 50 של 2% FBS תא אנדותל בינוני היטב בראש התאים (תא luminal).
    3. לאחר 1 h, המדיום עם inoculum וירוס להסיר ולהחליף טריים 2% FBS תא אנדותל בינונית.
    4. לאחר 48 שעות, מדגם 500 µL של המדיום תרבות, להדביק תאים Minibrain טריים
    5. לאחר 120 h, מדגם 500 µL של המדיום תרבות, להדביק תאים Minibrain טריים.
    6. לאחר 192 h, להציל את תרבות בינוני (= וירוס מניות מועשר) ולחלץ את הרנ א מתאי Minibrain לניתוח ביטוי גנים כפי שתואר על ידי א da Costa et al. (2018)34.

6. שימוש BBB-Minibrain ללמוד חוצה BBB ו המוח תא פילוח של biomolecule

  1. תחבורה ברחבי BBB של נוירון מיקוד biomolecule
    1. השתמש Minibrain-BBB מוכנים כמו שמתואר שלב 4.1.7.
    2. בנקודת הזמן הו, להוסיף את biomolecule (בדוגמה בתנאי במקטע ' תוצאה ', 58.75 ng/BBB של מולקולות NeuroTag-NV permeant תא נוספו לכל BBB-Minibrain הכנס.
    3. דגירה של BBB-Minibrain-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% לחות.
    4. לאחר 24 שעות, להסיר את ההתקן סנן ממברנה פוליאסטר מוסיף תרבות, לקבוע PeLY, מכתים את התאים Minibrain עבור hNeurons neurofilament Nf200 ואז לזהות הנוכחות של biomolecule Minibrain (בדוגמה הניתנים התוצאה סעיף, NeuroTag-NV זוהה באמצעות נוגדן מכוונת נגד דלקת-התג שמכיל35,40).
  2. תחבורה ברחבי BBB neuroregenerative biomolecule ואת וזמינותו neuroprotective עוקבות ב Minibrain לאחר biomolecule חצה BBB
    1. השתמש Minibrain-BBB שהוכן כפי שמתואר בשלב 4.1.7.
      הערה: עבור מולקולות מיקוד נוירונים בלבד, תאים Minibrain יכול להיות מוחלף על ידי היחידה תאים (NT2-N)38נוירונים.
    2. בנקודת הזמן הו, להוסיף 58.75 ng/BBB-Minibrain טוב של תא permeant NV מולקולות (הטופס הפעיל CPM-NeuroTag-NV, טופס-פעיל CPM-NeuroTag-NVΔ) מתוארת על ידי ג Prehaud et al. (2014)35.
    3. דגירה של BBB-Minibrain באינקובטור 37 ° C, 5% CO2 ו 95% לחות.
    4. לאחר 4 שעות, לגרום פצעים בודדים עם מחט הזריקה (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, בלגיה) על תאים Minibrain. להפוך לפחות 10 שריטות על כל אדם טוב. לקבוע PeLY על בת לוויה. טוב.
    5. דגירה של BBB-Minibrain באינקובטור 37 ° C, 5% CO2 ו 95% לחות.
    6. לאחר 8 שעות, החלף את המדיום בתא abluminal על ידי בינוני טריים תא אנדותל מלאה.
      הערה: חשוב להחלפת המדיום בשלב זה מאז ופציעתם של התאים Minibrain יכול לגרום מוות של תאים ולאחר מכן שחרורו של תרכובות ציטוטוקסיות.
    7. דגירה של BBB-Minibrain באינקובטור 37 ° C, 5% CO2 ו 95% לחות.
    8. לאחר 48 שעות, מוכתם התאים האקסון ההתחדשות של hNeurons כפי שתואר על ידי ג Prehaud et al. (2013)40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BBB-Minibrain הוא cellulo בתוך ניסיוני מודל של ממשק מוח-דם.

BBB-Minibrain מוגדר במערכת הוספה תרבות ממברנה פוליאסטר לחקות תא דם במפלס העליון של תא המוח בקומה התחתונה של הממשק דם-מוח (איור 2 אב'). זה מורכב תא luminal עם hCMEC/D3 תאי אנדותל מסנן ויוצרים BBB תא abluminal, אשר מכיל Minibrain tri-התרבות האנושית של תאים במוח (הנוירונים, האסטרוציטים ותאים microglial). התאים Minibrain התערוכה קלאסית tri-תרבות מעורבת האוכלוסין פנוטיפ (איור 1, החלונית התחתונה נכון) וסמנים אקספרס ספציפיים של כל סוג של תא כפי שמוצג על ידי דה קוסטה א ואח ', 201834.

השימוש hCMEC/D3 שכבה ב BBB-Minibrain מאפשר קבלת מחסום חזק עם תמונה Pe רשעLY של 0.95e-03 ס מ/min ושל רשע טרנס אנדותל חשמל ההתנגדות (TEER) של Ω/cm 51.892. ערכים אלה הם בטווח הערכים הטובים ביותר אי פעם המתוארים עבור תאי אנדותל אדם קו27,41 ממברנה פוליאסטר תרבות הוספה מערכת כזו (איור 2C). תאים אלה מבטאים את צומת חזק סמני חלבונים כגון זואי-1 וקדהרין כצפוי על ידי כימות חדירות (נתונים לא מוצג). הם מבטאים גם את כל ערכות המשנה של רצפטורים, בזרימת שנאים או מובילי [קולטנים: LDLR, קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה; LRP1, קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה הקשורים חלבון 1; INSR, קולטן לאינסולין; LEPR, לפטין קולטן; LU, מולקולה אדהזיה הבזליים; TFRC, CD71 אנטיגן; AGER, מתקדם קולטן המוצר הסופי גליקוזילציה. מסועי בזרימת: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 חלבון; ABCC5, ABCC5 חלבון. מסועי: STRA6, מגורה על ידי retinoic חומצה ג'ין 6 חלבונים; SLC2A1, נשא גלוקוז הקלד 1; SLC7A5, טרנספורטר גדול חומצת אמינו נייטרלי 1; SLC1A1, ממס מוביל הפרוטאין המשפחה 1; SLC38A5, המוביל ממס המשפחה 38 חבר 5 חלבונים; SLC16A1, monocarboxylate תחבורה חלבון 1], אשר הם חלבונים מפתח הרלוונטיות שלהם תפקודים ביולוגיים (איור דו-ממדי)21.

BBB-Minibrain מאפשר בחירה, הגברה, אפיון משתנים נגיפי neuroinvasive נדיר של הכנה חיסון נגד וירוס חי.

המכשיר תרבות BBB-Minibrain שימש כמו cellulo בתוך בדיקת בידוד המאפשר הגברה של משתנים neuroinvasive/neurovirulent נדיר להציג פוטנציאל קדחת צהובה וירוסים חיסונים חיים נגיפי (YFV)42. YFV הוא וירוס viscerotropic מיקוד הכבד, לא עובר ביעילות BBB. הווירוס neurotropic הצרפתי, FNV, שימש חיסון YFV בשידור חי עד33,43שנות השמונים. FNV נמצאה כדי לגרום neuropathogenesis פוסט-vaccinal אצל ילדים (0.3 עד 0.4% בקרב vaccinees), ולכן הופסק בשנת 198233,43. השתמשנו FNV כאן בתור אב-טיפוס של וירוס YF, אשר עשוי להכיל שיעור גבוה של42,neuroinvasive/neurovirulent גרסאות44. הכנה וירוס FNV (קרי, 3500 PFU/ml) נוספה בתא luminal של BBB-Minibrain, הפקד היה BBB-Minibrain שהיה נגוע מעושה. נוכחות של חלקיקי וירוס בתא luminal אינו משנה את מחסום חדירות כפי שנמדד 24 שעות מאוחר יותר מאז לתפליט הצדריLY ב הבארות ויראלי לא היה שונה מזה PeLy של שליטה בארות (0.80 ± 0.09 x 10-3 ס מ/דקה ו 0.86 ± 0.09 x 10-3 ס מ/דקה עבור PeLY שליטה, YFV-FNV בארות בהתאמה). התוכן של תא abluminal הוערך נוכחות של וירוסים מאת assay פלאק, בבית 24 שעות ביממה פוסט זיהום. התאים Minibrain היו מודגרות יומיים יותר מה להעריך ההגברה של גרסאות neuroinvasive בתאי המוח, כדי לפקח על ביטוי גנים כמו שמתואר על הקומיקס למוצג באיור 3 א.

גילינו כמה וירוסים YFV-FNV, אשר יכולים לחצות BBB-24 h (אומר PFU 43/mL). וירוסים היו מוגבר במשך היומיים הבאים על ידי הכפלה של הנגיף בתוך תאי המוח (כלומר כייל של 4.69 x 104 PFU/mL), (איור 3B). ראוי לציין, הכנה זן החיסון אשר אינו גורם neuropathogenesis פוסט-vaccinal לא ביעילות יעשה BBB במערכת זו כפי זה הוכח על ידי דה קוסטה א et al. (2018)34. זיהינו שני סמנים ביולוגיים של הכפלה של הנגיף: אינטרפרון מגורה גנים 15 (ISG15) ואינטרפרון 7 גורם רגולטורי (IRF7). הביטויים של סמנים ביולוגיים שני אלה היו מגורה כאשר אוכלוסייה ויראלי זו neuroinvasive היה passaged באופן סדרתי על תאים Minibrain (איור 3C). אלה upregulations נמדדת Q-RT-PCR היו בקורלציה בקפדנות המטען הנגיפי (פירסון ערך p 0.0016 עבור ISG15 ו- 0.0260 עבור IRF7).

BBB-Minibrain מאפשרת שתי assaying את היכולת של biomolecule לעבור את המכשול, באותו זמן בדיקה אם הפונקציה biomolecule השתמר לאחר המעבר BBB.

NV היא biomolecule נגזר נגיף הכלבת שניחן בתכונות מדהימות של neuroprotection ו- neuroregeneration40. זה מפוליפפטיד קטנה חוצה גם באופן טבעי קרום התא ולא BBB היה התמזגו וקיבלנו מסוגל למקד את הנוירונים. הבחירה שלנו היה להשתמש החלק המשתנה (VHH) של נוגדן שרשרת אחת לאמה שחוצה את הקרומים הביולוגיים כולל36,של BBB45 ו- NeuroTag מיקוד נוירונים במיוחד. NV היה קשור VHH ובנוסף NeuroTag, לבנות CPM-NeuroTag-NV (איור 4A) וכדי את VHH רק לבנות CPM-NeuroTagΔ-NV חסר את NeuroTag ספציפי שמאפשר כיוון התקפות על הנוירונים (איור 4B). לאחר שנוספו תא luminal, CPM-NeuroTag-NV (נקודות ירוקות) חוצה BBB והיה מסוגל למקד נוירונים אנושיים (באדום) (איור 4C, יח). CPM-NeuroTagΔ-NV חוצה את המכשול תא אנדותל (נקודות ירוקות) אבל מטרות פחות ביעילות את הנוירונים אנושי (רוב נקודות ירוקות ממוקמים מחוץ הנוירונים) (איור 4D).

כמתואר לעיל, NV היה קשור VHH, NeuroTag כדי לבנות CPM-NeuroTag-NV. עשינו אותו הדבר עבור NVΔ צורה לא פעילה של NV חסר החלק הפעיל של NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (איור 5A). לאחר שנוספו תא Luminal, CPM-NeuroTag-NV חוצה BBB והיה מסוגל לחדש את האקסונים של נוירונים אנושיים לאחר ופצעו (איור 5B, לוח נכון), להיפך ל CPM-NeuroTag-NV Δ הטופס פעילה של אן. וי (איור 5B, שמאלה לוח)40. מאפיינים אלה היו לבדיקה שני סוגי פרוטוקולים; גם טרום – חשיפה (איור 5C) או בכל פרוטוקול חשיפה פוסט (איור 5D). כאשר מיושמת לפני הפעולה באקסון מגרד (4 h, H4), CPM-NeuroTag-NV מפעילה את neuroprotection של הנוירונים הפצועים וטיפל לרגנרציה עצב להיפך של זיוף תאים (קרי, פקד) או את התאים שטופלו CPM-NeuroTag-NVΔ (ממוצע התחדשות 91% ו- 12%-10% בהתאמה, איור 5C). מתי biomolecule הוחל אחרי נגעים עצב (1 שעה, H1, איור 5D) כדי לחקות את פרוטוקול רפואית לאחר חשיפה, CPM-NeuroTag-NV היא עדיין היכולת להתחדש אקסונים להיפך צורת CPM-NeuroTag-NV Δ, (בעלי מוגבלויות אומר התחדשות 85% ו- 5.1% בהתאמה) (איור 5D).

Figure 1
איור 1: מודל Minibrain. הזמן שולחן של התרבויות NT2-n/A ו- CHME/Cl5 (לוח העליון). תמונות (לוחות התחתון) של הקו הסלולרי המקורי (Ntera/cl2. D1) בחלונית השמאלית, neurospheres פסאודו שהושג לאחר טיפול ATRA בחלונית העליונה האמצעית ', CHME/Cl5, החלונית התחתונה האמצעית, את triculture Minibrain (מכתים סגול Cristal), בחלונית הימנית, כתוצאה של התערובת של NT2-n/A ו- CHME / CL5 תרבויות. סולם בר 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: המודל BBB-Minibrain. א. הזמנים של תרבויות hCMEC/D3, תצלום של המכשיר BBB-Minibrain: ממברנה פוליאסטר תרבות מוסיף-מסנן עם המכשול אנדותל hCMEC/D3 מתקיים עם forcep לפני כדי להיות מוכנס אל באר אחת של 12 בארות התא תרבות צלחת. B. קריקטורה המתארת את המכשיר עם תא luminal (דם) המכיל את המכשול אנדותל תא, תא abluminal (המוח) המכילות את התאים Minibrain (נוירונים אנושיים, האסטרוציטים ותאים microglial). ג. נציג מדדי permeabililty BBB-Minibrain על ידי TEER (קרי, TransEndothelial ההתנגדות החשמלית) על שלושה מכשירים או חדירות כדי LY (קרי, PeLY) על חמישה מסננים. ד. ניתוח ביטוי על ידי q-RT-PCR של רצפטורים, בזרימת שנאים שנאים על hCMEC/D3 תאי אנדותל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דגם ה BBB-Minibrain מאפשר זיהוי של neuroinvasive משתנים בין הכנת החיסון YFV בשידור חי. א בלוח הזמנים של הניסוי. B. כימות של וירוסים אשר חצו BBB מאת פלאק ויוצרים יחידה (PFU) טיטור של וירוס חי (כל נקודה מייצג אחד ממברנה פוליאסטר תרבות מוסיף הניסוי). ג. מגרש של ביטוי גנים ISG15 ו- IRF7 נמדדת q-RT-PCR כפונקציה של מספר נגיפים ב המטען הנגיפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: BBB-Minibrain מאפשרת בדיקה של neuroregenerative biomolecule מאפיינים: מיקוד ספציפי של נוירונים כאשר NV היא דבוקה NeuroTag. A-קריקטורה של CPM בסיס NV (קרי, CPM-NeuroTag-אן וי) המכיל של NeuroTag ספציפית למטרה נוירון במיוחד. B-קריקטורה של CPM בסיס NV שנמחקו של NeuroTag (דהיינו, CPM-NeuroTagΔ-אן וי). ג. immunofluorescence הנציג תצלומים של הנוירונים אנושי. קנה המידה בר 50 מיקרומטר. NF 200 באדום, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-אן וי ב גרעינים ירוק, כחול. ד. מולקולות CPM-NeuroTag-NV ניתן לחצות BBB, למקד בצורה יעילה יותר מאשר CPM-NeuroTagΔ-NV נוירונים אנושיים. נוירונים נגוע, מכלל האוכלוסיה של נוירונים נספרו בשקופיות triplicate לאחר immunolabeling. סה כ נוירונים תואמות לתאים חיובי NF200 (באדום). כל כדוריות אדומות המשויך נקודה ירוקה, אחד או יותר (CPM-אן וי) נחשבת נוירון חיובי. הסטודנט אינטראקצית מבחן t שניים זנב * * *p = 0.0002. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: BBB-Minibrain מאפשרת בדיקה של neuroregenerative biomolecule מאפיינים: חוצה BBB אינו משנה את מאפייני neuroregenerative NV. A-קריקטורה של CPM בסיס NV (קרי, CPM-NV) והקובץ המקביל בעלי מוגבלויות (קרי, CPM-NVΔ). B. התחדשות האקסון לפי CPM-אן וי ב ב- cellulo מאפס assay (לוח נכון). CPM-NVΔ לא יכול לעורר התחדשות האקסון (החלונית הימנית), סולם בר 100 מיקרומטר. C. CPM-NV יכול לחצות תא אנדותל והפק אקסונים על הנוירונים של BBB-Minibrain בעת החלת 4 שעות לפני הנגע: (החלונית העליונה) תכנית הניסוי; (החלונית התחתונה) כימות של ההתחדשות. ד. CPM-NV פעילה גם בתחום פרוטוקול רפואית כאשר מוחל 1 h לאחר פציעתם: (החלונית העליונה) תכנית הניסוי; (החלונית התחתונה) כימות של ההתחדשות. הסטודנט אינטראקצית מבחן t שניים זנב * * *p < 0.0001. התחדשות חושבה מן הניסויים triplicate (> 800 נוירונים נספרים) לאחר צביעת של תאים עצביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה להדגים כיצד לבנות את cellulo בתוך הדם/מוח ממשק, BBB-Minibrain, על ידי שילוב של מודל BBB ותרבות של מעורב במוח תאים במוח (Minibrain) לתוך ערכת יחיד. מערכת זו היא ביולוגית רלוונטית, קל להגדיר ולטפל עבור ניסויים מיומן היטב בתרבות התא.

באשר במבחנה מודל אחר של BBB, תוצאות אמינות מתקבלת אם פקד דרסטית הלוחצת של המכשול מוחל. מוסיף, אליו צריך להיבדק בקפידה עבור חדירות והוספה כלשהו עם חדירות לקוי ערכים (קרי, PeLY גבוה יותר-1.2) צריכים להיות מושלך.

דוגמאות FBS צריך להיבדק בקפידה כדי לזהות אצווה זה אינו מבטל את המאפיינים של BBB. ניתן להזמין את אותה עצה לגבי המדיום הרכב ב איזה וירוס חלקיקים או מולקולות הן מדולל. כמו כן מומלץ להשאיר קטן ככל האפשר את עוצמת הקול של biomolecule או וירוסים ההשעיה, על מנת לא לשנות את הרכב בינונית של תא luminal. הבידול של התרבות האנושית שיתוף נוירון/האסטרוציטים התרבותיות Ntera/CL2. D1 הוא טכנולוגיה מוכחת. בניגוד נוירונים אנושיים אשר mitotic פוסט, האסטרוציטים הם עדיין חלוקת תאים. התפשטות גבוה של תאי האסטרוציטים נצפית לפעמים. אם זה קורה, התרבות Minibrain צריך להיות מושלך. התאים CHME/Cl5 שהיינו במעבדה שלנו היו phenotyped כדי להוכיח שהם ממקור אנושי (הומו ספיינס CCNT1 phenotyping). יש סיכון יש הרבה CHME בשימוש כמה מעבדות שעשויים להיות ממוצא עכברוש (Rattus norvegicus) כפי שנטען על ידי גרסיה-מסה י' ואח (2017)46. לכן, מומלץ לבדוק מקור השורה של התא CHME/Cl5.

מערכת tri-התרבות האנושית Minibrain כולל פוסט mitotic נוירונים (בעיקר דופאמין), האסטרוציטים וקו תא microglial, מחקה סביבה מוחית מפושטת. עדיין ניתן לשפר את המערכת. אפשר לדמיין הוספת oligodendrocytes להפוך התרבות במטרה להשיג ו דנדריטים או תאים microglial הראשי. ניתן להחליף את minibrain גם עם תרבות מעורבת של תאי גזע האדם, נגזר19,20,21. למרות זאת, השונות בין מגרשים שונים של תאים יצטרך להיות מומחה בקפידה. ניתן להגדיל את המורכבות BBB-Minibrain גם על-ידי הוספת pericytes23. בידיים שלנו, שיפור זה היה מובן הקושי שיש גישה אמינה pericytes ממקור אנושי.

הראו את הכדאיות והתועלת של הקיט הזה מחקה את הממשק דם-מוח, לבודד i) חלקיקי וירוס נדיר neuroinvasive מתוך מדגם חיסון נגד קדחת צהובה שהתפתח במאפיין כדי להזין את המוח דרך BBB, ו- ii). להגביר את אוכלוסיות משנה אלה neuroinvasive בתרבות Minibrain tri-מחקה parenchyma מפושטת המוח. יישומים עתידיים ניתן להרחיב את בקרת האיכות של חיסונים חיים אחרים כגון החיסון חזרת כדי לקדם את ה-BBB Minibrain כמו ממוצע ללמוד neurovirulence תכונות במבחנה.

המחקר פיילוט השני היה להראות כי מועמד סמים עובר BBB ומגיע את Minibrain, מבלי לאבד את תכונותיו נוירו-ההתחדשות. אנו משוכנעים חריפה BBB-Minibrain יכול לאפשר התקדמות גדולה ב--מיון של מולקולות לפני שחרורם בדיקות פרה. השימוש של BBB-Minibrain צריך לאפשר יישום אמצעים 3Rs שמטרתם להפחית את השימוש ניסויים עבור מבחני reglementary ומחקר ניסויי בבעלי חיים.

בסך הכל עם ההתפתחות הבאה של גישות סיליקו (מודל המחשב), בקרוב נוכל לזהות את המועמדים סמים עם הסתברות גבוהה של חוצה BBB, הפיתוח של דגם תלת-ממד cellulo מחקה את הדם לחוץ parenchyma הממשק יהיה לעזר רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

קניין רוחני של המערכת הייתה הפטנטים שאוזכרו 32, 35 , 38.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים פנימי פסטר כולל של גרנט Incitative (PTR 435) ועל ידי מענק "Contrat דה Soutien à la רשרש" הניתנים על ידי סאנופי פסטר את פסטר. א דה קוסטה נתמך על ידי מענק סאנופי-פסטר פלוריאן Bakoa היא זוכת מענק PhD שסופקו על-ידי ANRT (האגודה נאסיונאל דה לה רשרש et de la Technologie). . אנחנו חבים יחסי ציבור פייר-אוליבייה Couraud, ד ר פלורנס מילר לדיונים מועיל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Tags

Neuroscience גיליון 146 BBB-Minibrain ב- cellulo דגם תאי אנדותל אדם hCMEC/D3 Ntera/Cl2D.1 תא עצב אנושיים אסטרוציט אנושי אנושי microglial תאים CHME/Cl5
מודל ממשק מוח-דם אנושי ללמוד מכשול המעברים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציה שלהם עם המוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa,… More

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter