Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS
* These authors contributed equally

Summary

Qui presentiamo un protocollo che descrive l'impostazione di un cellulo in BBB (barriera ematoencefalica)-cultura di poliestere membrana porosa Minibrain inserire il sistema al fine di valutare il trasporto di biomolecole o agenti infettivi attraverso un Bee umano e loro impatto fisiologico sulle cellule cerebrali adiacenti.

Abstract

I primi screening di farmaci del sistema nervoso su un pertinenti e affidabile nel modello BBB cellulo per la loro penetrazione e loro interazione con la barriera e il parenchima cerebrale è ancora un bisogno insoddisfatto. Per colmare questa lacuna, abbiamo progettato un 2D in modello cellulo, il BBB-Minibrain, combinando un poliestere membrana porosa cultura inserto umano BBB modello con un Minibrain formato da un tri-coltura di cellule di cervello (neuroni, astrociti e microglia). Il BBB-Minibrain ci ha permesso di testare il trasporto di un candidato della droga neuroprotective (ad esempio, Neurovita), attraverso la BBB, per determinare il targeting specifico di questa molecola ai neuroni e per mostrare che la proprietà neuroprotective della droga è stata conservata dopo la droga aveva attraversato la BBB. Abbiamo anche dimostrato che BBB-Minibrain costituisce un modello interessante per rilevare il passaggio di particelle del virus attraverso la barriera di cellule endoteliali e per monitorare l'infezione del Minibrain di particelle del virus neuroinvasive. Il BBB-Minibrain è un sistema affidabile, facile da gestire per ricercatore addestrati nella tecnologia di coltura cellulare e predittiva dei fenotipi di cellule di cervello dopo il trattamento o insulto. L'interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: l'introduzione di derisking passaggi precocemente durante lo sviluppo di droga da un lato e riducendo l'uso di d'altra parte la sperimentazione animale.

Introduction

Il cervello è separato dalla circolazione sistemica da una struttura non-permeabile che limita gli scambi tra parenchima del cervello e del sangue, chiamato emato - encefalica (BBB). Principalmente composto di cellule endoteliali cerebrali, la BBB dinamicamente interagisce con gli astrociti, microglia perivascolari e neuroni del parenchima cerebrale vicine. Le tre funzioni principali della BBB sono la creazione e il mantenimento dell'omeostasi ionica per funzioni neuronali, rifornimento del cervello con le sostanze nutrienti e protezione dalle lesioni tossiche o ingresso di agenti patogeni1,2, che contribuiscono alla il mantenimento della omeostasi del cervello e sue funzioni3. Questa barriera è così efficiente che solo pochi farmaci possono attraversare la BBB,4,5. Allo stato attuale, i metodi disponibili per predire se una molecola passa la BBB e diffuso nel cervello sono costituiti ex vivo studi sul monitoraggio di immagine materiale, autopsia del cervello di volontari umani di MRI (risonanza magnetica) o PET (emissione della posizione la tomografia) o farmacodinamica e farmacocinetici studi preclinici in animali6,7,8. Queste tecniche e modelli hanno alcune limitazioni, come la risoluzione limitata dell'animale domestico e la bassa sensibilità di MRI6,8, la difficoltà di quantificare molecole (cioè, le molecole dell'anticorpo basato per esempio) che male penetrare il cervello7e per il preclinici studia il loro costo elevato e la località di sperimentazione animale.

L'ultimo punto è importante perché, secondo il 3R regole, (sostituzione, affinamento e riduzione dei test sugli animali) le amministrazioni di regolamentazione hanno chiesto che i ricercatori sviluppano urgentemente scientificamente accurata alternativa all'animale sperimentazione9,10,11,12,13,14,15.

Negli ultimi decenni, diversi modelli in vitro di BBB sono stati proposti16,17,18 coltivando il filtro membrana inserisce le cellule endoteliali da diverse specie come il mouse, ratto, bovino e suino. Per quanto riguarda la specie umana, la disponibilità di scarsa e difficile di cellule primarie richiesto ai ricercatori di sviluppare modelli umani basati su cellule endoteliali immortalizzate cervello o cellule staminali umane19,20, 21. Queste barriere sono surrogati corretto in vitro di BBB a condizione che esprimono gli indicatori delle cellule endoteliali, marcatori di stretta della giunzione, trasportatori di efflusso, vettori soluti, recettori e rispondere a stimoli endoteliale 20. Alcuni modelli BBB utilizzando filtro membrana inserti rivestiti da cellule endoteliali e altri tipi di cellule (cioè, gli astrociti, neuroni o periciti22,23,24) sono stati analizzati. L'obiettivo di queste co-culture era di aumentare le caratteristiche fisiche di BBB, approfittando della secrezione di fattori solubili da astrociti/neuroni o periciti.

Tuttavia, nessuno di questi modelli include il parenchima cerebrale per studiare e prevedere il destino di un candidato della droga una volta ha superato la barriera. Di conseguenza, il nostro obiettivo era quello di costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di cellule cerebrali miste in un unico kit. Il BBB-Minibrain utilizza un sistema di cultura costituito da un filtro poroso inserito in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule del multiwell. Il filtro è ricoperto con cellule hCMEC/D3, una linea di endothelial delle cellule di cervello umano che è stata dimostrata altamente affidabile per droga BBB test25,26,27, per formare la BBB. Il Minibrain, che è una cultura co-differenziata dei neuroni umani e astrociti derivati dal NTera/Cl2.D1 cella linea28,29 misto insieme con la linea cellulare umana microglial CHME/Cl530 in rapporto corrispondente alla microglia vs rapporti di neuroni-astrociti del cervello31, è coltivata anche nella parte inferiore della piastra.

Oltre a studiare il passaggio di farmaci attraverso la barriera emato-encefalica e il loro destino nel parenchima, l'interfaccia di emato-encefalica in cellulo modello potrebbe essere un potente strumento per affrontare l'ingresso di agenti patogeni nel cervello (neuroinvasiveness), la dispersione nel cervello (neurotropism) e la tossicità (neurovirulence) che possano esercitare sulle cellule di parenchima del cervello. Studi neurovirulence e neuroinvasiveness sarebbero beneficiare dello sviluppo di un efficiente modello di cellulo ed essere vantaggioso sostituire modelli animali. Utilizzando il kit di BBB-Minibrain32, abbiamo dimostrato il fenotipo neuroinvasive di rari mutanti virali che accumulato nel ceppo di virus neurotropi francese del Virus della febbre gialla (vale a dire, FNV-YFV33,34) utilizzato per preparare un interrotto il vaccino vivo YFV e il passaggio di una biomolecola neuroregenerative e neuroprotective, chiamato Neurovita (d'ora in poi denominato NV nel manoscritto)35. Perché NV né naturalmente attraversa la membrana delle cellule, né la BBB, NV è stata fusa con la parte variabile (VHH) di un anticorpo di singola catena di lama che attraversa le membrane biologiche, tra cui la BBB e funziona come una cella penetrante molecola (CPM)36. La proprietà CPM di VHH sembra dipendere il punto isoelettrico e la lunghezza dei VHH37.

Questo test cellulo dovrebbe rendere possibile ordinare le molecole che potenzialmente potrebbero attraversare la BBB prima realizzazione di farmacocinetica e farmacodinamica analisi negli animali e idealmente nello stesso tempo essere in grado di prevedere il loro comportamento nel sistema nervoso parenchima. Questo sistema è biologicamente rilevanti e facile da impostare e gestire da professionisti ben addestrati in cella cultura26,29,30,38. L'interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: ridurre i costi di test preclinici su una mano e riducendo l'uso di sperimentazione animale d'altra parte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cella lavoro della coltura di Ntera/CL2. D1 per preparare una co-coltura di hNeurons post-mitotici e hAstrocytes (NT2-n/a)

Nota: Questo è il componente di Minibrain (Figura 1).

  1. Coltura del Ntera/Cl2.D1
    1. Rimuovere una fiala di cellule congelate dal serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.
    2. Scongelare le cellule rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
    3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di terreno DMEM F12 completo (per volta Eagle Medium di Dulbecco: medio di miscela nutriente F-12) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), glutamina 2mm, 100 UI di penicillina e streptomicina µ g 100 (cioè, completare Medio DMEM F12).
    4. Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA). Dissociare il pellet in 2 mL di terreno DMEM F12 completo.
    5. Trasferire in un matraccio di cultura del tessuto T75 in polistirolo con trattamento specifico per le cellule aderenti sensibili (T75Cell+) che contiene 13 mL di terreno DMEM F12 completo.
    6. Coltura di cellule in un incubatore mantenuto a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza (vale a dire, circa 5 giorni). Sostituire il terreno ogni 2-3 giorni.
  2. Subcoltura del Ntera/Cl2.D1 e amplificazione
    1. Rimuovere il supporto dal pallone.
    2. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) completato con Ca2 + e Mg2 +.
    3. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di soluzione di EDTA (conservati presso RT).
    4. Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0.05% tripsina, 0,02% EDTA) e incubare per 2 minuti a TA.
    5. Agitare il matraccio e assicurarsi che le cellule si staccano dalla superficie plastica.
    6. Aggiungere 10 mL di terreno DMEM F12 completo per inattivare la tripsina, trasferire in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g a TA.
    7. Dissociare la pallina con 10 mL di terreno completo e uso 1 mL per inoculare ogni nuova bottiglia contenente 14 mL di terreno DMEM F12 completo.
      Nota: Trenta boccette T75 Cell+ sono necessari per ogni differenziazione.
    8. Incubare le beute a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza.
  3. Differenziazione di NTera/Cl2.D1 in co-coltura umana del neurone-Astrocita
    Nota: Questo è il componente principale della Minibrain.
    1. Al giorno 0, dissociare le cellule con tripsina-EDTA come descritto al punto 1.2 e dissociare il pellet cellulare di ciascuna beuta con 2 mL di terreno DMEM F12 completo.
    2. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (corrispondente a 5 x 106 cellule) a 60 capsule di Petri in plastica di diametro 85 mm che contiene 11 mL di terreno DMEM F12 completo.
      Nota: Le celle non verranno collegato alla plastica e saranno aggregato a formare pseudo neurosfere (Vedi foto nel pannello inferiore della Figura 1). Incubare il 60 capsule di Petri a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità per un giorno.
    3. Al giorno 1, aggiungere 1 mL di terreno DMEM F12 completo completato con 130 µM di acido all-Trans retinoico (ATRA) a capsula di Petri (concentrazione finale ATRA 10 µM) e restituire le piastre a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità per 24 h.
    4. Al Day 2, trasferire molto attentamente il supporto che contiene sfere di cella di ogni Petri Dish in una provetta da 50 mL e centrifugare per 10 min a 50 x g e RT. dissociarsi attentamente il pellet sciolto con 13 mL di completa DMEM F12 supplementato con 10 µM ATRA e aggiungere th e 13 mL in un nuovo diametro di 85 mm di Petri.
      Nota: Sopra i vari passaggi, è estremamente importante mantenere la densità di sfere alta come la densità ottenuta a giorno 2 (cioè, intorno a una densità di 70%). Pertanto, se la densità della sfera sta abbassando, ridurre il numero totale delle capsule di Petri in base al numero delle cellule.
    5. Ripetere la procedura sopra descritta (punto 1.3.4) ai giorni 4, 6 e 8.
    6. Al giorno 10, ripetere la procedura sopra descritta, ma aggiungere le sfere per le beute T75 Cell+ invece di capsule di Petri. Aggiungere le celle da una capsula di Petri in un matraccio da T75 Cell+ .
    7. A giorni 11, 13, 15 e 17, cambiare il mezzo usato con 14 mL di completo F12 DMEM completate con 10 µM ATRA.
    8. Giorno 19, sostituire il terreno con 14 mL di terreno DMEM F12 completo senza ATRA per fiaschetta.
    9. Giorno 20, dissociare delicatamente le cellule con tripsina/EDTA come segue.
      1. Per ciascuna beuta T75 Cell+ , sciacquare le cellule con 10 mL di PBS completati con Ca2 + e Mg2 +; Incubare le cellule con 4 mL di EDTA per 5 minuti a TA.
      2. Rimuovere con cautela l'EDTA e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA e incubare per 7 minuti a RT. agitare molto delicatamente la beuta e aggiungere attentamente 8 mL di terreno DMEM F12 completo.
      3. Centrifugare 10 per min 160 x g e RT. dissociare il pellet cellulare in 13 mL di terreno DMEM F12 completo e trasferimento in un fiasco di T75 Cell+ .
        Nota: La dissociazione molto delicata con tripsina-EDTA consentirà di recuperare l'ATRA differenziato cellule dalle cellule teratocarcinoma originale, che sono fortemente collegate agli articoli in plastica.
    10. Al giorno 21, rimuovere il supporto e le cellule morte. Aggiungere 14 mL di completa DMEM F12 supplementato con 5% FBS, glutamina 2mm, penicillina 100 IU, 100 µ g streptomicina e 0,5 µM di AraC (citosina β-D-arabinofuranoside) (completare 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. A 23 giorni, 25 e 28, Sostituisci utilizzato medio con 14 mL di 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. A 29 giorni fino a 49 (ogni due giorni), Sostituisci utilizzato medium con 14 mL di terreno DMEM F12 completo completato con 5% di siero bovino fetale, glutamina 2mm, 100 UI di penicillina, 100 µ g streptomicina, 5 µM di FudR (5-fluoro-2' deoxyuridine) e 10 µM Urd (uridina) (completare 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Al giorno 50, Sostituisci utilizzato medio con 14 mL di completa DMEM F12 supplementato con 5% FBS, glutamina 2mm, 100 UI di penicillina, 100 µ g streptomicina e 10 µM Urd (completare 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. In 51 giorni fino a 95 (due volte a settimana), Sostituisci utilizzato medio con 14 mL di completare 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Nota: Le cellule possono essere usati per esperimenti da giorno 51 ma non oltre il giorno 95. L'uso di trattamenti seriali con inibitori della mitosi permette di recuperare la popolazione pura di co-coltura di hNeuron post-mitotici e hAstrocytes (NT2-n/a).
    15. Per le cellule del seme, procedere con trypsinization dolce come descritto per il giorno 20.

2. cellula cultura lavoro di umana microglial cells CHME/Cl5

Nota: Questo è il componente di microglial del Minibrain (Figura 1).

  1. Coltivando l'umano microglial cells CHME/Cl5
    1. Rimuovere una fiala di cellule congelate nel serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.
    2. Scongelare rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
    3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di terreno DMEM F12 completo completato con 5% di siero bovino fetale, glutamina 2mm, 100 UI di penicillina e streptomicina di 100 µ g (cioè completa 5% FBS DMEM F12 medio).
    4. Centrifugare a 200 x g per 5 min a RT. dissociarsi la pallina con 2 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5%.
    5. Trasferire in un pallone di T75 Cell+ contenente 13 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5%.
    6. Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza. Sostituire il terreno ogni 2-3 giorni.
  2. Subcoltura le cellule microgliali umano CHME/Cl5
    1. Rimuovere il mezzo di dal pallone.
    2. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di PBS completati con Ca2 + e Mg2 +.
    3. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di soluzione di EDTA (conservati presso RT).
    4. Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 2 minuti a TA.
    5. Agitare il matraccio e assicurarsi che le cellule si staccano dalla superficie plastica.
    6. Aggiungere 10 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5% per inattivare la tripsina, trasferire in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g e RT.
    7. Dissociare la pallina con 10 mL di terreno completo e uso 1 mL per inoculare ciascuna beuta nuovo contenente 14 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5%.
    8. Incubare le beute a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza.

3. cultura lavoro con la hCMEC/D3 per rivestire inserti porosi e preparare BBB

  1. Coltura di cellule endoteliali umane hCMEC/D3 (Figura 2)
    1. Diluire il tipo io la spia del collagene a 01:30 con acqua sterile puro (grado di coltura delle cellule).
    2. Trasferire 10 mL in un matraccio da T75 Cell+ e incubare 2 ore a 37 ° C, 5% CO2 e incubatore di umidità 95%.
    3. Rimuovere la soluzione di collagene e sostituirlo con 15 mL di medium delle cellule endoteliali supplementato con 10 mM HEPES (denominati medium completo cellulare endoteliale).
    4. Rimuovere una fiala di cryo di cellule nel serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.
      Nota: Le cellule sono state coltivate, e un sacco di seme è stato effettuato come descritto dal produttore. La linea cellulare è coperto da un accordo di trasferimento di materiale biologico. Le cellule sono ottenute al numero 25 di passaggio e non devono essere utilizzate oltre il passaggio 35.
    5. Scongelare rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
    6. Trasferire le cellule nel matraccio T75 Cell+ e restituire il pallone a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità per 2-4 h.
    7. Rimuovere con attenzione il mezzo senza perdere o la rimozione delle cellule. Sciacquare le cellule una volta con 10 mL di terreno completo delle cellule endoteliali.
    8. Aggiungere 15 mL di terreno completo delle cellule endoteliali.
    9. Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 100% confluenza (non meno di 4 giorni) senza cambiare il mezzo.
  2. Subcoltura hCMEC/D3 per preparare l'inserto della BBB
    1. Rivestire una nuova staffa T75 Cell+ o inserti con il tipo I del collagene del ratto come descritto in precedenza (punto 3.1).
    2. Rimuovere il supporto dal pallone. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di PBS completati con Ca2 + e Mg2 +.
    3. Aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 5 minuti a 37 ° C.
    4. Agitare il matraccio e assicurarsi che le celle sono completamente staccate dalla superficie plastica.
    5. Aggiungere 4 mL di terreno completo delle cellule endoteliali per inattivare la tripsina.
    6. Con una pipetta di plastica da 5 mL, meccanicamente dissociare le cellule ad aspirazione e lavando la sospensione cellulare mentre mantenendo la pipetta 5ml al fondo del matraccio, almeno 5 volte.
    7. Contare le celle e USA 5 x 104 cellule/inserto per una cultura di membrana ben poliestere 12 inserti inserto e 2 x 106 cellule per un pallone da T75 Cell+ . Preparare anche tre filtri senza cellule per esperimenti con gli inserti di poliestere membrana cultura PELy (cioè, permeabilità di cellule endoteliali da vedere Lucifero giallo sotto il paragrafo 4.2).
    8. Incubare le boccette o inserti a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 100% confluenza.
    9. Non modificare il mezzo per boccetta T75 Cell+ fino a un nuovo passaggio. Al contrario per BBB sulla cultura di membrana in poliestere inserti: sostituire il terreno ai giorni 2 e 4, utilizzare il BBB per esperimenti al giorno 6.

4. costruzione e controllo di qualità del BBB-Minibrain (Figura 2)

  1. Creazione di un poliestere di BBB-Minibrain cultura membrana inserire dispositivo (Figura 2B)
    1. Crescere le cellule hCMEC/D3 su 12 ben poliestere cultura membrana inserire filtri per 6 giorni su medium cellulare endoteliale prima del loro utilizzo per l'esperimento.
    2. Rivestire un piatto ben 12 con poli-D-lisina (1 mL/pozzetto, 10 µ g/mL, 4 h a RT) e poi laminina (1 mL/pozzetto, 1 µ g/mL, pernottamento presso RT).
    3. Rimuovere la laminina e aggiungere 1 mL di medium di endothelial delle cellule completate con 5% FBS (media di 5% delle cellule endoteliali).
    4. Incubare per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    5. Delicatamente tripsinizzano il NT2-n/a (come descritto al punto 1.3.9) e CHME/Cl5 (come descritto al punto 2.2) e dissociare il pellet cellulare con supporto completo delle cellule endoteliali.
    6. Contare le celle, mix 3.6 x 105 NT2-n/a e 0,4 x 105 CHME/Cl5 cellule/pozzetto e piastra ben seme il 12.
    7. A T = 24 h (24 h dopo la semina): cambiare il mezzo usato con medium fresco completo endothelial delle cellule (cellule Minibrain e cellule endoteliali) e trasferire il filtro hCMEC/D3 poliestere membrana cultura inserto sulla parte superiore delle cellule Minibrain. Incubare la BBB-Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
      Nota: Il BBB-Minibrain sarà quindi composto da uno strato di cellule endoteliali umane hCMEC/D3 il filtro isolando il compartimento luminal (o compartimento di "sangue") e di una coltura mista di cellule umane hNT2-n/a e hCHME/Cl5 (Minibrain) nella parte inferiore di ben definizione il comparto abluminale (o vano "cervello") (Figura 2B).
  2. Convalida della permeabilità endoteliale del BBB-Minibrain (controllo qualità) (Figura 2)
    1. Preparare il tampone di trasporto (TB), che è HBSS (Hanks' equilibrata soluzione salina) buffer con Ca2 + e Mg2 + completati con piruvato di sodio 10 mM HEPES e 1 mM.
    2. Preparare 12 pozzetti con 1,5 mL di tampone di trasporto per pozzetto.
    3. T = 0, rendere fresca buffer di trasporto integrato con 50 µM Lucifer Yellow (LY-TB).
    4. Invertire ogni filtro capovolta per rimuovere con cautela il mezzo senza intaccare la barriera endoteliale delle cellule.
    5. Collocare il filtro sulla piastra ben 12 riempita e aggiungere 0,5 mL di LY-TB.
    6. Incubare le piastre in un incubatore a 37° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    7. A T = 10 min trasferimento i filtri su TB nuovo riempito 12 piastre a pozzetti e tenere il vano abluminale della prima piastra per lettura OD.
    8. A T = 25 min, ripetere il passaggio 4.2.7.
    9. A T = 45 min, interrompere il trasporto rimuovendo i filtri dalle piastre. Tenere abluminale e luminal scomparti per misure OD.
    10. Trasferimento in un buio 96 pozzetti dei campioni: 10 µ l con 190 µ l TB per la LY-TB e i vani di luminal, 200 µ l di campione per i comparti abluminale.
    11. Misurare la fluorescenza della LY-TB presenti nei diversi campioni a λ428 nm λ535 nm (lunghezza di eccitazione e di emissione delle onde rispettivamente).
    12. Calcolare la permeabilità endoteliale (Pe) verso LY-TB (PeLY) secondo Siflinger-Birnboim, A et al (1987)39 e Da Costa, A et al (2018)34 utilizzando la formula:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) e PeLY= PSe/S.
      Nota: PSf è la permeabilità del filtro senza cellule, PSt è la permeabilità del filtro con le cellule, PSe è la permeabilità del tempo monostrato endoteliale la superficie di monostrato, S è la superficie di strato monomolecolare (per un filtro ben 12 = 1,12 cm2 ), PeLY è espressa in cm/min. Per hCMEC/D3 PeLY dovrebbe essere compresa tra 0,7 e 1,2 x 10-3 cm/min a seconda principalmente degli FB utilizzati negli esperimenti. Importante: un PeLY superiore a 1.2 significa che la BBB non è abbastanza stretta e qualche perdita può essere osservata. Eliminare queste barriere.

5. uso di BBB-Minibrain per evidenziare la presenza di particelle virali neuro-invasivo in un campione di vaccino Virus della febbre gialla, il virus neurotropi francese, YFV-FNV 34 (Figura 3)

  1. Attraversamento di BBB e moltiplicazione del virus di febbre gialla nella Minibrain
    1. Utilizzare il BBB-Minibrain preparata come descritto nel passaggio 4.1.7 24 h prima dell'aggiunta del virus; sostituire il mezzo per mezzo di 2% FBS endothelial delle cellule.
      Nota: È estremamente importante evitare di modificare il mezzo appena prima di aggiungere il virus. Cambiando il mezzo può attivare le cellule endoteliali umane e transitoriamente aprire la barriera che permetterà il passaggio del virus. Qui il mezzo è cambiato 24 h prima di iniziare l'esperimento.
    2. T = 0, aggiungere 3500 placca formando unità (PFU) di YFV-FNV diluito in 50 µ l del 2% medio delle cellule endoteliali FBS molto attentamente sulla parte superiore del vano luminal. Il controllo BBB-Minibrain viene inoculato con 50 µ l di terreno di cellule endoteliali di FBS 2% senza virus. Determinare PeLY il compagno bene.
    3. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    4. Dopo 24 h, rimuovere il dispositivo di filtro membrana in poliestere inserti di cultura e determinare PeLY, campione 1 mL dal vano abluminale e titolare il virus come descritto da A. da Costa et al (2018)34. Sostituire il mezzo con mezzo di fresco 2% FBS endothelial delle cellule.
    5. Incubare la BBB-Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    6. Dopo 72 h, assaggiare il mezzo dal vano abluminale e titolare il virus, e/o estrarre il RNA dalle cellule Minibrain per analisi di espressione genica come descritto da A. da Costa et al (2018)34.
  2. Amplificazione delle varianti neurotropic di YFV-FNV sulle cellule Minibrain da passaggi consecutivi
    1. Uso Minibrain celle rivestite 12 piastre a pozzetti (vale a dire punti 4.1.6 e 4.1.7).
    2. In fase di lettera h 0, aggiungere 3.500 placca formando unità di YFV-FNV diluito in 50 µ l di 2% FBS delle cellule endoteliali terreno molto attentamente sulla parte superiore delle cellule (luminal vano).
    3. Dopo 1 h, rimuovere il supporto con l'inoculo di virus e sostituire con mezzo di fresco 2% FBS endothelial delle cellule.
    4. Dopo 48 h, campione 500 µ l di terreno di coltura e infettare cellule fresche di Minibrain
    5. Dopo 120 ore, campione 500 µ l di terreno di coltura e infettare cellule fresche di Minibrain.
    6. Dopo 192 h, salvare il terreno di coltura (= virus stock arricchito) ed estrarre il RNA dalle cellule Minibrain per analisi di espressione genica come descritto da A. da Costa et al (2018)34.

6. uso di BBB-Minibrain per studiare il cervello delle cellule targeting di una biomolecola e incrocio di BBB

  1. Trasporto attraverso la Bee di un neurone targeting biomolecule
    1. Utilizzare il Minibrain-BBB preparato come descritto passo 4.1.7.
    2. Al punto di tempo 0 h, aggiungere la biomolecola (nell'esempio fornito nella sezione risultato 58.75 ng/BBB delle molecole delle cellule permeante NeuroTag-NV sono stati aggiunti a BBB-Minibrain inserire.
    3. Incubare la BBB-Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    4. Dopo 24 h, rimuovere il dispositivo di filtro membrana in poliestere inserti di cultura e determinare PeLY, quindi macchiare le cellule di Minibrain per hNeurons dei neurofilamenti Nf200 e rilevare la presenza di biomolecole in Minibrain (nell'esempio fornito nel risultato sezione, NeuroTag-NV è stato rilevato usando un anticorpo diretto contro il Strep-Tag che contiene35,40).
  2. Trasporto attraverso la Bee di una biomolecola neuroregenerative e neuroprotective successive analisi nel Minibrain dopo la biomolecola ha attraversato la BBB
    1. Utilizzare il Minibrain-BBB preparato come descritto nel passaggio 4.1.7.
      Nota: Per molecole targeting solo i neuroni, le cellule Minibrain possono essere sostituite dai neuroni cellule (NT2-N) solo38.
    2. Al punto di tempo 0 h, aggiungere 58.75 ng/BBB-Minibrain bene delle molecole delle cellule permeante NV (forma attiva CPM-NeuroTag-NV, modulo non attivo CPM-NeuroTag-NVΔ) descritto da C. Prehaud et al (2014)35.
    3. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    4. Dopo 4 h, rendere le ferite individuali con un ago per iniezione (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgio) sulle cellule del Minibrain. Fare almeno 10 graffi su ogni singolo bene. Determinare PeLY sul compagno bene.
    5. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    6. Dopo 8 h, sostituire il mezzo nel vano abluminale dal mezzo fresco e completo delle cellule endoteliali.
      Nota: È importante sostituire il mezzo in questa fase poiché il ferimento delle cellule Minibrain può portare alla morte delle cellule e quindi il rilascio di composti citotossici.
    7. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    8. Dopo 48 h, macchiato le cellule per la rigenerazione dell'assone di hNeurons come descritto da C. Prehaud et al (2013)40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il BBB-Minibrain è un cellulo in sperimentale modello di interfaccia sangue-cervello.

Il BBB-Minibrain è impostato sull'apparato di inserto cultura di membrana in poliestere per imitare un compartimento sangue al piano superiore e un cervello al livello inferiore dell'interfaccia sangue-cervello (Figura 2AB). Si compone di un vano luminal con le cellule endoteliali hCMEC/D3 sul filtro formando il BBB ed un vano abluminale, che contiene il Minibrain tri-cultura umana delle cellule cerebrali (neuroni, astrociti e microglia). Le cellule di Minibrain esibiscono una tri-cultura classica miscelati popolazione fenotipo (Figura 1, pannello inferiore di destra) e marcatori rapidi specifici di ciascun tipo di cella, come mostrato da Costa r. et al., 201834.

L'uso di hCMEC/D3 strato a BBB-Minibrain permette di ottenere una forte barriera con un Pe mediaLY di 0.95e-03 cm/min e una media Trans endoteliale elettrico resistenza (TEER) di 51.89 Ω/cm2. Questi valori sono nella gamma di valori migliori mai descritti per una linea di cellule endoteliali umane27,41 in tale membrana in poliestere cultura inserto sistema (Figura 2). Queste cellule esprimono marcatori proteici giunzione stretta come ZO-1 e caderina come previsto per la quantificazione di permeabilità (dati non mostrati). Esse esprimono anche tutti i sottoinsiemi dei recettori, efflusso trasportatori o trasportatori [recettori: LDLR, del ricevitore della lipoproteina di densità bassa; LRP1, del ricevitore della lipoproteina di densità bassa ha collegato la proteina 1; INSR, recettore dell'insulina; LEPR, recettore della leptina; LU, molecola di adesione delle cellule basali; TFRC, CD71 antigene; AGER, avanzata glicosilazione del ricevitore di prodotto finale. Trasportatori di efflusso: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 della proteina; ABCC5, ABCC5 della proteina. Trasportatori: STRA6, stimolata dalla proteina del gene acido 6 di retinoico; SLC2A1, trasportatore del glucosio di tipo 1; SLC7A5, trasportatore di grandi aminoacidi neutri 1; SLC1A1, proteina di famiglia 1 soluto carrier; SLC38A5, proteina di membro 5 di soluto carrier famiglia 38; SLC16A1, monocarboxylate trasporto proteina 1], che sono proteine chiave pertinenti per loro funzioni biologiche (Figura 2D)21.

Il BBB-Minibrain permette di selezione, amplificare e caratterizzare neuroinvasive rare varianti virali da una preparazione di vaccini di virus vivi.

Il dispositivo di cultura BBB-Minibrain è stato utilizzato come un cellulo in test di isolamento che permette e amplificazione delle varianti rare neuroinvasive/neurovirulent potenzialmente presenti nel virus di febbre gialla (YFV) vaccini virali vivi42. YFV è un virus viscerotropic targeting per il fegato che non attraversa in modo efficiente la BBB. Il francese virus neurotropo, FNV, fu utilizzato come un vaccino vivo YFV fino il 1980s33,43. FNV è stato trovato per causare neuropathogenesis post-vaccinale nei bambini (0,3-0,4% tra vaccinati) e così è stato interrotto nel 198233,43. Abbiamo usato FNV qui come un prototipo di virus YF che può contenere una percentuale alta di varianti neuroinvasive/neurovirulent42,44. Una preparazione di virus FNV (cioè, 3500 PFU/ml) è stato aggiunto nel vano di luminal di un BBB-Minibrain, il controllo era un BBB-Minibrain che era finto-infetti. Presenza di particelle del virus nel vano di luminal non altera la permeabilità della barriera come misurata 24 ore più tardi dato che il PeLY nei pozzetti virali non era diverso dal PeLy di pozzetti di controllo (0.80 ± 0,09 x 10-3 cm/min e 0,86 ± 0,09 x 10-3 cm/min per PeLY nel controllo e nella YFV-FNV pozzi rispettivamente). Il contenuto del vano abluminale è stato valutato per la presenza di virus di saggio della placca, all'infezione post 24 h. Le cellule Minibrain sono state incubate due giorni oltre a valutare l'amplificazione di neuroinvasive varianti in cellule cerebrali e per monitorare l'espressione genica come descritto sul cartone animato sulla Figura 3A.

Abbiamo rilevato alcuni virus YFV-FNV, che può attraversare la barriera emato-encefalica alle 24 h (media 43 PFU/mL). I virus sono stati amplificati per i prossimi due giorni dalla moltiplicazione del virus all'interno delle cellule di cervello (dire titolo di 4,69 x 104 PFU/mL), (Figura 3B). Di nota, una preparazione di ceppo del vaccino che non causa post-vaccinali neuropathogenesis sarebbe non efficientemente attraversare la BBB in questo sistema come è stato dimostrato da Costa r. et al (2018)34. Abbiamo identificato due biomarcatori della moltiplicazione del virus: l'interferone ha stimolato Gene 15 (ISG15) e l'interferone regolamentazione fattore 7 (IRF7). Le espressioni di questi due biomarcatori sono state stimolate quando questa popolazione virale neuroinvasive era in serie attraversata sulle cellule Minibrain (Figura 3). Questi upregulations misurato da Q-RT-PCR erano strettamente correlate al carico virale (Pearson p rapporto 0.0016 ISG15 e 0,0260 per IRF7).

Permette di BBB-Minibrain entrambi analizzando la possibilità di una biomolecola a superare la barriera e la sperimentazione di tempo stesso se la funzione di biomolecole è stata conservata dopo l'attraversamento di BBB.

NV è una biomolecola derivata dal virus della rabbia che possiede proprietà sorprendente di neuroprotezione e neurorigenerazione40. Questo piccolo polipeptide che naturalmente nessuno attraversa la membrana cellulare né la BBB è stato fuso con un CPM in grado di indirizzare i neuroni. La nostra scelta era di utilizzare la parte variabile (VHH) di un anticorpo di singola catena di lama che attraversa le membrane biologiche, tra cui il BBB36,45 e un NeuroTag targeting neuroni specificamente. NV è stato collegato per la VHH e un NeuroTag, per costruire un CPM-NeuroTag-NV (Figura 4A) e per il VHH solo per costruire un CPM-NeuroTagΔ-NV manca il NeuroTag specifico permettendo il targeting dei neuroni (Figura 4B). Dopo essere stato inserito nel vano luminal, CPM-NeuroTag-NV (punti verdi) attraversa la barriera emato-encefalica ed era in grado di indirizzare i neuroni umani (in rosso) (Figura 4, D). CPM-NeuroTagΔ-NV attraversa la barriera endoteliale delle cellule (punti verdi) ma obiettivi meno efficientemente i neuroni umani (maggioranza dei puntini verdi si trova di fuori i neuroni) (Figura 4).

Come descritto in precedenza, NV è legata a un VHH e un NeuroTag per costruire un CPM-NeuroTag-NV. Abbiamo fatto lo stesso per NVΔ una forma inattiva di NV carente la parte attiva della NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (Figura 5A). Dopo essere stato inserito nel vano Luminal, CPM-NeuroTag-NV attraversa la barriera emato-encefalica ed era in grado di rigenerare gli assoni dei neuroni umani dopo la ferita (figura 5B, pannello di destra), al contrario di CPM-NeuroTag-NV Δ la forma inattiva di NV (figura 5B, sinistra pannello)40. Queste proprietà sono state analizzate in due tipi di protocolli; un pre-esposizione (Figura 5) o in un protocollo di esposizione post (Figura 5). Quando applicato prima l'assone graffiare (4h, H4), CPM-NeuroTag-NV innesca il neuroprotection dei neuroni feriti e la rigenerazione assonale al contrario della simulazione trattata cellule (cioè il controllo) o le cellule trattate con CPM-NeuroTag-NVΔ (media rigenerazione 91% e 12% - 10% rispettivamente, Figura 5). Quando la biomolecola è stato applicato dopo le lesioni axonal (1 ora, H1, Figura 5) al fine di imitare un protocollo terapeutico post-esposizione, CPM-NeuroTag-NV è ancora in grado di rigenerare gli assoni al contrario della forma disabili di CPM-NeuroTag-NV Δ ( vuol dire rigenerazione 85% e del 5,1%, rispettivamente) (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: modello di The Minibrain. Tabella di tempo delle culture NT2-n/a e CHME/Cl5 (pannello superiore). Fotografie (pannelli inferiori) della linea cellulare originale (Ntera/cl2. D1) nel pannello di sinistra, la pseudo neurosfere ottenuta dopo il trattamento di ATRA nel pannello superiore centrale, il CHME/Cl5, nel pannello inferiore centrale e il triculture di Minibrain (Cristal violetto colorazione), nel pannello di destra, con conseguente della miscela di NT2-n/a e CHME / CL5 culture. Scala bar 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: il modello di BBB-Minibrain. A. calendario delle culture hCMEC/D3 e fotografia del dispositivo BBB-Minibrain: un cultura di membrana in poliestere inserti-filtro con barriera endoteliale hCMEC/D3 è tenuto con una pinza prima di essere inserito in un pozzetto di un 12 pozzi cell piastra di coltura. B. Cartoon che descrive il dispositivo con il luminal vano (sangue) contenente la barriera endoteliale delle cellule e vano abluminale (cervello) che contiene le cellule di Minibrain (neuroni umani, astrociti e microglia). C. misure rappresentative del permeabililty di BBB-Minibrain di TEER (cioè, transendoteliale resistenza elettrica) su tre dispositivi o permeabilità a LY (cioè, PeLY) su cinque filtri. D. analisi di espressione di q-RT-PCR dei recettori, trasportatori di efflusso e trasportatori su cellule endoteliali hCMEC/D3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: modello The BBB-Minibrain permette l'identificazione di varianti neuroinvasive tra preparazione di vaccino vivo YFV. R. pianificazione dell'esperimento. B. quantificazione dei virus che hanno attraversato la BBB di placca che forma la titolazione di unità (PFU) di virus vivo (ogni punto rappresenta una membrana di poliestere cultura inserti esperimento). C. terreno di espressione del gene ISG15 e IRF7 misurata da q-RT-PCR in funzione del numero di particelle virali del carico virale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: The BBB-Minibrain permette di testare neuroregenerative biomolecola proprietà: targeting specifico dei neuroni quando NV è fusa a NeuroTag. A. Cartoon di CPM basato NV (cioè, CPM-NeuroTag-NV) contenente un NeuroTag specifico per indirizzare specificamente del neurone. B. Cartoon di CPM basato NV eliminato di NeuroTag (cioè, CPM-NeuroTagΔ-NV). C. fotografie di immunofluorescenza rappresentativo dei neuroni umani. Scala bar 50 µm. 200 NF in rosso, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV in verde, nuclei in blu. D. CPM-NeuroTag-NV molecole possono attraversare la BBB e neuroni umani di destinazione più efficientemente di CPM-NeuroTagΔ-NV. Neuroni infetti e la popolazione totale dei neuroni sono stati contati in triplice copia diapositive dopo immunolabeling. Totali neuroni corrispondono a NF200 cellule positive (in rosso). Le celle di rosso associate a uno o più punto verde (CPM-NV) viene conteggiato come un neurone positivo. T-test di student spaiati due code * * *p = 0,0002. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: The BBB-Minibrain permette di testare neuroregenerative biomolecola proprietà: incrocio di BBB non altera le proprietà neuroregenerative di NV. A. Cartoon di CPM basato NV (cioè, CPM-NV) e la sua controparte disabili (cioè, CPM-NVΔ). B. la rigenerazione assonale di CPM-NV in un in cellulo scratch test (pannello di destra). CPM-NVΔ non può attivare la rigenerazione dell'assone (pannello sinistro), scala bar 100 µm. C. CPM-NV può attraversare la cellula endoteliale e rigenerare gli assoni sui neuroni di BBB-Minibrain quando applicato 4 h prima della lesione: schema (pannello superiore) dell'esperimento; (pannello inferiore) quantificazione della rigenerazione. D. CPM-NV è inoltre attiva in un protocollo terapeutico quando viene applicato 1 h dopo il ferimento: schema (pannello superiore) dell'esperimento; (pannello inferiore) quantificazione della rigenerazione. T-test di student spaiati due code * * *p < 0,0001. Rigenerazione è stata calcolata da esperimenti in triplice copia (> 800 neuroni contati) dopo la macchiatura delle cellule neuronali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo articolo abbiamo dimostrato come costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di misto cervello cellule cerebrali (Minibrain) in un unico kit. Questo sistema è biologicamente rilevanti, facile da impostare e gestire per gli sperimentatori ben addestrati nella coltura delle cellule.

Come per qualsiasi altro modello in vitro di BBB, otterrebbe risultati affidabili se drastica controllo di tenuta della barriera viene applicato. Inserti devono essere accuratamente testati per permeabilità e con valori di permeabilità inadeguata (cioè, un PeLY superiore a 1.2) qualsiasi inserto deve essere scartati.

Campioni FBS dovrebbero essere accuratamente collaudati per identificare un batch che non consente di disattivare le caratteristiche della BBB. Lo stesso Consiglio può essere fatto per quanto riguarda il mezzo di veicolo nel quale virus particelle o biomolecole sono diluiti. Si consiglia inoltre di mantenere piccolo come possibile il volume di sospensione biomolecola o virus, al fine di non alterare la composizione media del comparto luminal. Differenziazione della cultura umana co-coltura del neurone/astrociti il Ntera/CL2. D1 è una tecnologia collaudata. Contrariamente ai neuroni umani che sono post-mitotici, gli astrociti sono ancora divisione delle cellule. A volte è osservato alta proliferazione delle cellule astrociti. Se questo accade, la cultura di Minibrain deve essere scartato. Le cellule CHME/Cl5 che abbiamo utilizzato nel nostro laboratorio sono stati fenotipizzate per dimostrare che erano di origine umana (Homo sapiens CCNT1 phenotyping). C'è il rischio che alcuni lotti CHME utilizzati in alcuni laboratori possono essere dell'origine di ratto (Rattus norvegicus) come sostenuto da Garcia-Mesa Y. et al (2017)46. Pertanto, si consiglia di verificare l'origine della linea cellulare CHME/Cl5.

Il sistema tri-cultura umana di Minibrain tra cui post mitotica neuroni (principalmente dopaminergico), astrociti e una linea di cellule microgliali, imita un ambiente semplificato e cerebrale. Questo sistema può ancora essere migliorato. Si può immaginare aggiungendo oligodendrociti alla cultura con l'obiettivo di ottenere gli assoni myelinated o cellule microglial primarie. Il minibrain può essere sostituita con una coltura mista di cellule staminali umane19,20,21. Tuttavia, la variabilità tra lotti diversi di cellule dovrà essere acquistato padronanza di con attenzione. La complessità di BBB-Minibrain può anche essere aumentata aggiungendo periciti23. Nelle nostre mani, questo miglioramento è stato ostacolato dalla difficoltà di avere un accesso affidabile a periciti di origine umana.

Abbiamo dimostrato la fattibilità e l'utilità di questo kit che imita l'interfaccia sangue-cervello, isolare i) raro neuroinvasive le particelle del virus da un campione di vaccino della febbre gialla che si sono evoluti la proprietà per entrare nel cervello attraverso la barriera emato-encefalica, e ii). amplificare queste sottopopolazioni neuroinvasive nella Minibrain tri-cultura che imita un parenchima cerebrale semplificata. Future applicazioni è possibile estendere il controllo di qualità di altri vaccini vivi come il vaccino parotite e per promuovere la BBB-Minibrain come mezzo per studiare le caratteristiche di neurovirulence in vitro.

Il secondo studio pilota era di mostrare che un farmaco candidato passa attraverso la BBB e raggiunge il Minibrain, senza perdere le sue proprietà neuro-rigeneratori. Siamo fortemente convinti che la BBB-Minibrain può consentire importanti progressi nella pre-selezione delle molecole prima di rilasciarli per test preclinici. L'uso di BBB-Minibrain dovrebbe agevolare l'attuazione di 3Rs misure volte a ridurre l'uso di sperimentazione animale per membreo analisi e di ricerca sperimentale.

Complessivamente con il successivo sviluppo di approcci in silico (modello di computer), presto saremo in grado di identificare farmaci candidati con un'alta probabilità di attraversare la BBB, lo sviluppo di un modello 3D In cellulo che imita il sangue di parenchima nervoso interfaccia sarebbe di grande aiuto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

La proprietà intellettuale del sistema era i brevetti a cui fa riferimento a 32, 35 e 38.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni interne dal Institut Pasteur inclusa una sovvenzione Incitative (PTR 435) e da una sovvenzione "Contrat de Soutien à la Recherche" fornita da Sanofi Pasteur a Institut Pasteur. A. da Costa è stato sostenuto da Sanofi-Pasteur sovvenzione e Florian Bakoa è destinatario di una borsa di dottorato fornita da ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Siamo grati a Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florence Miller per utili discussioni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Tags

Neuroscienze numero 146 BBB-Minibrain in cellulo modello neurone umano hCMEC/D3 Ntera/Cl2D.1 di cellule endoteliali umane Astrocita umano umano microglial cells CHME/Cl5
Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa,… More

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter