Summary
Una fístula aortófica fue creada perforando la aorta renal murina a través de ambas paredes en la vena cava inferior y fue seguida por la creación de una estenosis en su salida a través de la ligadura parcial de la vena cava inferior. Este modelo reproducible se puede utilizar para estudiar la estenosis venosa central.
Abstract
La estenosis venosa central es una entidad importante que contribuye a la insuficiencia de la fístula arteriovenosa (AVF). Un modelo de AVF murino fue modificado para crear una ligadura parcial de la vena cava inferior (IVC) en la salida de la fístula, imitando la estenosis venosa central. Se introducen aspectos técnicos de este modelo. La aorta y la CIV se exponen, después de una incisión abdominal. La aorta infrarrenal y la CIV se diseccionan para la sujeción proximal, y la aorta distal está expuesta para la punción. El CIV en el punto medio entre la vena renal izquierda y la bifurcación aórtica se disecciona cuidadosamente para colocar un 8-0 sutura debajo de la CIV. Después de sujetar la aorta y la CIV, se crea un AVF punzándose la aorta infrarrenal a través de ambas paredes en el CIV con una aguja de 25 G, seguido de ligar un catéter intra-venoso (IV) de 22 G y un IVC juntos. Luego se retira el catéter, creando una estenosis venosa reproducible sin oclusión. La aorta y la CIV no se sujetan después de confirmar la hemostasis primaria. Este novedoso modelo de estenosis venosis central es fácil de realizar, reproducible y facilitará los estudios sobre el fallo de la AVF.
Introduction
Las fístulas arteriovenosas (AVF) son los accesos más comunes para la hemodiálisis, con una latencia superior y una infección reducida en comparación con otros accesos como injertos o catéteres venosos centrales. Sin embargo, hasta el 60% de AVF no puede madurar1,2,3; una revisión sistemática reciente informó que las tasas de paciencia primaria en 1 año fueron sólo 60%4. La estenosis a lo largo de la salida venosa causa predominantemente el fracaso de la maduración de la AVF5,6. Hay ciertos lugares característicos propensos a la estenosis proximal a la fístula: el segmento de oscilación yuxtaanastomotica para la fístula radiocéfala, la región del arco cefálico para la fístula braquiocéfala y la vena central de la fístula con catéteres subclavistas ipsilaterales colocados o venas yugulares internas7,8.
La estenosis venosa central es a menudo asintomática en pacientes sin AVF, pero puede causar edema ipsilateral en las extremidades porhipertensión venosa, así como fracaso de la maduración de la fístula cuando se le reta por el flujo de fístula 9. La fisiopatología de la estenosis venosa central probablemente está relacionada con la inflamación y la cascada de coagulación activada después de la colocación del dispositivo. Además, el movimiento constante de la punta del catéter, así como el aumento del flujo de la fístula pueden alterar la tensión de cizallamiento, lo que resulta en la deposición plaquetaria y el engrosamiento de la pared venosa10. Para entender los mecanismos básicos subyacentes a la falla de AVF causada por la estenosis venosa central, se requiere un modelo animal que imita la estenosis venosa central con un AVF.
Hemos establecido un modelo de fístula aortocaval murino que es fácil de realizar y dominar y recapitula el curso clínico de AVF humana. 11 Aplicamos los conceptos y la técnica de varios modelos murinos previamente establecidos para crear un modelo de AVF murino novedoso con estenosis venosa. Introducimos un modelo de fístula de aortocaval murino con una estenosis IVC en la fístula de salida que se puede utilizar para el estudio de la estenosis venosa central.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC).
1. Anestesia y procedimientos preoperatorios
- Esterilice todos los instrumentos y materiales quirúrgicos mediante autoclave. Encienda el dispositivo de soporte térmico para estar seguro de que está caliente (40-42 oC).
- Coloque un ratón C57BL/6 de 9-11 semanas en una cámara de inducción de acrílico y anestetizarlo con isoflurano vaporizado al 2,5% y oxígeno de 0,8 L/min. La inducción de la anestesia toma alrededor de 3 min.
- Retire el ratón de la cámara. Confirme un plano profundo de anestesia con un pellizco de dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del día, un pellizco para la oreja y un pellizco de cola. Coloque el ratón en posición supina en el área quirúrgica y entregue un 2,5% de isoflurano con mascarilla de silicona. Proporcionar buprenorfina a 0,1 mg/kg analgésico y aplicar pomada oftálmica a los ojos.
- Retire el pelaje del lado ventral del cuello hasta la parte inferior del abdomen usando Nair, un removedor de pelo.
- Limpie y desinfecte el sitio quirúrgico utilizando un exfoliante de dos pasos con 10% de povidona-yodo y 70% de isopropanol. Aplique una cortina quirúrgica.
2. Procedimientos operativos
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Exposición de los sitios de abrazaderas y punción
- Preparar instrumentos estériles y usar guantes estériles para mantener la esterilidad durante toda la cirugía.
- Haz una incisión abdominal de línea media profunda en la piel con un bisturí desde el nivel del borde inferior del hígado hasta justo por encima del pubis. Cortar a través de la musculatura con tijeras para abrir la cavidad abdominal.
- Inserte un retractor en el abdomen y tire de los intestinos hacia el lado derecho. Manténgalos húmedos envolviéndolos en una gasa empapada de salina. Retreive la vejiga y las vesículas seminales (en ratones machos) y sáquelas al lado caudal. Diseccionar el mesenteria entre el recto y el retroperitoneo con un soporte de microaguja para obtener una vista completa de la aorta y la CIV.
- Dissección de la aorta infrarrenal y la CIV en bloque de los tejidos retroperitoneales laterales y dorsales circundantes con un soporte de microaguja para coirlos.
- Diseccionar los tejidos circundantes para exponer el sitio de la punción aórtica a aproximadamente tres cuartas partes de la distancia desde la vena renal izquierda hasta la bifurcación aortica.
-
Disección de CIV
- Diseccionar entre la CIV infrarrenal y la aorta inmediatamente distal a la vena renal izquierda. Extienda la disección de forma distal a la mitad entre la vena renal izquierda y la bifurcación aórtica, de modo que la CIV infrarrenal, tanto aguas arriba como aguas abajo de la estenosis, se pueda observar postoperatoriamente.
NOTA: La disección contundente entre la CIV y la aorta se debe realizar de forma inmediata distal a la vena renal izquierda, donde el tejido conectivo entre la CIV y la aorta está relativamente suelto. - Haga una ventana para separar el CIV de la aorta en ese nivel y diseccionar el ICV del tejido circundante. Coloque un 8-0 sutura monofilamento de poliamida en primer lugar debajo de la IVC y la aorta (Figura1A),luego coloque la sutura debajo solamente de la IVC (Figura 1B) tirando del extremo de la sutura a través de la ventana.
NOTA: Dado que el CIV es frágil, disecting a lo largo de la aortica es útil para hacer una ventana para evitar que el CIV, así como pequeñas iVC o ramas aórticas se dañen. Si se produce sangrado, es probable que sea incontrolable. Si el CIV tiene ramas laterales distintas, coloque un 8-0 sutura discada a las ramas.
- Diseccionar entre la CIV infrarrenal y la aorta inmediatamente distal a la vena renal izquierda. Extienda la disección de forma distal a la mitad entre la vena renal izquierda y la bifurcación aórtica, de modo que la CIV infrarrenal, tanto aguas arriba como aguas abajo de la estenosis, se pueda observar postoperatoriamente.
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Creación de AVF
- Doble una aguja de 25 G en un ángulo de 45-60o en un punto de 4 mm desde la punta de la aguja.
- Sujete la aorta infrarrenal y la CIV aplicando un clip microquirúrgico.
- Gire la aorta medialmente y caudalmente agarrando el tejido conectivo que rodea la bifurcación para exponer el sitio de punción de la aorta estirado ligeramente al lado ventral.
- Sosteniendo la aorta en una posición adecuada, perforar a través de la aorta en el IVC utilizando la aguja preparada de 25 G (Figura1C).
- Suelte la aorta y cubra el lugar de la punción con el tejido circundante tirando hacia arriba desde el lado izquierdo de la aorta. Saque la aguja y presione suavemente el sitio de la punción con un hisopo con punta de algodón para la hemostasis.
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Creación de la estenosis del CIV
- Coloque una punta de un catéter de 22 G IV (ver la Tabla de Materiales)sobre el IVC longitudinalmente. Ligar el catéter IV y iVC junto con un 8-0 sutura (Figura1D)y, a continuación, retire el catéter IV.
- Confirme la hemostasis primaria (Figura1E) y luego desenganche la aorta y la CIV. Cubra el lugar de la punción 1 min más para asegurar la hemostasis.
NOTA: No apriete demasiado tiempo para evitar la trombosis IVC distal a la estenosis. - Devolver los órganos a sus posiciones originales y cerrar el abdomen con 6-0 suturas.
3. Procedimientos postoperatorios
- Después del cierre de la herida abdominal, interrumpa la inhalación de isoflurano. Coloque el ratón en una jaula individual sin ropa de cama y coloque la jaula en un dispositivo de soporte térmico para evitar la hipotermia.
NOTA: El ratón se observa hasta que logran y mantienen la recumbencia esternal. Aplicar atención postoperatoria incluyendo analgesia y cuidado de heridas de acuerdo con las recomendaciones de la IACUC local. Para la analgesia utilizamos buprenorfina a 0,1 mg/kg por vía intrasmuscular cada 12 h durante 48 horas siguiendo los procedimientos quirúrgicos y posteriormente según sea necesario. - Confirme la patencia de AVF postoperatoria mediante el ultrasonido Doppler (consulte la Tabla de materiales). Además, mida otras características de recipiente y flujo según sea necesario.
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Representative Results
Los ratones machos se sometieron a la operación mencionada anteriormente para crear un AVF y una estenosis de CIV. Los ratones de control sólo se sometieron a laparotomía y disección de los tejidos que rodean el CIV, por ejemplo, un procedimiento falso, o sólo la creación de una estenosis de CIV sin la creación simultánea de un AVF.
El IVC se observó con ultrasonido Doppler el día 7 después del procedimiento quirúrgico (Figura2). Las áreas de fístula y estenosis del CIV sedetectaron fácilmente en la vista longitudinal (Figura 2C,E). La CIV entre la fístula y la estenosis se dilatió en ratones que tenían un AVF con la estenosis. Las formas de onda de ultrasonido se examinaron en el CIV en el punto de la estenosis (Figura2D,F). En ratones que llevaban una estenosis sola, sin un AVF, el segmento de estenosis mostró una forma de onda venosa con un ensanchamiento más espectral que los ratones accionados por las burlas, pero sin mucha pulstilidad. Sin embargo, en ratones que tienen un AVF, así como una estenosis, el segmento de estenosis mostró una forma de onda pulsátil además de ensanchamiento espectral. La velocidad máxima media del tiempo del flujo en la estenosis en ratones que tenían un AVF con estenosis fue significativamente mayor que la de los ratones que tenían estenosis sola (Tabla1).
El modo de ultrasonido B Doppler se utilizó en vistas transversales para evaluar la CIV el día siete después de la cirugía (Tabla 1). El diámetro medio de la CIV en la estenosis en ratones que tienen estenosis por sí solo fue similar a los ratones que tenían una AVF, así como la estenosis (Tabla 1). El porcentaje de estenosis del CIV se calculó de acuerdo con el método NASCET12. Utilizando el segmento ascendente o el segmento aguas abajo como referencia, el porcentaje de estenosis fue significativamente mayor en ratones que tenían un AVF además de la estenosis (Tabla 1).
Figura 1. Fotos operativas del modelo AVF murino con estenosis venosa. (A) Colocar un 8-0 sutura debajo de la IVC (puntas de flecha azules) y la aorta (puntas de flecha rojas) a medio camino entre la vena renal izquierda (puntas de flecha amarillas) y la bifurcación aórtica, distalmente a cualquier rama grande de IVC si está presente. (B) Coloque la sutura solo debajo del CIV. (C) Después de la sujeción proximal, perforar la aorta a través de ambas paredes y en el CIV. (D) Ate una punta de un catéter IV de 22 G y el CIV junto con la sutura colocada. (E) Retire el catéter y desenganche. Se puede observar el flujo sanguíneo arterial a través de la estenosis de la CIV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Resultados por ultrasonido el día 7 después del procedimiento quirúrgico. Arriba: imágenes representativas de ratones con un procedimiento falso. (A) La imagen en modo B muestra IVC en la vista longitudinal. El lado izquierdo es el lado craneal. (B) Forma de onda de la IVC infrarrenal. Medio: imágenes representativas de ratones con estenosis sola. (C) La imagen en modo B muestra IVC incluyendo la estenosis (asterisco amarillo) en la vista longitudinal. El lado izquierdo es el lado craneal. (D) Forma de onda en el área de la estenosis. Parte inferior: Imágenes representativas de ratones con AVF con estenosis. (E) La imagen en modo B muestra IVC incluyendo fístula (asterisco blanco) y estenosis. El lado izquierdo es el lado craneal. (F) Forma de onda en el área de la estenosis. La barra de escala blanca representa 1 mm. Barra de escala amarilla representa 100 ms. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Estenosis | Sí | Sí | Valor P |
| Avf | No | Sí | |
| Velocidad máxima mediada en el tiempo (mm/s) | 180 | 878 | 0.0023 |
| Diámetro de la estenosis (mm) | 0,62 a 0,01 | 0,63 a 0,01 | 0.3558 |
| % estenosis (upsteam) | 43% | 66% | 0.0159 |
| % estenosis (downsteam) | 42% | 56% | 0.0006 |
Tabla 1. Medición por ultrasonido en el área de estenosis de IVC de cada grupo. Mediciones derivadas por ultrasonido en el área de estenosis iVC de ratones con estenosis sola y ratones que tienen AVF con estenosis el día 7 después de la cirugía. %estenosis (ascendente) á (1 - [diámetro en estenosis / diámetro en el segmento de referencia aguas arriba]) x 100%. %estenosis (aguas abajo) á (1 - [diámetro en estenosis / diámetro en el segmento de referencia aguas abajo]) x 100%. %dilatación á (diámetro en el día postoperatorio 7 / diámetro preoperatorio en el mismo segmento) x 100%. Los valores P se basan en las pruebas t del estudiante, n a 4-6.
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Discussion
El modelo aFIA murino se ha utilizado para estudiar los mecanismos básicos y los eventos moleculares que conducen a la maduración de la AVF13,14. En este estudio, modificamos un modelo aVF murino establecido para crear un modelo de fístula aortocaval murino novedoso con una estenosis IVC en el tracto de salida de la fístula. Nuestro modelo de ligadura es similar a varios modelos murinos descritos anteriormente que utilizan ligadura vascular. Se creó un modelo murino de trombosis venosa profunda utilizando ligadura parcial de CIV con un espaciador de aguja de 30 G15; utilizamos un espaciador de catéter 22 G IV más grande para crear una estenosis más pequeña y así evitar la oclusión trombótica. Se utilizó un modelo murino de ligadura parcial de la arteria carótida para inducir el flujo perturbado, lo que llevó a la aterosclerosis16; nuestro modelo también utilizó una ligadura venosa parcial y, en consecuencia, demostró un flujo perturbado en el CIV en el área de la ligadura parcial.
Se han estudiado los mecanismos subyacentes a la insuficiencia de maduración de la AVF causada por la estenosis venosa de la fístula. Se demostró que los cambios hemodinámicos, incluidas las frecuencias perturbadas de la tensión de cizallamiento, eran factores importantes17,18. Una simulación de dinámica de fluidos computacional mostró un flujo perturbado en la estenosis venosa19,aunque no se han notificado previamente modelos animales de AVF con estenosis venosa. Este modelo de fístula aortocaval murino modificado se puede utilizar para estudiar un AVF con estenosis venosa central. El diámetro de IVC en la estenosis tiene menos variación y más consistencia en este modelo; la ligadura parcial de CIV utilizando un catéter IV aumenta la reproducibilidad de este modelo. Los síntomas clínicos y los signos de estenosis venosa central amenudo se manifiestan sólo después de la creación de la fístula en la extremidad ipsilateral 9. En este modelo, los ratones que tienen una estenosis iCV parcial (<50%) tenía un flujo normal y eran asintomáticos, mientras que la adición de un AVF aumentó el grado de estenosis a un grado que podría causar síntomas (>50%) (Figura 2, Tabla 1). Estos resultados imitan el fenotipo de la estenosis venosis central; el aumento del flujo venoso debido a la presencia de la fístula puede revelar la existencia de estenosis venosis venosa central asintomática, causando hipertensión venosa y fracaso de la maduración de la fístula.
Hay algunos pasos y puntos críticos para mejorar la tasa de éxito y la coherencia del procedimiento. Si el CIV tiene ramas laterales distintas, un 8-0 sutura se coloca distalmente (caudalmente) a las ramas (Figura1). En el modelo original de AVF murino, las ramas laterales de IVC se ignoran típicamente porque la mayor resistencia vascular de las ramas evita que el flujo de la fístula entre en las ramas. Sin embargo, si la estenosis IVC se crea proximalmente a ramas laterales distintas en este modelo, el flujo de fístula puede escapar a las ramas debido a la resistencia vascular por la sutura recién colocada. Para evitar el sangrado masivo, la disección Civ se inicia inmediatamente de forma inferior a la vena renal izquierda y se extiende más de forma inferior hasta el punto en que se va a ligar el CIV. Este paso es la parte más crítica de esta cirugía; es probable que el sangrado de la CIV o las ramas dañadas sean incontrolables. Además, para evitar tocar el CIV al colocar la sutura a su alrededor, y potencialmente rasgarla, el 8-0 la sutura se coloca inicialmente alrededor de la CIV y la aorta, y luego se reposiciona debajo sólo de la CIV. Por último, el nudo del 8-0 sutura se coloca en el lado de la CIV, no directamente antes, para evitar cualquier artefacto que pueda afectar el examen de ultrasonido postoperatorio.
Una limitación potencial de este estudio es que la estenosis IVC en este modelo se crea por compresión mecánica externa; La inflamación adventicia causada por la sutura y la disección IVC podría afectar potencialmente la remodelación venosa en el área de la estenosis. Además, la fístula de este modelo se hace entre la aorta y el CIV para que todo el flujo de la fístula se dirija a la estenosis iVC, mientras que la fístula creada en la extremidad superior humana a menudo permite que se desarrollen venas colaterales, manteniendo la estenosis asintomática. Este modelo no muestra signos físicos de estenosis venosa central, como edema distal y formación colateral.
En resumen, introducimos un protocolo para un modelo de fístula aortocaval murino novedoso con una estenosis de salida IVC que es fácil de realizar y reproducible. Esperamos que este modelo sea útil para estudiar los cambios hemodinámicos mediante una estenosis venosa central que podría afectar la maduración de la AVF.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el US National Institute of Health (NIH) Grant R01-HL128406; el Premio de Revisión del Mérito del Programa de Investigación y Desarrollo del Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Los Estados Unidos de los Estados Unidos I01-BX002336; así como con los recursos y el uso de instalaciones en el VA Connecticut Healthcare System, West Haven, CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
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