Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/59667
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Faculty of Dentistry, University of Toronto

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול להקמת מודל המושרה לקשירה של חניכיים מורטין מעורבים טוחנות הלסת הכפולה מרובים, וכתוצאה מכך אזורים גדולים יותר של רקמת חניכיים מעורב ועצם עבור ניתוח עוקבות, כמו גם השימוש מופחת בעלי חיים. טכניקה להערכת נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לנושאים אנושיים מתואר גם.

Abstract

היתרונות העיקריים של לימוד פתופסולוגיה של מחלת חניכיים ניצול מודלים murine הם עלות מופחתת של בעלי חיים, מערך של זנים מהונדסים גנטית, המספר המכריע של ניתוחים שניתן לבצע על שנקטפו ברקמות רכות וקשות. עם זאת, רבות ממערכות אלה כפופות לביקורות פרוצדורליות. כחלופה, המודל המושרה לקשירה של מחלת חניכיים, מונע על ידי פיתוח ושמירה של מיקרובידום אוראלי בלתי מהימן, יכול להיות מועסק, אשר המושרה במהירות ואמין יחסית. למרבה הצער, הווריאציות של פרוטוקול חניכיים murine הנגרמת לקשירה מבודדים לאזורים מוקד של החניכיים ובכפוף לציון בטרם עת של החיבור המותקן. זה ממזער את כמות הרקמה הזמינה לניתוחים הבאים ומגבירה את מספר בעלי החיים הנדרשים למחקר. פרוטוקול זה מתאר את המניפולציות המדויקות הדרושות כדי למקם ליגטורות טוחנת מורחבת עם שמירה ושימוש משופר של טכניקת לשטוף רומן לשחזר נויטרופילים אוראלי בעכברים עם גישה חלופית המשקל את השערים לעיל אתגרים טכניים.

Introduction

מחלת חניכיים (PD) היא מחלה אוסטאופתית הקשורה בתחלואה מארח משמעותי ונטל כלכלי, אשר מתבטא על ידי דלקת חניכיים ואובדן של שתי מצורף רקמה רכה ו osseous תמיכה עבור שיניים מושפעות1,2,3,4. תהליך זה נשלט על ידי אינטראקציות בין מיקרוביוטה אוראלי לבין המערכת החיסונית הטבועה של המארח. הוא קשור גם עם החרפה של מחלות דלקתיות אחרות כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם, סרטן5,6,7,8. מבחינה היסטורית, זה היה שיערו כי הפתוגנזה המשטרה תלויה בכמויות גדולות של חיידקים ספציפיים כגון פוררומונס חניכיים מסוים9. עם זאת, ראיות שאירעו לאחרונה מצביעות על כך שרכיב החיידקים של המשטרה מתווך על-ידי השימוש בסוגי השיניים. הביוilm היא קהילה מאורגנת ומורכבת של מיקרואורגניזמים רבים, שיכולים להתקיים במצב שיתופי והרסני בלתי-מצבי10,11. המבנה האוראלי מעניק בדרך כלל עמידות למחשב המארח על ידי מניעת הקמתה של החיידק הפתוגניים ומקדם את מבנה רקמת חניכיים אידיאלי ותפקוד באמצעות רגולציה של התגובה החיסונית מארח12,13. רטבאליות של היחסים equilibrious בין אורגניזמים בתוך חלל הפה ואת המערכת החיסונית מארח עלול להוביל שינויים בהומאוסטזיס רקמות, וכתוצאה מכך ההתפתחות של הופעות המחקר הקליני והרדיוגרפיה של המשטרה5,10,12,13,14.

מעניין, הקמת הדיסקטאוזיס אוראלי, בעוד הנדרש ליזום של PD, אינו מספיק כדי לנהוג במשטרה בכל האנשים, הימנעות לקראת היכולת של התגובה החיסונית מארח לחתור במעבר של microbiota בין שיתופי ודיסביוטית מדינות15. זה מציב זרקור מסוים על האמצעים שבהם המשטרה משפיעה על אחד הדמויות המובילות של מערכת החיסון המולדת, כלומר הפולימיוולוייט (pmn), או נויטרופילים, מתוך פרספקטיבות מקומיות מערכתית16,17.

בבני אדם, PMNs מגויסים מהמחזור בקצב של ~ 2 x 106 תאים/h ברקמות החיבור חניכיים בריאים, שם הם האוכלוסייה הלוקוציט בעלת הדירוג. כאן, הם גורשו לאחר מכן מן החניכיים sulcus לתוך חלל אוראלי כרכיב של נוזל חניכיים crevicular. בנוכחות המשטרה, נויטרופילים מתבטא בתוך מחזור הדם וחלל הפה, שבו התאים האלה אפקטור להחזיק פנוטיפ היפרסטרומה שמוביל להרס הנ ל של החניכיים17,18,19,20,21,22. לכן, הבנת התפקיד של PMNs ב PD ומצבים דלקתיים אחרים מערכתית הוא בעל חשיבות עליונה.

למרות שהוא מקובל שמחלות כרוניות מקושרות באופן הדדי למשטרה, המנגנונים הבסיסיים עדיין לא הגיעו לידי בקשה, ותורמים לקשיים בניהול התנאים הללו והקטלניים. מספר מודלים בעלי חיים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות ייחודיים, כבר נוצל לחקור את הפתופסולוגיה של PD23,24. התמקדות ספציפית על דגמי murine, ישנם מגוון של פרוטוקולים שדרכם לימוד של PD הוא הקלה; עם זאת, הם בעלי מספר חסרונות טכניים ופיזיולוגיים25,26,27,28,29,30,31.

הראשון, gavage אוראלי מודל העכבר דורש רבים אוראלי החיסונים של פתוגנים חניכיים אנושיים כדי ליצור דלקת חניכיים ואובדן העצם. בנוסף, הוא בדרך כלל לפניו על ידי תקופה של טיפול אנטיביוטי כדי לחתור תחת המודר מורלין פלורה אוראלי25. מודל זה דורש לעתים קרובות הכשרה מיוחדת לבצע בבטחה את gavage אוראלי, משתמשת רק חלק קטן של פתוגנים חניכיים מתוך microbiome האנושית מורכבים יותר, ודורש מספר חודשים כדי ליצור אובדן העצם מכתשיים.

לעומת זאת, המושרה כימית מודלים murine לנצל את מסירת אוראלי של חומצה sulfonic בנזן (TNBS) או הנתרן דטרן סולפט (DSS), סוכני בשימוש נפוץ בהקמת מודלים murine של קוליטיס על פני תקופה של מספר חודשים כדי לגרום לאובדן העצם חניכיים26. מודלים מבוססי פנים וחוץ לפנים הינם זמינים, אשר כרוכים בחותכות murine ורקמות של dorsum, כמו גם calvarium, בהתאמה. במודל מורסה לשעבר, כמה זריקות של חיידקים מנוהלים, יצירת אבצס חניכיים מרובים ומחסור של אובדן העצם מכתשיים, הגבלת השימוש שלהם במחקר של PD. הדגמים האחרונים מורסה מתאים יותר באופן משמעותי כדי ללמוד התקפה בקטריאלי, דלקת, וספיגת עצם באתרים מחוץ לחלל הפה, אשר מבטלת את ההערכה של החניכיים ומיקרובידום בעל פה27,28,29,30,31.

באמצעות מודל המושרה לקשירה של חניכיים, תפר ממשי קלוע הותקנה בדרך כלל סביב הטוחנת השנייה. כחלופה, מקטע ליניארי אחד של חומר תפר ניתן להוסיף בין הראשון והשני טוחנות32,33. המטרה של מיקום לקשירה היא להקל על הצטברות חיידקים וליצור דיסביוזיס בתוך חניכיים sulci, וכתוצאה מכך דלקת חניכיים והשמדת הרקמות ההלחנה של החניכיים. בעיקר, מודל זה מסוגל לייצר משמעותית יותר מכתשיים אובדן העצם בהשוואה לgavage הנפוץ יותר בשימוש אוראלי דגם34. עוד מסבך את השימוש במודל gavage אוראלי הוא ההתנגדות הטבעית על ידי מספר זנים של עכברים (כלומר, C57BL/6) כדי לפתח אובדן העצם מכתשיים. זה גם בעייתי, כמו זן זה הוא הנפוץ ביותר בתחום מחקר בעלי חיים מבוסס מורלין35.

הליכים קיימים המתוארים על-ידי מרצ ואח ' ואייב והאג שנגלי המציאו כדי לפשט את הפעולה הטכנית של הצבת ליגטורה33,36. למרבה הצער, הפרוטוקול לשעבר דורש מיוחדות 3D ציוד מודפס, בעלי פוטנציאל אובדן לקשירה מוקדמת, ובכך להגדיל את השימוש בעלי חיים ואת העלויות הקשורות בזמן נוסף שהושקע בחדר הניתוח. יתר על כן, שני הפרוטוקולים מייצרים רק אזורים קטנים של החניכיים החולים זמין למחקר.

היתרונות הטמונים בטכניקה זו מבוססים על מחקר סימולטני של ביוביוזיס ואימונולוגיה ששולטים על החניכיים, ניצול של בעלי חיים בעלי עלות נמוכה עם רקעים גנטיים מגוונים, ושיטות דיור פשוטות ובעלי גידול. ככאלה, על המטרות להיות מגדילים את הכרכים של הרקמה החולה, ובניסיונות לתרגל את עקרונות הירידה במחקר בעלי חיים, לצמצם את צריכת החיות לרמה נמוכה ככל האפשר. זה דורש להבטיח כי כל בעלי החיים מסוגלים להיכלל בניתוח ניסיוני37. עם זאת, יש לציין כי לא משנה איזה מודל בעלי חיים של מחלת חניכיים מנוצל, אין מודל יחיד המקיף את כל האלמנט של משטרת האנושות pathפסיולוגיה.

פרוטוקול חדש זה מפעיל את המיקום של ליגטורה סביב שיניים מרובות מקסימום הלסת הטוחנת באמצעות מיכשור וחומרים שנמצאים ברוב המעבדות. זה מאפשר כמות מספקת של זמן בקלות ובביטחון להתקין ליגטורה כי סביר avulse בטרם עת. בסופו של דבר, כמו PMNs לבצע את ההרס של החניכיים במשטרה, מתודולוגיה הרומן לשחזר נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לבני אדם מוצג גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל מחקרים מורטין נענו לתקנות המוסריות הרלוונטיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טורונטו ומועצת האתיקה של המחקר (פרוטוקול 20011930).

1. התקנת קשירה

הערה: זהו נוהל כירורגי לא סטרילי שניתן לבצע באולם הפעלה רגיל. השימוש בבעלי חיים ללא חיידקים (לא מכוסה כאן) מנדטים טיפול בתוך הקבינט אבטחה, שימוש במכשירים סטרילי, והחיסון של חלל הפה עם פתוגנים חניכיים כדי לגרום לביטויים הקליניים של חניכיים.

  1. לנהל את ההרדמה התוך הצפק ל 8 – 12 שבוע בן זכר C57BL/6 עכברים, אשר צריך להיות הסתגלות למתקן הדיור שלהם, באמצעות 0.5 "26 גרם מחט תת-עורית סטרילי ו 1 מזרק mL על פי מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש הוועדה (IACUC) הנחיות.
    הערה: שילוב של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) הרדמה במהירות ובאופן אמין משרה את רמת ההרדמה המתאימה במשך ההליך.
  2. להעריך את עומק ההרדמה לפני ו כל 15 דקות במהלך ההליך כפי שמעידים על ידי אובדן של רפלקס הדוושה.
  3. מקמו את העכבר על מצע כירורגי מחומם (איור 1א). ייצוב לסת והלסת התחתונה במצב פתוח באמצעות להקות אלסטיים והשען את הצוואר עם גליל כותנה כדי לשמור על לסת בכיוון אופקי יותר (איור 1B). מכסים את הגוף ואת הזנב של בעל החיים כדי לרכך את אובדן החום במהלך ההליך.
  4. מקמו את המיקרוסקופ הכירורגי על ההגדלה הרצויה והתאורה (אם לא רכוב ישירות על המיקרוסקופ) על חלל הפה עבור ויזואליזציה של שיניים. בעוד ההגדלה הרצויה היא תלוית המפעיל, הדמיה אופטימלית של חלל הפה מתקבל ב 16x.
  5. התקנת לתפור מ5-0 סטרילית משי קלועה סביב הראשון (M1) ושנית (M2) מקסלסת טוחנות בתוך חניכיים sulcus באמצעות מלקחיים קיסם.
    הערה: התפרים ממשי קלוע של מד קטן יותר ניתן להשתמש למטרה זו כדי להקל על התקנה מהירה יותר ולהפחית את האפשרות של נזק רקמות רכות רך.
    1. מקמו את הזנב המרוחק של התפר בצד החכי של השיניים והכניסו את הקטע הטוב ביותר בין המגע של M2 ו-M3 (איור 2א).
    2. לעטוף את התפר סביב משטח בוצ של M2 ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו-M2. ודא כי שני הקצוות של תפר משכו היטב כדי לנהוג תפר לתוך חניכיים sulcus ולהסיר את כל המרווח (איור 2ב).
    3. לעטוף את מקטע תפר הטוב ביותר סביב M1, מתחת לגובהו של קונטור, ולהוסיף אותו בין המגע של M1 ו-M2. משוך את הזנב האבובי של תפר הדוק כדי לנהוג תפר לתוך חניכיים sulcus ולהסיר את כל המרווח (איור 2ג).
      הערה: אם ההתנגדות נצפתה בעת הכנסת תפר בין M1 ו-M2 או M2 ו-M3, איש הקשר עשוי להיות פתוח במקצת באמצעות שיניים סטנדרטיות אקספלורר.
    4. לקשור את קצות תפר עם קשר של מנתח לקצץ את זנבות קצר ככל האפשר. מניחים את הקשר בתוך החניכיים בטוח בין M1 ו-M2 בצד השני של שיניים מקסימום הלסת (איור 2ד).
      הערה: צעדים 1.4.1 – 1.4.4 ניתן לחזור על הצד השני, במידת הצורך.
    5. מחטא את כלי הניתוח בתוך מעקר הזכוכית החמה בין כל נושא בעל חיים.
      התראה: קצות המלקחיים חדים מאוד ויכולים בקלות לגרום לטראומה אוראלית ולדימום משמעותי. הכינו קטעים קטנים של גזה כדי להסיר דם מחלל הפה ולהפעיל לחץ על פצעים מדממים פעיל.
  6. לאחר התקנת ליגטורה, להסיר את העכבר ממנגנון כירורגי, מקום לכלוב נקי תחת מנורת חום לצג עד התאושש לחלוטין.
  7. הבית בנפרד כל עכבר עם העשרה הסביבה המתאימה ולאפשר גישה מודעות למים מסוננים ומחית האוכל רגיל בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות (12-h אור/12-h מחזור כהה) במשך 7 – 11 ימים.
    הערה: מחית האוכל מקטינה את הכוחות הנדרשים להסטיק ובכך מפחיתה את הכאב הקשור להזנה, ומסייעת למנוע אובדן מוקדם של החיבור המותקן.

2. אוסף דוגמאות

  1. המתת חסד על פי ההנחיות המאושרות IACUC.
    הערה: המתת חסד אישית באמצעות תא CO2 ולאחריה פריקה צוואר הרחם היא השיטה המועדפת עבור פרוטוקול זה. הדבר עשוי להשתנות בהתאם לניסויים הדורשים קצירת רקמות נוספות.
  2. באמצעות הפיפטה, מיד לשטוף את חלל הפה עם 100 μL של עיקור 4 ° c מפוספז-מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום עבור 10 s.
  3. חזור על השלב 2.2 2x ולמקם כל אחד לשטוף 15 mL במבחנה אחת של פוליפרופילן בדיקה סטרילית.
  4. להעביר את התוכן למבחנה 50 mL של פוליפרופילן בדיקה סטרילית על-ידי הפעלת אותם באמצעות מסנן רשת הפעלה 40 של שינוי.
  5. העבר את התכנים הללו למבחנה חדשה של פוליפרופילן 5 מ ל במבחנה סטרילית.
    הערה: ההעברה הסופית של המדגם לצינורית קטנה יותר מאפשרת את ההדמיה המשופרת של הגלולה הסלולרית בשלבים הקרבים.
    1. אם תרצה, להסיר את הקשירה טוחנת (s) ומקום לתוך 300 μL של מעוקר 1x PBS (4 ° צ', ללא סידן ומגנזיום) ב 15 מ"ל שפופרת של פוליפרופילן בדיקה וסטרילי בנפרד. מתפרעים בעדינות ומסירים. את התפר מהצינור מדגם זה מטופל באופן זהה לדגימת השטיפה האוראלית מנקודה זו והלאה.
  6. הוסף 33.3 μL של 16% פאראפורמלדהיד (בתחתית) כדי להקל על קיבוע המדגם.
  7. וורטקס את הדגימות מיד. ומכאן על הקרח במשך 15 דקות
  8. ממלאים את הצינור כדי 15 mL עם PBS 1x כדי לדלל את המשחק, ואז צנטריפוגה ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  9. מפני שהוא מאחר ומשהה את הגלולה ב-1 מ ל של מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (FACS) ב -4 ° c. ספירת תאים על מונה הומוציטוטומטר או תא אוטומטי.
  10. צנטריפוגה את המדגם שוב ב 1000 RCF ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  11. מזף את supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח מתאים של מאגר FACS עבור ריכוז סופי של 0.5 – 1.0 x 106 תאים/50 μl של מאגר facs.

3. מכתים נוגדנים לניתוח ציטומטלי זרימה

הערה: סמן והכה את כל צינורות ה-FACS הנדרשים לפני השימוש.

  1. הוסף 1 μL של סרום חולדה 2 μL של נוגדן IgG אנטי עכבר כדי 50 μL של המדגם, מערבולת מיד, ולחסום על קרח עבור 20 דקות.
  2. הוסף את הנוגדנים המתאימים לכל מדגם, מערבולת מיד, ו הדגירה על הקרח 30 דקות בחושך.
    הערה: בחירה וכמויות של נוגדנים תלויות בניסויים של טייס מיטוב מוקדם המותאמים לטכניקה ספציפית זו.
  3. שטוף דגימות עם 1 מ ל של מאגר FACS, vortexing בקצרה ותפרידו עבור 5 דקות ב 1000 x g ו 4 ° c. חזור על שלב 2x זה.
  4. השהה דגימות מחדש ב-250 μL של מאגר FACS, כיסוי צינורות עם סרט פרפין, עטוף ברדיד אלומיניום ומחזיק ב -4 ° צ' עד לניתוח.
    הערה: הוא אידיאלי לנתח דגימות תוך שעות של השלמת הפרוטוקול עקב אובדן של אות פלורסנט במשך פרקי זמן ארוכים של אחסון. עם זאת, ניתן לנתח דגימות 2 – 3 ימים לאחר מכן אם נדרש בהחלט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרם הנציג cy, לנסות נתונים מדגימות לשטוף אוראלי של נאיבי (איור 3a) ו מודלק (איור 3ב) חלל הפה מוריין משני המושרה לקשירה חניכיים מסופקים. התאוששות של PMNs מתוך ליגטורה מותקן הפגינו גם (איור 3ג). זרם cytometer ערוץ המתח מכויל באופן ידני, ואת הפיצויים בוצע עם חרוזים בעלי פיצוי חד מוכתם. PMNs הוגדרו כ-Ly6G+ veF4/80-ve באמצעות מיתאר האסטרטגיה38. מינימום של 500 אירועים PMN מגודרת נרכשו מכל שטיפה אוראלי ודגימת קשירה. הכדאיות של PMN הייתה נחושה להיות כ-37% על-ידי טרי, כתמים כחולים. תמונות מייצגות של רמות העצם מכתשיים כפי שנמדד מתוך ציצה העצם מכתשיים (ABC) לצומת cementoenamel (CEJ) עבור בריא (איור 4א) ועכברים ליגבטים (איור 4ב'). ההבדלים היחסיים בין מדידות אלה (איור 4ג) מסופקים.

Figure 1
איור 1: מיצוב בעלי חיים לצורך הארכה מטוחנת. (א) גישה לחלל הפה מושגת על ידי החזקת הלסת התחתונה במצב מדוכא על ידי הצבת המתיחה קלה על הלסת התחתונה הלסת חותכת tion. (ב) גזה ממוקם תחת הגולגולת כדי למנוע תנועה של הראש ולמקם את לסת במצב אופקי יחסית. הגוף והזנב מכוסים כדי למנוע אובדן חום לפני הזזת השלב הכירורגי מתחת למיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צילום סדרתי של התקנת ליגטורה. (א) הזנב המרוחק של התפר ממוקם בצד החכי של השיניים, והקטע העומד מוכנס בין המגע של M2 ו-M3. (ב) תפר הוא עטוף אז סביב משטח בוצ של M2 ולאחר מכן הוכנס בין המגע של M1 ו-m2. (ג) קטע תפר האבובי עטוף סביב M1 מתחת לגובהו של מתאר ואז הוכנס בין המגע של M1 ו-M2. (ד) קצות התפר קשורות בקשר של מנתח וגזוז קרוב ככל האפשר לקשר. הקשר ממוקם בתוך החניכיים בטוח בין M1 ו-M2 בצד החכי של שיניים מקסימום הלסת. כל התצלומים נרכשו על גזור מקסימום להקליט צעדים פרוצדורליים עם השקפה ללא הכול של שיניים טוחנת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מגרשים FACS הנציג ולאחר אסטרטגיה מפגינים נוכחות נויטרופילים אוראלי. נויטרופילים התגלו מן הדגימות הבאות והעריכו על ידי cy,לשטוףאת הפה (א) אוראלי מעכבר נאיבי, (ב) שטיפה אוראלי, ו (ג) התאושש ליגטורות מעכבר עם חניכיים המושרה (בקיעים). מוצגים באמצעות מגרשים מארץ האסטרטגיה. סינגמייטים (האס. אס x FSC-w) ו נויטרופילים (Ly6G+ ve/fsc-ve) היו מגודרת כמוצג. ערכים מספריים משקפים את אחוז התאים בתוך כל שער. מע-א = אזור פיזור צד; מהאס-וואט = רוחב פיזור בצד; מדחס-H = גובה פיזור צד; FSC-A = אזור פיזור קדימה; FSC-W = רוחב פיזור קדימה; מעבר לגובה פיזור של FSC-H =. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מכתשיים אובדן הבדלים בין שליטה ובעלי חיים ליגולי. תמונות מייצגות להפגין הבדלים בתוך מכתשיים אובדן העצם בין (א) שליטהו (ב) ליגבטים עכברים. (ג) מדידות מן הצומת cementoenamel (cej) לתוך מכתשיים ציצה העצם (ABC), יחד עם זוויות שורה של M1 ו-M2, מוצגים (ממוצע ± SEM, n = 3). ערכי P נקבעו על-ידי ANOVA בשני כיוון עם בדיקת LSD של פישר שלאחר הוק. (* p < 0.01; * * p < 0.001; * * * p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האלמנט הקריטי ביותר המשויך לשימוש של מודל המושרה לקשירה murine של חניכיים ממורכז סביב שמירה של ליגטורה עד לזמן ההקרבה או הסרה מכוונת. החיבור המותקן-רגיש פרטים-הקשירה מסוגל לגרימת אובדן משמעותי של גובה העצם מכתשיים כמו 6 ימים, את בין 11 – 16 תקופת היום39. ההחלטה להקריב נושאי בעלי חיים לפני התקופה המקסימלית של אובדן העצם, עיבוד זה מודל קצר הרבה יותר של חניכיים המושרה לקשירה, נבחר כדי להקטין עוד יותר את השכיחות של לקשירה מוקדמת הנגרמת, מוגדר כאובדן הקשירה לפני זמן ההקרבה, אשר הופך את בעל החיים לא אבחון.

החיסרון הנפוץ ביותר של מודל זה מדגיש את הקושי הטכני נתפס של התקנת ליגטורה בשל הממדים הזעיר של שיניים מוראין מולר, אשר טווח היקף מ 4.4 מ"מ (M1) כדי 2.6 מ"מ (M3)40. בעיה זו ניתן לטפל במעורבות של צוות כירורגי/מתלמדים עבור התקנת קשירה, אשר דורש (ברוב) 10 דקות/בעלי חיים וכולל משלוח של הרדמה. יתר על כן, הצבת ליגטורה היא מיומנות שולט באמצעות חזרה, והוא לא אינטנסיבי יותר מאשר הרבה טכניקות נפוצות מבוססות מעבדה הדורשות תואר גבוה של מיומנות ידנית. מבחינה פרוצדורלית, השימוש בהרדמה תוך הצפק מספק זמן רב להקלה על התקנת קשירה. אם נדרש, זה גם מאפשר החלפה של כל ליגטורות שאינן מותקנות באופן משביע רצון, כמו לוקליזציה של תפר החניכיים ואת הקשר בין המגע של M1 ו-M2 הוא אידיאלי לשמירה.

השינויים המוצעים של פרוטוקולים אלה, אשר מתקשרים אחד 1) הארכה של שן טוחנת אחת באמצעות תפר או 2 מקטע ליניארי אחד של תפר ממוקם בין מגע יחיד של שיניים טוחנת, מספק מספר יתרונות. מנקודת מבט טכנית, הפרוטוקול מנצל ציוד כי הוא זמין או יכול להיות בנוי מתוך הציוד הקיים מראש באופן דומה לאייב ו-Hajishengallis. זה ברור את הצורך הזמנות מיוחדות או ייצור של ציוד על ידי 3D הדפסה33. ההתקנה של תפר מתמשך לתפור מקלע סביב שיניים מרובות מאובטח עם קשר של מנתח זה לא יכול להיות מופרע על ידי הלשון עשוי גם לשפר את שימור הקשירה.

במהלך פרוטוקול זה, בהשוואה לטכניקה שהוצעה על-ידי מרצ ואח ', שבה צפויים הפסדים של עד 20%, הייתה היעדרות מוחלטת של כלייית ליגיון מוקדמת36. בעוד השכיחות של אובדן לקשירה לא הוערך ישירות על ידי אייב hajishengallis, הטכניקה הוחלה במספר מחקרים41,42,43,44. מנקודת מבט טכנית, נזק רקמות רכות רך התחמק בעלי חיים ליגבטים. גורמים התורמים לתופעה זו כוללים התבוננות רציפה של חלל הפה דרך מיקרוסקופ, הדמיה מתמדת של קצות מלקחיים, ושימוש של מלקחיים נקיים כדי למנוע החלקה של תפר במהלך המיקום.

בתוך חלל הפה, מקטעים מאורכים של חומר תפר גם להגדיל באופן דרמטי את כמות רקמת החולה הזמין לניתוח והתוצאה היא ירידה מסומנת בשימוש בעלי חיים. הסיבה לכך היא כי כל הנושאים יכולים להיכלל בניתוח, והאיגוד של דגימות רקמות ושטיפה אינו נדרש. יש לציין כי ניתן להעלות את הצלעות הטוחנת מקסימום שיניים משומן בעזרת טכניקות שדווחו בעבר כדי להגדיל את שטח הרקמה המושפעת41. עם זאת, שינוי זה אינו אפשרי במקרים בהם נדרש עיצוב פה מפוצל, השאלת תמיכה ביישום של פרוטוקול חדש זה. לבסוף, בדומה לפרוטוקולים הקודמים לקשירה מושרה חניכיים, השימוש בטכניקה זו אינו מוגבל ל-8 – 12 זכר בן שבוע C57BL/6 עכברים. עכברים בגיל המבוגר, או מין, ורקעים גנטיים שונים עשויים להיות מקובלים בהתאם לעיצוב ניסיוני.

למרבה הצער, מודל זה עדיין בעל כמה תקלות טכניות וmethodologic. השימוש של עכברים מסוימים ללא פתוגן כמפורט לעיל לא יכול לחקות את ההתקדמות של חניכיים אנושיים. זה בגלל הבדלים מספר בין ההרכב של הרכב שלהם ביואילאמים אוראלי, אשר מגביל את התקפות החיצוני של הערכת חיידקים-חיידקים וחיידקים-מארח האינטראקציות45. זה יכול תיאורטית להיות הבין באמצעות שימוש בעכברים ללא חיידקים, אשר מסבך את הפרוטוקול באופן משמעותי. מאמצים נוספים ומשאבים נדרשים על מנת להבטיח שנושאי בעלי חיים יישארו ללא חיידקים במהלך הדיור והתפעול הכירורגי. צעדים נוספים חייבים גם להיות מונהג כדי לפתח חניכיים, כמו עכברים אלה עמידים לפני המשטרה המושרה לקשירה בהעדר הצטברות חיידקים46,47.

יתר על כן, מונו-זיהום ושיתוף מודלים ליגטורה ליפול קצר של לכידה של המצב האנושי, כמו מחלת חניכיים מייצגת אינטראקציה מורכבת יותר בין הביוilm ומערכת החיסון המארחת. בנסיבות אלה, הבעת האפשרות להבהיר את תפקידי, והאינטראקציות בין מספר מצומצם של חיידקים בעלי פה אנושי עשוי להיחשב לחסר ולחוסר יתרון, במיוחד בהקשר של לימוד חיסוני החניכיים.

לבסוף, ראיות שאירעו לאחרונה יש מעורב כי כוחות של מסטיק מסוגלים לשנות מעקב חיסוני חניכיים באמצעות הצטברות של T מסייע 17 תאים, מתווך אינטגרלי של חסינות מכשול48. ככאלה, השימוש בתזונה רכה, בעיקר בבעלי חיים מבוגרים, עשוי לשמש כמייסד פוטנציאלי. זה עשוי להפחית את הפוטנציאל של אובדן העצם הפיזיולוגי נורמלי באזורים שבהם ליגטורות הוחלו. לאור ראיה זו, יש להתחשב בשיקול הדעת לשימוש בבעלי חיים בגילאי ובבקרות מתאימות לגיל המתאים, היכן שממצאים אלה צוינו לבולטים ביותר.

השימוש במודל זה פשוט יחסית ניתן להרחיב את הערכת מכתשיים אובדן העצם על ידי טומוגרפיה מיקרו מחושב, ניתוח היסטולוגית של העצם מכתשיים והסביבה חניכיים המצורפת, וניהול האפיון microbiota אוראלי, כל אשר הושלמו עם הקיימים המושרה לקשירה מודלים PD33,49. למרות שלעיתים רחוקות דנו או מנוצל, זה אפשרי גם להעריך את ההשפעות של הטיפול, (כמו גם את התיקון והתחדשות של החניכיים) בהגדרה של חניכיים מורמין המושרה על ידי הסרת ליגטורה בהרדמה כללית עם מלקחיים קיסם בצבע דק39. לבסוף, השימוש במודל זה עשוי להיות מורחב כדי ללמוד את ההשפעות הסיסטמית של מחלת חניכיים בשל עומס דלקתי מוגבר הנגרמת על ידי הארכה של יותר מאשר שן אחת, כמו גם שמאל וימין מקסימום שיניים טוחנת הלסת, אם הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ג. וו. סי נתמך על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). המחברים רוצים להודות ד ר Chunxiang Sun על הסיוע שלה בביצוע הטריכתמים כחול.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 155 חניכיים ליגטורה חניכיים חניכיים מכתשיים מודל בעל חיים זרם cy להזרים נויטרופילים אימונולוגיה דלקת
מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust … More

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter