Summary
Denna artikel presenterar ett protokoll för upprättande av en Ligature-inducerad modell av murina parodontit med flera maxillary molarer, vilket resulterar i större områden av de inblandade gingival vävnad och ben för efterföljande analys samt minskad användning av djur. En teknik för att bedöma orala neutrofiler på ett sätt som motsvarar de mänskliga försökspersonerna beskrivs också.
Abstract
De främsta fördelarna med att studera patofysiologin för parodontit använda murina modeller är den minskade kostnaden för djur, en rad genetiskt modifierade stammar, det stora antalet analyser som kan utföras på skördade mjuk och hård vävnad. Många av dessa system är dock föremål för procedurmässig kritik. Som ett alternativ, den ligatur-inducerad modell av parodontit, driven av lokaliserad utveckling och retention av en dysbiotic oral microbiome, kan användas, som snabbt induceras och relativt tillförlitlig. Tyvärr, de varianter av ligatur-inducerad murin parodontit protokollet är isolerade till fokala regioner i den och föremål för förtida avulsion av den installerade ligatur. Detta minimerar mängden vävnad som finns tillgänglig för efterföljande analyser och ökar antalet djur som krävs för studier. Detta protokoll beskriver de exakta manipulationer som krävs för att placera förlängda molar-ligaturer med förbättrad retention och användning av en ny sköljteknik för att återvinna orala neutrofiler hos möss med ett alternativt tillvägagångssätt som lindrar de tidigare nämnda tekniska utmaningar.
Introduction
Parodontit (PD) är ett osteolytiskt tillstånd i samband med betydande värd morbiditet och ekonomisk börda, vilket manifesteras av gingival inflammation och förlust av både mjuk vävnad kvarstad och bendefekter stöd för den drabbade tandbildning1,2,3,4. Denna process styrs av interaktioner mellan den orala bakterieflora och medfödda immunförsvaret hos värden. Det är också förknippat med exacerbation av andra systemiska inflammatoriska sjukdomar inklusive diabetes, hjärt-kärlsjukdom, och cancer5,6,7,8. Historiskt, det var en hypotes om att PD patogenes är beroende av stora mängder av specifika bakterier såsom Porphyromonas gingivalis9. De senaste bevisen tyder dock på att den mikrobiella komponenten i PD förmedlas av den odontologiska biofilmen. Den biofilm är en organiserad, komplex gemenskap av många mikroorganismer som kan existera i friska symbiotiska och destruktiva dysbiotiska stater10,11. Den muntliga biofilm ger normalt motstånd mot värden genom att förhindra inrättandet av Foci av patogena bakterier och främjar ideal gingival vävnad struktur och funktion genom reglering av värden immunsvar12,13. Perturbations av det equilibrious förhållandet mellan kommensaler organismer inom munhålan och värd immunsystemet kan leda till förändringar i vävnad homeostas, vilket resulterar i dysbacteriosis och utveckling av Hallmark kliniska och radiografiska framträdanden av PD5,10,12,13,14.
Intressant, inrättandet av en muntlig dysbacteriosis, samtidigt som krävs för initiering av PD, är inte tillräckligt för att köra PD i alla individer, undkommer mot förmågan hos värden immunsvar att undergräva övergången av bakterieflora mellan symbiotiska och dysbiotiska stater15. Detta sätter en särskild strålkastarljuset på de medel genom vilka PD påverkar en av de ledande tecknen i det medfödda immunförsvaret, nämligen polymorfonukleära granulocyt (PMN), eller neutrofila, från lokala och systemiska perspektiv16,17.
Hos människa rekryteras PMNs från cirkulationen med en hastighet av ~ 2 x 106 celler/h i friska parodontala bindväv, där de är den dominerande leukocytpopulationen. Här, de är sedan utvisas från gingival sulcus i munhålan som en del av gingival crevicular vätska. I närvaro av PD, neutrofili manifesterar i cirkulationen och munhålan, där dessa effektorceller har en hyperinflammatorisk fenotyp som leder till den ovan nämnda förstörelsen av den17,18,19,20,21,22. Därför är det ytterst viktigt att förstå PMNs roll i PD och andra systemiska inflammatoriska tillstånd.
Även om det är allmänt accepterat att kroniska sjukdomar är ömsesidigt knutna till PD, har de bakomliggande mekanismerna ännu inte klarlagts, vilket bidrar till svårigheterna i hanteringen av dessa sjukliga och potentiellt dödliga systemiska tillstånd. Flera experimentella djurmodeller, var och en med unika fördelar och nackdelar, har utnyttjats för att studera patofysiologin hos PD23,24. Med särskilt fokus på murina modeller, det finns en mängd olika protokoll genom vilka studien av PD underlättas; de har dock flera tekniska och fysiologiska brister25,26,27,28,29,30,31.
Först, den muntliga sonden musmodellen kräver många muntliga vaccinationer av mänskliga parodontala patogener att generera gingival inflammation och benförlust. Dessutom är det i allmänhet föregås av en period av antibiotikabehandling för att undergräva murina kommensaler oral Flora25. Denna modell kräver ofta specialiserad utbildning för att säkert utföra den muntliga sonden, använder endast en liten del av parodontala patogener från mer komplexa mänskliga oral microbiome, och kräver flera månader för att etablera alveolära benförlust.
I motsats, kemiskt inducerade murin modeller utnyttja den muntliga leveransen av Trinitrobensen sulfonsyra (TNBS) eller dextran sulfate natrium (DSS), agenter som vanligen används för att fastställa murina modeller av kolit under en period av flera månader för att inducera parodontala benförlust26. Intraorala och extraorala abscess-baserade modeller finns tillgängliga, som involverar murina incisorer och vävnader av dorsum samt calvarium, respektive. I fd abscess modell, flera injektioner av bakterier administreras, skapa flera gingival bölder och en brist på alveolära benförlust, begränsa deras användning i studien av PD. De senare abscess modellerna är betydligt mer benägna att studera bakteriell virulens, inflammation, och benresorption på platser utanför munhålan, vilket eliminerar utvärderingen av den och oral mikrobiomet27,28,29,30,31.
Med hjälp av Ligature-inducerad modell av parodontit, en flätad sidensutur har vanligen installerats runt om den andra molar. Som ett alternativ kan ett enda linjärt segment av suturmaterial sättas in mellan den första och andra molarer32,33. Målet med ligatur placeringen är att underlätta bakteriell ackumulering och generera dysbios inom gingival sulci, vilket resulterar i parodontala vävnad inflammation och förstörelse av vävnaderna komponera periodontium. Framför allt, denna modell är kapabel att producera betydligt mer alveolär benförlust jämfört med de vanligare orala sontmjöl modell34. Ytterligare komplierar användningen av den muntliga sondmatning modellen är det naturliga motståndet av flera stammar av möss (dvs, C57BL/6) att utveckla alveolära benförlust. Detta är också problematiskt, eftersom denna stam är den mest använda i Murine-baserade djur forskning35.
Befintliga förfaranden som beskrivs av marchesan et al. och Abe och hajishengallis utformades för att förenkla den tekniska handlingen att placera ligatur33,36. Tyvärr kräver det tidigare protokollet specialiserad 3D-tryckt utrustning och besitter potentialen för för tidig ligatur förlust, vilket ökar djurens användning och kostnaderna i samband med ytterligare tid i operationssalen. Dessutom genererar båda protokollen endast små regioner av det sjuka den som finns för en studie.
De fördelar som ligger i denna teknik är förankrade i den samtidiga studien av oral dysbios och immunologi som styr periodontium, utnyttjande av låg kostnad djur med olika genetiska bakgrunder, och enkla bostäder och djurhållning praxis. Som sådana bör mål vara att maximera volymerna av sjuk vävnad och, i försök att öva principerna för minskning av djurförsök, minska djur konsumtionen till en så låg nivå som möjligt. Detta förutsätter att alla djur kan inkluderas i experimentella analyser37. Det bör dock noteras att oavsett vilken djurmodell av parodontit utnyttjas, det finns ingen enda modell som omfattar varje del av mänskliga PD patofysiologi.
Detta nya protokoll sysselsätter placeringen av en ligatur runt flera maxillary molar tänder med hjälp av instrumentering och material som finns inom de flesta laboratorier. Det tillåter en tillräcklig mängd tid för att enkelt och tryggt installera en ligatur som sannolikt inte kommer att avulse för tidigt. Slutligen, eftersom PMNs samordnar förstörelsen av den i PD, en ny metod för att återvinna orala neutrofiler på ett sätt som liknar människor presenteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla murina studier uppfyllde de relevanta etiska föreskrifterna och godkändes av University of Toronto djur vårds nämnd och forskningsetik nämnden (protokoll 20011930).
1. ligatur installation
Anmärkning: Detta är en icke-sterila kirurgiska ingrepp som kan utföras i en Standard Operating Theater. Användningen av bakteriefria djur (som inte omfattas här) mandat hantering inom ett biosäkerhetsskåp, användning av sterila instrument, och inympning av munhålan med parodontala patogener att orsaka de kliniska manifestationerna av parodontit.
- Administrera intraperitoneal anestesi till 8 – 12 veckor gamla manliga C57BL/6 möss, som bör acklieras till sin bostad anläggning, med hjälp av en 0,5 "26 G steril Hypodermic nål och 1 mL spruta enligt godkända institutionella djurskötsel och användning kommittén (IACUC) riktlinjer.
Anmärkning: en kombination av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) bedövningsmedel snabbt och tillförlitligt inducerar lämplig nivå av anestesi under hela förfarandet. - Bedöm anestesidjupet före och var 15 min under ingreppet, vilket framgår av förlusten av pedal reflex.
- Placera musen på en uppvärmd kirurgisk plattform (figur 1a). Stabilisera överkäken och mandibeln i öppet läge med hjälp av elastiska band och stötta halsen med en bomulls rulle för att bibehålla överkäken i en mer horisontell orientering (figur 1B). Täck kroppen och svansen av djuret för att lindra värmeförluster under förfarandet.
- Placera det kirurgiska mikroskopet vid önskad förstoring och belysning (om det inte monteras direkt på mikroskopet) över munhålan för visualisering av tandbildning. Även om den önskade förstoringen är operatörsberoende erhålls optimal visualisering av munhålan vid 16X.
- Installera en steril 5-0 flätad sidensutur runt den första (M1) och andra (m2) maxillary molarer inom gingival sulcus med hjälp av Splinter forceps.
Obs: flätade sidensuturer av en mindre mätare kan användas för detta ändamål för att underlätta snabbare installation och minska risken för iatrogen mjukvävnadsskada.- Placera suturets distala svans på den palatala sidan av dentitionen och sätt in det proximala segmentet mellan kontakten m2 och M3 (figur 2A).
- Linda suturen runt den buckala ytan på m2 och sätt in den mellan kontakten M1 och m2. Se till att båda ändarna av suturen dras tätt för att driva suturen i gingival sulcus och ta bort allt slack (figur 2B).
- Linda den proximala suturen segmentet runt M1, under dess höjd kontur, och sätt in den mellan kontakt av M1 och m2. Dra den proximala svansen på suturen tätt för att driva suturen i gingival sulcus och ta bort allt slack (figur 2C).
Anmärkning: om resistensen observeras vid isättning av suturen mellan M1 och m2 eller m2 och M3, kan kontakten vara öppen något med en vanlig tand Utforskare. - Knyt ändarna på suturen med en kirurg Knut och trimma svansarna så kort som möjligt. Placera knuten i gingival embrasure mellan M1 och m2 på palatal sidan av maxillary tandbildning (figur 2D).
Anmärkning: steg 1.4.1 – 1.4.4 kan upprepas på kontralaterala sidan, om det behövs. - Sterilisera de kirurgiska instrumenten i en varm glaspärla autoklav mellan varje djur ämne.
Varning: spetsarna på tång är extremt vassa och kan lätt orsaka muntliga trauma och betydande blödning. Förbered små segment av gasväv för att ta bort blod från munhålan och tryck för att aktivt blöda sår.
- Efter ligatur installationen, ta bort musen från den kirurgiska apparaten, placera i en ren bur under en värmelampa och övervaka tills helt återvinnas.
- Individuellt hus varje mus med lämplig miljöberikning och tillåta AD libitum tillgång till filtrerat vatten och mosad standard Chow i en temperatur-och luftfuktighet kontrollerad miljö (12-h ljus/12-h mörk cykel) för 7 – 11 dagar.
Obs: mosad Chow minskar de krafter som krävs för tuggmotstånd därigenom minska smärta i samband med utfodring, och aids för att förhindra för tidig förlust av den installerade ligatur.
2. provtagning
- Euthanize-möss enligt de godkända IACUC-riktlinjerna.
Anmärkning: individuell eutanasi som använder en CO2 kammare följt av cervikal dislokation är den föredragna metoden för detta protokoll. Detta kan ändras beroende på experiment som kräver skörd av ytterligare vävnader. - Använd en pipett och skölj omedelbart munhålan med 100 μL steriliserad 4 ° c 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium i 10 s.
- Upprepa steg 2,2 2x och placera varje sköljning i en enda 15 mL konisk polypropen steril provrör.
- Överför innehållet till en 50 mL konisk polypropen steril provrör genom att köra dem genom ett 40 μm nylonnät filter.
- Överför dessa innehåll till en ny 15 mL konisk polypropen steril provrör.
Obs: den slutliga överföringen av provet till ett mindre rör möjliggör förbättrad visualisering av den cellulära pelleten i kommande steg.- Om så önskas, avlägsna molar-ligaturen och placera den i 300 μL steriliserad 1x PBS (4 ° c, utan kalcium och magnesium) i en separat 15 mL konisk polypropen steril provrör. Agitera försiktigt och ta bort suturen från röret. Detta prov behandlas identiskt med det orala sköljprovet från denna punkt framåt.
- Tillsätt 33,3 μL av 16% PARAFORMALDEHYD (PFA) för att underlätta provtagningen.
- Vortex proverna omedelbart och inkubera på isen i 15 min.
- Fyll röret till 15 mL med 1x PBS för att späda ut PFA och centrifugera vid 1000 x g och 4 ° c i 5 min.
- Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1 mL fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) buffert vid 4 ° c. Räkna celler på en hemocytometern eller automatiserad cell räknare.
- Centrifugera provet igen vid 1000 RCF och 4 ° c i 5 min.
- Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i en lämplig volym av FACS-bufferten för en slutlig koncentration av 0,5 – 1,0 x 106 celler/50 μl FACS-buffert.
3. antikropps färgning för flödescytometrisk analys
Märk: Märk och kyla alla erforderliga FACS-rör före användning.
- Tillsätt 1 μL rått serum och 2 μL anti-mus-IgG-antikropp till 50 μL av provet, Vortex omedelbart och blockera på isen i 20 min.
- Tillsätt lämpliga antikroppar till varje prov, Vortex omedelbart, och inkubera på isen för 30 min i mörkret.
Obs: urval och volymer av antikroppar beror på tidigare optimerings pilotexperiment skräddarsydda för denna specifika teknik. - Tvätta proverna med 1 ml FACS-buffert, vortexa kort och centrifugering i 5 min vid 1000 x g och 4 ° c. Upprepa detta steg 2x.
- Omsuspendera prover i 250 μL av FACS buffert, täck rör med paraffin film, wrap i aluminiumfolie, och håll vid 4 ° c tills analysen.
Obs: det är idealiskt att analysera prover inom timmar efter avslutad protokollet på grund av förlusten av fluorescerande signal under långa perioder av lagring. Prover kan dock analyseras 2 – 3 dagar senare om det är absolut nödvändigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa flödescytometri data från orala sköljprover av en naiv (figur 3a) och inflammerad (figur 3B) murina munhålan sekundärt till ligatur-inducerad parodontit tillhandahålls. Indrivningen av PMNs från en installerad ligatur påvisas också (figur 3C). Flow flödescytometerns kanal spänningar kalibrerades manuellt, och kompensation utfördes med enfärgade ersättning pärlor. PMNs definierades som Ly6G+ veF4/80-ve med hjälp av den beskrivna gating Strategy38. Ett minimum av 500 gated PMN händelser förvärvades från varje oral skölj och ligatur prov. PMN lönsamhet bestämdes vara cirka 37% av trypan Blåfärgning. Representativa bilder av alveolära ben nivåer mätt från alveolära Bone Crest (ABC) till cementoemalj korsningen (cej) för friska (figur 4A) och och ligaturer möss (figur 4B). De relativa skillnaderna mellan dessa mätningar (figur 4C) tillhandahålls.
Figur 1: djur positionering för molar ligering. (A) tillgången till munhålan uppnås genom att hålla underkäken i en deprimerad position genom att placera mild dragning på maxillary och mandibular framtand Dentition. B) gasväv placeras under skallen för att förhindra förflyttning av huvudet och för att placera överkäken i en relativt horisontell position. Kroppen och svansen är täckta för att förhindra värmeförlust innan du flyttar Operations stadiet under mikroskopet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: sekventiell fotografering av ligatur installation. Aden distala svansen på suturen är placerad på den palatala sidan av tandningen, och det proximala segmentet infogas mellan kontakten m2 och M3. (B) suturen Lindas sedan runt den buckala ytan på m2 och sedan infogas mellan M1 och m2-kontakten. C) det proximala suturen-segmentet lindas runt M1 under dess höjd av kontur som sedan infogas mellan M1 och m2-kontakten. Dändarna på suturen binds med en kirurg Knut och putsas så nära knuten som möjligt. Knuten är placerad i gingival embrasure mellan M1 och m2 på palatal sidan av maxillary Dentition. Alla fotografier förvärvades på dissekerade maxilla för registrering av processuella steg med en fri sikt mot molar Dentition. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa FACS tomter och gating strategi visar oral neutrofila närvaro. Neutrofiler återfanns från följande prover och bedömdes med flödescytometri: (a) oral sköljning från en naiv mus, (B) oral sköljning och (C) återvunna ligaturer från en mus med ligatur-inducerad parodontit (bilateralt). Representativa gating strategi scatterplots visas. Singlets (SSC-H x SSC-W och FSC-H x FSC-W) och neutrofiler (Ly6G+ ve/F480-ve) var gated som visas. Numeriska värden återspeglar procentandelen celler i varje grind. SSC-A = sido Spridningsområde; SSC-W = sidans spridnings bredd; SSC-H = sida scatter höjd; FSC-A = framåt Spridningsområde; FSC-W = framåt spridnings bredd; FSC-H = framåt scatter höjd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: skillnader i alveolära benförlust mellan kontroll och och ligaturer djur. Representativa bilder som visar skillnader i alveolär benförlust mellan (a) kontroll och (B) och ligaturer möss. (C) mätningar från cementoemalj-korsningen (cej) till alveolära benkrön (ABC), tillsammans med mesiopalatal-och distopalatal-linjevinklarna M1 och m2, visas (medelvärde ± SEM, n = 3). P-värden bestämdes av tvåvägsanova med ett LSD-test efter hoc-Fisher. (* p < 0,01; * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiska elementet i samband med användning av murina ligatur-inducerad modell av parodontit är centrerad kring retention av ligatur fram till tidpunkten för uppoffring eller avsiktlig avlägsnande. Den installerade biofilm-glans ligatur kan inducera en betydande förlust av alveolära benhöjd på så få som 6 dagar, plateauing mellan 11 – 16 dagars period39. Beslutet att offra djur försökspersoner innan den maximala perioden av benförlust, vilket gör detta till en mycket kortare modell av ligatur-inducerad parodontit, valdes för att ytterligare minska förekomsten av förtida ligatur avulsion, definierad som förlusten av ligatur före tiden för offret, som återger djuret nondiagnostic.
Den oftast citerade nackdelen med denna modell belyser den upplevda tekniska svårigheten att installera ligatur på grund av den minimala dimensioner murina molar Dentition, som sträcker sig i omkrets från 4,4 mm (M1) till 2,6 mm (m3)40. Denna fråga kan mildras genom inblandning av kirurgisk personal/praktikanter för ligatur installation, som kräver (högst) 10 min/djur och inkluderar leverans av anestesi. Dessutom är placeringen av ligatur en färdighet behärskas genom upprepning, och det är inte mer intensivt än många vanliga Lab-baserade tekniker som kräver en förhöjd grad av manuell skicklighet. Från en procedurmässig synvinkel, användning av intraperitoneal anestesi ger lång tid att underlätta ligatur installation. Om det behövs, det tillåter också utbyte av alla ligaturer som inte är installerade på ett tillfredsställande sätt, som lokalisering av suturen till gingival sulcus och Knut mellan kontakten av M1 och m2 är idealisk för lagring.
De föreslagna ändringarna av dessa protokoll, som kräver antingen 1) ligering av en enda molar med hjälp av en omkretsriktningen sutur eller 2) ett enda linjärt segment av suturen placeras mellan en enda kontakt av molar Dentition, ger flera fördelar. Ur ett tekniskt perspektiv använder protokollet utrustning som antingen är lätt tillgänglig eller kan konstrueras från befintlig utrustning på ett liknande sätt som Abe och Hajishengallis. Detta undanrömer behovet av specialbeställningar eller tillverkning av utrustning genom 3D Printing33. Installationen av en kontinuerlig silke sutur sling runt flera tänder säkrade med en kirurg Knut som inte kan störas av tungan kan också förbättra ligatur retention.
Under loppet av detta protokoll, jämfört med den teknik som föreslagits av Marchesan et al. där förluster på upp till 20% förväntas, det fanns en total avsaknad av för tidig ligatur avulsion36. Medan incidensen av ligatur förlust inte bedömdes direkt av Abe och hajishengallis, tekniken har tillämpats i ett antal studier41,42,43,44. Ur ett tekniskt perspektiv, iatrogen mjukvävnadsskada var undvikas i och ligaturer djur. Faktorer som bidrar till detta fenomen inkluderar en kontinuerlig observation av munhålan genom ett mikroskop, konstant visualisering av spetsarna på pincett, och användning av rena pincett för att förhindra glider bort av suturen under placeringen.
Inom munhålan, de långsträckt segment av suturmaterial också dramatiskt öka mängden sjuka vävnad tillgängliga för analys och kan resultera i en markant minskning av djuranvändning. Detta beror på att alla ämnen kan ingå i analysen, och sammanslagning av vävnad och skölj prover krävs inte. Det bör noteras att det är möjligt att ligera den kontralaterala maxillary molar tandbildning utnyttja de tidigare rapporterade teknikerna för att öka den drabbade vävnaden område41. Denna ändring är dock inte möjlig i de fall där en design med delad mun krävs, vilket stöder tillämpningen av detta nya protokoll. Slutligen, besläktad med de tidigare Ligature-inducerad parodontit protokoll, användning av denna teknik är inte begränsad till 8 – 12 veckor gamla manliga C57BL/6 möss. Möss av äldre ålder, antingen kön, och olika genetiska bakgrunder kan vara acceptabelt beroende på experimentell design.
Tyvärr har denna modell fortfarande några tekniska och metodologiska fel. Användningen av specifika patogen-fria möss som beskrivs ovan kan inte efterlikna utvecklingen av mänskliga parodontit. Detta beror på flera skillnader mellan sammansättningen av deras kommensaler oral biofilmer, som begränsar den externa giltigheten av att utvärdera bakterier-bakterier och bakterier-värd interaktioner45. Detta kan teoretiskt mildras genom användning av bakteriefria möss, vilket försvårar protokollet avsevärt. Ytterligare ansträngningar och resurser krävs för att säkerställa att djur ämnen förblir bakteriefria under bostäder och kirurgisk manipulation. Ytterligare åtgärder måste också inledas för att utveckla parodontit, eftersom dessa möss är resistenta mot ligatur-inducerad PD i avsaknad av bakteriell ackumulering46,47.
Dessutom, mono-infektion och co-infektion ligatur modeller inte går igenom människans tillstånd, som parodontit utgör en mer komplex polymikrobiell interaktion mellan bio film och värd immunförsvaret. Under dessa omständigheter, belysa rollerna och interaktioner mellan ett begränsat antal mänskliga orala bakterier kan anses bristfällig och potentiellt ofördelaktig, särskilt i samband med studier av parodontiumimmunobiologi.
Slutligen har de senaste bevisen inblandade att de krafter tuggmotstånd kan ändra gingival immunoövervakning genom ansamling av T Helper 17 celler, en integrerad medlare av barriär immunitet48. Som sådan, användning av en mjuk kost, särskilt hos äldre djur, kan agera en potentiell confounder. Detta kan minska risken för normal fysiologisk benförlust i regioner där ligaturer har tillämpats. Mot bakgrund av denna bevisning bör man noggrant överväga användningen av äldre djur och lämpliga åldersmatchade kontroller där dessa fynd har noterats som mest framträdande.
Användningen av denna relativt enkla modellen kan utvidgas till att utvärdera alveolär benförlust av mikro-datortomografi, histologiska analyser av både alveolära ben och omgivande bifogade gingiva, och genomföra oral bakterieflora karakterisering, som alla har åstadkommits med befintliga ligatur-inducerad PD-modellerna33,49. Även om sällan diskuteras eller utnyttjas, det är också möjligt att bedöma effekterna av behandling, (liksom reparation och förnyelse av periodontium) i inställningen av ligatur-inducerad murina parodontit genom att ta bort ligatur under narkos med Fine-Point Splinter pincett39. Slutligen, användning av denna modell kan utvidgas till att studera de systemiska effekterna av parodontit på grund av den ökade inflammatoriska belastningen orsakad av ligering av mer än en tand, samt vänster och höger maxillary molar Dentition, om så önskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
JW C. stöds av den kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR). Författarna skulle vilja tacka Dr Chunxiang Sun för hennes hjälp med att utföra trypan Blåfärgning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W.
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D.
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P.
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A.
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P.
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
