Summary
この記事では、複数の上顎大臼歯を含む糸字誘発モデルを確立するためのプロトコルを提示し、その後の分析と動物の使用量の減少のために関与する歯肉組織および骨のより大きな領域をもたらす。ヒト被験者に類似した方法で経口好中球を評価する技術も記載されている。
Abstract
マウスモデルを利用して歯周病の病態生理学を研究する主な利点は、動物のコストの削減、遺伝子組み換え株の配列、収穫された柔らかい組織および硬質組織に対して行うことができる膨大な数の分析である。しかし、これらのシステムの多くは手続き上の批判の対象となります。代替として、生理周期疾患の合字誘発モデルは、生体生物的経口微生物叢の局所的な発達および保持によって駆動され、急速に誘導され、比較的信頼性が高い、採用することができる。残念ながら、合字誘発性マウス歯炎プロトコルの変異体は、歯素の焦点領域に単離され、インストールされた合字の早期発従の対象となる。これにより、後続の分析に使用できる組織の量が最小限に抑え、研究に必要な動物の数が増加します。このプロトコルは、前述を緩和する代替アプローチを用いてマウスの口腔好中球を回収する新しいリンス技術の保持と使用を改善した拡張モル合字を配置するために必要な正確な操作を記述します。技術的な課題。
Introduction
歯周病(PD)は、有意な宿主罹患率および経済的負担に関連する骨溶解状態であり、歯肉の炎症および軟部組織結合および患部の骨の支持の両方の喪失によって現れる1、2、3、4である。このプロセスは、宿主の経口微生物叢と自然免疫系との相互作用によって支配される。また、糖尿病、心血管疾患、および癌5、6、7、8を含む他の全身性炎症性疾患の悪化に関連する。歴史的に、PD病因はポルフィロモナス・ギンギバリス9のような特定の細菌に大量に依存していると仮定した。しかしながら、最近の証拠は、PDの微生物成分が歯科バイオフィルムによって媒介されることを示唆している。バイオフィルムは、健康な共生および破壊的な生生物状態10、11に存在し得る多数の微生物の組織化された複雑なコミュニティである。経口バイオフィルムは、通常、病原性細菌の病巣の樹立を防止することによって宿主に耐性を与え、宿主免疫応答12、13の調節を通じて理想的な歯肉組織の構造および機能を促進する。口腔内の単一生物と宿主免疫系との間の平衡関係の摂動は、組織恒常性の変化をもたらし、その結果、PD5、10、12、13、14の顕著な臨床および放射線出現の特徴的な臨床および放射線出現の発症をもたらし得る。
興味深いことに、経口ジスバクテリア症の確立は、PDの開始に必要であるが、全ての個体においてPDを駆動するのに十分ではなく、共生およびジビオティック状態間の微生物叢の移行を覆す宿主免疫応答の能力に向かって排除する15。これは、PDが先天性免疫系の主要なキャラクターの1つ、すなわち多形核顆粒球(PMN)、または好中球に影響を与える手段に特定のスポットライトを置き、局所的および全身的な観点から16、17を置く。
ヒトでは、PMNは、健康な歯周結合組織において〜2x106細胞/hの割合で循環からリクルートされ、そこでは白血球集団が優勢である。ここで、それらは、その後、歯肉管管液の成分として口腔内に歯肉溝から排出される。PDの存在下で、好中球症は循環および口腔内に現れ、これらのエフェクター細胞は、歯周期17、18、19、20、21、22の前述の破壊につながる過剰炎症表現型を有する。したがって、PDおよび他の全身性炎症状態におけるPMNの役割を理解することは最も重要である。
慢性疾患がPDと相互に関連していることは広く受け入れられているが、根本的なメカニズムはまだ解明されておらず、これらの病的で致命的な全身状態の管理における困難に寄与している。複数の実験動物モデルは、それぞれ独自の長所と短所を有し、PD23、24の病態生理学を研究するために利用されている。特にマウスモデルに焦点を当てて、PDの研究が容易になる様々なプロトコルがあります。しかし、彼らはいくつかの技術的および生理学的な欠点を持っています25,26,27,28,29,30,31.
まず、口腔ガバゲージマウスモデルは、歯肉炎症および骨損失を生成するためにヒト歯周病原体の多数の経口接種を必要とする。加して、一般に、マウスの口腔内細菌叢25を覆す抗生物質治療の期間が先行する。このモデルは、多くの場合、経口ガベを安全に行うために専門的な訓練を必要とし、より複雑なヒト経口微生物から歯周病原体のほんの一部のみを使用し、肺胞骨喪失を確立するために数ヶ月を必要とします。
対照的に、化学的に誘導されたマウスモデルは、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)またはデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の経口送達を利用し、歯周骨損失26を誘発するために数ヶ月にわたって大腸炎のマウスモデルを確立するのに一般的に使用される薬剤である。口腔内および口腔外膿瘍ベースのモデルは、それぞれカルバリウムと同様に、モルサムのマウス切開器および組織を含む利用可能である。前者の膿瘍モデルでは、細菌のいくつかの注射が投与され、複数の歯肉膿瘍および歯槽骨喪失の消滅を引き起こし、PDの研究におけるその使用を制限する。後者の膿瘍モデルは、口腔外の部位における細菌毒性、炎症、および骨吸収を研究する傾向が有意に高く、歯竜菌および口腔微生物叢の評価を排除する27、28、29、30、31である。
歯周炎の合字誘発モデルを用いて、編組シルク縫合糸は、一般的に第2の大臼歯の周りに円周に設置されている。代替として、縫合材料の単一の線形セグメントは、第1および第2の臼歯32、33の間に挿入することができる。合字配置の目的は、細菌の蓄積を促進し、歯肉スルチ内のジスバイオシスを生成し、歯周組織の炎症および歯周を構成する組織の破壊をもたらすことである。最も顕著なのは、このモデルは、より一般的に使用される経口ガバゲージモデル34と比較して有意により多くの肺胞骨損失を産生することができる。さらに口腔ガベモデルの使用を複雑にすることは、歯槽骨損失を発症するマウスのいくつかの株(すなわち、C57BL/6)による自然な耐性である。この株は、マウスベースの動物研究35で最も頻繁に使用されるので、これはまた問題です。
マルケサンら、安倍、ハジシェンガリスによって記述された既存の手順は、合字33、36を配置する技術的な行為を簡素化するために考案されました。残念ながら、前者のプロトコルは、特殊な3Dプリント機器を必要とし、それによって動物の使用と手術室で費やされた追加の時間に関連するコストを増加させる早期合字損失の可能性を有しています。さらに、両方のプロトコルは、研究のために利用可能な疾患歯当ての小さな領域のみを生成します。
この技術に伴う利点は、歯竜を支配する経口ジスビオシスと免疫学の同時研究、多様な遺伝的背景を持つ低コストの動物の利用、シンプルな住宅と畜産の実践に基づいています。そのため、疾患組織の量を最大化し、動物研究における減少の原則を実践しようとする試みにおいて、動物の消費量を可能な限り低いレベルに減らすことが目標となるべきである。これには、すべての動物が実験分析37に含まれる能力を確保する必要があります。しかしながら、歯周病のどの動物モデルが利用されても、ヒトPD病態生理学のあらゆる要素を包含する単一のモデルがないことに留意すべきである。
この新しいプロトコルは、ほとんどの実験室で見られる計装および材料を使用して、複数の上顎臼歯の周りの合字の配置を採用しています。これは、早期に発芽する可能性が低い合字を簡単かつ自信を持ってインストールするのに十分な時間を可能にします。最後に、PMNがPDにおける歯素の破壊を調整するにつれて、ヒトに類似した方法で経口好中球を回収する新しい方法論も提示される。
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Protocol
すべてのマウス研究は、関連する倫理規定に準拠し、トロント大学動物ケア委員会と研究倫理委員会(プロトコル20011930)によって承認されました。
1. 合字のインストール
注:これは標準的な手術室で行うことができる非無菌の外科処置である。生殖不能動物の使用(ここではカバーされていない)は、生体安全キャビネット内での取り扱い、無菌器具の使用、歯周病原体を伴う口腔の接種を義務付け、歯周炎の臨床症状を引き起こす。
- 8~12週齢の雄C57BL/6マウスに腹腔内麻酔を投与し、認可された制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)ガイドラインに従って、0.5"26 G滅菌皮下注射針と1 mL注射器を使用して、彼らの住宅施設に順応する必要があります。
注:ケタミン(100 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)の組み合わせは、手順の期間中に麻酔の適切なレベルを迅速かつ確実に誘発します。 - ペダル反射の損失によって証拠として、手順中に麻酔深度を15分ごとに評価します。
- 加熱された手術用プラットフォームにマウスを置きます (図 1A)。弾性バンドを使用して開放位置で上顎と下顎を安定させ、首を綿ロールでプロップして、上顎をより水平方向に維持するのを助ける(図1B)。手順中の熱損失を軽減するために、動物の体と尾をカバーします。
- 歯列の可視化のために口腔の上に所望の倍率と照明(顕微鏡に直接取り付けされていない場合)に外科顕微鏡を置きます。所望の倍率はオペレータ依存であるが、口腔の最適な可視化は16倍で得られる。
- スプリンター鉗子を使用して、最初の(M1)と第2(M2)上顎臼歯の周りに無菌の5-0編組シルク縫合糸を取り付ける。
注:より小さいゲージの編組された絹の縫合糸はより速い取付けを促進し、イアトロジェニックな柔らかいティッシュの損傷の可能性を減らすためにこの目的のために使用することができる。- 歯列の口蓋側に縫合糸の遠位尾を置き、M2とM3の接触の間に近位セグメントを挿入する(図2A)。
- M2の頬面の周りに縫合糸を巻き付け、M1とM2の接触の間に挿入します。縫合糸の両端がしっかりと引っ張られ、縫合糸が歯肉溝に引っ張られ、すべての緩みを取り除くようにしてください(図2B)。
- 近位縫合セグメントをM1の周りに巻き付け、輪郭の高さより低く、M1とM2の接触の間に挿入します。縫合糸の近位尾をしっかりと引っ張って縫合糸を歯肉溝に突き出し、すべての緩みを取り除きます(図2C)。
メモ:M1とM2またはM2とM3の間に縫合糸を挿入する際に抵抗が認められる場合は、標準の歯科探査機を使用して接触がわずかに開いている可能性があります。 - 縫合糸の端を外科医の結び目で結び、できるだけ短く尾をトリミングします。上顎歯列の口蓋側にある M1 と M2 の間の歯肉のエンブラレにノットを配置します (図 2D)。
注: 必要に応じて、手順 1.4.1 ~ 1.4.4 を反対側で繰り返すことができます。 - 各動物の被験者の間の熱いガラスビーズ殺菌器の外科用器具を殺菌しなさい。
注意:鉗子の先端は非常に鋭く、簡単に口腔外傷および重大な出血を引き起こす可能性があります。口腔から血液を取り除き、積極的に出血創傷に圧力を加えるためにガーゼの小さなセグメントを準備します。
- 合字の取り付け後、手術装置からマウスを取り出し、ヒートランプの下の清潔なケージに入れ、完全に回復するまで監視します。
- 個々のマウスを適切な環境エンリッチメントで収納し、温度と湿度制御された環境(12時間光/12-h暗いサイクル)で7〜11日間、フィルター処理された水とマッシュ標準チョウへのアドリビタムアクセスを可能にします。
注:マッシュチョウは、マスチックに必要な力を減少させ、それによって摂食に伴う痛みを軽減し、取り付けられた合字の早期喪失を防ぐのに役立ちます。
2. サンプルコレクション
- 承認されたIACUCガイドラインに従ってマウスを安楽死させる。
注:CO2チャンバーを使用し、その後に子宮頸部脱臼を使用する個々の安楽死は、このプロトコルに好ましい方法です。これは、追加の組織の収穫を必要とする実験に応じて変更される可能性があります。 - ピペットを使用して、すぐに100°Cの殺菌4°C1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の100°Lで口腔を10sですすいだ。
- ステップ2.2 2xを繰り返し、各リンスを単一の15 mL円錐状ポリプロピレン滅菌試験管に入れます。
- 内容物を40μmナイロンメッシュフィルターで実行することにより、50 mL円錐状ポリプロピレン滅菌試験管に転写します。
- これらの内容物を新しい15 mL円錐状ポリプロピレン滅菌試験管に移します。
注:より小さい管へのサンプルの最終的な移動は今後のステップの細胞ペレットの改善された視覚化を可能にする。- 必要に応じて、モル合字を取り出し、別の15 mL円錐状ポリプロピレン滅菌試験管に滅菌1x PBS(4°、カルシウムおよびマグネシウムなし)の300μLに入れます。静かに攪拌し、チューブから縫合糸を取り除く。このサンプルは、この時点から経口リンスサンプルと同一に処理されます。
- サンプル固定を容易にするために、16%パラホルムアルデヒド(PFA)の33.3 μLを加えます。
- サンプルを直ちにボルテックスし、氷上で15分間インキュベートする。
- チューブを15 mLに1x PBSで充填してPFAを希釈し、1000 x gで遠心分離機を5分間4°Cに充填します。
- 上清を吸引し、4°Cで蛍光活性化細胞選別(FACS)緩衝液の1mLでペレットを再サーデ。ヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンターで細胞をカウントします。
- 1000 RCFで再びサンプルを遠心分離し、4 °Cで5分間。
- 上清を吸引し、FACSバッファーの最終濃度0.5~1.0 x 106セル/50μLの適切な体積のペレットを再サスペンドします。
3. フローサイトメトリック分析のための抗体染色
メモ:使用前に必要なすべてのFACSチューブにラベルを付け、冷やしてください。
- ラット血清1μL、抗マウスIgG抗体2μLをサンプル50μLに加え、直ちに渦を、氷上で20分間ブロックします。
- 各サンプルに適切な抗体を追加し、直ちに渦を加え、暗闇の中で30分間氷上でインキュベートします。
注:抗体の選択と体積は、この特定の技術に合わせた以前の最適化パイロット実験に依存します。 - FACSバッファーの1 mLでサンプルを洗浄し、ボルテックスを短時間で、1000 x gおよび4 °Cで5分間遠心分離します。この手順 2x を繰り返します。
- FACSバッファーの250°Lでサンプルを再サスペンドし、パラフィンフィルムでチューブをカバーし、アルミニウム箔で包み、分析まで4°Cで保持します。
メモ:長期間の保存中に蛍光信号が失われるため、プロトコルを完了してから数時間以内にサンプルを分析することが理想的です。ただし、絶対に必要な場合は、2~3日後にサンプルを分析できます。
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Representative Results
ナイーブ(図3A)および炎症を起こした(図3B)マウス口腔から合字誘発歯炎に続く経口リンス試料からの代表的なフローサイトメトリーデータが提供される。インストール済み合字からの PMN の回復も示されています (図 3C)。フローサイトメータチャネル電圧を手動で校正し、単一染色補償ビーズで補償を行った。PMNは、輪郭ゲーティング戦略38を使用してLy6G+veF4/80-veとして定義されました。各経口リンスおよび合字サンプルから最低500個のゲートPMNイベントが取得されました。PMN生存率はトリパンブルー染色により約37%と判定した。肺胞骨紋(ABC)から健康なセメントエナメル接合部(CEJ)に測定した肺胞骨レベルの代表的な画像(図4A)および連結マウス(図4B)。これらの測定値の相対的な違い(図4C)を示す。
図1:モルライゲーションのための動物の位置決め。(A)口腔へのアクセスは、上顎および下顎切歯歯歯体に軽度の牽引を置くことによって、うつ病の位置に下顎骨を保持することによって達成される。(B)ガーゼは、頭部の動きを防止し、上顎を比較的水平な位置に配置するために頭蓋骨の下に置かれる。ボディおよび尾部は顕微鏡の下で外科段階を動かす前に熱損失を防ぐために覆われる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:合字設置の順次写真(A) 縫合糸の遠位尾は歯列の口蓋側に配置され、M2とM3の接触の間に近位セグメントが挿入される。(B) 縫合糸をM2の頬表面に巻き付け、M1とM2の接触の間に挿入する。(C) 近位縫合セグメントは、等高さの高さより低いM1の周りに巻き付け、M1とM2の接触の間に挿入されます。(D) 縫合糸の端部は外科医の結び目で結ばれ、結び目にできるだけ近い。結び目は上顎歯列の口蓋側のM1とM2の間の歯肉のエンブラルに置かれる。すべての写真は、大臼歯の遮るもののないビューで手続きステップを記録するために解剖された上顎で取得されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表的なFACSプロットと口腔好中球の存在を実証するゲーティング戦略。好中球を次のサンプルから回収し、フローサイトメトリーによって評価した:(A)ナイーブマウスからの経口リンス、(B)経口リンス、および(C)合字誘発歯肉炎(両側)を有するマウスから合字を回収した。代表的なゲーティング戦略散布図を示す。シングルト(SSC-H x SSC-WおよびFSC-H x FSC-W)および好中球(Ly6G+ve/F480-ve)は図に示すようにゲートされた。数値は、各ゲート内のセルのパーセンテージを反映します。SSC-A = 側方散乱領域;SSC-W = サイド散乱幅;SSC-H = サイド散乱高;FSC-A = 前方散乱領域;FSC-W = 前方散乱幅;FSC-H = 前方散乱の高さ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:コントロール動物と結種動物の肺胞骨損失差代表的な写真は、(A)対照と(B)鎖形マウスとの間の歯槽骨喪失の違いを示す。(C)セメントエナメル接合部(CEJ)から肺胞骨紋(ABC)までの測定値は、M1およびM2のメシオパラタールおよび解歯槽線角とともに、(平均±SEM、n=3)を示す。P値は、ポストホックフィッシャーのLSD試験を用いた双方向ANOVAによって決定された。(*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
歯周炎のマウス合字誘発モデルの使用に関連する最も重要な要素は、犠牲または意図的な除去の時まで合字の保持を中心とする。設置されたバイオフィルム-リテンション合字は、わずか6日間で歯槽骨の高さの有意な損失を誘導することができ、11〜16日周期39の間に高原化する。骨損失の最大期間の前に動物の被験者を犠牲にするという決定は、合字誘発歯炎のはるかに短いモデルをレンダリングし、動物の非診断を引き起こす犠牲の時間の前に合字の損失として定義される早期合字のアバルジョンの発生率をさらに減少させるために選択された。
このモデルの最も一般的に引用される欠点は、4.4mm(M1)から2.6mm(M3)40までの周囲の小さな大きさのマウスモル歯列寸法に起因する合字を設置することの技術的な難しさを強調している。この問題は、(最大で)10分/動物を必要とし、麻酔の送達を含む合字のインストールのための外科スタッフ/研修生の関与を通じて軽減することができます。さらに、合字の配置は繰り返しによって習得されたスキルであり、手の器用さの高い程度を必要とする多くの一般的なラボベースの技術と同様に集中的ではありません。手続き上の観点から、腹腔内麻酔の使用は合字のインストールを容易にするために広範な時間を提供する。必要に応じて、M1とM2の接触間の歯肉溝と結び目への縫合の局在化が保持に最適であるため、満足のいく方法で設置されていない合字の交換も可能です。
これらのプロトコルの提案された改変は、1)円周縫合糸または2)モル歯列の単一接触の間に配置された縫合糸の単一の線形セグメントのいずれかを必要とする、いくつかの利点を提供する。技術的な観点から、このプロトコルは、容易に入手可能な機器、または安倍やハジシェンガリスと同様の方法で既存の機器から構築できる機器を利用しています。これは、3D印刷33による機器の特別注文や製造の必要性を排除します。舌によって妨げることができない外科医の結び目で固定された複数の歯の周りに連続的な絹の縫合糸の取り付けはまた合字の保持を改善するかもしれない。
このプロトコルの過程で、最大20%の損失が予想されるマルケサンらによって提案された技術と比較して、早期合字アデューション36が完全に欠損した。合字喪失の発生率は安倍とハジシェンガリスによって直接評価されなかったが、この技術は多くの研究で適用されている41,42,43,44.技術的な観点から、イアトロゲン軟部組織損傷は、連結動物において回避された。この現象に寄与する要因には、顕微鏡による口腔の継続的な観察、鉗子の先端の一定の可視化、配置中の縫合糸の滑り落ちを防ぐためのクリーン鉗子の使用などがあります。
口腔内では、縫合材料の細長いセグメントはまた、分析に利用可能な疾患組織の量を劇的に増加させ、動物の使用の顕著な減少をもたらすことができます。これは、すべての被験者が分析に含むことができ、組織およびリンスサンプルのプールが不要であるためである。なお、患部41を増加させる先に報告された技術を利用して、対国間上顎大臼歯をリゲートすることができることに留意すべきである。ただし、この変更は、スプリットマウス設計が必要な場合には不可能であり、この新しいプロトコルの適用のためのサポートを貸し出します。最後に、以前の合字誘発歯炎プロトコルに似て、この技術の使用は、8〜12週齢の雄C57BL/6マウスに限定されない。より高齢のマウス、性別、および様々な遺伝的背景は、実験計画に応じて許容され得る。
残念ながら、このモデルにはまだ技術的および方法論的な欠陥があります。上記のように特定の病原体を含まないマウスの使用は、ヒト歯上炎の進行を模倣することはできません。これは、細菌-細菌および細菌宿主相互作用45を評価する外部の有効性を制限する、彼らの共皮経口バイオフィルムの組成間のいくつかの相違によるものである。これは、理論的には、プロトコルを著しく複雑にする生殖不能マウスの使用を通じて軽減することができる。ハウジングおよび外科的操作中に動物の被験者が生殖不能のままであることを保証するために、さらなる努力と資源が必要である。これらのマウスは細菌蓄積46、47がない場合に合字誘発PDに対して耐性であるため、歯歯炎を発症するためのさらなる対策も講じる必要がある。
さらに、単一感染および共感染合字モデルは、歯周病がバイオフィルムと宿主免疫系との間のより複雑なポリ微生物相互作用を表すので、ヒトの状態を再現するには及ばない。このような状況において、限られた数のヒト口腔細菌の役割、および相互作用を解明することは、特に歯酸免疫生物学を研究する文脈において、欠乏および潜在的に不利であると考えられる。
最後に、最近の証拠は、マスチックの力がTヘルパー17細胞の蓄積を介して歯肉免疫サーベイランスを改変することができることを含み、バリア免疫48の不可欠なメディエーターである。このように、ソフトダイエットの使用は、特に古い動物において、潜在的な共同創設者として作用し得る。これは、合字が適用されている領域で正常な生理学的な骨損失の可能性を減少させる可能性があります。.この証拠に照らして、これらの知見が最も顕著であることが指摘されている老齢動物および適切な年齢に一致するコントロールの使用に慎重に考慮する必要があります。
この比較的単純なモデルの使用は、マイクロコンピュータ断層撮影による肺胞骨損失の評価、肺胞骨および周囲の付着歯肉の両方の経理学的解析、および経口微生物叢特性評価を行うために拡張することができ、そのすべてが既存の合字誘発PDモデル33、49で達成された。めったに議論または利用されることはめったにないが、微細点破片鉗子39を有する全身麻酔下で合字を除去することによって合字誘発性マウス歯膜炎の設定における治療の効果(ならびに歯素の修復および再生)を評価することも可能である。最後に、このモデルの使用は、必要に応じて、複数の歯の結び合合によって引き起こされる炎症負荷の増加による歯周病の全身的な影響、ならびに左右の上顎大臼歯の歯列を研究することに拡張され得る。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
J. W. C. はカナダ保健研究所 (CIHR) の支援を受けています。著者たちは、トリパンブルー染色を行う際の彼女の支援に対して、春祥孫博士に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
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