Summary
本文提出了建立涉及多个上颌骨的月牙病结扎诱导模型的协议，从而在涉及牙龈组织和骨骼的较大区域进行后续分析，并减少动物使用。还介绍了一种以类似于人类受试者的方式评估口服中性粒细胞的技术。
Abstract
利用鼠模型研究牙周病的病理生理学的主要优点是降低了动物的成本，一系列转基因菌株，大量的分析可以在收获的软组织和硬组织上进行。然而，其中许多制度受到程序上的批评。作为替代方案，可以采用牙周病的结扎诱导模型，由非生物性口腔微生物群的局部发展和保留驱动，这种模型是快速诱导的，相对可靠。不幸的是，结扎引起的鼠期牙周炎协议的变种被隔离到牙周的重点区域，并受到安装的连体过早的外泄。这最大限度地减少了可用于后续分析的组织数量，并增加了研究所需的动物数量。该协议描述了必要的精确操作，以放置扩展的摩尔结扎，改善保留和使用一种新的冲洗技术，以恢复小鼠的口服嗜中性粒细胞与另一种方法，以减轻上述技术挑战。
Introduction
牙周病（PD）是一种与重大宿主发病率和经济负担相关的骨解疾病，表现为牙龈炎症和软组织附件的丧失和对受影响的牙龈1、2、3、4的骨质支持。这个过程由宿主的口腔微生物群和先天免疫系统之间的相互作用所控制。它也与其他全身炎性疾病的恶化有关，包括糖尿病、心血管疾病和癌症5，6，7，8。从历史上看，据推测，PD发病机制依赖于大量的特定细菌，如波菲洛莫纳斯牙龈9。然而，最近的证据表明，PD的微生物成分是由牙科生物膜介导的。生物膜是一个有组织的，复杂的社区，由众多微生物组成，可以存在于健康的共生和破坏性的生物发育不良状态10，11。口服生物膜通常通过防止致病菌的建立来抵抗宿主，并通过调节宿主免疫反应12、13促进理想的牙龈组织结构和功能。口腔内共体生物体与宿主免疫系统之间平衡关系的扰动可能导致组织平衡的改变，导致细菌不及PD5、10、12、13、14的标记临床和放射外观的发展。
有趣的是，建立口腔不良细菌病，虽然需要启动PD，但不足以驱动PD在所有个体，逃避宿主免疫反应的能力，颠覆微生物群之间的共生和发育不良状态15过渡。这特别突出了PD影响先天免疫系统的主要特征之一，即多态核粒细胞（PMN），或中性粒细胞，从局部和系统的角度来看，从局部和系统的角度16，17。
在人类中，PMN在健康的牙周结缔组织中以+2 x 106细胞/小时的速度从循环中招募，它们是主要白细胞种群。在这里，它们随后被从牙龈硫酸盐中排出到口腔中，作为牙龈粘液的组成部分。在PD的存在，嗜中性粒细胞在循环和口腔中显现，其中这些效应细胞具有超炎表型，导致上述破坏的牙周17，18，19，20，21，22。因此，了解 PMN 在 PD 和其他全身炎症条件中的作用至关重要。
虽然人们普遍认为慢性病与PD有相互联系，但基本机制尚未得到阐明，造成这些病态和可能致命的系统疾病的管理困难。多个实验动物模型，每个都有独特的优点和缺点，已被利用来研究PD23，24的病理生理学。特别侧重于鼠模型，有各种协议，通过它促进对PD的研究;然而，他们有几个技术和生理缺陷25，26，27，28，29，30，31。
首先，口服腹膜小鼠模型需要大量人类牙周病原体的口服接种，以产生牙龈炎症和骨质流失。此外，它一般先有一段时间的抗生素治疗，以颠覆鼠群的口腔菌群25。这种模式通常需要专门的训练来安全地进行口腔结节，只使用一小部分来自更复杂的人类口腔微生物群的牙周病原病原体，并且需要几个月才能建立腹腔骨流失。
相反，化学诱导的鼠模型利用口服三硝基苯硫酸（TNBS）或硫酸钠（DSS），这种在几个月内建立结肠炎的鼠类模型时常用的制剂诱导牙周骨流失26。基于口腔内脓肿和外脓肿的模型可用，分别涉及地膜和钙化物的鼠切口和组织。在以前的脓肿模型中，多次注射细菌，产生多个牙龈脓肿和缺乏藻类骨质流失，限制了其在PD研究中的使用。后者脓肿模型明显更容易研究口腔外部位的细菌毒性、炎症和骨吸收，从而消除对牙周和口腔微生物群27、28、29、30、31的评价。
使用牙周炎的结结诱导模型，一个编织的丝线缝合线通常围绕第二摩尔周围安装。作为替代方案，缝合材料的单一线性段可以插入第一和第二摩尔32，33之间。结扎放置的目的是促进细菌积累和在牙龈硫化物内产生肌酸，导致牙周组织炎症和破坏组织组成牙周。最值得注意的是，这种模式能够产生显着更多的阿尔韦拉尔骨流失相比，更常用的口腔口盖模型34。使口服性食样模型的使用更加复杂的是，几种小鼠菌株（即C57BL/6）对发育的卵泡骨流失具有天然的抵抗力。这也是有问题的，因为这种菌株是最常用的基于鼠的动物研究35。
马尔切桑等人、安倍和哈吉森利斯所描述的现有程序旨在简化将连字33、36放置的技术操作。不幸的是，前一个协议需要专门的3D打印设备，并具有过早结扎丢失的可能性，从而增加动物的使用和与在手术室中花费的额外时间相关的成本。此外，这两种协议只产生可用于研究的患病牙周小区域。
该技术的优点在于同时研究口腔发育不良和免疫学，这些研究控制着牙周，利用具有不同遗传背景的低成本动物，以及简单的住房和饲养方法。因此，目标应该是尽量扩大病组织的数量，并为了实践减少动物研究的原则，将动物消费减少到尽可能低的水平。这需要确保所有动物都能被纳入实验分析37。然而，应该指出的是，无论使用哪种牙周病的动物模型，没有一个单一的模型，包括人类PD病理生理学的每一个元素。
这项新协议使用大多数实验室中的仪器和材料，在多个超颌摩尔牙齿周围放置结扎。它允许足够的时间轻松而自信地安装不太可能过早发生的连字。最后，当PMN协调PD中牙周牙的销毁时，还提出了一种以类似人类的方式恢复口服中性粒细胞的新方法。
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Protocol
所有鼠的研究都符合相关的伦理法规，并经多伦多大学动物护理委员会和研究伦理委员会批准（协议20011930）。
1. 连字安装
注：这是一个非无菌的外科手术，可以在标准手术室进行。使用无细菌动物（此处未涵盖）要求在生物安全柜内处理、使用无菌仪器以及用牙周病原体接种口腔，以引起牙周炎的临床表现。
- 根据经批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，使用0.5"26G无菌皮下针和1 mL注射器，对8~12周大的雄性C57BL/6小鼠进行腹腔内麻醉，这些小鼠应适应其住房设施。
注：氯胺酮（100毫克/千克）和木兰辛（10毫克/千克）麻醉剂的组合，在手术过程中迅速可靠地诱导适当的麻醉水平。 - 评估手术前和每 15 分钟的麻醉深度，踏板反射损失证明了这一点。
- 将鼠标放在加热的手术平台上（图1A）。使用弹性带将 maxilla 和下颌稳定在打开位置，并用棉卷支撑颈部，以帮助在更水平的方向上保持 maxilla（图1B）。盖住动物的身体和尾巴，以减轻手术过程中的热量损失。
- 将手术显微镜置于所需的放大倍率和照明（如果未直接安装在显微镜上），以可视化牙龈。当所需的放大倍率取决于操作员时，口腔的最佳可视化在 16 倍时得到。
- 在第一 （M1） 和第二 （M2） 上颌摩尔周围安装无菌 5-0 编织丝缝合线，使用碎裂钳在牙龈硫酸液中。
注：小型仪表的编织丝线可用于此目的，以便加快安装速度并减少异体性软组织损伤的可能性。- 将缝合线远端置于牙龈的凹面，并在M2和M3的接触之间插入近端段（图2A）。
- 将缝合线包裹在 M2 的布卡表面周围，并将其插入 M1 和 M2 的接触点之间。确保缝合的两端被拉紧，将缝合线推入牙龈硫化物并去除所有松弛（图2B）。
- 将近缝合线段环绕 M1，使其低于其轮廓高度，并将其插入 M1 和 M2 的接触点之间。紧紧拉缝合线近端尾部，将缝合成牙龈硫化物并去除所有松弛（图2C）。
注：如果在 M1 和 M2 或 M2 和 M3 之间插入缝合线时观察到电阻，则使用标准牙科探索器，接触可能稍微打开。 - 用外科医生的结系缝合的末端，并尽可能短地修剪尾巴。将结放在 M1 和 M2 之间的牙龈膜中，放在上颌牙龈的凹面上（图2D）。
注：如果需要，可以在反面重复步骤 1.4.1_1.4.4。 - 在每个动物主体之间的热玻璃珠消毒器中消毒手术器械。
注意：钳子的尖端非常锋利，容易造成口腔创伤和严重出血。准备一小段纱布，从口腔中取出血液，并施加压力，积极出血伤口。
- 结扎安装后，将鼠标从手术器械中取出，放入热灯下的清洁笼子，并监控，直到完全恢复。
- 在温度和湿度控制的环境中（12-h Light/12-h 黑暗周期）内，单独容纳每只小鼠，并可让贴合器在温度和湿度控制的环境中使用过滤水和捣碎的标准小菜，为期 7-11 天。
注：捣碎的奶胶可降低咀嚼所需的力，从而减少与喂食相关的疼痛，并有助于防止已安装的结扎过早丢失。
2. 样本收集
- 根据经批准的IACUC指南对小鼠实施安乐死。
注：使用CO2腔室后跟宫颈脱位进行单独安乐死是本协议的首选方法。这可能会改变，这取决于需要收获额外组织的实验。 - 使用移液器，立即用100μL的灭菌4°C 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗口腔，无需钙和镁10s。
- 重复步骤 2.2 2x，将每次冲洗放入单个 15 mL 锥形聚丙烯无菌试管中。
- 将内容物通过 40 μm 尼龙网状过滤器将其输送到 50 mL 锥形聚丙烯无菌试管中。
- 将这些内容物转移到新的15 mL锥形聚丙烯无菌试管中。
注： 样品最终转移到较小的管中，可以在接下来的步骤中改进细胞颗粒的可视化效果。- 如果需要，取出摩尔结扎，放入300 μL的消毒1x PBS（4°C，不含钙和镁）中，放入单独的15 mL圆锥形聚丙烯无菌试管中。轻轻搅拌，从管中取出缝合线。从这个角度开始，该样品的处理方式与口服冲洗样品相同。
- 加入33.3 μL 16%的甲醛（PFA），以方便样品固定。
- 立即涡旋样品，在冰上孵育15分钟。
- 用1x PBS将管注至15 mL，以稀释PFA，然后在1000 x g和4°C下离心5分钟。
- 在4°C下，在荧光活性细胞分拣（FACS）缓冲液中吸气上清液，重新悬浮颗粒。在血细胞计或自动细胞计数器上对细胞计数。
- 在1000 RCF和4°C下再次将样品离心5分钟。
- 吸出上清液，将颗粒重新悬浮在适当体积的FACS缓冲液中，最终浓度为0.5±1.0 x 106细胞/50μL的FACS缓冲液。
3. 用于流动细胞测定分析的抗体染色
注意：在使用前标记并冷却所有必需的 FACS 管。
- 将1μL的大鼠血清和2μL的抗小鼠IgG抗体加入50μL的样品中，立即涡旋，并在冰上块20分钟。
- 在每个样品中加入适当的抗体，立即涡旋，在黑暗中在冰上孵育30分钟。
注：抗体的选择和数量取决于先前针对此特定技术定制的优化试验。 - 用1 mL的FACS缓冲液清洗样品，在1000 x g和4°C下短暂涡旋和离心5分钟。重复此步骤 2 倍。
- 在 250 μL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮样品，用石蜡薄膜覆盖管，用铝箔包裹，并保持在 4°C 下直到分析。
注：由于长时间储存期间荧光信号丢失，在完成协议后几小时内分析样品是理想的选择。但是，如果绝对需要，可以在 2~3 天后对样品进行分析。
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Representative Results
提供来自幼稚的口腔冲洗样本（图3A）和发炎（图3B）的代表性流细胞学数据，该数据是结扎引起的牙周炎的次要的。还演示了从已安装的连字恢复 PMN （图 3C）。流量细胞仪通道电压经过手动校准，使用单色补偿珠进行补偿。PMN 使用概述的浇注策略38定义为 Ly6G+veF4/80-ve。从每个口服冲洗和连字样本中至少采集了500个门控PMN事件。PMN 的生存能力被确定为大约 37% 通过锥蓝色染色。从阿尔韦拉尔骨峰（ABC）到水泥纳米结（CEJ）测量的阿尔韦拉尔骨水平代表图像（图4A）和结块小鼠（图4B）。提供了这些测量值之间的相对差异（图4C）。
图1：动物定位为摩尔结扎。（A） 通过在上颌和下颌切口上施加温和的牵引力，将下颌置于凹陷位置，从而获得口腔。（B） 高泽被放置在头骨下面，以防止头部移动，并将 maxilla 置于相对水平的位置。在显微镜下移动手术阶段之前，身体和尾部被覆盖以防止热量损失。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：连字安装的顺序照片。（A） 缝合口的远端位于牙口的凹面，近端段插入M2和M3的接触点之间。（B） 缝合线然后包裹在 M2 的布卡表面，然后插入 M1 和 M2 的接触之间。（C） 近缝合线段绕在 M1 的轮廓高度以下，然后插入 M1 和 M2 的接触点之间。（D） 缝合线的末端与外科医生的结绑在一起，并尽可能接近结。结被放置在M1和M2之间的牙龈膜膜，位于上额凹陷的阴极侧。所有照片均采集在解剖的maxilla上，用于记录程序步骤，并一览无余地查看摩尔凹痕。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：代表FACS图和门控策略，证明口服中性粒细胞的存在。从以下样本中回收和通过流动细胞学评估的嗜中性粒细胞：（A）从幼鼠口冲洗，（B）口服冲洗，以及（C）从带有结扎引起的牙周炎小鼠中恢复结扎（双边）。显示具有代表性的浇注策略散点图。单体（SSC-H x SSC-W 和 FSC-H x FSC-W）和嗜中性粒细胞（Ly6G+ve/F480-ve）均如图所示。数值反映每个门内的单元格的百分比。SSC-A = 侧散射区域;SSC-W = 侧散射宽度;SSC-H = 侧散射高度;FSC-A = 正向散射区域;FSC-W = 正向散射宽度;FSC-H = 正向散射高度。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：对照动物和结扎动物之间的阿尔韦拉尔骨质流失差异。代表照片显示 （A） 对照和 （B） 结块小鼠在阿尔韦拉尔骨流失方面的差异.（C） 显示了从水泥纳米结 （CEJ） 到腹腔骨峰 （ABC） 以及 M1 和 M2 的环流和远端线角度的测量值（均值 = SEM，n = 3）。P 值由双向 ANOVA 通过后费舍尔的 LSD 测试确定。（\p < 0.01; \p < 0.001; \p < 0.0001）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
与使用月冠引起的牙周炎模型相关的最关键的因素是围绕保留结扎，直到牺牲或故意去除的时间。安装的生物膜保持结扎能够导致在6天内导致阿尔韦拉尔骨高度的显著损失，在11-16天期间39之间稳定下来。决定在骨质流失的最长时期之前牺牲动物受试者，使这个结扎引起的牙周炎模型更短，被选择进一步减少过早结扎的发生率，定义为在牺牲前失去结扎，使动物无法诊断。
该模型最常引用的缺点突出表明，由于鼠鼠凹陷的微小尺寸，周长范围从 4.4 mm （M1） 到 2.6 mm （M3）40，因此安装连字的技术难度明显。这个问题可以通过外科工作人员/受训人员参与结扎安装来缓解，这最多需要10分钟/动物，包括麻醉。此外，结扎的放置是通过重复掌握的技能，它不比许多常见的基于实验室的技术，需要更高的手动灵巧程度更密集。从程序的角度来看，使用腹内麻醉提供了广泛的时间，以促进结扎安装。如果需要，它还允许更换未以令人满意的方式安装的任何连字，因为 M1 和 M2 触点之间的缝合线和结的定位是保持的理想选择。
这些协议的拟议修改要求使用圆周缝合线对单个摩尔进行结扎，或者2）在摩尔假牙的单个接触之间放置一个线性缝合段，这提供了几个优点。从技术角度看，该协议使用的设备要么随时可用，要么可以按照与安倍和哈吉森利斯类似的方式从现有设备中建造。这消除了需要特殊订单或制造设备3D打印33。在多颗牙齿周围安装连续的丝质缝合带，用外科医生的结固定，不受舌头干扰，也可以改善结扎保留。
在该协议过程中，与Marchesan等人提出的预计损失高达20%的技术相比，完全不存在过早的结扎性附着性36。虽然阿不都文事件损失的发生率没有直接由安倍和哈吉森利斯评估，但该技术已应用于一些研究41，42，43，44。从技术角度看，在结扎动物中避免了异体性软组织损伤。造成这种现象的因素包括通过显微镜持续观察口腔，不断可视化钳口，以及使用干净的钳子防止在放置过程中从缝合线滑落。
在口腔内，缝合材料的拉长段也大大增加了可用于分析的病变组织的数量，并可能导致动物使用明显减少。这是因为所有受试者都可以包括在分析中，并且不需要组织池和冲洗样品。应该指出的是，有可能利用先前报道的技术，使反向上颌长毛齿牙增加受影响的组织面积41。但是，在需要分嘴设计的情况下，无法进行这种修改，这为应用此新协议提供了支持。最后，与以前的结扎引起的牙周炎方案类似，该技术的使用不限于8-12周大的雄性C57BL/6小鼠。年龄较大的小鼠，无论是性别，以及各种遗传背景，根据实验设计，是可以接受的。
遗憾的是，该模型仍然具有一些技术和方法缺陷。使用上述详述的特定无病原体小鼠不能模仿人类牙周炎的进展。这是由于其共生口服生物膜的组成存在若干差异，这限制了评估细菌-细菌和细菌宿主相互作用的外部有效性45。从理论上讲，这可以通过使用无细菌小鼠来缓解，这使得协议变得显著复杂化。需要额外的努力和资源，以确保动物受试者在住房和手术操作期间保持无菌。还必须采取进一步措施发展牙周炎，因为这些小鼠在无细菌积累46，47的情况下对结扎引起的PD具有抗药性。
此外，单一感染和合并结扎模型无法概括人类状况，因为牙周病代表了生物膜和宿主免疫系统之间更复杂的多微生物相互作用。在这种情况下，阐明有限数量的人类口腔细菌的作用和相互作用可能被认为是缺陷和潜在的不利，特别是在研究牙周免疫生物学的背景下。
最后，最近的证据已经牵连到，粘胶的力量能够通过T帮助器17细胞的积累来改变牙龈免疫监测，这是屏障免疫的一个整体中介48。因此，使用软饮食，特别是在老年动物中，可能会起到潜在的共分作用。这可能减少在已应用连字的区域的正常生理骨流失的可能性。鉴于这一证据，应认真考虑使用老年动物和适当的年龄匹配控制，这些发现被认为是最突出的。
这个相对简单的模型的使用可以扩展到评估阿尔韦拉尔骨流失通过微计算机断层扫描，对阿尔韦拉尔骨和周围附着牙龈进行地形学分析，并进行口服微生物群表征，所有这些都已经完成了现有的结扎诱导PD模型33，49。虽然很少讨论或使用，它也是可行的评估治疗的效果，（以及修复和再生的牙周炎）在结扎引起的鼠期牙周炎的设置，通过去除结扎在一般麻醉下与细点分裂钳39。最后，该模型的使用可以扩展到研究牙周病的系统性影响，由于多颗牙齿的结扎引起的炎症负荷增加，以及左、右上颌齿性假牙（如果需要的话）。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
J. W. C. 得到加拿大卫生研究所（CIHR）的支持。作者要感谢孙春祥博士协助进行试青蓝染色。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
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