Summary
Questo articolo presenta un protocollo per stabilire un modello di parodontite indotta da legatura di parodontite murina che coinvolge molari maxillari multipli, con conseguente aree più grandi del tessuto gengivale e dell'osso coinvolti per l'analisi successiva, nonché l'uso ridotto degli animali. Viene descritta anche una tecnica per valutare i neutrofili orali in modo analogo ai soggetti umani.
Abstract
I principali vantaggi dello studio della fisiopatologia della malattia parodontale utilizzando modelli murini sono la riduzione del costo degli animali, la gamma di ceppi geneticamente modificati, il gran numero di analisi che possono essere eseguite su tessuti molli e duri raccolti. Tuttavia, molti di questi sistemi sono oggetto di critiche procedurali. In alternativa, può essere impiegato il modello di malattia parodontale indotta dalla legatura, guidata dallo sviluppo localizzato e dalla ritenzione di un microbioma orale disbiotico, che è rapidamente indotto e relativamente affidabile. Purtroppo, le varianti del protocollo di parodontite murina indotta dalla legatura sono isolate nelle regioni focali del parodonto e soggette ad avulsione prematura della legatura installata. Questo riduce al minimo la quantità di tessuto disponibile per le analisi successive e aumenta il numero di animali necessari per lo studio. Questo protocollo descrive le manipolazioni precise necessarie per inserire legature molare estese con una migliore ritenzione e l'uso di una nuova tecnica di risciacquo per recuperare i neutrofili orali nei topi con un approccio alternativo che mitiga i suddetti sfide tecniche.
Introduction
La malattia parodontale (PD) è una condizione osteolitica associata a una significativa morbilità dell'ospite e onere economico, che si manifesta con infiammazione gengivale e perdita sia dell'attaccamento dei tessuti molli che del supporto osseo per la dentizione interessata1,2,3,4. Questo processo è regolato dalle interazioni tra il microbiota orale e il sistema immunitario innato dell'ospite. È anche associato con esacerbazione di altre malattie infiammatorie sistemiche tra cui il diabete, malattie cardiovascolari, e il cancro5,6,7,8. Storicamente, è stato ipotizzato che la patogenesi della PD dipende da grandi quantità di batteri specifici come Porphyromonas gingivalis9. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che la componente microbica della PD è mediata dal biofilm dentale. Il biofilm è una comunità organizzata e complessa di numerosi microrganismi che possono esistere in sani stati simbiotici e distruttivi disbiotici10,11. Il biofilm orale normalmente offre resistenza all'ospite impedendo la creazione di foci di batteri patogeni e promuove la struttura e la funzione del tessuto gengivale ideale attraverso la regolazione della risposta immunitaria dell'ospite12,13. Le perturbazioni della relazione equilibriosa tra gli organismi commensali all'interno della cavità orale e il sistema immunitario ospite possono portare ad alterazioni dell'omeostasi dei tessuti, con conseguente disbatteriosi e sviluppo del segno distintivo delle comparse cliniche e radiografiche di PD5,10,12,13,14.
È interessante notare che la creazione di una disbatteriosi orale, sebbene necessaria per l'avvio della PD, non è sufficiente per guidare la PD in tutti gli individui, eludendo verso la capacità della risposta immunitaria dell'ospite di sovvertire la transizione del microbiota tra stati simbiotici e disbiotici15. Questo pone un particolare riflettore sui mezzi attraverso i quali la PD influenza uno dei principali caratteri del sistema immunitario innato, vale a dire il granulocito polimorfonucleare (PMN), o neutrofilo, da prospettive locali e sistemiche16,17.
Nell'uomo, le PNN vengono reclutate dalla circolazione ad un tasso di 2 x 106 cellule/h nei tessuti connettivi parodontali sani, dove sono la popolazione di leucociti predominante. Qui, vengono successivamente espulsi dal solco gengivale nella cavità orale come componente del liquido crevicolare gengivale. In presenza della PD, la neutrofilia si manifesta all'interno della circolazione e della cavità orale, dove queste cellule eftori possiedono un fenotipo iperinfiammatorio che porta alla suddetta distruzione del parontium17,18,19,20,21,22. Pertanto, comprendere il ruolo delle PMN nella PD e in altre condizioni infiammatorie sistemiche è della massima importanza.
Anche se è ampiamente riconosciuto che le malattie croniche sono reciprocamente legate alla PD, i meccanismi sottostanti devono ancora essere chiariti, contribuendo a difficoltà nella gestione di queste condizioni sistemiche morbose e potenzialmente fatali. Diversi modelli animali sperimentali, ciascuno con vantaggi e svantaggi unici, sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia del PD23,24. Concentrandosi in particolare sui modelli murini, ci sono una varietà di protocolli attraverso i quali lo studio della PD è facilitato; tuttavia, essi possiedono diverse carenze tecniche e fisiologiche25,26,27,28,29,30,31.
In primo luogo, il modello di topo gavage orale richiede numerose inoculazioni orali di patogeni parodontali umani per generare infiammazione gengivale e perdita ossea. Inoltre, è generalmente preceduto da un periodo di trattamento antibiotico per sovvertire la flora orale murinacommensale 25. Questo modello spesso richiede una formazione specializzata per eseguire in modo sicuro il gavage orale, utilizza solo una piccola frazione di patogeni parodontali dal più complesso microbioma orale umano e richiede diversi mesi per stabilire la perdita ossea alveolare.
Al contrario, i modelli murini indotti chimicamente utilizzano la consegna orale di acido solforico trinitrobenzene (TNBS) o sodio solfato dextran (DSS), agenti comunemente utilizzati nella creazione di modelli murini di colite per un periodo di diversi mesi per indurre la perdita ossea periodoontale26. Sono disponibili modelli a base di ascesso intraorale ed extraorale, che coinvolgono rispettivamente gli incisivi murini e i tessuti del dorsum e il calvario. Nel modello precedente di ascesso, vengono somministrate diverse iniezioni di batteri, creando ascessi gingivali multipli e una carenza di perdita ossea alveolare, limitando il loro uso nello studio della PD. Questi ultimi modelli di ascesso sono significativamente più adatti allo studio della virulenza batterica, dell'infiammazione e del riassorbimento osseo in siti al di fuori della cavità orale, che elimina la valutazione del paroto e del microbioma orale27,28,29,30,31.
Utilizzando il modello indotto dalla legatura della parodontite, una sutura di seta intrecciata è stata comunemente installata ciferenzialmente intorno al secondo molare. In alternativa, è possibile inserire un singolo segmento lineare di materiale di sutura tra il primo e il secondo molari32,33. L'obiettivo del posizionamento della legatura è quello di facilitare l'accumulo batterico e generare disbiosi all'interno del sulci gengivale, con conseguente infiammazione del tessuto parodontale e distruzione dei tessuti che compongono il parodonto. In particolare, questo modello è in grado di produrre significativamente più perdita ossea alveolare rispetto al modello di gavage orale più comunemente usato34. A complicare ulteriormente l'uso del modello di gavage orale è la resistenza naturale da parte di diversi ceppi di topi (cioè C57BL/6) allo sviluppo della perdita ossea alveolare. Questo è anche problematico, in quanto questo ceppo è il più frequentemente utilizzato nella ricerca animale a base di murini35.
Le procedure esistenti descritte da Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis sono state ideate per semplificare l'atto tecnico di collocare la legatura33,36. Purtroppo, il primo protocollo richiede attrezzature specializzate stampate in 3D e possiede il potenziale per la perdita prematura delle legature, aumentando così l'uso degli animali e i costi associati al tempo aggiuntivo trascorso in sala operatoria. Inoltre, entrambi i protocolli generano solo piccole regioni del parodonto malato disponibili per uno studio.
I vantaggi che si trovano con questa tecnica sono radicati nello studio simultaneo della disbiosi orale e dell'immunologia che governano il parodonto, l'utilizzo di animali a basso costo con diversi background genetici e semplici pratiche abitative e allevamento. Come tale, gli obiettivi dovrebbero essere di massimizzare i volumi di tessuto malato e, nel tentativo di praticare i principi di riduzione della ricerca animale, ridurre il consumo di animali a un livello il più basso possibile. Ciò richiede che tutti gli animali siano in grado di essere inclusi nelle analisi sperimentali37. Tuttavia, va notato che non importa quale modello animale della malattia parodontale viene utilizzato, non esiste un singolo modello che comprenda ogni elemento della fisiopatologia della PD.
Questo nuovo protocollo impiega il posizionamento di una legatura intorno a più denti molari mascellare utilizzando strumentazione e materiali che si trovano all'interno della maggior parte dei laboratori. Permette una quantità sufficiente di tempo per installare facilmente e con sicurezza una legatura che è improbabile che si amvulsi prematuramente. Infine, poiché le PMN coordinano la distruzione del parodonto nella PD, viene presentata anche una nuova metodologia per recuperare i neutrofili orali in modo analogo agli esseri umani.
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Protocol
Tutti gli studi murine rispettavano i pertinenti regolamenti etici e sono stati approvati dall'Università di Toronto Animal Care Committee e dal Research Ethics Board (Protocollo 20011930).
1. Installazione della legatura
NOTA: Questa è una procedura chirurgica non sterile che può essere eseguita in una sala operatoria standard. L'uso di animali privi di germi (non qui trattato) impone la manipolazione all'interno di un armadio di biosicurezza, l'uso di strumenti sterili e l'inoculazione della cavità orale con patogeni parodontali per causare le manifestazioni cliniche della parodontite.
- Somministrare l'anestesia intraperitoneale a 8-12 topi C57BL/6 maschi di una settimana, che dovrebbero essere acclimatati alla loro struttura abitativa, utilizzando un ago ipodermico sterile da 0,5" G e una siringa da 1 mL secondo le linee guida approvate del comitato di cura e di utilizzo degli animali (IACUC).
NOTA: Una combinazione di anestetici chetamina (100 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) induce rapidamente e in modo affidabile il livello appropriato di anestesia per tutta la durata della procedura. - Valutare la profondità anestetica prima e ogni 15 minuti durante la procedura, come evidenziato dalla perdita del riflesso del pedale.
- Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica riscaldata (Figura 1A). Stabilizzare la mascella e mandibole in posizione aperta utilizzando elastici e sostenere il collo con un rotolo di cotone per aiutare a mantenere la mascella in un orientamento più orizzontale (Figura 1B). Coprire il corpo e la coda dell'animale per mitigare la perdita di calore durante la procedura.
- Posizionare il microscopio chirurgico all'ingrandimento e all'illuminazione desiderati (se non montato direttamente al microscopio) sopra la cavità orale per la visualizzazione della dentizione. Mentre l'ingrandimento desiderato dipende dall'operatore, la visualizzazione ottimale della cavità orale si ottiene a 16x.
- Installare una sutura sterile di seta intrecciata 5-0 intorno al primo (M1) e al secondo (M2) molari mascellanti all'interno del solco gengivale utilizzando pinze scheggiate.
NOTA: suture di seta intrecciate di un misuratore più piccolo possono essere utilizzate per facilitare un'installazione più rapida e ridurre la possibilità di danni ai tessuti molli iatrogenici.- Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentizione e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M2 e M3 (Figura 2A).
- Avvolgere la sutura intorno alla superficie buccaliale di M2 e inserirla tra il contatto di M1 e M2. Assicurarsi che entrambe le estremità della sutura siano tirate strettamente per guidare la sutura nel solco gengivale e rimuovere tutto il margine di flessibilità (Figura 2B).
- Avvolgere il segmento di sutura prossimale intorno a M1, sotto la sua altezza di contorno, e inserirlo tra il contatto di M1 e M2. Tirare la coda prossimale della sutura ermeticamente per guidare la sutura nel solco gengivale e rimuovere tutto il allentamento (Figura 2C).
NOTA: Se si osserva resistenza quando si inserisce la sutura tra M1 e M2 o M2 e M3, il contatto potrebbe essere leggermente aperto utilizzando un esploratore dentale standard. - Legare le estremità della sutura con un nodo di chirurgo e tagliare le code il più corto possibile. Collocare il nodo nell'embrasure gingivale tra M1 e M2 sul lato palatale della dentizione mascellare (Figura 2D).
NOTA: i passaggi da 1.4.1– 1.4.4 possono essere ripetuti sul lato contralaterale, se necessario. - Sterilizzare gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore di perline di vetro caldo tra ogni soggetto animale.
INFORMATIVA: Le punte delle pinze sono estremamente affilate e possono facilmente causare traumi orali e sanguinamento significativo. Preparare piccoli segmenti di garza per rimuovere il sangue dalla cavità orale e applicare pressione alle ferite sanguinanti attivamente.
- Dopo l'installazione di legatura, rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico, posizionare in una gabbia pulita sotto una lampada termica e monitorare fino a quando non completamente recuperato.
- Ospita singolarmente ogni topo con l'adeguato arricchimento ambientale e consenti l'accesso al libitum all'acqua filtrata e al manicomio di cibo in un ambiente controllato dalla temperatura e dall'umidità (ciclo scuro di 12 ore di luce/12 h) per 7-11 giorni.
NOTA: La chow del purè riduce le forze necessarie per la masticazione riducendo così il dolore associato all'alimentazione e aiuta a prevenire la perdita prematura della legatura installata.
2. Raccolta di campioni
- Topi eutanasi secondo le linee guida Approvate IACUC.
NOTA: l'eutanasia individuale che utilizza una cameraco2 seguita da lussazione cervicale è il metodo preferito per questo protocollo. Questo può essere modificato a seconda di esperimenti che richiedono la raccolta di tessuti aggiuntivi. - Utilizzando una pipetta, sciacquare immediatamente la cavità orale con 100 gradi l di salina sterilizzata 4C 1x priva di fosfato (PBS) senza calcio e magnesio per 10 s.
- Ripetere il passaggio 2.2 2x e posizionare ogni risciacquo in una singola provetta sterile in polipropilene conico da 15 ml.
- Trasferire il contenuto in una provetta sterile in polipropilene conico da 50 ml eseguendoli attraverso un filtro a rete di nylon da 40 m.
- Trasferire questi contenuti in una nuova provetta sterile in polipropilene conico da 15 mL.
NOTA: il trasferimento finale del campione su un tubo più piccolo consente la migliore visualizzazione del pellet cellulare nei passaggi imminenti.- Se lo si desidera, rimuovere la legatura molare (s) e mettere in 300 L di sterilizzato 1x PBS (4 gradi C, senza calcio e magnesio) in un separato 15 mL conico polipropilene sterile test camera. Agitare delicatamente e rimuovere la sutura dal tubo. Questo campione viene trattato in modo identico al campione di risciacquo orale da questo punto in avanti.
- Aggiungere 33,3 litri di paraformaldeide (PFA) del 16% per facilitare la fissazione del campione.
- Vorticare i campioni immediatamente e incubare sul ghiaccio per 15 min.
- Riempire il tubo a 15 mL con 1x PBS per diluire PFA, quindi centrifugare a 1000 x g e 4 gradi C per 5 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di buffer di smistamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS) a 4 gradi centigradi. Contare le celle su un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
- Centrifugare nuovamente il campione a 1000 RCF e 4 gradi centigradi per 5 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un volume appropriato di buffer FACS per una concentrazione finale di 0,5–1,0 x 106 celle/50 l di buffer FACS.
3. Colorazione anticorpale per l'analisi citometrica del flusso
NOTA: Etichettare e raffreddare tutti i tubi FACS necessari prima dell'uso.
- Aggiungete 1 - L di siero di ratto e 2 -L di anticorpo IgG anti-topo a 50 l del campione, vortice immediatamente, e blocco sul ghiaccio per 20 min.
- Aggiungere gli anticorpi appropriati ad ogni campione, vortice immediatamente, e incubare sul ghiaccio per 30 min al buio.
NOTA: la selezione e i volumi degli anticorpi dipendono da esperimenti pilota di ottimizzazione preliminari su misura per questa tecnica specifica. - Lavare i campioni con 1 mL di tampone FACS, vortice brevemente e centrifugando per 5 min a 1000 x g e 4 gradi centigradi. Ripetere questo passaggio 2x.
- Risospendere i campioni in 250 , l di tampone FACS, tubi di copertura con pellicola di paraffina, avvolgere in un foglio di alluminio, e tenere a 4 gradi centigradi fino all'analisi.
NOTA: È ideale analizzare i campioni entro poche ore dal completamento del protocollo a causa della perdita di segnale fluorescente durante lunghi periodi di conservazione. Tuttavia, i campioni possono essere analizzati 2-3 giorni dopo, se assolutamente necessario.
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Representative Results
Vengono forniti dati relativi alla citometria di flusso rappresentativo proveniente da campioni di risciacquo orale di un'ingenua (Figura 3A) e infiammata (Figura 3B) di cavità orale che si trovano secondaria mente alla parodontite indotta dalla legatura. Viene inoltre illustrato il ripristino di PMN da una legatura installata (Figura 3C). Le tensioni del canale del citometro di flusso sono state calibrate manualmente e la compensazione è stata eseguita con perline di compensazione con una singola macchia. I PMN sono stati definiti come Ly6G-veF4/80 utilizzando la strategia di gating descritta38. Un minimo di 500 eventi PMN recintati sono stati acquisiti da ogni campione di risciacquo e legatura orale. La vitalità del PMN è stata determinata per essere di circa il 37% dalla colorazione blu trypan. Immagini rappresentative dei livelli ossei alveolare misurati dalla cresta ossea alveolare (ABC) alla giunzione (CEJ) per il cemento sano (Figura 4A) e topi ligate (Figura 4B). Vengono fornite le differenze relative tra queste misurazioni (Figura 4C).
Figura 1: posizionamento degli animali per la legatura molare. (A) L'accesso alla cavità orale si ottiene tenendo la mandibola in una posizione depressa ponendo una lieve trazione sulla dentizione dell'incisione mascellare e mandibolare. (B) Gauze è posto sotto il cranio per impedire il movimento della testa e per posizionare la mascella in una posizione relativamente orizzontale. Il corpo e la coda sono coperti per prevenire la perdita di calore prima di spostare lo stadio chirurgico al microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fotografia sequenziale dell'installazione della legatura. (A) La coda distale della sutura è posizionata sul lato palatale della dentizione e il segmento prossimale viene inserito tra il contatto di M2 e M3. (B) La sutura viene quindi avvolta intorno alla superficie buccale di M2 e quindi inserita tra il contatto di M1 e M2. (C) Il segmento di sutura prossimale viene avvolto intorno a M1 sotto la sua altezza di contorno poi inserito tra il contatto di M1 e M2. (D) Le estremità della sutura sono legate con un nodo del chirurgo e rifilate il più vicino possibile al nodo. Il nodo viene posto nell'embrasure gengivale tra M1 e M2 sul lato palatale della dentizione mascellare. Tutte le fotografie sono state acquisite su mascella sezionata per la registrazione di passi procedurali con una visione libera della dentizione molare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione faCS trame e strategia di gating dimostrando la presenza di neutrofili orali. I neutrofili sono stati recuperati dai seguenti campioni e valutati dalla citometria di flusso: (A) risciacquo orale da un topo ingenuo, (B) risciacquo orale e (C) hanno recuperato le legature da un topo con parodontite indotta da legature (bilateralmente). Vengono mostrati i grafici a dispersione della strategia di gating rappresentativa. I singlet (SSC-H x SSC-W e FSC-H x FSC-W) e i neutrofi (Ly6G-ve/F480-ve) sono stati gated come mostrato. I valori numerici riflettono la percentuale di celle all'interno di ogni gate. SSC-A - area di dispersione laterale; SSC-W : larghezza di dispersione laterale; SSC-H: altezza di dispersione laterale; FSC-A : area di dispersione in avanti; FSC-W : larghezza di dispersione in avanti; FSC-H: altezza di dispersione in avanti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Differenze di perdita ossea dell'alveolar tra animali di controllo e ligate. Foto rappresentative che dimostrano differenze nella perdita ossea alveolare tra il controllo( A) e i topi ligate (B). (C) Le misurazioni dalla giunzione del cementoenamel (CEJ) alla cresta ossea alveolare (ABC), insieme agli angoli della linea mesiopalatale e distopalatale di M1 e M2, sono indicate (media SEM, n - 3). I valori P sono stati determinati da ANOVA bidirezionale con un test LSD post-hoc di Fisher. ('p < 0.01; 'p < 0.001; 'p < 0.0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'elemento più critico associato all'uso del modello di parodontite indotta dalla legatura murina è centrato intorno alla ritenzione della legatura fino al momento del sacrificio o della rimozione intenzionale. La legatura biofilm-retentiva installata è in grado di indurre una significativa perdita di altezza ossea alveolare in appena 6 giorni, plateauing tra il periodo di 11-16 giorni39. La decisione di sacrificare i soggetti animali prima del periodo massimo di perdita ossea, rendendo questo modello molto più breve di parodontite indotta da legatura, è stata selezionata per ridurre ulteriormente l'incidenza di avulsione legatura matura, definita come la perdita della legatura prima del tempo di sacrificio, che rende l'animale non diagnostico.
Lo svantaggio più comunemente citato di questo modello evidenzia la difficoltà tecnica percepita di installare la legatura a causa delle dimensioni minime della dentizione molare murina, che variano in circonferenza da 4,4 mm (M1) a 2,6 mm (M3)40. Questo problema può essere mitigato attraverso il coinvolgimento del personale chirurgico / tirocinanti per l'installazione di legature, che richiede (al massimo) 10 min / animale e comprende la consegna di anestesia. Inoltre, il posizionamento della legatura è un'abilità padroneggiata attraverso la ripetizione, e non è più intensiva di molte tecniche comuni basate sul laboratorio che richiedono un elevato grado di destrezza manuale. Dal punto di vista procedurale, l'uso dell'anestesia intraperitoneale fornisce molto tempo per facilitare l'installazione delle legature. Se necessario, consente anche la sostituzione di eventuali legature che non sono installate in modo soddisfacente, in quanto la localizzazione della sutura al solco gengivale e nodo tra il contatto di M1 e M2 è ideale per la ritenzione.
Le modifiche proposte di questi protocolli, che richiedono una legatura di 1) di un singolo molare utilizzando una sutura circonferenziale o 2) un singolo segmento lineare di sutura posto tra un singolo contatto della dentizione molare, offre diversi vantaggi. Da un punto di vista tecnico, il protocollo utilizza attrezzature che sono prontamente disponibili o possono essere costruite da apparecchiature preesistenti in modo simile ad Abe e Hajishengallis. Ciò elimina la necessità di ordini speciali o la produzione di apparecchiature mediante stampa3D 33. L'installazione di una sutura di seta continua fionda intorno a più denti fissati con un nodo del chirurgo che non può essere disturbato dalla lingua può anche migliorare la ritenzione di legatura.
Nel corso di questo protocollo, rispetto alla tecnica proposta da Marchesan et al. in cui si prevedono perdite fino al 20%, c'era una completa assenza di avulsione prematura legatura36. Mentre l'incidenza della perdita di legatura non è stata valutata direttamente da Abe e Hajishengallis, la tecnica è stata applicata in una serie di studi41,42,43,44. Da un punto di vista tecnico, i danni ai tessuti molli sono stati evitati negli animali ligate. I fattori che contribuiscono a questo fenomeno includono un'osservazione continua della cavità orale attraverso un microscopio, una visualizzazione costante delle punte delle pinze e l'uso di pinze pulite per evitare lo scivolamento della sutura durante il posizionamento.
All'interno della cavità orale, i segmenti allungati del materiale di sutura aumentano drasticamente la quantità di tessuto malato disponibile per l'analisi e possono provocare una marcata diminuzione dell'uso animale. Questo perché tutti i soggetti sono in grado di essere inclusi nell'analisi, e il raggruppamento di tessuti e risciacquo non è richiesto. Va notato che è possibile legiare la dentizione molare mascellare contralaterale utilizzando le tecniche precedentemente segnalate per aumentare l'area del tessuto interessata41. Tuttavia, questa modifica non è possibile nei casi in cui è necessaria una progettazione a bocca aperta, dando supporto per l'applicazione di questo nuovo protocollo. Infine, simile ai precedenti protocolli di parodontite indotta da legature, l'uso di questa tecnica non è limitato a 8-12 topi maschi della settimana C57BL/6. I topi di età avanzata, entrambi i sessi, e vari background genetici possono essere accettabili a seconda del design sperimentale.
Sfortunatamente, questo modello possiede ancora alcuni difetti tecnici e metodologici. L'uso di specifici topi privi di agenti patogeni come descritto sopra non può imitare la progressione della parodontite umana. Ciò è dovuto a diverse differenze tra la composizione dei loro biofilm orali commensale, che limita la validità esterna della valutazione batteri-batteri e interazioni batterico-ospite45. Questo può teoricamente essere mitigato attraverso l'uso di topi privi di germi, che complica significativamente il protocollo. Sono necessari ulteriori sforzi e risorse per garantire che i soggetti animali rimangano privi di germi durante l'alloggiamento e la manipolazione chirurgica. Devono essere istituite ulteriori misure per sviluppare la parodontite, poiché questi topi sono resistenti alla PD indotta dalla legatura in assenza di accumulo batterico46,47.
Inoltre, i modelli di monoinfezione e legatura di coinfezione non sono in funzione della ricapitolazione della condizione umana, poiché la malattia parodontale rappresenta un'interazione polimicrobica più complessa tra il biofilm e il sistema immunitario dell'ospite. In queste circostanze, chiarire i ruoli e le interazioni tra un numero limitato di batteri orali umani può essere considerato carente e potenzialmente svantaggioso, soprattutto nel contesto dello studio dell'immunobiologia del parodonto.
Infine, prove recenti hanno implicato che le forze di masticazione sono in grado di modificare l'immunosorveglianza gingival attraverso l'accumulo di T helper 17 cellule, un mediatore integrale di immunità barriera48. Come tale, l'uso di una dieta morbida, soprattutto negli animali più anziani, può agire un potenziale confondatore. Questo può ridurre il potenziale per la normale perdita ossea fisiologica nelle regioni in cui sono state applicate le legature. Alla luce di questi dati, occorre considerare attentamente l'uso di animali anziani e controlli adeguati corrispondenti all'età in cui tali risultati sono stati notati come i più importanti.
L'uso di questo modello relativamente semplice può essere esteso alla valutazione della perdita ossea degli alveolare mediante tomografia micro-calcolata, analisi istologiche sia dell'osso alveolare che della gengiva associata circostante, e alla conduzione della caratterizzazione del microbiota orale, che sono stati tutti realizzati con i modelli PD indotti dalla legatura esistenti33,49. Anche se raramente discusso o utilizzato, è anche fattibile valutare gli effetti del trattamento, (così come la riparazione e la rigenerazione del parodonto) nell'impostazione della parodontite murine indotta di legatura rimuovendo la legatura in anestesia generale con pinze schegge a punto fine39. Infine, l'uso di questo modello può essere esteso allo studio degli effetti sistemici della malattia parodontale a causa dell'aumento del carico infiammatorio causato dalla legatura di più di un dente, nonché alla dentizione molare mascellare sinistra e destra, se lo si desidera.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
J. W. C. è supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Chunxiang Sun per la sua assistenza nell'esecuzione della colorazione blu trypan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
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