Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Robuust, ligatuur-geïnduceerde model van lymfklier-periodontitis voor de evaluatie van orale neutrofielen

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/59667
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Faculty of Dentistry, University of Toronto

Summary

Dit artikel presenteert een protocol voor de vaststelling van een ligatuur-geïnduceerde model van de parodontitis Murine met meerdere maxillaire Molars, resulterend in grotere gebieden van de betrokken gingivale weefsel en bot voor latere analyse, alsmede verminderde dierlijke gebruik. Een techniek om orale neutrofielen te beoordelen op een manier die analoog is aan menselijke proefpersonen wordt ook beschreven.

Abstract

De belangrijkste voordelen van het bestuderen van de pathofysiologie van parodontale ziekte met behulp van Murine-modellen zijn de verlaagde kosten van dieren, array van genetisch gemodificeerde stammen, het enorme aantal analyses dat kan worden uitgevoerd op geoogste zachte en harde weefsels. Veel van deze systemen zijn echter onderhevig aan procedurele kritieken. Als alternatief, het ligatuur-geïnduceerde model van parodontale ziekte, gedreven door de gelokaliseerde ontwikkeling en het behoud van een dysbiotische orale microbiome, kan worden gebruikt, die snel wordt geïnduceerd en relatief betrouwbaar. Helaas zijn de varianten van het ligatuur-geïnduceerde Murine parodontitis protocol geïsoleerd tot de focale gebieden van het parodontium en onderhevig aan voortijdige avulsie van de geïnstalleerde ligatuur. Dit minimaliseert de hoeveelheid weefsel die beschikbaar is voor latere analyses en verhoogt het aantal dieren dat nodig is voor onderzoek. Dit protocol beschrijft de precieze manipulaties die nodig zijn om verlengde molaire ligaturen te plaatsen met een verbeterde retentie en het gebruik van een nieuwe Spoeltechniek om orale neutrofielen bij muizen te herstellen met een alternatieve aanpak die de bovengenoemde technische uitdagingen.

Introduction

Periodontale ziekte (PD) is een osteolytische aandoening die gepaard gaat met een significante gastheer morbiditeit en economische last, die zich manifesteert door gingivale ontsteking en verlies van zowel zachte weefsel gehechtheid als osseeuze steun voor de aangetaste tandheelkunde1,2,3,4. Dit proces wordt beheerst door interacties tussen de mondelinge microbiota en aangeboren immuunsysteem van de gastheer. Het wordt ook geassocieerd met exacerbatie van andere systemische ontstekingsziekten, waaronder diabetes, hart-en vaatziekten, en kanker5,6,7,8. Historisch gezien was het veronderstelde dat PD-pathogenese afhankelijk is van grote hoeveelheden specifieke bacteriën zoals Porphyromonas gingivalis9. Recent bewijs suggereert echter dat de microbiële component van PD wordt gemedieerd door de tandheelkundige biofilm. De biofilm is een georganiseerde, complexe Gemeenschap van talrijke micro-organismen die kunnen bestaan in gezonde symbiotische en destructieve dysbiotic Staten10,11. De mondelinge biofilm geeft normaliter weerstand aan de gastheer door te voorkomen dat de oprichting van Foci van pathogene bacteriën en bevordert ideale gingivale weefselstructuur en functie door regulering van de gastheer immuunrespons12,13. Verstoringen van de evenwichts verhouding tussen commensale organismen in de mondholte en het gastheer immuunsysteem kunnen leiden tot veranderingen in weefselhomeostase, resulterend in dysbacteriose en ontwikkeling van de Hallmark klinische en radiografische verschijningen van PD5,10,12,13,14.

Interessant is dat de oprichting van een mondelinge dysbacteriose, terwijl vereist voor de initiatie van PD, niet voldoende is om PD in alle individuen te stimuleren, en te elueren naar het vermogen van de gastheer immuunrespons om de overgang van microbiota tussen symbiotische en dysbiotische toestanden15te ondermijnen. Dit plaatst een bijzondere schijnwerper op de middelen waardoor PD een van de leidende karakters van het aangeboren immuunsysteem beïnvloedt, namelijk de polymorfonucleaire granulocyt (PMN), of neutrofielen, van lokale en systemische perspectieven16,17.

Bij mensen worden PMNs geworven uit de circulatie met een snelheid van ~ 2 x 106 cellen/h in gezonde periodontale bindweefsels, waar ze de overheersende leukocyten populatie zijn. Hier worden ze vervolgens uit de gingivale Sulcus in de mondholte gezet als een onderdeel van de gingivale creviculaire vloeistof. In aanwezigheid van PD, neutrofilie manifesten in de bloedsomloop en de mondholte, waar deze Effector cellen bezitten een hyperinflammatoire fenotype dat leidt tot de bovengenoemde vernietiging van de parodontium17,18,19,20,21,22. Daarom is het van het allergrootste belang om de rol van PMNs in PD en andere systemische ontstekings condities te begrijpen.

Hoewel algemeen wordt aanvaard dat chronische ziekten samengebonden zijn met PD, moeten de onderliggende mechanismen nog worden opgehelderd, wat bijdraagt aan moeilijkheden bij het beheer van deze morbide en potentieel fatale systemische omstandigheden. Meerdere experimentele diermodellen, elk met unieke voor-en nadelen, zijn gebruikt om de pathofysiologie van PD23,24bestuderen. Specifiek gericht op Murine-modellen, zijn er verschillende protocollen waarmee de studie van PD wordt vergemakkelijkt; ze bezitten echter verschillende technische en fysiologische tekortkomingen25,26,27,28,29,30,31.

Ten eerste vereist het Oral maagsonde Mouse model talrijke orale inoculaties van humane parodontale pathogenen om gingivale ontsteking en botverlies te genereren. Bovendien wordt het meestal voorafgegaan door een periode van antibioticabehandeling om de Murine commensale Oral flora25te ondermijnen. Dit model vereist vaak gespecialiseerde training om de orale gavage veilig uit te voeren, gebruikt slechts een kleine fractie van parodontale pathogenen uit de complexere menselijke orale microbiome, en vereist enkele maanden om alveolaire botverlies vast te stellen.

In tegenstelling, chemisch geïnduceerde Murine modellen maken gebruik van de mondelinge levering van trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) of dextran sulfaat natrium (DSS), agenten vaak gebruikt bij het vaststellen van Murine modellen van colitis over een periode van enkele maanden voor het opwekken van periodontale botverlies26. Intraorale en extraoraal Abscess gebaseerde modellen zijn beschikbaar, waarbij de Murine snijtanden en weefsels van de dorsum evenals calvarium, respectievelijk. In het voormalige abces-model worden verschillende injecties van bacteriën toegediend, waardoor meerdere gingivale abcessen en een tekort aan alveolaire botverlies worden gebruikt, wat het gebruik ervan in de studie van PD beperkt. De laatste abces modellen zijn aanzienlijk meer geschikt voor het bestuderen van bacteriële virulentie, ontsteking, en botresorptie op plaatsen buiten de mondholte, die de evaluatie van het parodontium en orale microbiome27,28,29,30,31elimineert.

Met behulp van het ligatuur-geïnduceerde model van parodontitis, is een gevlochten zijde hechtmiddel vaak rond de tweede molaire geïnstalleerd. Als alternatief kan een enkel lineair segment van hechtmateriaal worden ingevoegd tussen de eerste en de tweede kiezen32,33. Het doel van de ligatuur plaatsing is het vergemakkelijken van bacteriële accumulatie en het genereren van dysbiosis binnen de gingivale sulci, resulterend in parodontale weefsel ontsteking en vernietiging van de weefsels componeren van het parodontium. Met name, dit model is geschikt voor het produceren significant meer alveolaire botverlies in vergelijking met de meer algemeen gebruikte mondelinge maagsonde model34. Verdere complicerende het gebruik van de orale maagsonde model is de natuurlijke weerstand van verschillende stammen van muizen (dat wil zeggen, C57BL/6) aan het ontwikkelen van alveolaire botverlies. Dit is ook problematisch, aangezien deze stam het vaakst wordt gebruikt in op muriene gebaseerd dierlijk onderzoek35.

Bestaande procedures beschreven door marchesan et al. en Abe en hajishengallis werden bedacht om de technische handeling van het plaatsen van de ligatuur33,36te vereenvoudigen. Helaas vereist het vroegere protocol gespecialiseerde 3D-geprinte apparatuur en heeft het potentieel voor vroegtijdig ligatuur verlies, waardoor het dieren gebruik toeneemt en de kosten die gepaard gaan met extra tijd doorgebracht in de operatiekamer. Bovendien, beide protocollen genereren alleen kleine gebieden van de zieke parodontium beschikbaar voor een studie.

De voordelen van deze techniek zijn gebaseerd op de gelijktijdige studie van orale dysbiose en immunologie die het periodontium beheersen, het gebruik van laaggeprijsde dieren met verschillende genetische achtergronden, en eenvoudige huisvestings-en veehouderijpraktijken. Als zodanig moeten doelstellingen zijn om de hoeveelheid ziek weefsel te maximaliseren en, in pogingen om de beginselen van vermindering van dierlijk onderzoek te oefenen, de dier consumptie tot een zo laag mogelijk niveau te reduceren. Dit vereist dat alle dieren in experimentele analyses37kunnen worden opgenomen. Er moet echter worden opgemerkt dat ongeacht welk diermodel van parodontale ziekte wordt gebruikt, er geen enkel model is dat elk element van de menselijke PD-pathofysiologie omvat.

Dit nieuwe protocol maakt gebruik van de plaatsing van een ligatuur rond meerdere maxillaire molaire tanden met behulp van instrumentatie en materialen die zijn gevonden in de meeste laboratoria. Het maakt voldoende tijd om gemakkelijk en met vertrouwen een ligatuur te installeren die waarschijnlijk niet voortijdig wordt avulse. Tot slot, zoals pmns de vernietiging van het parodontium in PD coördineert, wordt ook een nieuwe methodologie gepresenteerd om orale neutrofielen op een manier analoog aan de mens te herstellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle onderzoeken van Murine voldeden aan de relevante ethische voorschriften en werden goedgekeurd door de Dierenzorg Commissie van de Universiteit van Toronto en de Raad voor onderzoek ethiek (protocol 20011930).

1. ligatuur installatie

Opmerking: dit is een niet-steriele chirurgische ingreep die kan worden uitgevoerd in een standaard operatie theater. Het gebruik van kiemvrije dieren (hier niet gedekt) is een mandaat voor de behandeling binnen een bioveiligheidskast, het gebruik van steriele instrumenten en de inoculatie van de mondholte met parodontitis om de klinische manifestaties van parodonticus te veroorzaken.

  1. Dien intraperitoneale anesthesie toe aan 8 – 12 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen, die moeten worden geacclimeerd aan hun huisvestings faciliteit, met behulp van een 0,5 "26 G steriele hypodermische naald en 1 mL spuit volgens erkende richtlijnen voor het Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
    Opmerking: een combinatie van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) anesthetica snel en betrouwbaar induceert het juiste niveau van anesthesie voor de duur van de procedure.
  2. Beoordeel de verdovings diepte vóór en elke 15 min tijdens de procedure, zoals blijkt uit het verlies van de pedaal reflex.
  3. Plaats de muis op een verwarmd chirurgisch platform (Figuur 1a). Stabiliseer de maxilla en onderkaak in de open positie met behulp van elastische banden en prop de nek met een katoenen rol om de maxilla in een meer horizontale oriëntatie te houden (Figuur 1B). Bedek het lichaam en de staart van het dier om het warmteverlies tijdens de procedure te verminderen.
  4. Plaats de chirurgische Microscoop op de gewenste vergroting en belichting (indien niet rechtstreeks op de Microscoop gemonteerd) over de mondholte voor visualisatie van de tanden. Hoewel de gewenste vergroting afhankelijk is van de operator, wordt een optimale visualisatie van de mondholte verkregen bij 16x.
  5. Installeer een steriel 5-0 gevlochten zijde hechtdraad rond de eerste (M1) en tweede (m2) maxillaire kiezen binnen de gingivale Sulcus met behulp van Splinter Tang.
    Opmerking: gevlochten zijde hechtingen van een kleinere gauge kunnen worden gebruikt voor dit doel om snellere installatie te vergemakkelijken en de mogelijkheid van iatrogene beschadiging van het weke delen te verminderen.
    1. Plaats de distale staart van de hechtdraad aan de palatale kant van de tanden en steek het proximale segment tussen het contact van m2 en M3 (Figuur 2A).
    2. Wikkel de hechtdraad rond het buccale oppervlak van m2 en plaats deze tussen het contact van M1 en m2. Zorg ervoor dat beide uiteinden van de hecht strak worden getrokken om de hechting in de gingivale Sulcus rijden en verwijder alle speling (Figuur 2B).
    3. Wikkel het proximale hecht segment rond M1, onder de hoogte van de contour, en plaats het tussen het contact van M1 en m2. Trek de proximale staart van de hecht stof strak om de hechting in de gingivale Sulcus te brengen en verwijder alle speling (Figuur 2C).
      Opmerking: als de weerstand wordt waargenomen bij het inbrengen van de hechtdraad tussen M1 en m2 of m2 en M3, kan het contact licht open zijn met behulp van een standaard tandheelkundige Verkenner.
    4. Bind de uiteinden van de hecht met de knoop van een chirurg en trim de staarten zo kort mogelijk. Plaats de knoop in de gingivale kanon tussen M1 en m2 op de palatale kant van de maxillaire tand (Figuur 2D).
      Opmerking: stappen 1.4.1 – 1.4.4 kan worden herhaald op de contralaterale kant, indien nodig.
    5. Steriliseer de chirurgische instrumenten in een hete glazen kraal sterilisator tussen elk dier onderwerp.
      Let op: de uiteinden van de Tang zijn extreem scherp en kunnen gemakkelijk een oraal trauma en significante bloedingen veroorzaken. Bereid kleine segmenten van gaas om bloed uit de mondholte te verwijderen en druk op actieve bloeden wonden.
  6. Na de ligatuur installatie, verwijder de muis van het chirurgische apparaat, plaats in een schone kooi onder een hitte lamp en monitor totdat volledig hersteld.
  7. Individueel huis elke muis met de juiste milieu verrijking en laat ad libitum toegang tot gefilterd water en aardappelpuree Standard Chow in een temperatuur-en vochtigheid-gecontroleerde omgeving (12-h licht/12-h donkere cyclus) voor 7 – 11 dagen.
    Let op: Mashed Chow verlaagt de krachten die nodig zijn voor de mastiek en vermindert daardoor de pijn die gepaard gaat met voeden, en helpt bij het voorkomen van vroegtijdig verlies van de geïnstalleerde ligatuur.

2. monsterverzameling

  1. Euthanize muizen volgens de goedgekeurde IACUC richtlijnen.
    Opmerking: individuele euthanasie met behulp van een CO2 kamer gevolgd door cervicale dislocatie is de voorkeursmethode voor dit protocol. Dit kan worden gewijzigd afhankelijk van de experimenten die het oogsten van extra weefsels vereisen.
  2. Spoel met behulp van een pipet de mondholte onmiddellijk af met 100 μL gesteriliseerde 4 °C 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium gedurende 10 sec.
  3. Herhaal stap 2,2 2x en plaats elke spoeling in een enkele 15 mL conische polypropyleen steriele reageerbuis.
  4. Breng de inhoud over in een conische polypropyleen test buis van 50 mL door ze door een nylon mesh-filter van 40 μm te laten lopen.
  5. Breng deze in een nieuwe 15 mL conische polypropyleen steriele reageerbuis.
    Opmerking: de uiteindelijke overdracht van het monster naar een kleinere buis zorgt voor de verbeterde visualisatie van de cellulaire pellet in de komende stappen.
    1. Indien gewenst, verwijder de molaire ligatuur (en) en plaats in 300 μL gesteriliseerde 1x PBS (4 °C, zonder calcium en magnesium) in een aparte 15 mL conische polypropyleen steriele reageerbuis. Roer voorzichtig en verwijder de hechting van de buis. Dit monster wordt vanaf dit punt identiek behandeld met het orale spoel monster.
  6. Voeg 33,3 μL 16% Paraformaldehyde (PFA) toe om de monster fixatie te vergemakkelijken.
  7. Vortex de monsters onmiddellijk en incuberen op ijs gedurende 15 minuten.
  8. Vul de buis tot 15 mL met 1x PBS om PFA te verdunnen, en centrifugeer vervolgens bij 1000 x g en 4 °c gedurende 5 minuten.
  9. Zuig de supernatant op en reactiveert de pellet in 1 mL fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer bij 4 °C. Tel cellen op een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
  10. Centrifugeer het monster opnieuw bij 1000 RCF en 4 °C gedurende 5 minuten.
  11. Zuig de supernatant op en hervat de pellet in een geschikte hoeveelheid FACS buffer voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 – 1,0 x 106 cellen/50 ΜL FACS buffer.

3. antilichaam kleuring voor flowcytometrische analyse

Opmerking: label en chill alle benodigde FACS tubes voorafgaand aan het gebruik.

  1. Voeg 1 μL rat serum en 2 μL anti-muis IgG-antilichaam toe aan 50 μL van het monster, Vortex onmiddellijk en Blokkeer op ijs gedurende 20 minuten.
  2. Voeg de juiste antilichamen toe aan elk monster, Vortex onmiddellijk, en incuberen op ijs gedurende 30 minuten in het donker.
    Opmerking: de selectie en volumes van antilichamen zijn afhankelijk van voorafgaande optimalisatie proef experimenten die zijn afgestemd op deze specifieke techniek.
  3. Was monsters met 1 ml FACS buffer, grondig kort en centrifugeren gedurende 5 min bij 1000 x g en 4 °c. Herhaal deze stap 2x.
  4. Respendeer monsters in 250 μL FACS buffer, afdek buizen met paraffine folie, wikkel in aluminium folies en houd vast bij 4 °C tot de analyse.
    Opmerking: het is ideaal om monsters te analyseren binnen enkele uren na voltooiing van het protocol als gevolg van het verlies van fluorescerende signaal tijdens lange perioden van opslag. Echter, monsters kunnen worden geanalyseerd 2 – 3 dagen later als absoluut vereist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve stroom cytometrie gegevens uit orale spoeling monsters van een naïeve (Figuur 3a) en ontstoken (Figuur 3B) Murine mondholte secundair aan de ligatuur-geïnduceerde parodontitis. De terugwinning van Pmn's uit een geïnstalleerde ligatuur is ook aangetoond (Figuur 3C). Flow cytometer kanaal spanningen werden handmatig gekalibreerd en compensatie werd uitgevoerd met enkel-gekleurd compensatie kralen. PMNs werden gedefinieerd als Ly6G+ veF4/80-ve met behulp van de geschetst gating strategie38. Van elk oraal AFSPOEL-en ligatuur monster werden minimaal 500 gated PMN-voorvallen verworven. De levensvatbaarheid van PMN werd vastgesteld op ongeveer 37% door trypan blauwe kleuring. Representatieve beelden van alveolaire botniveaus, gemeten vanaf de alveolaire botkam (ABC) tot de cementoenamel junctie (cej) voor gezond (Figuur 4A) en geligeerd muizen (Figuur 4B). De relatieve verschillen tussen deze metingen (Figuur 4C) zijn aanwezig.

Figure 1
Figuur 1: dieren positionering voor molaire ligatie. A) de toegang tot de mondholte wordt bereikt door de onderkaak in een depressieve positie te houden door milde tractie op de maxillaire en mandibulaire snijtanden te plaatsen. B) gaas wordt onder de schedel geplaatst om beweging van het hoofd te voorkomen en de maxilla in een relatief horizontale positie te plaatsen. Het lichaam en de staart zijn bedekt om warmteverlies te voorkomen voorafgaand aan het verplaatsen van de chirurgische fase onder de Microscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: opeenvolgende foto van de ligatuur installatie. A) de distale staart van de hechtdraad wordt op de palatale zijde van de tanden geplaatst en het proximale segment wordt ingevoegd tussen het contact van m2 en M3. B) de hechtdraad wordt vervolgens rond het buccale oppervlak van m2 gewikkeld en vervolgens tussen het contact van M1 en m2 ingebracht. C) het proximale hecht segment wordt rond M1 gewikkeld onder de hoogte van de contour en vervolgens ingevoegd tussen het contact van M1 en m2. D) de uiteinden van de hechtdraad worden met de knoop van een chirurg vastgebonden en zo dicht mogelijk bij de knoop geknipt. De knoop wordt geplaatst in de gingivale kanon tussen M1 en m2 op de palatale kant van de maxillaire tand. Alle Foto's werden verkregen op ontleed maxilla voor het vastleggen van procedurele stappen met een onbelemmerd zicht op de molaire tanden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: representatieve FACS plots en gating-strategie die de aanwezigheid van oraal neutrofielen aantoont. Neutrofielen werden teruggewonnen uit de volgende monsters en beoordeeld door Flowcytometrie: (a) orale spoeling van een naïeve muis, (B) orale spoeling, en (C) herstelde ligaturen van een muis met ligatuur-geïnduceerde parodontitis (bilateraal). Representatieve gating strategie scatterplots worden weergegeven. Singlets (SSC-H x SSC-W en FSC-H x FSC-W) en neutrofielen (Ly6G+ ve/F480-ve) werden afgesloten zoals afgebeeld. Numerieke waarden weerspiegelen het percentage cellen binnen elke poort. SSC-A = zijspreidings gebied; SSC-W = zijspreidings breedte; SSC-H = zijspreidings hoogte; FSC-A = voorwaartse spreidings gebied; FSC-W = voorwaartse spreidingsbreedte; FSC-H = voorwaartse spreidings hoogte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: alveolaire botverlies verschillen tussen controle en geligeerd dieren. Representatieve Foto's die verschillen vertonen in alveolaire botverlies tussen (a) controle en (B) geligeerd muizen. C) de metingen van de cementoenamel junctie (cej) naar alveolaire BOTKAM (ABC), samen met de mesiopalatale en distopalatale lijn hoeken van M1 en m2, worden getoond (gemiddelde ± SEM, n = 3). P-waarden werden bepaald door een tweeweg ANOVA met een post-hoc Fisher ' s LSD test. (* p < 0,01; * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het meest kritische element in verband met het gebruik van het muriene ligatuur-geïnduceerde model van parodontitis is gecentreerd rond het vasthouden van de ligatuur tot het moment van opoffering of opzettelijke verwijdering. De geïnstalleerde biofilm-retentive ligatuur is in staat om een significant verlies van alveolaire bothoogte te induceren in slechts 6 dagen, met een en tussen de 11 – 16 dagen periode39. De beslissing om dierlijke proefpersonen op te offeren vóór de maximale periode van botverlies, waardoor dit een veel korter model van ligatuur-geïnduceerde parodontitis werd, werd geselecteerd om de incidentie van premature ligatuur Avulsie verder te verminderen, gedefinieerd als het verlies van de ligatuur vóór het tijdstip van opoffering, wat het dier niet-diagnostisch maakt.

Het meest geciteerde nadeel van dit model wijst op de waargenomen technische moeilijkheid van het installeren van de ligatuur als gevolg van de minuscule afmetingen van muriene molaire tanden, die in omtrek variëren van 4,4 mm (M1) tot 2,6 mm (M3)40. Dit probleem kan worden verzacht door de betrokkenheid van chirurgische medewerkers/stagiairs voor ligatuur installatie, die (maximaal) 10 min/dier vereist en omvat de levering van anesthesie. Bovendien is de plaatsing van de ligatuur een vaardigheid beheerst door herhaling, en het is niet intensiever dan veel gemeenschappelijke Lab-gebaseerde technieken die een verhoogde mate van handvaardigheid vereisen. Vanuit procedureel oogpunt biedt het gebruik van intraperitoneale anesthesie uitgebreide tijd om de ligatuur installatie te vergemakkelijken. Indien nodig, het maakt ook vervanging van eventuele ligaturen die niet zijn geïnstalleerd op een bevredigende manier, als de lokalisatie van de hecht aan de gingivale Sulcus en knoop tussen het contact van M1 en m2 is ideaal voor retentie.

De voorgestelde wijzigingen van deze protocollen, die voor 1) ligatie van een enkele molaire met behulp van een omtrek hecht of 2) een enkel lineair segment van hechtdraad tussen een enkel contact van de molaire gebit, biedt verschillende voordelen. Vanuit technisch oogpunt, het protocol maakt gebruik van apparatuur die ofwel direct beschikbaar is of kan worden opgebouwd uit reeds bestaande apparatuur op dezelfde manier als Abe en Hajishengallis. Dit voor gaat de noodzaak van speciale bestellingen of fabricage van apparatuur door 3D Printing33. De installatie van een doorlopende zijde hechting Sling rond meerdere tanden beveiligd met een chirurg knoop die niet kan worden verstoord door de tong kan ook het verbeteren van de ligatuur retentie.

In de loop van dit protocol, in vergelijking met de techniek voorgesteld door Marchesan et al. waarin verliezen tot 20% worden verwacht, was er een volledige afwezigheid van premature ligatuur-Avulsie36. Hoewel de incidentie van ligatuur verlies niet direct werd beoordeeld door Abe en hajishengallis, is de techniek toegepast in een aantal studies41,42,43,44. Vanuit technisch oogpunt werd iatrogene schade aan weke delen vermeden in geligeerd dieren. Factoren die bijdragen aan dit fenomeen omvatten een continue observatie van de mondholte door een Microscoop, constante visualisatie van de uiteinden van de Tang, en het gebruik van schone tang om te voorkomen dat het wegglijden van de hecht tijdens de plaatsing.

Binnen de mondholte, de langwerpige segmenten van hechtmateriaal ook drastisch verhogen de hoeveelheid zieke weefsel beschikbaar voor analyse en kan resulteren in een duidelijke afname van het gebruik van dieren. Dit komt omdat alle proefpersonen in de analyse kunnen worden opgenomen en het bundelen van weefsel-en spoel monsters niet nodig is. Opgemerkt moet worden dat het mogelijk is om de contralaterale maxillaire molaire getand te ligeren met behulp van de eerder gemelde technieken om het aangetaste weefselgebied41te verhogen. Deze wijziging is echter niet mogelijk in gevallen waarin een split-Mouth-ontwerp vereist is, waarbij steun wordt geboden voor de toepassing van dit nieuwe protocol. Ten slotte, verwant aan de vorige ligatuur-geïnduceerde parodontitis protocollen, gebruik van deze techniek is niet beperkt tot 8 – 12 week-oude mannelijke C57BL/6 muizen. Muizen van oudere leeftijd, beide seks, en verschillende genetische achtergronden kunnen aanvaardbaar zijn, afhankelijk van het experimentele ontwerp.

Helaas heeft dit model nog steeds enkele technische en methodologische gebreken. Het gebruik van specifieke pathogeen-vrije muizen zoals hierboven beschreven, kan de progressie van menselijke periodontitis niet nabootsen. Dit is te wijten aan verschillende verschillen tussen de samenstelling van hun commensale mondelinge biofilms, die de externe geldigheid van de evaluatie van bacteriën-bacteriën en bacteriën-host interacties45beperkt. Dit kan theoretisch worden verzacht door het gebruik van kiemvrije muizen, die het protocol aanzienlijk compliceert. Er zijn extra inspanningen en middelen nodig om ervoor te zorgen dat dierhouders tijdens de huisvesting en chirurgische manipulatie kiemvrij blijven. Verdere maatregelen moeten ook worden ingesteld om parodontitis te ontwikkelen, aangezien deze muizen resistent zijn tegen ligatuur-geïnduceerde PD bij afwezigheid van bacteriële accumulatie46,47.

Bovendien, mono-infectie en co-infectie ligatuur modellen tekortschieten van het recapitulating van de menselijke aandoening, als parodontale ziekte vertegenwoordigt een meer complexe polymicrobiële interactie tussen de biofilm en gastheer immuun systeem. In deze omstandigheden, verheldering van de rollen van, en interacties tussen een beperkt aantal menselijke orale bacteriën kunnen worden beschouwd als gebrekkig en potentieel nadelig, vooral in het kader van het bestuderen van parodontium Immunobiologie.

Tot slot, recent bewijs is betrokken dat de krachten van de spieren zijn geschikt voor het wijzigen van gingivale immunosurveillance door de accumulatie van T helper 17 cellen, een integrale bemiddelaar van barrière immuniteit48. Als zodanig kan het gebruik van een zachte voeding, vooral bij oudere dieren, een potentiële medeoprichter zijn. Dit kan de kans op een normaal fysiologisch botverlies verminderen in gebieden waar ligaturen zijn toegepast. In het licht van dit bewijs dient zorgvuldig rekening te worden gehouden met het gebruik van ouderdoms dieren en passende leeftijds controles waarbij deze bevindingen het meest prominent zijn geconstateerd.

Het gebruik van dit relatief eenvoudige model kan worden uitgebreid tot het evalueren van alveolaire botverlies door micro-computertomografie, histologische analyses van zowel het alveolaire bot als de omliggende bijgevoegde gingiva, en het uitvoeren van orale microbiota karakterisering, die allemaal zijn bereikt met de bestaande ligatuur-geïnduceerde PD-modellen33,49. Hoewel zelden besproken of gebruikt, het is ook mogelijk om te beoordelen van de effecten van de behandeling, (evenals de reparatie en regeneratie van het periodontium) in de setting van ligatuur-geïnduceerde Murine parodontitis door het verwijderen van de ligatuur onder narcose met Fine-Point Splinter Tang39. Tot slot kan het gebruik van dit model worden uitgebreid tot het bestuderen van de systemische effecten van parodontale ziekte als gevolg van de toegenomen ontstekings belasting veroorzaakt door de ligatie van meer dan één tand, evenals de linker-en rechter maxillaire molaire getand, indien gewenst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

J. W. C. wordt ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR). De auteurs willen Dr. Chunxiang Sun bedanken voor haar hulp bij het uitvoeren van de trypan Blue-kleuring.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Tags

Immunologie en infectie uitgave 155 parodontitis rietbinder gingiva parodontium alveolaire bot diermodel Flowcytometrie neutrofielen immunologie ontsteking
Robuust, ligatuur-geïnduceerde model van lymfklier-periodontitis voor de evaluatie van orale neutrofielen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust … More

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter