Summary
В этой статье представлен протокол для создания лигатуры индуцированной модели мурин пародонтита с участием нескольких челюстно-лицевой моляров, в результате чего большие области участвующих десен ткани и кости для последующего анализа, а также сокращение использования животных. Также описан метод оценки пероральных нейтрофилов по аналогии с человеческими субъектами.
Abstract
Основными преимуществами изучения патофизиологии пародонтального заболевания с использованием мочек морин являются снижение стоимости животных, массив генетически модифицированных штаммов, огромное количество анализов, которые можно проводить на собранных мягких и твердых тканях. Однако многие из этих систем подвергаются процедурной критике. В качестве альтернативы может быть использована модель пародонта, вызванная локализованным развитием и сохранением дисбиотического микробиома полости рта, которая быстро индуцирована и относительно надежна. К сожалению, варианты протокола пародонта, индуцированного лигатурой, изолированы в координационных регионах пародонта и подвержены преждевременному авруции установленной лигатуры. Это сводит к минимуму количество тканей, доступных для последующего анализа и увеличивает количество животных, необходимых для изучения. Этот протокол описывает точные манипуляции, необходимые для размещения расширенных моляровских лигатур с улучшенным удержанием и использованием новой техники смыва для восстановления пероральных нейтрофилов у мышей с альтернативным подходом, который смягчает вышеупомянутые технических проблем.
Introduction
Пародонта (PD) является остеолитикическое состояние, связанное со значительной заболеваемости хозяина и экономической нагрузки, которая проявляется воспаление десивов и потеря как мягких тканей и косой поддержки для пострадавших зубной протез1,2,4. Этот процесс регулируется взаимодействиями между оральной микробиотой и врожденной иммунной системой хозяина. Это также связано с обострением других системных воспалительных заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания, и рак5,6,7,8. Исторически сложилось так, было гипотеза, что PD патогенеза зависит от большого количества конкретных бактерий, таких как Porphyromonas gingivalis9. Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что микробный компонент PD опосредовано стоматологической биопленки. Биопленка представляет собой организованное, сложное сообщество многочисленных микроорганизмов, которые могут существовать в здоровых симбиотических и разрушительных дисбиотических состояниях10,11. Устные биопленки обычно обеспечивает устойчивость к хозяину, предотвращая создание очагов патогенных бактерий и способствует идеальной структуре и функции тканей десивной ткани путем регулирования иммунного ответа хозяина12,13. Возмущения равновесных отношений между commensal организмов в полости рта и принимающей иммунной системы может привести к изменениям в ткани гомеостаза, в результате дисбактериоза и развития отличительной клинической и радиографической видимости PD5,10,12,13,14.
Интересно, что создание устной дисбактериоз, хотя и требуется для начала PD, не является достаточным для привода PD во всех людей, ускользая от способности хозяина иммунный ответ, чтобы подорвать переход микробиоты между симбиотических и дисбиотических состояний15. Это ставит особое внимание на средства, с помощью которых PD влияет на одного из ведущих персонажей врожденной иммунной системы, а именно полиморфонуклеарные гранулоциты (PMN), или нейтрофилов, с местной и системной точки зрения16,17.
У людей, PMNs набираются из циркуляции в размере 2 х 106 клеток / ч в здоровых соединительных тканей пародонта, где они являются преобладающей популяции лейкоцитов. Здесь они впоследствии вытесняются из слизи gingival в полость рта в качестве компонента кревикулярной жидкости. При наличии PD, нейтрофилии проявляется в циркуляции и полости рта, где эти клетки-эффекторы обладают гипервоспалительным фенотипом, что приводит к вышеупомянутому разрушению пародонта17,18,19,20,21,22. Поэтому понимание роли ПМН в ПД и других системных воспалительных заболеваниях имеет первостепенное значение.
Хотя широко признается, что хронические заболевания взаимно связаны с PD, основные механизмы еще предстоит выяснить, что усугубляет трудности в управлении этими болезненными и потенциально смертельными системными условиями. Несколько экспериментальных моделей животных, каждый с уникальными преимуществами и недостатками, были использованы для изучения патофизиологии PD23,24. Сосредоточение особого внимания на моделях мурин, существуют различные протоколы, с помощью которых облегчается изучение PD; однако, они обладают несколькими техническими и физиологичными недостатками25,26,27,28,29,30,31.
Во-первых, устные gavage мыши модель требует многочисленных устных прививок человеческих пародонтальных патогенов для создания воспаления десяна и потери костной массы. Кроме того, как правило, предшествует период лечения антибиотиками, чтобы подорвать минрин комменсальной оральной флоры25. Эта модель часто требует специализированной подготовки, чтобы безопасно выполнять устные gavage, использует лишь небольшую часть пародонтальных патогенов из более сложных человеческих устных микробиома, и требует нескольких месяцев, чтобы установить альвеолярной потери костной массы.
В отличие от этого, химически индуцированных морин модели использовать устные доставки тринитробензена сульфоновой кислоты (TNBS) или декрен сульфат натрия (DSS), агенты обычно используются в создании мочеиспускательных моделей колита в течение нескольких месяцев, чтобы вызвать пародонтальной потери костной массы26. Доступны внутриоральные и экстраоральные модели на основе абсцесса, которые включают в себя резцы и ткани мины на сум, а также кальварий, соответственно. В бывшей модели абсцесса, несколько инъекций бактерий вводят, создавая несколько деснных абсцессов и недостаток альвеолярной потери костной массы, ограничивая их использование в изучении PD. Последние абсцесс модели значительно более склонны к изучению бактериальной вирулентности, воспаления и резорбции костей на участках за пределами полости рта, что исключает оценку пародонта и орального микробиома27,28,29,30,31.
Используя модель пародонтита, индуцированная лигатурой, плетеный шелковый шов обычно устанавливался по окружности вокруг второго моляра. В качестве альтернативы можно вставить один линейный сегмент шовного материала между первым и вторым молярами32,33. Цель размещения лигатуры заключается в облегчении бактериального накопления и генерации дисбактериоза в сульчи десен, что приводит к воспалению пародонтальной ткани и разрушению тканей, составляющих пародонт. Наиболее примечательно, что эта модель способна производить значительно больше альвеолярной потери костной массы по сравнению с более часто используемым устным gavage модель34. Еще более осложняет использование пероральной модели gavage является естественное сопротивление нескольких штаммов мышей (т.е., C57BL/6) к развитию альвеолярной потери костной массы. Это также проблематично, так как этот штамм является наиболее часто используемым в мурин основе исследований животных35.
Существующие процедуры, описанные Marchesan et al. и Абэ и Гаджишенгаллис были разработаны для упрощения технического акта размещения лигатуры33,36. К сожалению, прежний протокол требует специализированного 3D-печатного оборудования и обладает потенциалом для преждевременной потери лигатуры, тем самым увеличивая использование животных и затраты, связанные с дополнительным временем, затрачиваемым в операционной. Кроме того, оба протокола генерируют лишь небольшие области больного пародонтия, доступные для исследования.
Преимущества, которые лежат с этой техникой основываются в одновременном изучении перорального дисбактериоза и иммунологии, которые регулируют пародонтум, использование недорогих животных с разнообразным генетическим образованием, а также простое жилье и методы ведения земледелия. Таким образом, цели должны заключаться в максимизации объемов заболеваний тканей и, в попытках практиковать принципы сокращения исследований на животных, снизить потребление животных до максимально низкого уровня. Это требует обеспечения того, чтобы все животные могут быть включены в экспериментальные анализы37. Однако следует отметить, что независимо от того, какая животное модель пародонта используется, нет единой модели, которая охватывает каждый элемент патологиологии PD человека.
Этот новый протокол использует размещение лигатуры вокруг нескольких челюстно-лицевых молочных зубов с использованием приборов и материалов, которые находятся в большинстве лабораторий. Это позволяет достаточное количество времени, чтобы легко и уверенно установить лигатуру, которая вряд ли avulse преждевременно. Наконец, по мере того, как ПМН координируют разрушение пародонта в PD, также представлена новая методология восстановления пероральных нейтрофилов, аналогичная людям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования по изучению морина соответствовали соответствующим этическим нормам и были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Торонто и Советом по этике исследований (Protocol 20011930).
1. Установка лигатуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нестерильная хирургическая процедура, которая может быть проведена в стандартной операционной. Использование микробов животных (не распространяется здесь) мандатов обработки в биобезопасности шкаф, использование стерильных инструментов, и прививки полости рта с пародонтального патогенов, чтобы вызвать клинические проявления пародонтита.
- Администрирование интраперитонеальной анестезии до 8-12 недельных мужчин C57BL/6 мышей, которые должны быть акклиматизированы к их жилого объекта, используя 0,5" 26 G стерильной подкожной иглы и 1 мЛ шприц в соответствии с утвержденными институциональных животных по уходу и использованию комитета (IACUC) руководящих принципов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) анестезии быстро и надежно индуцирует соответствующий уровень анестезии в течение всего срока процедуры. - Оцените глубину анестезии до и каждые 15 минут во время процедуры, о чем свидетельствует потеря педали рефлекса.
- Расположите мышь на нагретой хирургической платформе(рисунок 1А). Стабилизировать челюсти и челюсти в открытом положении с помощью резинки и опора шеи с хлопчатобумажным рулоном, чтобы помочь сохранить челюсти в более горизонтальной ориентации (Рисунок 1B). Обложка тела и хвоста животного, чтобы уменьшить потерю тепла во время процедуры.
- Расположите хирургический микроскоп при желаемом увеличении и освещении (если не крепится непосредственно к микроскопу) над полостью рта для визуализации зубного ряда. В то время как желаемое увеличение зависит от оператора, оптимальная визуализация полости рта получается в 16x.
- Установите стерильные 5-0 плетеные шелковые швы вокруг первого (M1) и второй (M2) челюстно-лицевые моляры в gingival sulcus с помощью осколок щипцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плетеные шелковые швы меньшего калибра могут быть использованы для этой цели для облегчения более быстрой установки и уменьшить возможность повреждения ятрогенных мягких тканей.- Расположите дистальный хвост шва на небной стороне зубного ряда и вставьте проксимальный сегмент между контактом M2 и M3(рисунок 2A).
- Оберните шов вокруг buccal поверхности M2 и вставьте его между контактом M1 и M2. Убедитесь, что оба конца шва тянут плотно, чтобы загнать шов в gingival sulcus и удалить все слабину (Рисунок 2B).
- Оберните проксимальный сегмент шва вокруг M1, ниже его высоты контура, и вставьте его между контактом M1 и M2. Потяните проксимальный хвост швы плотно, чтобы загнать шов в слизь десен и удалить все слабину(Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сопротивление наблюдается при вставке шова между M1 и M2 или M2 и M3, контакт может быть открыт немного с помощью стандартного зубного исследователя. - Свяжите концы шва узлом хирурга и обрежьте хвосты как можно короче. Поместите узел в дешвийской амбразы между M1 и M2 на небной стороне челюстно-лицевого зубного ряда(рисунок 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.4.1-1.4.4 могут быть повторены на контралатеральной стороне, если это необходимо. - Стерилизовать хирургические инструменты в горячем стеклянном стерилизаторе из бисера между каждым животным предметом.
ВНИМАНИЕ: Кончики щиптем чрезвычайно острые и могут легко вызвать травму полости рта и значительное кровотечение. Подготовьте небольшие участки марли для удаления крови из полости рта и надавите на активно кровоточащие раны.
- После установки лигатуры, удалить мышь из хирургического аппарата, поместите в чистую клетку под тепловой лампой и монитор до полного восстановления.
- Индивидуально разместить каждую мышь с соответствующим экологическим обогащением и позволить ad libitum доступ к фильтрованной воде и пюре стандартный чау в температуре и влажности контролируемой среде (12-h свет / 12-h темный цикл) в течение 7-11 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Mashed чау уменьшает силы, необходимые для мастикации тем самым уменьшая боль, связанную с кормлением, и помогает предотвратить преждевременную потерю установленной лигатуры.
2. Коллекция образцов
- Эвтаназия мышей в соответствии с утвержденными руководящими принципами IACUC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальная эвтаназия с использованием КАМЕРЫ CO2 с последующим вывихом шейки матки является предпочтительным методом для этого протокола. Это может быть изменено в зависимости от экспериментов, которые требуют сбора дополнительных тканей. - Используя пипетку, немедленно промыть полость рта с 100 л стерилизованных 4 C 1x фосфат-буфера солей (PBS) без кальция и магния в течение 10 с.
- Повторите шаг 2.2 2x и поместите каждый промыть в одной 15 мл конической полипропиленовой стерильной пробирки.
- Перенесите содержимое в коническую полипропиленовую стерильную пробирку мощностью 50 мл, пропустив их через нейлоновый фильтр мощностью 40 мкм.
- Перенесите это содержимое в новую коническую полипропиленовую стерильную пробирку мощностью 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная передача образца в меньшую трубку позволяет улучшить визуализацию клеточной гранулы в предстоящих шагах.- При желании удалите моляровую лигатуру (ы) и поместите в 300 л стерилизованного 1x PBS (4 кв.с., без кальция и магния) в отдельной 15 мл конической полипропиленовой стерильной пробирки. Осторожно агитировать и снять шов с трубки. Этот образец обрабатывается одинаково, чем устный образец промывки с этой точки вперед.
- Добавьте 33,3 л параформальдегида (PFA) 16%, чтобы облегчить фиксацию образца.
- Вихрь образцы немедленно и инкубировать на льду в течение 15 минут.
- Заполните трубку до 15 мл с 1x PBS разбавить PFA, затем центрифуга на 1000 х г и 4 КС в течение 5 мин.
- Приготовьте супернатант и отдохните гранулы в 1 мл флуоресцентной сортировки клеток (FACS) буфера при 4 градусах Цельсия. Подсчитайте клетки на гемоситометре или автоматизированном счетчике клеток.
- Центрифуге образец снова на 1000 RCF и 4 КК в течение 5 мин.
- Примачивайте супернатант и resuspend гранулы в соответствующем томе буфера FACS для окончательной концентрации 0.5-1.0 x 106 ячеек/50 л буфера FACS.
3. Антитела окрашивания для потока цитометрического анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка и холод все необходимые трубки FACS до использования.
- Добавьте 1 кл/л крысиной сыворотки и 2 зл антитела антимышки IgG к 50 злу образца, вихрь немедленно, и блок на льду в течение 20 минут.
- Добавьте соответствующие антитела к каждому образцу, вихрь немедленно, и инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбор и объемы антител зависят от предыдущих экспериментов по оптимизации, адаптированных к этому конкретному методу. - Промойте образцы с 1 мл буфера FACS, вихревой кратко и центрифугирование в течение 5 мин при 1000 х г и 4 КС. Повторите этот шаг 2x.
- Приостанавливайте образцы в 250 кл. буфера FACS, накройте трубками парафиновой пленкой, заверните в алюминиевую фольгу и удерживайте при 4 градусах Цельсия до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеально для анализа образцов в течение нескольких часов после завершения протокола из-за потери флуоресцентного сигнала в течение длительных периодов хранения. Тем не менее, образцы могут быть проанализированы 2-3 дней спустя, если это абсолютно необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель потока цитометрии данные из устных промыть образцы наивной(Рисунок 3А) и воспаленной(Рисунок 3B) мурин полости рта вторичной лигатуры индуцированного пародонтита предоставляются. Также демонстрируется восстановление ПМН от установленной лигатуры(рисунок 3C). Напряжение китометра потока было откалибровано вручную, а компенсация осуществлялась с помощью одноцветных компенсационных бусин. PMNs были определены как Ly6GveF4/80-ve с использованием изложенной стратегии gating38. Минимум 500 закрытых событий PMN были приобретены из каждого перорального образца смыва и лигатуры. PMN жизнеспособность была определена, чтобы быть примерно 37% на trypan синий окрашивания. Репрезентативные изображения альвеолярных уровней костей, измеряемых от альвеолярного костного гребня (ABC) до цементоэнамеля соединения (CEJ) для здоровых(рисунок 4A) и ligated мышей(Рисунок 4B). Относительные различия между этими измерениями(рисунок 4C) предоставляются.
Рисунок 1: Позиционирование животных для перевязки моляров. (A) Доступ к полости рта достигается путем проведения нижней челюсти в подавленном положении, поместив мягкий тяги на верхнечелюстной и нижней резвости зубной дентиция. (B) Gauze помещается под череп, чтобы предотвратить движение головы и поместить челюсть в относительно горизонтальное положение. Тело и хвост покрыты, чтобы предотвратить потерю тепла до перемещения хирургической стадии под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Последовательная фотография установки лигатуры. (A) Дистальный хвост шва расположен на небной стороне зубного ряда, и проксимальный сегмент вставляется между контактом M2 и M3. (B) Шов затем обернутые вокруг buccal поверхности M2 затем вставляется между контактом M1 и M2. (C) Проксимальный сегмент шва обернут вокруг M1 ниже его высоты контура, а затем вставляется между контактом M1 и M2. (D) Концы шва связаны узлом хирурга и обрезаются как можно ближе к узку. Узел помещается в дешвийской амбразы между M1 и M2 на небной стороне челюстно-лицевый зуб. Все фотографии были приобретены на вскрытой челюсти для записи процедурных шагов с беспрепятственным видом молярного зубного ряда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель FACS участков и gating стратегии демонстрации устного присутствия нейтрофилов. Нейтрофилы были извлечены из следующих образцов и оценены цитометрией потока: (A) устные промыть из наивной мыши, (B) устные промыть, и (C) восстановленные лигатуры из мыши с лигатурой индуцированного пародонтита (двустороннее). Представлены репрезентативные стратегии рассеивания. Синглеты (SSC-H x SSC-W и FSC-H x FSC-W) и нейтрофилы (Ly6Gqve/F480-ve)были закрыты, как показано на рисунке. Численные значения отражают процент ячеек внутри каждого ворот. SSC-A - область бокового рассеяния; SSC-W - ширина бокового рассеяния; Высота бокового рассеяния SSC-H; FSC-A - передняя область рассеяния; FSC-W - ширина рассеяния вперед; FSC-H - высота рассеяния вперед. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Альвеолярная потеря костной массы различия между контролем и ligated животных. Представитель фотографии, демонстрирующие различия в альвеолярной потери костной массы между (A) контроль и (B) ligated мышей. (C) Измерения от цементоэнамля соединения (CEJ) к альвеолярному костному гребню (ABC), наряду с mesiopalatal и distopalatal углами линии M1 и M2, показаны (средний - SEM, n no 3). P-значения определялись двусторонним ANOVA с тестом ЛСД после специального Фишера. (Пч злт; 0,01; злю; 0,001; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важный элемент, связанный с использованием мурин лигатуры индуцированной модели пародонтита сосредоточена вокруг удержания лигатуры до времени жертвоприношения или преднамеренного удаления. Установленная биопленка-ретентивная лигатура способна вывешить значительную потерю альвеолярной высоты кости всего за 6 дней, плато между 11-16 дневный период39. Решение пожертвовать животных субъектов до максимального периода потери костной массы, что делает это гораздо короче модель лигатуры индуцированного пародонтита, был выбран для дальнейшего снижения частоты преждевременной лигатуры авульсия, определяется как потеря лигатуры до времени жертвоприношения, что делает животное недиагностической.
Наиболее часто цитируется недостаток этой модели подчеркивает воспринимается техническая трудность установки лигатуры из-за незначительных размеров морин молярной зубной дентиции, которые варьируются в окружности от 4,4 мм (M1) до 2,6 мм (M3)40. Этот вопрос может быть смягчен за счет привлечения хирургического персонала / стажеров для установки лигатуры, которая требует (не более) 10 мин/ животных и включает в себя доставку анестезии. Кроме того, размещение лигатуры является навыком, освоил через повторение, и это не более интенсивным, чем многие общие методы на основе лаборатории, которые требуют повышенной степени ловкости рук. С процедурной точки зрения, использование интраперитонеальной анестезии предоставляет много времени для облегчения установки лигатуры. При необходимости он также позволяет заменить любые лигатуры, которые не установлены удовлетворительным образом, так как локализация шва на слизь и узел между контактом M1 и M2 идеально подходит для удержания.
Предлагаемые изменения этих протоколов, которые предусматривают либо 1) перевязку одного моляра с использованием окружного шва или 2) одного линейного сегмента шва, размещенного между одним контактом молярной зубной стойки, дают ряд преимуществ. С технической точки зрения в протоколе используется оборудование, которое либо легко доступно, либо может быть построено из ранее существовавшего оборудования по аналогии с Абэ и Гаджишенгаллисом. Это устраняет необходимость в специальных заказах или производстве оборудования с помощью 3D-печати33. Установка непрерывной шелковой швовой строп вокруг нескольких зубов, обеспеченных узел хирурга, которые не могут быть нарушены язык может также улучшить удержание лигатуры.
В ходе этого протокола, по сравнению с методом, предложенным Marchesan et al., в котором ожидаются потери до 20%, произошло полное отсутствие преждевременной лигатуры avulsion36. Хотя частота потери лигатуры не была непосредственно оценена Абэ и Гаджишенгаллис, метод был применен в ряде исследований41,42,43,44. С технической точки зрения, ятрогенного повреждения мягких тканей удалось избежать у высоченных животных. Факторы, способствующие этому явлению включают непрерывное наблюдение за полостью рта через микроскоп, постоянную визуализацию кончиков щипников и использование чистых щиптов для предотвращения соскальзывания шва во время размещения.
В полости рта, удлиненные сегменты шовного материала также резко увеличить количество больных тканей, доступных для анализа и может привести к заметному снижению использования животных. Это потому, что все субъекты могут быть включены в анализ, и объединение тканей и промыть образцы не требуется. Следует отметить, что можно ligate контралатеральной верхнечелюстной молярной зубной дентиции с использованием ранее сообщалось методы для увеличения пораженной области ткани41. Однако, эта модификация невозможна в тех случаях, когда требуется сплит-рот дизайн, кредитование поддержку для применения этого нового протокола. Наконец, сродни предыдущим протоколам пародонтита, индуцированному лигатурой, использование этой методики не ограничивается 8-12 недельным мужчиной C57BL/6 мышей. Мыши старшего возраста, любого пола, и различных генетических фонов может быть приемлемым в зависимости от экспериментального дизайна.
К сожалению, эта модель по-прежнему обладает некоторыми техническими и методологическими недостатками. Использование конкретных патогенных мышей, как описано выше, не может имитировать прогрессирование периодонтиза человека. Это связано с несколькими различиями между составом их commensal устные биопленки, что ограничивает внешнюю достоверность оценки бактерий-бактерий и бактерий-хозяев взаимодействий45. Теоретически это можно смягчить с помощью мышей, свободных от микробов, что значительно усложняет протокол. Необходимы дополнительные усилия и ресурсы для обеспечения того, чтобы животные остаются свободными от микробов во время жилищного и хирургического манипулирования. Дальнейшие меры должны быть введены для развития пародонтита, так как эти мыши устойчивы к лигатуре индуцированной PD при отсутствии бактериального накопления46,47.
Кроме того, моноинфекционные и коинфекционные модели лигатуры не подпадают под обзор состояния человека, поскольку пародонтоз представляет собой более сложное полимикробное взаимодействие между биопленкой и иммунной системой хозяина. В этих условиях, выяснение роли, и взаимодействия между ограниченным числом человеческих устных бактерий может считаться недостаточным и потенциально невыгодным, особенно в контексте изучения пародонтальной иммунобиологии.
Наконец, последние доказательства причастны к тому, что силы мастикации способны изменить дешвивальной иммунонадзора путем накопления T помощник 17 клеток, интегральный посредник барьерного иммунитета48. Таким образом, использование мягкой диеты, особенно у пожилых животных, может действовать потенциального confounder. Это может уменьшить потенциал для нормальной физиологиической потери костной массы в регионах, где лигатуры были применены. В свете этих данных следует тщательно рассмотреть вопрос об использовании пожилых животных и соответствующих возрастных мерах контроля в тех случаях, когда эти выводы, как было отмечено, являются наиболее заметными.
Использование этой относительно простой модели может быть расширена до оценки альвеолярной потери костной массы с помощью микро-компьютерной томографии, гистологического анализа как альвеолярной кости, так и окружающей гинговой ткани, и проведения оральной характеристики микробиоты, все из которых были выполнены с существующими моделью PD33,49. Хотя редко обсуждается или используется, это также возможно для оценки последствий лечения, (а также ремонт и регенерация пародонта) в настройках лигатуры индуцированной мурин пародонтит путем удаления лигатуры под общим наркозом с тонкой точки осколки щипцы39. Наконец, использование этой модели может быть расширено до изучения системных последствий заболевания пародонта из-за повышенной воспалительной нагрузки, вызванной перевязкой более одного зуба, а также левой и правой челюстно-лицевый молярный зуб, при желании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
JW C. поддерживается Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR). Авторы хотели бы поблагодарить доктора Chunxiang Sun за ее помощь в выполнении трипан синий окрашивания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W.
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D.
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P.
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A.
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P.
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
