Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Robust ligatur-indusert modell av murine periodontitt for evalueringen av muntlig nøytrofile

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/59667
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Faculty of Dentistry, University of Toronto

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å etablere en ligatur-indusert modell av murine periodontitt involverer flere maksillære jeksler, noe som resulterer i større områder av den involverte gingival vev og bein for senere analyse samt redusert dyre bruk. En teknikk for å vurdere muntlig nøytrofile på en måte analoge til menneskelige er også beskrevet.

Abstract

De viktigste fordelene ved å studere patofysiologi av periodontal sykdom utnytte murine modeller er de reduserte kostnadene for dyr, rekke genmodifiserte stammer, det store antall analyser som kan utføres på høstet myke og harde vev. Men mange av disse systemene er gjenstand for prosessuelle kritikk. Som et alternativ, ligatur-indusert modell av periodontal sykdom, drevet av den lokaliserte utvikling og oppbevaring av en dysbiotic oral mikrobiomet, kan benyttes, som er raskt indusert og relativt pålitelig. Dessverre er variantene av ligatur-indusert murine periodontitt protokoll isolert til fokal områder av periodontium og utsatt for prematur avulsion av den installerte ligatur. Dette minimerer mengden av vev tilgjengelig for senere analyser og øker antall dyr som kreves for studier. Denne protokollen beskriver presise manipulasjoner som kreves for å plassere utvidet molar ligaturer med forbedret oppbevaring og bruk av en roman skylle teknikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile i mus med en alternativ tilnærming som begrenser de nevnte tekniske utfordringer.

Introduction

Periodontal sykdom (PD) er en osteolytiske tilstand forbundet med betydelig vert sykelighet og økonomisk byrde, som er manifestert ved gingival betennelser og tap av både bløtvev vedlegg og fluorose støtte for de berørte tennene1,2,3,4. Denne prosessen styres av interaksjoner mellom det muntlige bakterieflora og medfødte immunsystemet til verten. Det er også forbundet med forverring av andre systemiske inflammatoriske sykdommer, inkludert diabetes, hjerte-og karsykdommer, og kreft5,6,7,8. Historisk var det hypotetisk gjennomsnitt at PD-patogenesen er avhengig av store mengder spesifikke bakterier som Porphyromonas gingivalis9. Men, tyder nyere bevis på at den mikrobielle komponenten av PD er formidlet av Dental biofilm. Den biofilm er en organisert, komplekst fellesskap av mange mikroorganismer som kan eksistere i sunne symbiotisk og destruktive dysbiotic stater10,11. Den muntlige biofilm normalt gir motstand til verten ved å hindre etablering av fokus på patogene bakterier og fremmer ideell gingival vev struktur og funksjon gjennom regulering av verten immunrespons12,13. Forstyrrelser av equilibrious forholdet mellom Commensal organismer i munnhulen og verts immunforsvaret kan føre til endringer i vev homeostase, noe som resulterer i dysbacteriosis og utvikling av Hallmark klinisk og radiografisk opptredener av PD5,10,12,13,14.

Interessant, etablering av en muntlig dysbacteriosis, mens nødvendig for initiering av PD, er ikke tilstrekkelig til å drive PD i alle individer, eluding mot evnen til verten immunforsvaret til å undergrave overgangen av bakterieflora mellom symbiotisk og dysbiotic stater15. Dette plasserer en bestemt søkelys på midlene der PD påvirker en av de ledende karakterene i det medfødte immunsystemet, nemlig polymorfonukleære granulocytt (PMN), eller nøytrofile, fra lokale og systemiske perspektiver16,17.

Hos mennesker, PMN er rekruttert fra sirkulasjonen med en hastighet på ~ 2 x 106 celler/h i sunne periodontal bindevev, hvor de er de predominating leukocytter befolkning. Her er de senere utvist fra gingival sulcus inn i munnhulen som en del av gingival crevicular væsken. I nærvær av PD, neutrophilia manifesterer innenfor sirkulasjon og munnhulen, hvor disse Effektor celler besitter en hyperinflammatory fenotype som fører til de nevnte ødeleggelsen av periodontium17,18,19,20,21,22. Derfor er forståelsen av rollen til PMN i PD og andre systemiske inflammatoriske tilstander av største betydning.

Selv om det er allment akseptert at kroniske sykdommer er gjensidig knyttet til PD, de underliggende mekanismene har ennå ikke belyst, bidra til vanskeligheter i forvaltningen av disse sykelig og potensielt fatale systemiske forhold. Mangfoldig eksperimentelle dyr modeller, hver med enestående fordeler og ulempen, ha blitt anvende å studere patofysiologi av PD23,24. Fokuserer spesielt på murine modeller, er det en rekke protokoller der studiet av PD er tilrettelagt; men de har flere tekniske og fysiologiske svakheter25,26,27,28,29,30,31.

For det første, det muntlig gavage musen modell behøver tallrik muntlig vaksiner av Human periodontal patogener å utvikle gingival betennelse og Ben forlis. I tillegg er det vanligvis innledes med en periode med antibiotika behandling for å undergrave den murine Commensal oral flora25. Denne modellen krever ofte spesialisert trening for å trygt utføre muntlige gavage, bruker bare en liten brøkdel av periodontal patogener fra de mer komplekse menneskelige muntlige mikrobiomet, og krever flere måneder å etablere alveolære bein tap.

I kontrast, kjemisk indusert murine modeller benytte muntlig levering av trinitrobenzene sulfonsyrer syre (TNBS) eller dextran sulfat natrium (DSS), agenter som vanligvis brukes i å etablere murine modeller av kolitt over en periode på flere måneder for å indusere periodontal bein tap26. Intraorale og extraoral abscess-baserte modeller er tilgjengelig, som involverer murine fortenner og vev av antecubital samt calvarium, henholdsvis. I den tidligere abscess modellen, flere injeksjoner av bakterier administreres, skape flere gingival abscesser og en mangel av alveolære bein tap, begrense deres bruk i studiet av PD. Sistnevnte abscess modeller er betydelig mer tilbøyelige til å studere bakteriell virulens, betennelser, og bein resorpsjon på steder utenfor munnhulen, som eliminerer evaluering av periodontium og muntlig mikrobiomet27,28,29,30,31.

Ved hjelp av ligatur-indusert modell av periodontitt, en flettet silke Sutur har ofte blitt installert circumferentially rundt andre molar. Som et alternativ, kan en enkelt lineær segment av Sutur materiale settes inn mellom første og andre jeksler32,33. Målet med ligatur plassering er å lette bakteriell akkumulering og generere dysbiosis innenfor gingival sulci, noe som resulterer i periodontal vev betennelser og ødeleggelse av vev komponere periodontium. Mest spesielt er denne modellen i stand til å produsere betydelig mer alveolære bein tap i forhold til de mer brukte muntlige gavage modell34. Videre kompliserer bruken av oral gavage modellen er den naturlige motstanden av flere stammer av mus (dvs. C57BL/6) til å utvikle alveolære bein tap. Denne er likeledes problematisk, idet denne belastning er de fleste hyppig anvendt inne murine-basert dyr forskning35.

Eksisterende prosedyrer beskrevet av Marchesan et al. og Abe og Hajishengallis ble utviklet for å forenkle den tekniske handlingen å plassere ligatur33,36. Dessverre krever den tidligere protokollen spesialisert 3D-trykt utstyr og har potensial for prematur ligatur tap, og dermed øke dyr bruk og kostnadene forbundet med ekstra tid brukt i operasjonsstuen. Videre genererer begge protokollene bare små områder av de syke periodontium som er tilgjengelige for en studie.

Fordelene som ligger med denne teknikken er jordet i samtidige studier av oral dysbiosis og immunologi som regulerer periodontium, utnyttelse av rimelige dyr med ulike genetiske bakgrunner, og enkle boliger og husdyrhold praksis. Som sådan bør mål være å maksimere volumer av syke vev og, i forsøk på å praktisere prinsippene for reduksjon i animalsk forskning, redusere animalsk forbruk til et nivå så lavt som mulig. Dette krever at alle dyr er i stand til å bli inkludert i eksperimentelle analyser37. Imidlertid bør det bemerkes at uansett hvilken dyremodell av periodontal sykdom er utnyttet, er det ingen enkelt modell som omfatter hvert element av menneskelig PD patofysiologi.

Denne nye protokollen sysselsetter plasseringen av en ligatur rundt flere maksillære molar tenner ved hjelp av instrumentering og materialer som finnes i de fleste laboratorier. Den innrømmer en nok beløpet av tid å lett og trygt installere en ligatur det er usannsynlig å avulse for tidlig. Til slutt, som PMN koordinere ødeleggelsen av periodontium i PD, en ny metodikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile på en måte som tilsvarer mennesker er også presentert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle murine studier overholdt de relevante etiske forskriftene og ble godkjent av University of Toronto Animal Care Committee og forskningsetikk styret (protokoll 20011930).

1. ligatur installasjon

Merk: Dette er en ikke-steril kirurgisk prosedyre som kan utføres i et standard operasjonsteater. Bruk av bakteriefrie dyr (dekkes ikke her) mandater håndtering i et biosafety kabinett, bruk av sterile instrumenter, og inoculation av munnhulen med periodontal patogener å forårsake kliniske manifestasjoner av periodontitt.

  1. Administrer intraperitoneal anestesi til 8-12 ukers-gamle mannlige C57BL/6 mus, som skal være acclimated til deres bolig anlegg, ved hjelp av en 0,5 "26 G steril sprøyte nål og 1 mL sprøyte i henhold til godkjent institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (IACUC) retningslinjer.
    Merk: en kombinasjon av ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) anestesi raskt og pålitelig induserer riktig nivå av anestesi for varigheten av prosedyren.
  2. Vurder bedøvelse dybden før og hver 15 min under prosedyren som gjenspeiles av tap av pedal refleks.
  3. Plasser musen på en oppvarmet kirurgisk plattform (figur 1a). Stabilisere maxilla og kjeven i åpen stilling ved hjelp av elastiske bånd og rekvisitt i nakken med en bomulls Rull for å opprettholde maxilla i en mer horisontal orientering (figur 1B). Dekk kroppen og halen av dyret for å redusere varmetap under inngrepet.
  4. Plasser det kirurgiske mikroskopet ved ønsket forstørrelse og belysning (hvis det ikke monteres direkte på mikroskopet) over munnhulen for visualisering av tennene. Selv om ønsket forstørrelse er operatøravhengig, oppnås optimal visualisering av munnhulen ved 16x.
  5. Installer en steril 5-0 flettet silke Sutur rundt den første (M1) og andre (M2) maksillære jeksler innenfor gingival sulcus ved hjelp av Splinter tang.
    Merk: flettet silke sting av en mindre gauge kan brukes til dette formålet for å lette raskere installasjon og redusere muligheten for iatrogenic bløtvev skade.
    1. Plasser den bakre halen på Sutur på den palatal siden av tennene og sett inn proksimale segmentet mellom kontakten på m2 og M3 (figur 2A).
    2. Vikle Sutur rundt den bukkal overflaten på m2 og sett den inn mellom kontakten på M1 og m2. Sørg for at begge endene av Sutur trekkes tett for å drive Sutur inn i gingival sulcus og fjerne all slakk (figur 2B).
    3. Vikle proksimale Sutur segmentet rundt M1, under dens høyde av kontur, og sett den mellom kontakten på M1 og m2. Trekk den proksimale halen på Sutur tett for å drive Sutur inn i gingival sulcus og Fjern all slakk (figur 2C).
      Merk: Hvis det observeres motstand når du setter inn Sutur mellom M1 og m2 eller m2 og M3, kan kontakten være litt åpen ved hjelp av en standard Dental Explorer.
    4. Knyt endene av Sutur med en kirurg knute og trim halen så kort som mulig. Plasser knuten i gingival embrasure mellom M1 og m2 på den palatal siden av maksillære tennene (figur 2D).
      Merk: trinn 1.4.1-1.4.4 kan gjentas på kontralateral IDen, om nødvendig.
    5. Sterilisere Kirurgiske instrumenter i et varmt glass perle steriliseringsapparat mellom hvert dyr emne.
      FORSIKTIG: tipsene til pinsett er ekstremt skarp og kan lett føre til oral traumer og betydelig blødning. Forbered små segmenter av gasbind for å fjerne blod fra munnhulen og legge press på aktivt blødende sår.
  6. Etter det ligatur installasjon, fjerne musa fra det inngrep apparat, sted i en feilfri bur under en heten lampen og dataskjerm til fullt ut kommet til hektene.
  7. Individuelt huset hver mus med riktig miljø berikelse og tillate Ad lib tilgang til filtrert vann og potetmos standard Chow i en temperatur-og fuktighet-kontrollerte miljø (12-h lys/12-h mørk syklus) i 7-11 dager.
    Merk: Most Chow minsker kreftene som kreves for tygge dermed redusere smerte forbundet med fôring, og hjelpemidler i å forebygge tidlig tap av den installerte ligatur.

2. samling av eksempler

  1. Euthanize mus i henhold til godkjente IACUC retningslinjer.
    Merk: individuell dødshjelp med en CO2 kammer etterfulgt av cervical forvridning er den foretrukne metoden for denne protokollen. Dette kan endres avhengig av eksperimenter som krever høsting av ekstra vev.
  2. Bruk en pipette umiddelbart skyll munnhulen med 100 μL av sterilisert 4 ° c 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium i 10 s.
  3. Gjenta trinn 2,2 2x og plasser hver skylling i et enkelt 15 mL konisk polypropylen sterilt reagensrør.
  4. Overfør innholdet til en 50 mL konisk polypropylen steril test tube ved å kjøre dem gjennom et 40 μm nylon mesh filter.
  5. Overfør disse innholdet til en ny 15 mL konisk polypropylen steril reagensrør.
    Merk: den endelige overføringen av prøven til et mindre rør gjør det mulig for forbedret visualisering av mobilnettet pellet i den kommende trinn.
    1. Hvis ønskelig, Fjern molar ligatur (e) og Legg inn 300 μL av sterilisert 1x PBS (4 ° c, uten kalsium og magnesium) i et separat 15 mL konisk polypropylen sterilt reagensrør. Agitere forsiktig og fjern Sutur fra slangen. Denne prøven blir behandlet identisk til oral skylle prøve fra dette punktet fremover.
  6. Tilsett 33,3 μL av 16% paraformaldehyde (PFA) for å lette prøve fiksering.
  7. Vortex prøvene umiddelbart og ruge på isen i 15 min.
  8. Fyll røret til 15 mL med 1x PBS å fortynne PFA, deretter sentrifuge ved 1000 x g og 4 ° c i 5 min.
  9. Aspirer supernatanten og resuspend pellet i 1 mL fluorescens celle sorterings (FACS) buffer ved 4 ° c. Telle celler på en hemocytometer eller automatisert celle teller.
  10. Sentrifuger prøven på nytt ved 1000 RCF og 4 ° c i 5 min.
  11. Aspirer supernatanten og resuspend pellet i et passende volum av FACS buffer for en endelig konsentrasjon på 0,5 – 1,0 x 106 celler/50 ΜL av FACS buffer.

3. antistoff farging for strømnings analytiske analyse

Merk: etiketten og chill alle nødvendige FACS rør før bruk.

  1. Tilsett 1 μL av rotte serum og 2 μL av anti-mus IgG-antistoff til 50 μL av prøven, Vortex umiddelbart, og blokkere på isen i 20 min.
  2. Tilsett de riktige Antistoffene i hver prøve, Vortex umiddelbart, og ruge på isen i 30 minutter i mørket.
    Merk: valg og antall antistoffer avhenger av tidligere forsøk på optimaliserings forsøk som er skreddersydd til denne spesifikke teknikken.
  3. Vask prøvene med 1 mL FACS buffer, virvlingen kort og sentrifugering i 5 min ved 1000 x g og 4 ° c. Gjenta dette trinnet 2x.
  4. Resuspend prøver i 250 μL av FACS buffer, dekk rør med parafin film, wrap i aluminiumsfolie, og hold ved 4 ° c til analyse.
    Merk: det er ideelt å analysere prøver innen timer etter å ha fullført protokollen på grunn av tap av fluorescerende signal i lange perioder med lagring. Prøvene kan imidlertid analyseres 2 – 3 dager senere hvis det er absolutt nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative Flow flowcytometri data fra Oral skylling prøver av en naiv (Figur 3a) og betent (Figur 3B) murine munnhulen sekundært til ligatur-indusert periodontitt er gitt. Gjenoppretting av PMN fra en installert ligatur er også demonstrert (Figur 3C). Flow flowcytometer kanal spenninger ble kalibrert manuelt, og kompensasjon ble utført med single-beiset kompensasjon perler. PMN ble definert som Ly6G+ veF4/80-ve bruker skissert gating strategi38. Et minimum av 500 gated PMN hendelser ble ervervet fra hver oral skylling og ligatur prøve. PMN levedyktighet var fast bestemt på å være omtrent 37% ved trypan blå farging. Representative bilder av alveolære bein nivåer målt fra alveolære Bone Crest (ABC) til cementoenamel Junction (CEJ) for sunn (Figur 4A) og ligaturer mus (Figur 4B). De relative forskjellene mellom disse målingene (Figur 4C) er oppgitt.

Figure 1
Figur 1: Animal posisjonering for molar ligation. (A) tilgang til munnhulen oppnås ved å holde kjeven i en deprimert stilling ved å plassere mildt trekkraft på maksillære og søvnapnéskinne helikopteret tennene. (B) gasbind er plassert under skallen for å hindre bevegelse av hodet og å plassere maxilla i en relativt horisontal posisjon. Kroppen og halen er dekket for å hindre varmetap før du flytter den kirurgiske fasen under mikroskopet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: sekvensiell bilde av ligatur installasjon. (A) den Sutur halen er plassert på palatal IDen av tennene, og proksimale segmentet settes inn mellom kontakten på m2 og M3. (B) Sutur blir deretter pakket rundt bukkal overflate av m2 deretter satt inn mellom kontakten på M1 og m2. (C) proksimale Sutur segmentet er pakket rundt M1 under sin høyde av kontur deretter satt inn mellom kontakten på M1 og m2. (D) endene av Sutur er bundet med en kirurg knute og trimmet så nært som mulig til knuten. Knuten plasseres i gingival embrasure mellom M1 og m2 på den palatal siden av maksillære tennene. Alle bildene ble kjøpt på dissekert maxilla for opptak prosessuelle trinn med en uhindret visning av molar tennene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: REPRESENTATIVE FACS plott og gating strategi demonstrere oral nøytrofile tilstedeværelse. Nøytrofile ble gjenopprettet fra følgende prøver og vurdert av Flow flowcytometri: (A) oral skyll fra en naiv mus, (B) oral skyll, og (C) gjenopprettede ligaturer fra en mus med ligatur-indusert periodontitt (bilateralt). Representative gating strategi scatterplots vises. Singleter (SSC-H x SSC-W og FSC-H x FSC-W) og nøytrofile (Ly6G+ ve/F480-ve) var gated som vist. Numeriske verdier gjenspeiler prosentandelen av celler i hver port. SSC-A = side scatter område; SSC-W = side scatter bredde; SSC-H = side scatter høyde; FSC-A = frem scatter-område; FSC-W = frem scatter bredde; FSC-H = sprednings høyde fremover. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: alveolære bein tap forskjeller mellom kontroll og ligaturer dyr. Representative bilder viser forskjeller i alveolære bein tap mellom (A) kontroll og (B) ligaturer mus. (C) målinger fra cementoenamel KRYSSET (CEJ) til alveolære bein kam (ABC), sammen med mesiopalatal og distopalatal linje vinkler på M1 og m2, vises (gjennomsnittlig ± SEM, n = 3). P-verdier ble bestemt av toveis ANOVA med en post-hoc Fisher-LSD-test. (* p < 0,01; * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske element knyttet til bruk av murine ligatur-indusert modell av periodontitt er sentrert rundt oppbevaring av ligatur til tidspunktet for offer eller tilsiktet fjerning. Den installerte biofilm-retentive-ligatur er i stand til å indusere et betydelig tap på alveolære Ben høyde på så lite som 6 dager, plateauing mellom 11 – 16 dagers perioden39. Beslutningen om å ofre dyr før maksimal periode med bein tap, gjengi dette en mye kortere modell av ligatur-indusert periodontitt, ble valgt for ytterligere å redusere forekomsten av prematur ligatur avulsion, definert som tap av ligatur før tidspunktet for offer, som gjengir dyret diagnostisert.

Den vanligste sitert ulempen med denne modellen fremhever oppfattet tekniske problemer med å installere ligatur på grunn av ørsmå dimensjoner av murine molar tennene, som spenner i omkrets fra 4,4 mm (M1) til 2,6 mm (M3)40. Dette problemet kan begrenses gjennom involvering av kirurgiske ansatte/praktikanter for ligatur installasjon, som krever (høyst) 10 min/dyr og inkluderer levering av anestesi. Videre er plassering av ligatur en ferdighet mastret gjennom repetisjon, og det er ikke mer intensiv enn mange vanlige Lab-baserte teknikker som krever en forhøyet grad av manuell fingerferdighet. Fra et prosessuelle synspunkt, gir bruk av intraperitoneal anestesi omfattende tid for å lette ligatur installasjon. Hvis det er nødvendig, kan det også erstatte eventuelle ligaturer som ikke er installert på en tilfredsstillende måte, som lokalisering av Sutur til gingival sulcus og knute mellom kontakt av M1 og m2 er ideell for oppbevaring.

De foreslåtte modifikasjoner av disse protokollene, som krever enten 1) ligation av en enkelt molar ved hjelp av en circumferential Sutur eller 2) en enkelt lineær segment av Sutur plassert mellom en enkelt kontakt med molar tennene, gir flere fordeler. Fra et teknisk perspektiv, utnytter protokollen utstyr som enten er lett tilgjengelig eller kan konstrueres fra eksisterende utstyr på en lignende måte til Abe og Hajishengallis. Dette obviates behovet for spesielle bestillinger eller produksjon av utstyr ved 3D-utskrift33. Installasjonen av en kontinuerlig silke Sutur slynge rundt flere tenner sikret med en kirurg knute som ikke kan forstyrres av tungen kan også forbedre ligatur oppbevaring.

I løpet av denne protokollen, sammenlignet med teknikken foreslått av Marchesan et al. der tap på opp til 20% er forventet, var det et fullstendig fravær av prematur ligatur avulsion36. Mens forekomsten av ligatur tap ikke var direkte vurdert av Abe og Hajishengallis, har teknikken blitt anvendt i en rekke studier41,42,43,44. Fra et teknisk perspektiv, iatrogenic bløtvev skade ble unngått i ligaturer dyr. Faktorer som bidrar til dette fenomenet inkluderer en kontinuerlig observasjon av munnhulen gjennom et mikroskop, konstant visualisering av tips av tang, og bruk av ren tang for å hindre slipping av av Sutur under plassering.

Innenfor munnhulen, den langstrakte segmenter av Sutur materiale også dramatisk øke mengden av sykt vev tilgjengelig for analyse og kan resultere i en markert nedgang i dyr bruk. Dette er fordi alle er i stand til å bli inkludert i analyse, og pooling av vev og skyll prøvene er ikke nødvendig. Det bør bemerkes at det er mulig å ombinde den kontralateral maksillære molar tennene utnytte tidligere rapporterte teknikker for å øke det berørte vevet området41. Imidlertid er denne endringen ikke mulig i tilfeller der en splitt-munnen design er nødvendig, utlån støtte for anvendelsen av denne nye protokollen. Til slutt, beslektet med den forrige ligatur-indusert periodontitt protokoller, bruk av denne teknikken er ikke begrenset til 8-12 ukers gammel mannlig C57BL/6 mus. Mus av eldre alder, enten sex, og ulike genetiske bakgrunner kan være akseptabelt avhengig av eksperimentell design.

Beklageligvis, denne modell fremdeles besitte noe teknisk og methodologic feil. Bruk av spesifikke patogen-frie mus som beskrevet ovenfor kan ikke etterligne progresjon av menneskelig periodontitt. Dette skyldes flere forskjeller mellom sammensetningen av deres Commensal oral biofilm, som begrenser den eksterne gyldigheten av evaluere bakterier-bakterier og bakterier-vert interaksjoner45. Dette kan teoretisk sett bli dempet gjennom bruk av bakteriefrie mus, noe som kompliserer protokollen betraktelig. Ytterligere innsats og ressurser er nødvendig for å sikre at dyr forblir bakteriefri under bolig og kirurgisk manipulasjon. Ytterligere tiltak må også iverksettes for å utvikle periodontitt, da disse musene er resistente mot ligatur-indusert PD i fravær av bakteriell akkumulering46,47.

Videre mono-infeksjon og co-infeksjon ligatur modeller bommer av recapitulating den menneskelige tilstand, som periodontal sykdom representerer en mer kompleks polymikrobielle interaksjon mellom biofilm og verten immunforsvaret. I disse omstendighetene, Elucidating rollene, og interaksjoner mellom et begrenset antall menneskelige muntlige bakterier kan betraktes mangelfull og potensielt ugunstig, spesielt i sammenheng med å studere periodontium immunobiology.

Endelig har nyere bevis innblandet at styrkene til tygge er i stand til å modifisere gingival immunosurveillance gjennom akkumulering av T-hjelperen 17 celler, en integrert formidler av barriere immunitet48. Som sådan, bruk av en bløt kosten, særlig inne eldre dyrene, kanskje gjerning en muligheter confounder. Dette kan redusere potensialet for normal fysiologiske bein tap i områder der ligaturer er brukt. I lys av dette bevis bør nøye overveielse gis til bruk av gamle dyr og passende Alderstilpassede Kontroller hvor disse funnene har blitt bemerket å være mest fremtredende.

Bruken av denne relativt enkle modellen kan utvides til å evaluere alveolære bein tap ved mikro-beregnet tomografi, histologic analyser av både alveolære bein og omkringliggende vedlagt gingiva, og gjennomfører muntlige bakterieflora karakterisering, som alle er oppnådd med eksisterende ligatur-indusert PD-modeller33,49. Selv om det sjelden diskuteres eller utnyttes, er det også mulig å vurdere virkningene av behandlingen, (samt reparasjon og regenerering av periodontium) i innstillingen av ligatur-indusert murine periodontitt ved å fjerne ligatur under narkose med fine-Point Splinter tang39. Til slutt, bruk av denne modellen kan utvides til å studere systemiske effekter av periodontal sykdom på grunn av økt inflammatorisk belastning forårsaket av ligation av mer enn én tann, samt venstre og høyre maksillære molar tennene, hvis ønskelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

JW C. støttes av Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Forfatterne vil gjerne takke Dr. Chunxiang Søn for hennes hjelp i å utføre trypan blå farging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Tags

Immunologi og infeksjon periodontitt ligatur gingiva periodontium alveolære bein dyr modell flyt flowcytometri nøytrofile immunologi betennelse
Robust ligatur-indusert modell av murine periodontitt for evalueringen av muntlig nøytrofile
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust … More

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter