Summary

Robust ligatur-indusert modell av murine periodontitt for evalueringen av muntlig nøytrofile

Published: January 21, 2020
doi:

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å etablere en ligatur-indusert modell av murine periodontitt involverer flere maksillære jeksler, noe som resulterer i større områder av den involverte gingival vev og bein for senere analyse samt redusert dyre bruk. En teknikk for å vurdere muntlig nøytrofile på en måte analoge til menneskelige er også beskrevet.

Abstract

De viktigste fordelene ved å studere patofysiologi av periodontal sykdom utnytte murine modeller er de reduserte kostnadene for dyr, rekke genmodifiserte stammer, det store antall analyser som kan utføres på høstet myke og harde vev. Men mange av disse systemene er gjenstand for prosessuelle kritikk. Som et alternativ, ligatur-indusert modell av periodontal sykdom, drevet av den lokaliserte utvikling og oppbevaring av en dysbiotic oral mikrobiomet, kan benyttes, som er raskt indusert og relativt pålitelig. Dessverre er variantene av ligatur-indusert murine periodontitt protokoll isolert til fokal områder av periodontium og utsatt for prematur avulsion av den installerte ligatur. Dette minimerer mengden av vev tilgjengelig for senere analyser og øker antall dyr som kreves for studier. Denne protokollen beskriver presise manipulasjoner som kreves for å plassere utvidet molar ligaturer med forbedret oppbevaring og bruk av en roman skylle teknikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile i mus med en alternativ tilnærming som begrenser de nevnte tekniske utfordringer.

Introduction

Periodontal sykdom (PD) er en osteolytiske tilstand forbundet med betydelig vert sykelighet og økonomisk byrde, som er manifestert ved gingival betennelser og tap av både bløtvev vedlegg og fluorose støtte for de berørte tennene1,2,3,4. Denne prosessen styres av interaksjoner mellom det muntlige bakterieflora og medfødte immunsystemet til verten. Det er også forbundet med forverring av andre systemiske inflammatoriske sykdommer, inkludert diabetes, hjerte-og karsykdommer, og kreft5,6,7,8. Historisk var det hypotetisk gjennomsnitt at PD-patogenesen er avhengig av store mengder spesifikke bakterier som Porphyromonas gingivalis9. Men, tyder nyere bevis på at den mikrobielle komponenten av PD er formidlet av Dental biofilm. Den biofilm er en organisert, komplekst fellesskap av mange mikroorganismer som kan eksistere i sunne symbiotisk og destruktive dysbiotic stater10,11. Den muntlige biofilm normalt gir motstand til verten ved å hindre etablering av fokus på patogene bakterier og fremmer ideell gingival vev struktur og funksjon gjennom regulering av verten immunrespons12,13. Forstyrrelser av equilibrious forholdet mellom Commensal organismer i munnhulen og verts immunforsvaret kan føre til endringer i vev homeostase, noe som resulterer i dysbacteriosis og utvikling av Hallmark klinisk og radiografisk opptredener av PD5,10,12,13,14.

Interessant, etablering av en muntlig dysbacteriosis, mens nødvendig for initiering av PD, er ikke tilstrekkelig til å drive PD i alle individer, eluding mot evnen til verten immunforsvaret til å undergrave overgangen av bakterieflora mellom symbiotisk og dysbiotic stater15. Dette plasserer en bestemt søkelys på midlene der PD påvirker en av de ledende karakterene i det medfødte immunsystemet, nemlig polymorfonukleære granulocytt (PMN), eller nøytrofile, fra lokale og systemiske perspektiver16,17.

Hos mennesker, PMN er rekruttert fra sirkulasjonen med en hastighet på ~ 2 x 106 celler/h i sunne periodontal bindevev, hvor de er de predominating leukocytter befolkning. Her er de senere utvist fra gingival sulcus inn i munnhulen som en del av gingival crevicular væsken. I nærvær av PD, neutrophilia manifesterer innenfor sirkulasjon og munnhulen, hvor disse Effektor celler besitter en hyperinflammatory fenotype som fører til de nevnte ødeleggelsen av periodontium17,18,19,20,21,22. Derfor er forståelsen av rollen til PMN i PD og andre systemiske inflammatoriske tilstander av største betydning.

Selv om det er allment akseptert at kroniske sykdommer er gjensidig knyttet til PD, de underliggende mekanismene har ennå ikke belyst, bidra til vanskeligheter i forvaltningen av disse sykelig og potensielt fatale systemiske forhold. Mangfoldig eksperimentelle dyr modeller, hver med enestående fordeler og ulempen, ha blitt anvende å studere patofysiologi av PD23,24. Fokuserer spesielt på murine modeller, er det en rekke protokoller der studiet av PD er tilrettelagt; men de har flere tekniske og fysiologiske svakheter25,26,27,28,29,30,31.

For det første, det muntlig gavage musen modell behøver tallrik muntlig vaksiner av Human periodontal patogener å utvikle gingival betennelse og Ben forlis. I tillegg er det vanligvis innledes med en periode med antibiotika behandling for å undergrave den murine Commensal oral flora25. Denne modellen krever ofte spesialisert trening for å trygt utføre muntlige gavage, bruker bare en liten brøkdel av periodontal patogener fra de mer komplekse menneskelige muntlige mikrobiomet, og krever flere måneder å etablere alveolære bein tap.

I kontrast, kjemisk indusert murine modeller benytte muntlig levering av trinitrobenzene sulfonsyrer syre (TNBS) eller dextran sulfat natrium (DSS), agenter som vanligvis brukes i å etablere murine modeller av kolitt over en periode på flere måneder for å indusere periodontal bein tap26. Intraorale og extraoral abscess-baserte modeller er tilgjengelig, som involverer murine fortenner og vev av antecubital samt calvarium, henholdsvis. I den tidligere abscess modellen, flere injeksjoner av bakterier administreres, skape flere gingival abscesser og en mangel av alveolære bein tap, begrense deres bruk i studiet av PD. Sistnevnte abscess modeller er betydelig mer tilbøyelige til å studere bakteriell virulens, betennelser, og bein resorpsjon på steder utenfor munnhulen, som eliminerer evaluering av periodontium og muntlig mikrobiomet27,28,29,30,31.

Ved hjelp av ligatur-indusert modell av periodontitt, en flettet silke Sutur har ofte blitt installert circumferentially rundt andre molar. Som et alternativ, kan en enkelt lineær segment av Sutur materiale settes inn mellom første og andre jeksler32,33. Målet med ligatur plassering er å lette bakteriell akkumulering og generere dysbiosis innenfor gingival sulci, noe som resulterer i periodontal vev betennelser og ødeleggelse av vev komponere periodontium. Mest spesielt er denne modellen i stand til å produsere betydelig mer alveolære bein tap i forhold til de mer brukte muntlige gavage modell34. Videre kompliserer bruken av oral gavage modellen er den naturlige motstanden av flere stammer av mus (dvs. C57BL/6) til å utvikle alveolære bein tap. Denne er likeledes problematisk, idet denne belastning er de fleste hyppig anvendt inne murine-basert dyr forskning35.

Eksisterende prosedyrer beskrevet av Marchesan et al. og Abe og Hajishengallis ble utviklet for å forenkle den tekniske handlingen å plassere ligatur33,36. Dessverre krever den tidligere protokollen spesialisert 3D-trykt utstyr og har potensial for prematur ligatur tap, og dermed øke dyr bruk og kostnadene forbundet med ekstra tid brukt i operasjonsstuen. Videre genererer begge protokollene bare små områder av de syke periodontium som er tilgjengelige for en studie.

Fordelene som ligger med denne teknikken er jordet i samtidige studier av oral dysbiosis og immunologi som regulerer periodontium, utnyttelse av rimelige dyr med ulike genetiske bakgrunner, og enkle boliger og husdyrhold praksis. Som sådan bør mål være å maksimere volumer av syke vev og, i forsøk på å praktisere prinsippene for reduksjon i animalsk forskning, redusere animalsk forbruk til et nivå så lavt som mulig. Dette krever at alle dyr er i stand til å bli inkludert i eksperimentelle analyser37. Imidlertid bør det bemerkes at uansett hvilken dyremodell av periodontal sykdom er utnyttet, er det ingen enkelt modell som omfatter hvert element av menneskelig PD patofysiologi.

Denne nye protokollen sysselsetter plasseringen av en ligatur rundt flere maksillære molar tenner ved hjelp av instrumentering og materialer som finnes i de fleste laboratorier. Den innrømmer en nok beløpet av tid å lett og trygt installere en ligatur det er usannsynlig å avulse for tidlig. Til slutt, som PMN koordinere ødeleggelsen av periodontium i PD, en ny metodikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile på en måte som tilsvarer mennesker er også presentert.

Protocol

Alle murine studier overholdt de relevante etiske forskriftene og ble godkjent av University of Toronto Animal Care Committee og forskningsetikk styret (protokoll 20011930). 1. ligatur installasjon Merk: Dette er en ikke-steril kirurgisk prosedyre som kan utføres i et standard operasjonsteater. Bruk av bakteriefrie dyr (dekkes ikke her) mandater håndtering i et biosafety kabinett, bruk av sterile instrumenter, og inoculation av munnhulen med periodontal patogener å…

Representative Results

Representative Flow flowcytometri data fra Oral skylling prøver av en naiv (Figur 3a) og betent (Figur 3B) murine munnhulen sekundært til ligatur-indusert periodontitt er gitt. Gjenoppretting av PMN fra en installert ligatur er også demonstrert (Figur 3C). Flow flowcytometer kanal spenninger ble kalibrert manuelt, og kompensasjon ble utført med single-beiset kompensasjon perler….

Discussion

Den mest kritiske element knyttet til bruk av murine ligatur-indusert modell av periodontitt er sentrert rundt oppbevaring av ligatur til tidspunktet for offer eller tilsiktet fjerning. Den installerte biofilm-retentive-ligatur er i stand til å indusere et betydelig tap på alveolære Ben høyde på så lite som 6 dager, plateauing mellom 11 – 16 dagers perioden39. Beslutningen om å ofre dyr før maksimal periode med bein tap, gjengi dette en mye kortere modell av ligatur-indusert periodontitt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JW C. støttes av Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Forfatterne vil gjerne takke Dr. Chunxiang Søn for hennes hjelp i å utføre trypan blå farging.

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -. P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Play Video

Cite This Article
Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

View Video