Denne artikkelen presenterer en protokoll for å etablere en ligatur-indusert modell av murine periodontitt involverer flere maksillære jeksler, noe som resulterer i større områder av den involverte gingival vev og bein for senere analyse samt redusert dyre bruk. En teknikk for å vurdere muntlig nøytrofile på en måte analoge til menneskelige er også beskrevet.
De viktigste fordelene ved å studere patofysiologi av periodontal sykdom utnytte murine modeller er de reduserte kostnadene for dyr, rekke genmodifiserte stammer, det store antall analyser som kan utføres på høstet myke og harde vev. Men mange av disse systemene er gjenstand for prosessuelle kritikk. Som et alternativ, ligatur-indusert modell av periodontal sykdom, drevet av den lokaliserte utvikling og oppbevaring av en dysbiotic oral mikrobiomet, kan benyttes, som er raskt indusert og relativt pålitelig. Dessverre er variantene av ligatur-indusert murine periodontitt protokoll isolert til fokal områder av periodontium og utsatt for prematur avulsion av den installerte ligatur. Dette minimerer mengden av vev tilgjengelig for senere analyser og øker antall dyr som kreves for studier. Denne protokollen beskriver presise manipulasjoner som kreves for å plassere utvidet molar ligaturer med forbedret oppbevaring og bruk av en roman skylle teknikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile i mus med en alternativ tilnærming som begrenser de nevnte tekniske utfordringer.
Periodontal sykdom (PD) er en osteolytiske tilstand forbundet med betydelig vert sykelighet og økonomisk byrde, som er manifestert ved gingival betennelser og tap av både bløtvev vedlegg og fluorose støtte for de berørte tennene1,2,3,4. Denne prosessen styres av interaksjoner mellom det muntlige bakterieflora og medfødte immunsystemet til verten. Det er også forbundet med forverring av andre systemiske inflammatoriske sykdommer, inkludert diabetes, hjerte-og karsykdommer, og kreft5,6,7,8. Historisk var det hypotetisk gjennomsnitt at PD-patogenesen er avhengig av store mengder spesifikke bakterier som Porphyromonas gingivalis9. Men, tyder nyere bevis på at den mikrobielle komponenten av PD er formidlet av Dental biofilm. Den biofilm er en organisert, komplekst fellesskap av mange mikroorganismer som kan eksistere i sunne symbiotisk og destruktive dysbiotic stater10,11. Den muntlige biofilm normalt gir motstand til verten ved å hindre etablering av fokus på patogene bakterier og fremmer ideell gingival vev struktur og funksjon gjennom regulering av verten immunrespons12,13. Forstyrrelser av equilibrious forholdet mellom Commensal organismer i munnhulen og verts immunforsvaret kan føre til endringer i vev homeostase, noe som resulterer i dysbacteriosis og utvikling av Hallmark klinisk og radiografisk opptredener av PD5,10,12,13,14.
Interessant, etablering av en muntlig dysbacteriosis, mens nødvendig for initiering av PD, er ikke tilstrekkelig til å drive PD i alle individer, eluding mot evnen til verten immunforsvaret til å undergrave overgangen av bakterieflora mellom symbiotisk og dysbiotic stater15. Dette plasserer en bestemt søkelys på midlene der PD påvirker en av de ledende karakterene i det medfødte immunsystemet, nemlig polymorfonukleære granulocytt (PMN), eller nøytrofile, fra lokale og systemiske perspektiver16,17.
Hos mennesker, PMN er rekruttert fra sirkulasjonen med en hastighet på ~ 2 x 106 celler/h i sunne periodontal bindevev, hvor de er de predominating leukocytter befolkning. Her er de senere utvist fra gingival sulcus inn i munnhulen som en del av gingival crevicular væsken. I nærvær av PD, neutrophilia manifesterer innenfor sirkulasjon og munnhulen, hvor disse Effektor celler besitter en hyperinflammatory fenotype som fører til de nevnte ødeleggelsen av periodontium17,18,19,20,21,22. Derfor er forståelsen av rollen til PMN i PD og andre systemiske inflammatoriske tilstander av største betydning.
Selv om det er allment akseptert at kroniske sykdommer er gjensidig knyttet til PD, de underliggende mekanismene har ennå ikke belyst, bidra til vanskeligheter i forvaltningen av disse sykelig og potensielt fatale systemiske forhold. Mangfoldig eksperimentelle dyr modeller, hver med enestående fordeler og ulempen, ha blitt anvende å studere patofysiologi av PD23,24. Fokuserer spesielt på murine modeller, er det en rekke protokoller der studiet av PD er tilrettelagt; men de har flere tekniske og fysiologiske svakheter25,26,27,28,29,30,31.
For det første, det muntlig gavage musen modell behøver tallrik muntlig vaksiner av Human periodontal patogener å utvikle gingival betennelse og Ben forlis. I tillegg er det vanligvis innledes med en periode med antibiotika behandling for å undergrave den murine Commensal oral flora25. Denne modellen krever ofte spesialisert trening for å trygt utføre muntlige gavage, bruker bare en liten brøkdel av periodontal patogener fra de mer komplekse menneskelige muntlige mikrobiomet, og krever flere måneder å etablere alveolære bein tap.
I kontrast, kjemisk indusert murine modeller benytte muntlig levering av trinitrobenzene sulfonsyrer syre (TNBS) eller dextran sulfat natrium (DSS), agenter som vanligvis brukes i å etablere murine modeller av kolitt over en periode på flere måneder for å indusere periodontal bein tap26. Intraorale og extraoral abscess-baserte modeller er tilgjengelig, som involverer murine fortenner og vev av antecubital samt calvarium, henholdsvis. I den tidligere abscess modellen, flere injeksjoner av bakterier administreres, skape flere gingival abscesser og en mangel av alveolære bein tap, begrense deres bruk i studiet av PD. Sistnevnte abscess modeller er betydelig mer tilbøyelige til å studere bakteriell virulens, betennelser, og bein resorpsjon på steder utenfor munnhulen, som eliminerer evaluering av periodontium og muntlig mikrobiomet27,28,29,30,31.
Ved hjelp av ligatur-indusert modell av periodontitt, en flettet silke Sutur har ofte blitt installert circumferentially rundt andre molar. Som et alternativ, kan en enkelt lineær segment av Sutur materiale settes inn mellom første og andre jeksler32,33. Målet med ligatur plassering er å lette bakteriell akkumulering og generere dysbiosis innenfor gingival sulci, noe som resulterer i periodontal vev betennelser og ødeleggelse av vev komponere periodontium. Mest spesielt er denne modellen i stand til å produsere betydelig mer alveolære bein tap i forhold til de mer brukte muntlige gavage modell34. Videre kompliserer bruken av oral gavage modellen er den naturlige motstanden av flere stammer av mus (dvs. C57BL/6) til å utvikle alveolære bein tap. Denne er likeledes problematisk, idet denne belastning er de fleste hyppig anvendt inne murine-basert dyr forskning35.
Eksisterende prosedyrer beskrevet av Marchesan et al. og Abe og Hajishengallis ble utviklet for å forenkle den tekniske handlingen å plassere ligatur33,36. Dessverre krever den tidligere protokollen spesialisert 3D-trykt utstyr og har potensial for prematur ligatur tap, og dermed øke dyr bruk og kostnadene forbundet med ekstra tid brukt i operasjonsstuen. Videre genererer begge protokollene bare små områder av de syke periodontium som er tilgjengelige for en studie.
Fordelene som ligger med denne teknikken er jordet i samtidige studier av oral dysbiosis og immunologi som regulerer periodontium, utnyttelse av rimelige dyr med ulike genetiske bakgrunner, og enkle boliger og husdyrhold praksis. Som sådan bør mål være å maksimere volumer av syke vev og, i forsøk på å praktisere prinsippene for reduksjon i animalsk forskning, redusere animalsk forbruk til et nivå så lavt som mulig. Dette krever at alle dyr er i stand til å bli inkludert i eksperimentelle analyser37. Imidlertid bør det bemerkes at uansett hvilken dyremodell av periodontal sykdom er utnyttet, er det ingen enkelt modell som omfatter hvert element av menneskelig PD patofysiologi.
Denne nye protokollen sysselsetter plasseringen av en ligatur rundt flere maksillære molar tenner ved hjelp av instrumentering og materialer som finnes i de fleste laboratorier. Den innrømmer en nok beløpet av tid å lett og trygt installere en ligatur det er usannsynlig å avulse for tidlig. Til slutt, som PMN koordinere ødeleggelsen av periodontium i PD, en ny metodikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile på en måte som tilsvarer mennesker er også presentert.
Den mest kritiske element knyttet til bruk av murine ligatur-indusert modell av periodontitt er sentrert rundt oppbevaring av ligatur til tidspunktet for offer eller tilsiktet fjerning. Den installerte biofilm-retentive-ligatur er i stand til å indusere et betydelig tap på alveolære Ben høyde på så lite som 6 dager, plateauing mellom 11 – 16 dagers perioden39. Beslutningen om å ofre dyr før maksimal periode med bein tap, gjengi dette en mye kortere modell av ligatur-indusert periodontitt…
The authors have nothing to disclose.
JW C. støttes av Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Forfatterne vil gjerne takke Dr. Chunxiang Søn for hennes hjelp i å utføre trypan blå farging.
Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
LSRFortessa | BD | X-20 | |
Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Xylazine | Rompun | 20mg/mL |