Summary
Este artigo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo induzido por ligadura de periodontite murine envolvendo múltiplos molares maxilars, resultando em áreas maiores do tecido gingival envolvido e osso para análise posterior, bem como redução do uso animal. Uma técnica para avaliar neutrófilos orais de uma forma análoga aos seres humanos também é descrita.
Abstract
As principais vantagens do estudo da fisiopatologia da doença periodontal utilizando modelos de urina são o custo reduzido dos animais, a variedade de cepas geneticamente modificadas, o grande número de análises que podem ser realizadas em tecidos macios e duros colhidos. No entanto, muitos destes sistemas estão sujeitos a críticas processuais. Como alternativa, o modelo induzido pela ligadura da doença periodontal, impulsionado pelo desenvolvimento localizado e retenção de um microbioma oral disbiótico, pode ser empregado, o que é rapidamente induzido e relativamente confiável. Infelizmente, as variantes do protocolo de periodontite murine induzida por ligadura são isoladas para regiões focais do periodontium e sujeitas à avulsão prematura da ligadura instalada. Isso minimiza a quantidade de tecido disponível para análises subsequentes e aumenta o número de animais necessários para estudo. Este protocolo descreve as manipulações precisas necessárias para colocar ligaduras molar estendidas com melhor retenção e uso de uma nova técnica de lavagem para recuperar neutrófilos orais em camundongos com uma abordagem alternativa que atenua o referido desafios técnicos.
Introduction
A doença periodontal (DP) é uma condição osteolítica associada à morbidade hospedeira significativa e carga econômica, que se manifesta pela inflamação gingival e perda de apego de tecidos moles e suporte osseoso para a dentição afetada1,2,3,4. Este processo é regido por interações entre a microbiota oral e o sistema imunológico inato do hospedeiro. Também está associada à exacerbação de outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer5,6,7,8. Historicamente, foi a hipótese de que a patogênese pd é dependente de grandes quantidades de bactérias específicas, como Porphyromonas gingivalis9. No entanto, evidências recentes sugerem que o componente microbiano da DP é mediado pelo biofilme odontológico. O biofilme é uma comunidade organizada e complexa de inúmeros microrganismos que podem existir em estados disbióticos e disbióticos saudáveis10,11. O biofilme oral normalmente oferece resistência ao hospedeiro, impedindo o estabelecimento de focos de bactérias patogênicas e promove a estrutura e função ideal do tecido gingival através da regulação da resposta imune do hospedeiro12,13. Perturbações da relação equilibrious entre organismos comensal dentro da cavidade oral e do sistema imunológico hospedeiro podem levar a alterações na homeostase tecidual, resultando em disbacteriose e desenvolvimento das aparências clínicas e radiográficas de marca registrada de PD5,10,12,13,14.
Curiosamente, o estabelecimento de uma disbacteriose oral, embora necessária para o início da DP, não é suficiente para conduzir a DP em todos os indivíduos, iludindo-se para a capacidade da resposta imune do hospedeiro para subverter a transição da microbiota entre os estados simbióticos e disbióticos15. Isso coloca um foco particular sobre os meios através dos quais a DP influencia um dos personagens principais do sistema imunológico inato, ou seja, o granulocito polimorfóide (PMN), ou neutrófilo, a partir de perspectivas locais e sistêmicas16,17.
Em seres humanos, PMNs são recrutados a partir da circulação a uma taxa de ~ 2 x 106 células / h em tecidos conectivos periodontais saudáveis, onde são a população de leukócitos predomáveis. Aqui, eles são posteriormente expulsos do sulco gingival na cavidade oral como um componente do líquido crevicular gingival. Na presença de DP, a neufilia se manifesta dentro da circulação e da cavidade oral, onde essas células efetoras possuem um fenótipo hiperinflamatório que leva à destruição acima mencionada do periodontium17,18,19,20,21,22. Portanto, entender o papel das PMNs na DP e em outras condições inflamatórias sistêmicas é de extrema importância.
Embora seja amplamente aceito que as doenças crônicas estejam reciprocamente ligadas à DP, os mecanismos subjacentes ainda não foram elucidados, contribuindo para dificuldades na gestão dessas condições sistêmicas mórbidas e potencialmente fatais. Vários modelos animais experimentais, cada um com vantagens e desvantagens únicas, têm sido utilizados para estudar a fisiopatologia da DP23,24. Concentrando-se especificamente em modelos de urina, há uma variedade de protocolos através dos quais o estudo da DP é facilitado; no entanto, possuem várias deficiências técnicas e fisiométricas25,26,27,28,29,30,31.
Primeiro, o modelo oral do rato do gavage exige inoculations orais numerosos de micróbios patogénicos periodontais humanos para gerar a inflamação do gingival e a perda do osso. Além disso, é geralmente precedido por um período de tratamento antibiótico para subverter a flora oral murine commensal25. Este modelo muitas vezes requer treinamento especializado para realizar com segurança o gavage oral, usa apenas uma pequena fração de patógenos periodontais do microbioma oral humano mais complexo e requer vários meses para estabelecer a perda de ossos alveolares.
Em contraste, modelos de urina quimicamente induzida utilizam a entrega oral de ácido sulfonic trinitrobenzene (TNBS) ou sódio de sulfato dextran (DSS), agentes comumente usados no estabelecimento de modelos de colite murina durante um período de vários meses para induzir a perda de ossos periodontais26. Modelos à base de abscesso intraoral e extraoral estão disponíveis, que envolvem os incisivos e tecidos de urina do dorsum, bem como calvarium, respectivamente. No antigo modelo abscesso, várias injeções de bactérias são administradas, criando múltiplos abcessos gingival e uma escassez de perda óssea alveolar, limitando seu uso no estudo da DP. Os últimos modelos de abscesso são significativamente mais aptos a estudar a virulência bacteriana, inflamação e resorção óssea em locais fora da cavidade oral, o que elimina a avaliação do periodontium e microbioma oral27,28,29,30,31.
Usando o modelo de periodontite induzido por ligadura, uma sutura de seda trançada tem sido comumente instalada circunferentemente em torno do segundo molar. Como alternativa, um único segmento linear de material de sutura pode ser inserido entre o primeiro e o segundo molares32,33. O objetivo da colocação da ligadura é facilitar o acúmulo bacteriano e gerar disbiose dentro dos sulci de gingival, resultando na inflamação do tecido periodontal e na destruição dos tecidos que compõem o periodontium. Mais notavelmente, este modelo é capaz de produzir significativamente mais perda óssea alveolar em comparação com o modelo de gavage oral34mais comumente usado. Complicando ainda mais o uso do modelo de gavage oral é a resistência natural por várias cepas de camundongos (ou seja, C57BL/6) ao desenvolvimento de perda óssea alveolar. Isso também é problemático, pois esta cepa é a mais utilizada na pesquisa animal baseada em urina35.
Os procedimentos existentes descritos por Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis foram concebidos para simplificar o ato técnico de colocar a ligadura33,36. Infelizmente, o protocolo anterior requer equipamentos especializados impressos em 3D e possuem o potencial de perda de ligadura prematura, aumentando assim o uso de animais e os custos associados ao tempo adicional gasto na sala de cirurgia. Além disso, ambos os protocolos geram apenas pequenas regiões do periodontium doente disponíveis para um estudo.
As vantagens que se encontram com esta técnica baseiam-se no estudo simultâneo da disbiose oral e imunologia que regem o periodontium, utilização de animais de baixo custo com diversas origens genéticas e práticas simples de habitação e pecuária. Como tal, os objetivos devem ser maximizar os volumes de tecidos doentes e, na tentativa de praticar os princípios de redução da pesquisa animal, reduzir o consumo animal a um nível tão baixo quanto possível. Isso requer garantir que todos os animais sejam capazes de serem incluídos nas análises experimentais37. No entanto, deve-se notar que não importa qual modelo animal de doença periodontal é utilizado, não há um único modelo que abrange todos os elementos da fisiopatologia da DP humana.
Este novo protocolo emprega a colocação de uma ligadura em torno de vários dentes molar maxiares usando instrumentação e materiais que são encontrados na maioria dos laboratórios. Permite uma quantidade de tempo suficiente instalar facilmente e confiàvelmente uma ligadura que seja pouco susceptível de avulse prematuramente. Finalmente, à medida que as PMNs coordenam a destruição do periodontium em PD, também é apresentada uma nova metodologia para recuperar neutrófilos orais de forma análoga aos seres humanos.
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Protocol
Todos os estudos de urina cumpriram os regulamentos éticos relevantes e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de Toronto e pelo Research Ethics Board (Protocol 20011930).
1. Instalação da ligadura
NOTA: Este é um procedimento cirúrgico não-estéril que pode ser realizado em uma sala de cirurgia padrão. O uso de animais livres de germes (não cobertos aqui) exige o manuseio dentro de um armário de biossegurança, o uso de instrumentos estéreis e a inoculação da cavidade oral com patógenos periodontais para causar as manifestações clínicas de periodontite.
- Administrar anestesia intraperitoneal a camundongos C57BL/6 machos de 8 a 12 semanas de idade, que devem ser aclimatados em suas instalações habitacionais, usando uma agulha hipodérmica estéril de 0,5" 26 G e 1 mL seringa de acordo com as diretrizes do comitê de cuidados e uso de animais institucionais aprovados (IACUC).
NOTA: Uma combinação de cetamina (100 mg/kg) e xilamina (10 mg/kg) anestésicos de forma rápida e confiável induz o nível adequado de anestesia para a duração do procedimento. - Avalie a profundidade anestésica antes e a cada 15 min durante o procedimento, como evidenciado pela perda do reflexo do pedal.
- Posicione o mouse em uma plataforma cirúrgica aquecida(Figura 1A). Estabilizar a maxilo e mandíbula na posição aberta usando faixas elásticas e sustentar o pescoço com um rolo de algodão para ajudar a manter a maxilo em uma orientação mais horizontal (Figura 1B). Cubra o corpo e a cauda do animal para mitigar a perda de calor durante o procedimento.
- Posicione o microscópio cirúrgico na ampliação e iluminação desejadas (se não montadadiretamente ao microscópio) sobre a cavidade oral para visualização da dentição. Enquanto a ampliação desejada é dependente do operador, a visualização ideal da cavidade oral é obtida a 16x.
- Instale uma sutura de seda trançada 5-0 estéril em torno do primeiro (M1) e segundo (M2) molars maxiares dentro do sulco gingival usando fórceps dissidentes.
NOTA: As suturas trançadas da seda de um calibre menor podem ser usadas para esta finalidade facilitar uma instalação mais rápida e reduzir a possibilidade de dano macio iatrogenic do tecido.- Posicione a cauda distal da sutura no lado palatal da dentição e insira o segmento proximal entre o contato de M2 e M3(Figura 2A).
- Envolva a sutura em torno da superfície bucal de M2 e insira-a entre o contato de M1 e m2. Certifique-se de que ambas as extremidades da sutura são puxadas firmemente para conduzir a sutura no sulco gingival e remover toda a folga(Figura 2B).
- Envolva o segmento de sutura proximal em torno da M1, abaixo de sua altura de contorno, e insira-o entre o contato de M1 e M2. Puxe a cauda proximal da sutura firmemente para conduzir a sutura no sulco de gingival e remova toda a folga(figura 2C).
NOTA: Se a resistência é observada ao inserir a sutura entre M1 e M2 ou M2 e M3, o contato pode ser aberto ligeiramente usando um explorador dental padrão. - Amarre as extremidades da sutura com o nó de um cirurgião e aparar as caudas o mais curto possível. Coloque o nó na embrasure gingival entre M1 e M2 no lado palatal da dentição maxiária (Figura 2D).
NOTA: Os passos 1.4.1-1.4.4 podem ser repetidos no lado contralateral, se necessário. - Esterilizar os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador de contas de vidro quente entre cada sujeito animal.
CUIDADO: As pontas dos fórceps são extremamente afiadas e podem facilmente causar trauma oral e sangramento significativo. Prepare pequenos segmentos de gaze para remover o sangue da cavidade oral e aplicar pressão sobre feridas sangrando ativamente.
- Após a instalação da ligadura, retire o rato do aparelho cirúrgico, coloque em uma gaiola limpa uma lâmpada de calor e monitore até se recuperar completamente.
- Individualmente abrigar cada mouse com o enriquecimento ambiental adequado e permitir o acesso ad libitum à água filtrada e purê de comida padrão em um ambiente de temperatura e umidade controlada (12-h light/12-h ciclo escuro) por 7-11 dias.
NOTA: Purê de sopa diminui as forças necessárias para a masticação, reduzindo assim a dor associada à alimentação, e ajuda na prevenção da perda prematura da ligadura instalada.
2. Coleção de amostras
- Eutanásia ratos de acordo com as diretrizes aprovadas IACUC.
NOTA: A eutanásia individual usando uma câmara de CO2 seguida de deslocamento cervical é o método preferido para este protocolo. Isso pode ser alterado dependendo de experimentos que exigem a colheita de tecidos adicionais. - Usando uma pipeta, lave imediatamente a cavidade oral com 100 μL de soro soro soro esnito esterilizado 4 °C 1x tampão de fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio por 10 s.
- Repita o passo 2.2 2x e coloque cada enxaguar em um único tubo de ensaio estéril cônico de polipropileno mL.
- Transfira o conteúdo para um tubo de ensaio estéril de polipropileno cônico de 50 mL, executando-os através de um filtro de malha de nylon de 40 μm.
- Transfira esses conteúdos para um novo tubo de ensaio estéril de polipropileno cônico de 15 mL.
NOTA: A transferência final da amostra para um tubo menor permite a melhor visualização da pelota celular nas próximas etapas.- Se desejar, retire a ligadura molar (s) e coloque em 300 μL de 1x PBS esterilizado (4 °C, sem cálcio e magnésio) em um tubo de ensaio estéril de polipropileno cônico separado de 15 mL. Agita rasto suavemente e retire a sutura do tubo. Esta amostra é tratada de forma idêntica à amostra de lavagem oral a partir deste ponto em diante.
- Adicione 33,3 μL de 16% de paraformaldeído (PFA) para facilitar a fixação da amostra.
- Vortex as amostras imediatamente e incubar no gelo por 15 min.
- Encha o tubo a 15 mL com 1x PBS para diluir PFA, a seguir centrífuga em 1000 x g e 4 °C para 5 min.
- Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em 1 mL de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) tampão em 4 °C. Conte as células em um hemocytometer ou contador de células automatizada.
- Centrífuga a amostra novamente em 1000 RCF e 4 °C por 5 min.
- Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em um volume apropriado de buffer FACS para uma concentração final de 0,5-1,0 x 106 células/50 μL de buffer FACS.
3. Mancha de anticorpos para análise citométrica de fluxo
NOTA: Rotular e refrigerar todos os tubos FACS necessários antes de usar.
- Adicione 1 μL de soro de rato e 2 μL de anticorpo igg anti-mouse a 50 μL da amostra, vórtice imediatamente, e bloqueie o gelo por 20 min.
- Adicione os anticorpos apropriados a cada amostra, vórtice imediatamente, e incubar no gelo por 30 min no escuro.
NOTA: A seleção e os volumes de anticorpos dependem de experimentos piloto de otimização prévia adaptados a esta técnica específica. - Lave amostras com 1 mL de tampão FACS, vórtice brevemente e centrífuga por 5 min a 1000 x g e 4 °C. Repita este passo 2x.
- Resuspenda amostras em 250 μL de tampão FACS, cubra tubos com filme de parafina, envolva em folha de alumínio e segure em 4 °C até a análise.
NOTA: É ideal analisar amostras dentro de horas de completar o protocolo devido à perda de sinal fluorescente durante longos períodos de armazenamento. No entanto, as amostras podem ser analisadas 2-3 dias depois, se absolutamente necessário.
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Representative Results
Dados representativos de citometria de fluxo de amostras de lavagem oral de uma ingênua(Figura 3A)e inflamado(Figura 3B) murine cavidade oral secundária à periodontite induzida pela ligadura são fornecidos. A recuperação de PMNs de uma ligadura instalada também é demonstrada(Figura 3C). As tensões do canal do cytometer do fluxo foram calibradas manualmente, e a compensação foi executada com grânulos single-stained da compensação. Pmns foram definidos como Ly6G+veF4/80-ve usando a estratégia de gating delineado38. Um mínimo de 500 eventos de PMN fechados foram adquiridos de cada enxaguadura oral e amostra de ligadura. A viabilidade do PMN foi determinada para ser aproximadamente 37% pela coloração azul do trypan. Imagens representativas de níveis ósseos alveolares medidos a partir da crista óssea alveolar (ABC) para a junção cementoenamel (CEJ) para ratos saudáveis(Figura 4A)e camundongos em liga(Figura 4B). São fornecidas as diferenças relativas entre essas medições(Figura 4C).
Figura 1: Posicionamento animal para a ligadura molar. (A) O acesso à cavidade oral é conseguido mantendo a mandíbula em uma posição deprimida, colocando tração leve na dentição incisiva maxilo e mandibular. (B) Gaze é colocada o crânio para evitar o movimento da cabeça e para colocar a maxilálica em uma posição relativamente horizontal. O corpo e a cauda são cobertos para evitar a perda de calor antes de mover o estágio cirúrgico o microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Fotografia sequencial da instalação da ligadura. (A) A cauda distal da sutura é posicionada no lado palatal da dentição, e o segmento proximal é inserido entre o contato de M2 e M3. (B) A sutura é então enrolada em torno da superfície bucal de M2, em seguida, inserido entre o contato de M1 e M2. (C)O segmento de sutura proximal é enrolado em torno de M1 abaixo de sua altura de contorno, em seguida, inserido entre o contato de M1 e M2. (D)As extremidades da sutura são amarradas com o nó de um cirurgião e aparadas o mais próximo possível do nó. O nó é colocado na embrasure gingival entre M1 e M2 no lado palatal da dentição maxiária. Todas as fotografias foram adquiridas em maxilo dissecado para a gravação de etapas processuais com uma visão desobstruída da dentição molar. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Parcelas representativas da FACS e estratégia de fabricação demonstrando presença oral de neutrófilos. Os neutrófilos foram recuperados das seguintes amostras e avaliados pela citometria do fluxo: (A)enxaguamento oral de um rato ingênuo,(B)enxaguamento oral, e(C)recuperou ligaduras de um rato com periodontite induzida por ligadura (bilateralmente). As tramas de dispersão de estratégia representativas são mostradas. Singlets (SSC-H x SSC-W e FSC-H x FSC-W) e neutrófilos (Ly6G+ve/F480-ve) foram fechados como mostrado. Os valores numéricos refletem a porcentagem de células dentro de cada portão. SSC-A = área lateral da dispersão; SSC-W = largura lateral da dispersão; SSC-H = altura lateral da dispersão; FSC-A = área de dispersão para a frente; FSC-W = largura de dispersão para a frente; FSC-H = altura de dispersão para a frente. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Diferenças de perda óssea alveolar entre controle e animais em liga. Fotos representativas demonstrando diferenças na perda óssea alveolar entre (A)controle e (B)camundongos em liga. (C) Medições da junção cementoenamel (CEJ) para crista óssea alveolar (ABC), juntamente com os ângulos de linha mesiopalatal e distopalatal de M1 e M2, são mostradas (média ± SEM, n = 3). Os valores P foram determinados pela ANOVA bipartida com um teste de LSD pós-hoc de Fisher. (*p< 0,01; **p < 0,001; ***p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O elemento mais crítico associado ao uso do modelo de periodontite induzido pela ligadura murine é centrado em torno da retenção da ligadura até o momento do sacrifício ou remoção intencional. A ligadura biofilme-retentive instalada é capaz de induzir uma perda significativa de altura alveolar do osso em tão poucos quanto 6 dias, platô entre o período de 11-16 dias39. A decisão de sacrificar indivíduos animais antes do período máximo de perda óssea, tornando este um modelo muito mais curto de periodontite induzida por ligadura, foi selecionada para reduzir ainda mais a incidência de avulsão de ligadura prematura, definida como a perda da ligadura antes do tempo de sacrifício, o que torna o animal não diagnóstico.
A desvantagem mais citada deste modelo destaca a dificuldade técnica percebida de instalar a ligadura devido às dimensões minúsculas da dentição molar de urina, que variam em circunferência de 4,4 mm (M1) a 2,6 mm (M3)40. Esta questão pode ser atenuada através do envolvimento de pessoal cirúrgico/ estagiários para instalação de ligadura, que requer (no máximo) 10 min /animal e inclui a entrega de anestesia. Além disso, a colocação da ligadura é uma habilidade dominada pela repetição, e não é mais intensa do que muitas técnicas comuns baseadas em laboratório que exigem um elevado grau de destreza manual. Do ponto de vista processual, o uso de anestesia intraperitoneal proporciona um tempo extenso para facilitar a instalação da ligadura. Se necessário, também permite a substituição de quaisquer ligaduras que não sejam instaladas de forma satisfatória, pois a localização da sutura ao sulco gingival e nó entre o contato de M1 e M2 é ideal para retenção.
As modificações propostas desses protocolos, que exigem uma única ligadura de 1) de um único molar utilizando uma sutura circunferente ou 2) um único segmento linear de sutura colocado entre um único contato da dentição molar, proporciona várias vantagens. Do ponto de vista técnico, o protocolo utiliza equipamentos que estão prontamente disponíveis ou podem ser construídos a partir de equipamentos pré-existentes de forma semelhante a Abe e Hajishengallis. Isso evita a necessidade de pedidos especiais ou fabricação de equipamentos por impressão3D 33. A instalação de um estilingue contínuo da sutura de seda em torno dos dentes múltiplos fixados com nó de um cirurgião que não pode ser perturbado pela lingüeta pode igualmente melhorar a retenção da ligadura.
Durante o curso deste protocolo, em comparação com a técnica proposta por Marchesan et al. em que as perdas de até 20% são antecipadas, houve uma completa ausência de avulsão ligadura prematura36. Enquanto a incidência de perda de ligadura não foi avaliada diretamente por Abe e Hajishengallis, a técnica tem sido aplicada em vários estudos41,42,43,44. Do ponto de vista técnico, danos iagênicos nos tecidos moles foram evitados em animais em liga. Os fatores que contribuem para esse fenômeno incluem uma observação contínua da cavidade oral através de um microscópio, visualização constante das pontas dos fórceps e uso de fórceps limpos para evitar escorregar da sutura durante a colocação.
Dentro da cavidade oral, os segmentos alongados de material de sutura também aumentam drasticamente a quantidade de tecido doente disponível para análise e podem resultar em uma diminuição acentuada no uso de animais. Isso ocorre porque todos os sujeitos são capazes de ser incluídos na análise, e o agrupamento de amostras de tecido e lavagem não é necessário. Note-se que é possível ligar a dentição molar maxiária contralateral utilizando as técnicas previamente relatadas para aumentar a área de tecido afetada41. No entanto, esta modificação não é possível nos casos em que é necessário um desenho de boca dividida, dando apoio para a aplicação deste novo protocolo. Finalmente, semelhante aos protocolos de periodontite induzidos por ligadura anteriores, o uso dessa técnica não se limita a 8-12 ratos C57BL/6 machos com semana de idade. Camundongos de idade avançada, seja sexo, e várias origens genéticas podem ser aceitáveis, dependendo do design experimental.
Infelizmente, este modelo ainda possui algumas falhas técnicas e metodológicas. O uso de camundongos específicos sem patógenos, conforme detalhado acima, não pode imitar a progressão da periodontite humana. Isto é devido a várias diferenças entre a composição de seus biofilmes orais comensal, o que limita a validade externa da avaliação de bactérias-bactérias e bactérias-host interações45. Isto pode teoricamente ser mitigado através do uso de camundongos livres de germes, o que complica significativamente o protocolo. Esforços e recursos adicionais são necessários para garantir que os indivíduos animais permaneçam livres de germes durante a habitação e manipulação cirúrgica. Outras medidas também devem ser instituídas para desenvolver periodontite, uma vez que esses camundongos são resistentes à dP induzida pela ligadura na ausência de acúmulo bacteriano46,47.
Além disso, os modelos de monoinfecção e coinfecção de ligadura ficam aquém da recapitulação da condição humana, pois a doença periodontal representa uma interação polimicrobiana mais complexa entre o biofilme e o sistema imunológico hospedeiro. Nestas circunstâncias, elucidar os papéis de, e as interações entre um número limitado de bactérias orais humanas podem ser consideradas deficientes e potencial disadvantageous, especial no contexto da imunobiologia do periodontium de estudo.
Finalmente, evidências recentes implicaram que as forças da masticação são capazes de modificar a imunovigilância gingival através do acúmulo de t ajudante 17 células, um mediador integral de imunidade barreira48. Como tal, o uso de uma dieta macia, especialmente em animais mais velhos, pode agir como um potencial confundidor. Isso pode reduzir o potencial para a perda fisiométrica normal óssea em regiões onde ligaduras foram aplicadas. À luz desta evidência, deve ser dada uma análise cuidadosa ao uso de animais idosos e aos controles adequados combinados pela idade, onde esses achados foram observados como sendo mais proeminentes.
O uso deste modelo relativamente simples pode ser estendido à avaliação da perda alveolar óssea por tomografia microcomputadorizada, análises histológicas do osso alveolar e da gingiva anexada ao entorno, e à realização da caracterização oral de microbiota, que foram realizadas com os modelos pd induzidos pela ligadura existentes33,49. Embora raramente discutido ou utilizado, também é viável avaliar os efeitos do tratamento, (bem como a reparação e regeneração do periodontium) no cenário de periodontite murine induzida por ligadura, removendo a ligadura anestesia geral com fórceps dissidentes de ponto fino39. Por fim, o uso desse modelo pode ser estendido ao estudo dos efeitos sistêmicos da doença periodontal devido ao aumento da carga inflamatória causada pela ligadura de mais de um dente, bem como a dentição molar maxiária esquerda e direita, se desejar.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
J. W. C. é apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Chunxiang Sun por sua ajuda na realização da coloração azul trypan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
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