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Immunology and Infection

ओरल न्यूट्रोफिल्स के मूल्यांकन के लिए मोनी पेरिन पीरियोडोंटाइटिस का मजबूत लिगेचर-प्रेरित मॉडल

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/59667
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Faculty of Dentistry, University of Toronto

Summary

यह लेख कई मैक्सिलरी मोलर्स को शामिल करते हुए क्यूरीन पीरियोडोंटाइटिस के लिगेचर-प्रेरित मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसके परिणामस्वरूप बाद के विश्लेषण के साथ-साथ कम पशु उपयोग के लिए शामिल गिंगिवल ऊतक और हड्डी के बड़े क्षेत्र होते हैं। मानव विषयों के अनुरूप तरीके से मौखिक न्यूट्रोफिल का आकलन करने की तकनीक का भी वर्णन किया गया है।

Abstract

मूत्र मॉडल का उपयोग करते हुए पीरियोडोन्टल रोग के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के मुख्य फायदे जानवरों की कम लागत, आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की सरणी, काटे गए नरम और कठोर ऊतकों पर किए जा सकने वाले विश्लेषणों की विशाल संख्या है। हालांकि, इनमें से कई प्रणालियां प्रक्रियात्मक आलोचनाओं के अधीन हैं । एक विकल्प के रूप में, स्थानीयकृत विकास और डिस्बायोटिक ओरल माइक्रोबायोम की अवधारण से प्रेरित पीरियोडोन्टल रोग के लिगेचर-प्रेरित मॉडल को नियोजित किया जा सकता है, जो तेजी से प्रेरित और अपेक्षाकृत विश्वसनीय है। दुर्भाग्य से, लिगेचर-प्रेरित मेरिन पीरियोडोंटाइटिस प्रोटोकॉल के वेरिएंट को पीरियोडोंटियम के केंद्र क्षेत्रों में अलग-थलग कर दिया जाता है और स्थापित लिगेचर के समय से पहले आक्षेप के अधीन होता है। यह बाद के विश्लेषणों के लिए उपलब्ध ऊतकों की मात्रा को कम करता है और अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को बढ़ाता है । यह प्रोटोकॉल चूहों में मौखिक न्यूट्रोफिल को ठीक करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के साथ मौखिक न्यूट्रोफिल को ठीक करने के लिए बेहतर प्रतिधारण और एक उपन्यास कुल्ला तकनीक के उपयोग के साथ विस्तारित मोलर लिगेचर रखने के लिए आवश्यक सटीक जोड़तोड़ का वर्णन करता है जो उपरोक्त को कम करता है तकनीकी चुनौतियां।

Introduction

पीरियोडोन्टल रोग (पीडी) एक ऑस्टियोलिटिक स्थिति है जो महत्वपूर्ण मेजबान रुग्णता और आर्थिक बोझ से जुड़ी है, जो प्रभावित दंत चिकित्सा1,2,3,4के लिए नरम ऊतक लगाव और ओसियस समर्थन दोनों की सूजन और हानि से प्रकट होती है। यह प्रक्रिया मेजबान के मौखिक माइक्रोबायोटा और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत द्वारा नियंत्रित होती है। यह मधुमेह, हृदय रोग, और कैंसर5,6,7,8सहित अन्य प्रणालीगत भड़काऊ रोगों के तीव्र के साथ भी जुड़ा हुआ है । ऐतिहासिक रूप से, यह परिकल्पना की गई थी कि पीडी रोगजनकता बड़ी मात्रा में विशिष्ट बैक्टीरिया जैसे पोर्फिरोनास गिंगिवलिस9पर निर्भर है। हालांकि, हाल के सबूतों से पता चलता है कि पीडी के माइक्रोबियल घटक दंत जैव फिल्म द्वारा मध्यस्थता की जाती है। बायोफिल्म कई सूक्ष्मजीवों का एक संगठित, जटिल समुदाय है जो स्वस्थ सहजीवी और विनाशकारी डिस्बायोटिक राज्यों10,11में मौजूद हो सकता है। मौखिक बायोफिल्म सामान्य रूप से रोगजनक बैक्टीरिया के फोसी की स्थापना को रोककर मेजबान के प्रति प्रतिरोध करती है और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया12,13के विनियमन के माध्यम से आदर्श गिंगिवल ऊतक संरचना और कार्य को बढ़ावा देती है । मौखिक गुहा और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर कॉममेंसल जीवों के बीच समतुल्य संबंध के क्षोभ ऊतक होम्योस्टेसिस में परिवर्तन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप पीडी5,10,12,13,14की हॉलमार्क नैदानिक और रेडियोग्राफिक छपने का डाइबेस्टेरियोसिस और विकास हो सकता है।

दिलचस्प बात यह है कि पीडी की दीक्षा के लिए आवश्यक मौखिक डिस्बैकेरियोसिस की स्थापना सभी व्यक्तियों में पीडी को चलाने के लिए पर्याप्त नहीं है, जो सहजीवी और डिस्बायोटिक राज्यों15के बीच माइक्रोबायोटा के संक्रमण को विकृत करने के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की क्षमता की ओर आक्षेप है। यह उन साधनों पर एक विशेष स्पॉटलाइट रखता है जिनके माध्यम से पीडी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के अग्रणी पात्रों में से एक को प्रभावित करता है, अर्थात् बहुरूपपरमाणु कणिका (पीएमएन), या न्यूट्रोफिल, स्थानीय और प्रणालीगत दृष्टिकोण16,17से।

मनुष्यों में, पीएमएनएस को स्वस्थ पीरियोडोन्टल संयोजी ऊतकों में ~ 2 x 106 कोशिकाओं/एच की दर से परिसंचरण से भर्ती किया जाता है, जहां वे पूर्वहावी ल्यूकोसाइट आबादी हैं। यहां, उन्हें बाद में गिंगवाल क्वीकुलर तरल पदार्थ के घटक के रूप में मौखिक गुहा में गिंगवाल सल्कस से निष्कासित कर दिया जाता है। पीडी की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिलिया परिसंचरण और मौखिक गुहा के भीतर प्रकट होता है, जहां इन प्रभावक कोशिकाओं में एक अतिभड़काऊ फेनोटाइप होता है जो पीरियोडोंटियम17,18,19,20, 21,22के उपर्युक्त विनाश की ओर जाता है। इसलिए पीडी और अन्य प्रणालीगत भड़काऊ परिस्थितियों में पीएमएनएस की भूमिका को समझना अत्यंत महत्वपूर्ण है ।

हालांकि यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि पुराने रोगों पारस्परिक रूप से पीडी से जुड़े हुए हैं, अंतर्निहित तंत्र अभी तक स्पष्ट किया जाना है, इन रुग्ण और संभावित घातक प्रणालीगत स्थितियों के प्रबंधन में कठिनाइयों के लिए योगदान । कई प्रयोगात्मक पशु मॉडल, प्रत्येक अद्वितीय लाभ और नुकसान के साथ, पीडी23,24के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है । विशेष रूप से मूत्र मॉडल पर ध्यान केंद्रित करते हुए, विभिन्न प्रकार के प्रोटोकॉल हैं जिनके माध्यम से पीडी के अध्ययन को सुविधाजनक बनाया जाता है; हालांकि, उनके पास कई तकनीकी और शारीरिक कमियां25,26,27,28,29,30,31हैं .

सबसे पहले, मौखिक गावज माउस मॉडल को जिंगिवल सूजन और हड्डी हानि उत्पन्न करने के लिए मानव पीरियोडोन्टल रोगजनकों के कई मौखिक टीका की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यह आम तौर पर एंटीबायोटिक उपचार की अवधि से पहले है जो मूत्र कॉमेसल मौखिक वनस्पति25को विकृत करता है। इस मॉडल को अक्सर मौखिक गावज को सुरक्षित रूप से करने के लिए विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, अधिक जटिल मानव मौखिक माइक्रोबायोम से पीरियोडोन्टल रोगजनकों के केवल एक छोटे से अंश का उपयोग करता है, और अल्वेलर हड्डी हानि स्थापित करने के लिए कई महीनों की आवश्यकता होती है।

इसके विपरीत, रासायनिक रूप से प्रेरित मूत्र मॉडल त्रिमूर्तिरोबेंजीन सल्फोनिक एसिड (टीएनबी) या डीएक्सटन सल्फेट सोडियम (डीएसएस) के मौखिक वितरण का उपयोग करते हैं, जो आमतौर पर कई महीनों की अवधि में कोलाइटिस के मूत्र मॉडल स्थापित करने में उपयोग किए जाने वाले एजेंट ों को पीरियोडोन्टल बोन लॉस26को प्रेरित करने के लिए प्रेरित किया जाता है। इंट्राओरल और एक्साटोरल फोड़ा-आधारित मॉडल उपलब्ध हैं, जिनमें क्रमशः डोरसम के साथ-साथ कैल्वरियम के मिमूत्र चीरों और ऊतकों को शामिल किया गया है। पूर्व फोड़ा मॉडल में, बैक्टीरिया के कई इंजेक्शन प्रशासित किए जाते हैं, जिससे कई गिंगिवल फोड़े जाते हैं और अल्वेलर हड्डी हानि की कमी होती है, जो पीडी के अध्ययन में उनके उपयोग को सीमित करती है। बाद फोड़ा मॉडल मौखिक गुहा के बाहर साइटों पर बैक्टीरियल उग्रता, सूजन और हड्डी अवशोषण का अध्ययन करने के लिए काफी अधिक उपयुक्त हैं, जो पीरियोडोंटियम और मौखिक माइक्रोबायोम27,28,29,30, 31के मूल्यांकन को समाप्त करता है।

पीरियोपोंटिस के लिगेचर-प्रेरित मॉडल का उपयोग करके, एक लट रेशम सीवन आमतौर पर दूसरे मोलर के चारों ओर परिधि में स्थापित किया गया है। विकल्प के रूप में, सीवन सामग्री का एक रैखिक खंड32,33के बीच डाला जा सकता है। लिगेचर प्लेसमेंट का लक्ष्य बैक्टीरियल संचय को सुविधाजनक बनाना और गिंगिवल सल्सी के भीतर डिस्बायोसिस उत्पन्न करना है, जिसके परिणामस्वरूप पीरियोडोन्टल ऊतक सूजन और पीरियोडोंटियम की रचना करने वाले ऊतकों का विनाश होता है। सबसे विशेष रूप से, यह मॉडल अधिक सामान्यरूप से उपयोग किए जाने वाले मौखिक गाव मॉडल34की तुलना में काफी अधिक अल्वेलर हड्डी हानि का उत्पादन करने में सक्षम है। इसके अलावा मौखिक gavage मॉडल के उपयोग उलझी चूहों के कई उपभेदों द्वारा प्राकृतिक प्रतिरोध है (यानी, C57BL/6) alveolar हड्डी हानि विकसित करने के लिए । यह भी समस्याग्रस्त है, क्योंकि यह तनाव सबसे अधिक बार मूत्र आधारित पशु अनुसंधान३५में इस्तेमाल किया जाता है ।

मार्चेशन एट अल और आबे और हाजीशेंगलिस द्वारा वर्णित मौजूदा प्रक्रियाओं को लिगेचर33,36रखने के तकनीकी कार्य को सरल बनाने के लिए तैयार किया गया था। दुर्भाग्य से, पूर्व प्रोटोकॉल विशेष 3 डी मुद्रित उपकरणकी आवश्यकता है और समय से पहले लिगेचर हानि के लिए क्षमता के अधिकारी, जिससे पशु उपयोग में वृद्धि और अतिरिक्त ऑपरेटिंग कमरे में बिताए समय के साथ जुड़े लागत । इसके अलावा, दोनों प्रोटोकॉल एक अध्ययन के लिए उपलब्ध रोगग्रस्त अवधि के केवल छोटे क्षेत्रों को उत्पन्न करते हैं।

इस तकनीक के साथ झूठ बोलने वाले फायदे मौखिक डिस्बायोसिस और इम्यूनोलॉजी के एक साथ अध्ययन में आधारित हैं जो पीरियोडोंटियम को नियंत्रित करते हैं, विविध आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले कम लागत वाले जानवरों का उपयोग करते हैं, और सरल आवास और पशुपालन प्रथाओं। इस प्रकार, लक्ष्य रोगग्रस्त ऊतकों की मात्रा को अधिकतम करने के लिए होना चाहिए और पशु अनुसंधान में कमी के सिद्धांतों का अभ्यास करने के प्रयासों में, पशुओं की खपत को यथासंभव कम स्तर तक कम करना चाहिए । इसके लिए यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि सभी पशु प्रायोगिकविश्लेषणोंमें शामिल होने में सक्षम हों । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोई फर्क नहीं पड़ता कि पीरियोडोन्टल रोग के किस पशु मॉडल का उपयोग किया जाता है, कोई भी मॉडल नहीं है जिसमें मानव पीडी पैथोफिजियोलॉजी के हर तत्व शामिल हैं।

यह नया प्रोटोकॉल अधिकांश प्रयोगशालाओं के भीतर पाए जाने वाले इंस्ट्रूमेंटेशन और सामग्रियों का उपयोग करके कई मैक्सिलरी मोलर दांतों के चारों ओर एक लिगेचर की नियुक्ति को नियोजित करता है। यह आसानी से और आत्मविश्वास से एक लिगाचर स्थापित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है जो समय से पहले avulse की संभावना नहीं है। अंत में, जैसा कि पीएमएनएस पीडी में पीरियोडोंटियम के विनाश का समन्वय करता है, मनुष्यों के अनुरूप मौखिक न्यूट्रोफिल को ठीक करने के लिए एक उपन्यास पद्धति भी प्रस्तुत की जाती है।

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Protocol

सभी murine अध्ययन प्रासंगिक नैतिक नियमों का पालन किया और टोरंटो पशु देखभाल समिति और अनुसंधान नैतिकता बोर्ड (प्रोटोकॉल २००११९३०) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. लिगेचर इंस्टॉलेशन

नोट: यह एक गैर-बाँझ शल्य चिकित्सा प्रक्रिया है जिसे मानक ऑपरेटिंग थिएटर में किया जा सकता है। रोगाणु मुक्त जानवरों का उपयोग (यहां कवर नहीं) एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर हैंडलिंग, बाँझ उपकरणों का उपयोग, और पीरियोडोन्टल रोगजनकों के साथ मौखिक गुहा के टीका को पीरियोडोंटाइटिस के नैदानिक अभिव्यक्तियों का कारण बनने के लिए अधिदेशित करता है।

  1. 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों, जो उनके आवास की सुविधा के लिए आदत होनी चाहिए करने के लिए इंट्रापेरिटोनियल संज्ञाहरण प्रशासन, एक ०.५ "26 जी बाँझ हाइपोडर्मिक सुई और 1 mL सिरिंज का उपयोग कर अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) दिशा निर्देशों के अनुसार ।
    नोट: केटामाइन (१०० मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) एनेस्थेटिक्स का एक संयोजन तेजी से और मज़बूती से प्रक्रिया की अवधि के लिए संज्ञाहरण के उचित स्तर को प्रेरित करता है ।
  2. पेडल पलटा के नुकसान का सबूत के रूप में प्रक्रिया के दौरान पहले और हर 15 मिन से पहले संवेदनाहारी गहराई का आकलन करें।
  3. माउस को गर्म सर्जिकल प्लेटफॉर्म(चित्रा 1ए)पर रखें। लोचदार बैंड का उपयोग करके खुली स्थिति में मैक्सिला और मंडीबल को स्थिर करें और गर्दन को अधिक क्षैतिज अभिविन्यास(चित्रा 1बी)में अधिकतमा बनाए रखने में मदद करने के लिए एक कपास रोल के साथ सहारा दें। प्रक्रिया के दौरान गर्मी की हानि को कम करने के लिए जानवर के शरीर और पूंछ को कवर करें।
  4. दंत चिकित्सा के दृश्य के लिए मौखिक गुहा पर वांछित आवर्धन और प्रकाश व्यवस्था (यदि सीधे माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार नहीं है) पर सर्जिकल माइक्रोस्कोप की स्थिति। जबकि वांछित आवर्धन ऑपरेटर-निर्भर है, मौखिक गुहा का इष्टतम दृश्य 16x पर प्राप्त किया जाता है।
  5. किरच संदंश का उपयोग करके गिंगिवल सल्कस के भीतर पहले (एम 1) और दूसरे (एम 2) मैक्सिलरी मोलर्स के चारों ओर एक बाँझ 5-0 लट रेशम सीवन स्थापित करें।
    नोट: एक छोटे गेज के लट रेशम टांके तेजी से स्थापना की सुविधा और iatrogenic नरम ऊतक क्षति की संभावना को कम करने के लिए इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. दंत चिकित्सा के पाताल पक्ष पर सीवन की डिस्टल पूंछ की स्थिति और M2 और M3(चित्रा 2ए)के संपर्क के बीच समीपस्थ खंड डालें ।
    2. एम 2 की बुकल सतह के चारों ओर सीवन लपेटें और इसे M1 और M2 के संपर्क के बीच डालें। सुनिश्चित करें कि सीवन के दोनों सिरों को कसकर खींच लिया जाता है ताकि सीवन को गिंगिवल सल्कस में चलाया जा सके और सभी सुस्त(चित्रा 2बी)को हटा दिया जा सके।
    3. समोच्च की अपनी ऊंचाई से नीचे, M1 के आसपास समीपस्थ सीवन खंड लपेटें, और इसे M1 और M2 के संपर्क के बीच डालें। सीवन की समीपस्थ पूंछ को कसकर खींचो ताकि सीवन को गिंगिवल सल्कस में चलाया जा और सभी सुस्त(चित्रा 2सी)को हटा दिया जा ।
      नोट: यदि M1 और M2 या M2 और M3 के बीच सीवन डालने के दौरान प्रतिरोध देखा जाता है, तो संपर्क एक मानक दंत एक्सप्लोरर का उपयोग करके थोड़ा खुला हो सकता है।
    4. एक सर्जन की गाँठ के साथ सीवन के सिरों टाई और संभव के रूप में कम के रूप में पूंछ ट्रिम । मैक्सिलरी डैंटिएंटन(चित्रा 2डी)के पाताल पक्ष पर M1 और M2 के बीच gingival एम्ब्रेयर में गाँठ रखें ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो चरण 1.4.1-1.4.4 कॉन्ट्रालेटरल पक्ष पर दोहराया जा सकता है।
    5. प्रत्येक पशु विषय के बीच एक गर्म ग्लास बीड स्टरलाइजर में शल्य चिकित्सा उपकरणों को स्टरलाइज करें।
      सावधानी: संदंश के सुझाव बेहद तेज होते हैं और आसानी से मौखिक आघात और महत्वपूर्ण रक्तस्राव का कारण बन सकते हैं। मौखिक गुहा से रक्त को हटाने के लिए धुंध के छोटे खंडों को तैयार करें और सक्रिय रूप से रक्तस्राव घावों पर दबाव लागू करें।
  6. लिगेचर इंस्टॉलेशन के बाद, माउस को सर्जिकल उपकरण से हटा दें, एक हीट लैंप के नीचे एक साफ पिंजरे में रखें और पूरी तरह से बरामद होने तक मॉनिटर करें।
  7. व्यक्तिगत रूप से उपयुक्त पर्यावरण संवर्धन के साथ प्रत्येक माउस घर और एक तापमान में फ़िल्टर पानी और मसला हुआ मानक चाउ के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग की अनुमति-और आर्द्रता नियंत्रित वातावरण (12-h प्रकाश/12-h अंधेरे चक्र) 7-11 दिनों के लिए ।
    नोट: मैश किए हुए चाउ मैस्टिकेशन के लिए आवश्यक बलों को कम कर देता है जिससे भोजन से जुड़े दर्द को कम किया जाता है, और स्थापित लिगेचर के समय से पहले नुकसान को रोकने में एड्स होता है।

2. नमूना संग्रह

  1. अनुमोदित आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: सर्वाइकल अव्यवस्था के बाद एक सीओ2 चैंबर का उपयोग करके व्यक्तिगत इच्छामृत्यु इस प्रोटोकॉल के लिए पसंदीदा तरीका है। अतिरिक्त ऊतकों की कटाई की आवश्यकता वाले प्रयोगों के आधार पर इसे बदला जा सकता है।
  2. एक पिपेट का उपयोग करके, तुरंत 10 एस के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना बंध्याकरण 4 डिग्री सेल्सियस 1x फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के 100 माइक्रोन के साथ मौखिक गुहा को कुल्ला करें।
  3. चरण 2.2 2x दोहराएं और प्रत्येक कुल्ला को एक 15 mL शंकुपॉलीप्रोपाइलीन बाँझ परीक्षण ट्यूब में रखें।
  4. सामग्री को 40 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से चलाकर 50 मीटर शंकुपॉलीप्रोपाइलीन बाँझ परीक्षण ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  5. इन सामग्रियों को एक नए 15 mL शंकुपॉलीप्रोपाइलीन बाँझ परीक्षण ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: एक छोटी ट्यूब के लिए नमूना के अंतिम हस्तांतरण आगामी चरणों में सेलुलर गोली के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है ।
    1. यदि वांछित हो, तो मोलर लिगेचर (एस) को हटा दें और एक अलग 15 एमएल शंकुीय पॉलीप्रोपाइलीन बाँझ परीक्षण ट्यूब में 1x पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) के 300 माइक्रोन में रखें। धीरे-धीरे उत्तेजित करें और ट्यूब से सीवन हटा दें। इस नमूने को आगे इस बिंदु से मौखिक कुल्ला नमूने के समान इलाज किया जाता है।
  6. नमूना निर्धारण की सुविधा के लिए 16% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 33.3 माइक्रोन जोड़ें।
  7. भंवर नमूने तुरंत और 15 min के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट ।
  8. पीएफए को पतला करने के लिए 1x पीबीएस के साथ ट्यूब को 15 एमएएल तक भरें, फिर 1000 x g पर अपकेंद्री और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) बफर के 1 मिलील में पैलेट को एस्पिरेट करें और फिर से निलंबित करें। एक हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर पर कोशिकाओं की गणना करें।
  10. 1000 आरसीएफ पर फिर से सैंपल और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल को सेंट्रलाइज करें।
  11. FACS बफर के 0.5-1.0 x 106 कोशिकाओं/50 μL की अंतिम एकाग्रता के लिए FACS बफर की एक उचित मात्रा में अतिशयोक्ति और पीछे की ओर ।

3. प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी धुंधला

नोट: लेबल और उपयोग करने से पहले सभी आवश्यक FACS ट्यूबों ठंडा ।

  1. चूहे सीरम के 1 μL और एंटी माउस आईजीजी एंटीबॉडी के 2 μL नमूने के 50 μL, भंवर तुरंत, और 20 min के लिए बर्फ पर ब्लॉक जोड़ें ।
  2. प्रत्येक नमूने में उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें, तुरंत भंवर, और अंधेरे में 30 सीन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंटीबॉडी का चयन और मात्रा इस विशिष्ट तकनीक के अनुरूप पूर्व अनुकूलन पायलट प्रयोगों पर निर्भर करती है।
  3. 1000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए संक्षेप में भंवर और अपकेंद्री के साथ नमूने धोएं। इस कदम को दोहराएं 2x।
  4. FACS बफर के 250 μL में नमूनों को फिर से निलंबित करना, पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूबों को कवर करना, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटना, और विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें।
    नोट: भंडारण की लंबी अवधि के दौरान फ्लोरोसेंट सिग्नल के नुकसान के कारण प्रोटोकॉल को पूरा करने के घंटों के भीतर नमूनों का विश्लेषण करना आदर्श है। हालांकि, यदि बिल्कुल आवश्यक हो तो नमूनों का विश्लेषण 2-3 दिन बाद किया जा सकता है।

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Representative Results

एक भोली के मौखिक कुल्ला नमूनों से प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री डेटा(चित्रा 3ए)और सूजन(चित्रा 3बी)मूत्र मौखिक गुहा माध्यमिक लिगेचर-प्रेरित पीरियोगोंटाइटिस के लिए प्रदान की जाती है। एक स्थापित लिगेचर से पीएमएनएस की वसूली भी प्रदर्शित की जाती है(चित्रा 3सी)। फ्लो साइटोमीटर चैनल वोल्टेज मैन्युअल रूप से कैलिब्रेट किए गए थे, और मुआवजे को एकल-दाग मुआवजा मोतियों के साथ किया गया था। पीएमएनएस को Ly6G+ veF4/80-ve उल्लिखित गेटिंग रणनीति३८का उपयोग करके परिभाषित किया गया था । प्रत्येक मौखिक कुल्ला और लिगेचर नमूने से न्यूनतम 500 गेटेड पीएमएन घटनाओं का अधिग्रहण किया गया था। पीएमएन व्यवहार्यता को ट्राइपैन ब्लू धुंधला करके लगभग 37% होना निर्धारित किया गया था। अल्वेलर हड्डी के स्तर की प्रतिनिधि छवियां, जैसा कि अल्वेलर बोन क्रेस्ट (एबीसी) से स्वस्थ(चित्रा 4ए)और लिगाटेड चूहों(चित्र4बी)के लिए सीमेंटोनेमल जंक्शन (सीईजे) तक मापा जाता है। इन मापों(चित्रा 4सी)के बीच सापेक्ष अंतर प्रदान किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मोलर लिगेशन के लिए पशु स्थिति। }मिल्ली और मंडीबुलर चीरा लगाने पर हल्का कर्षण रखकर मंडलायुक्त को उदास स्थिति में रखकर मौखिक गुहा तक पहुंच प्राप्त की जाती है । (ख)सिर के आंदोलन को रोकने और मैक्सिला को अपेक्षाकृत क्षैतिज स्थिति में रखने के लिए खोपड़ी के नीचे गाज रखी जाती है। शरीर और पूंछ माइक्रोस्कोप के नीचे सर्जिकल चरण को स्थानांतरित करने से पहले गर्मी के नुकसान को रोकने के लिए कवर किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लिगेचर स्थापना की अनुक्रमिक तस्वीर। (A)सीवन की डिस्टल पूंछ दंत चिकित्सा के पाताल पक्ष पर तैनात है, और समीपस्थ खंड M2 और M3 के संपर्क के बीच डाला जाता है । (ख)सीवन तो M2 की buccal सतह के आसपास लपेटा जाता है तो M1 और M2 के संपर्क के बीच डाला । (ग)समीपस्थ सीवन खंड को समोच्च की ऊंचाई से नीचे एम 1 के चारों ओर लपेटा जाता है फिर एम 1 और एम 2 के संपर्क के बीच डाला जाता है। (D)सीवन के सिरों को सर्जन की गाँठ से बांधा जाता है और गाँठ के जितना संभव हो उतना करीब छंटनी की जाती है। गाँठ को मैक्सिलरी दंत चिकित्सा के पाताल पक्ष पर एम 1 और एम 2 के बीच गिंगिवल एम्ब्रेयर में रखा गया है। सभी तस्वीरों को मोलार दंत चिकित्सा के अबाधित दृश्य के साथ प्रक्रियात्मक कदम रिकॉर्ड करने के लिए विच्छेदित मैक्सिला पर अधिग्रहीत किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि FACS भूखंडों और गेटिंग रणनीति मौखिक न्यूट्रोफिल उपस्थिति का प्रदर्शन । न्यूट्रोफिल निम्नलिखित नमूनों से बरामद किए गए थे और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था:(ए)एक भोले माउस से मौखिक कुल्ला,(बी)मौखिक कुल्ला, और(सी)लिगेचर-प्रेरित पीरियोडोंटाइटिस (द्विपक्षीय) के साथ माउस से लिगेचर बरामद किया गया। प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति तितर बितर भूखंड ों को दिखाया गया है। सिंगल्स (एसएससी-एच एक्स एसएससी-डब्ल्यू और एफएससी-एच एक्स एफएससी-डब्ल्यू) और न्यूट्रोफिल (Ly6G +ve/F480-ve) दिखाए गए थे । संख्यात्मक मूल्य प्रत्येक द्वार के भीतर कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाते हैं। एसएससी-ए = साइड स्कैटर एरिया; एसएससी-डब्ल्यू = साइड स्कैटर चौड़ाई; एसएससी-एच = साइड स्कैटर ऊंचाई; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर एरिया; एफएससी-डब्ल्यू = आगे तितर बितर चौड़ाई; एफएससी-एच = आगे तितर बितर ऊंचाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: नियंत्रण और लिगाटेड जानवरों के बीच अल्वेलर हड्डी हानि अंतर। प्रतिनिधि तस्वीरें(ए)नियंत्रण और(बी)लिगाटेड चूहों के बीच अल्वेलर हड्डी हानि में अंतर का प्रदर्शन करते हैं। (C)एम 1 और एम 2 के मेसिओपलटाल और डिस्टोपलटाल लाइन कोणों के साथ-साथ सीमेंटोनेमल जंक्शन (सीईजे) से अल्वेलर बोन क्रेस्ट (एबीसी) तक माप, दिखाया गया है (मतलब ± एसईएम, एन = 3)। पी मूल्यों के बाद एक तदर्थ फिशर एलएसडी परीक्षण के साथ दो तरह से ANOVA द्वारा निर्धारित किया गया । (*पी एंड एलटी; 0.01; **पी एंड एलटी; 0.001; ***पी एंड एलटी;0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पेरिन लिगेचर-पेरिओन्टिस के प्रेरित मॉडल के उपयोग से जुड़ा सबसे महत्वपूर्ण तत्व बलिदान या जानबूझकर हटाने के समय तक लिगेचर की अवधारण के आसपास केंद्रित है। स्थापित बायोफिल्म-रिटेंटिव लिगेचर 11-16 दिन की अवधि39के बीच कम से 6 दिनों में अल्वेलर हड्डी की ऊंचाई के महत्वपूर्ण नुकसान को प्रेरित करने में सक्षम है। हड्डी के नुकसान की अधिकतम अवधि से पहले पशु विषयों का बलिदान करने का निर्णय, यह लिगाचर-प्रेरित पीरियोटोंटाइटिस का एक बहुत छोटा मॉडल प्रतिपादन, समय से पहले लिगामेंट एवल्शन की घटनाओं को और कम करने के लिए चुना गया था, जिसे बलिदान के समय से पहले लिगेचर के नुकसान के रूप में परिभाषित किया गया था, जो पशु गैर-नैदानिक प्रदान करता है।

इस मॉडल का सबसे अधिक उद्धृत नुकसान मूत्र मोलर दंत चिकित्सा के लघु आयामों के कारण लिगेचर स्थापित करने की कथित तकनीकी कठिनाई पर प्रकाश डालता है, जो 4.4 मिमी (एम 1) से 2.6 मिमी (एम 3)40तक परिधि में है। इस मुद्दे को लिगेचर इंस्टॉलेशन के लिए सर्जिकल स्टाफ/प्रशिक्षुओं की भागीदारी के माध्यम से कम किया जा सकता है, जिसके लिए (सबसे कम) 10 मिनट/पशु की आवश्यकता होती है और इसमें संज्ञाहरण की डिलीवरी शामिल है । इसके अलावा, लिगेचर का प्लेसमेंट पुनरावृत्ति के माध्यम से महारत हासिल करने वाला कौशल है, और यह कई आम प्रयोगशाला-आधारित तकनीकों की तुलना में अधिक गहन नहीं है जिसके लिए मैनुअल निपुणता की एक ऊंचा डिग्री की आवश्यकता होती है। प्रक्रियात्मक दृष्टिकोण से, इंट्रापेरिटोनियल संज्ञाहरण का उपयोग लिगेचर स्थापना की सुविधा के लिए व्यापक समय प्रदान करता है। यदि आवश्यक हो, तो यह किसी भी लिगेचर के प्रतिस्थापन की अनुमति देता है जो संतोषजनक तरीके से स्थापित नहीं किए जाते हैं, क्योंकि एम 1 और एम 2 के संपर्क के बीच गिंगिवल सल्कस और गाँठ के लिए सीवन का स्थानीयकरण प्रतिधारण के लिए आदर्श है।

इन प्रोटोकॉल के प्रस्तावित संशोधन, जो या तो 1) एक ही मोलर के एक परिचारक सीवन या 2 का उपयोग कर के लिगेशन के लिए कहते हैं) मोलर दंत चिकित्सा के एक संपर्क के बीच रखा सीवन का एक रैखिक खंड, कई लाभ प्रदान करता है । तकनीकी नजरिए से, प्रोटोकॉल उन उपकरणों का उपयोग करता है जो या तो आसानी से उपलब्ध हैं या पहले से मौजूद उपकरणों से आबे और हाजीशेंगलिस के समान तरीके से निर्माण किया जा सकता है। यह 3डी प्रिंटिंग33द्वारा विशेष आदेशों या उपकरणों के निर्माण की आवश्यकता का निराकरण करता है । एक सर्जन की गाँठ है कि जीभ से परेशान नहीं किया जा सकता है कि कई दांतों के आसपास एक सतत रेशम सीवन गोफन की स्थापना भी लिगेचर प्रतिधारण में सुधार हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के दौरान, मार्चेसन एट अल द्वारा प्रस्तावित तकनीक की तुलना में, जिसमें 20% तक के नुकसान का अनुमान है, समय से पहले लिगेचर एवल्शन36का पूर्ण अभाव था। हालांकि अबे और हाजीशेंगलिस द्वारा लिगेचर लॉस की घटनाओं का सीधा आकलन नहीं किया गया था, लेकिन इस तकनीक को कई अध्ययनोंमें 41,42, 43,44में लागू किया गया है । तकनीकी नजरिए से, लिगाटेड जानवरों में आयट्रोजेनिक सॉफ्ट टिश्यू क्षति से बचा गया था। इस घटना में योगदान करने वाले कारकों में माइक्रोस्कोप के माध्यम से मौखिक गुहा का निरंतर अवलोकन, संदंश के सुझावों का निरंतर दृश्य, और प्लेसमेंट के दौरान सीवन के फिसलने से रोकने के लिए स्वच्छ संदंश का उपयोग शामिल है।

मौखिक गुहा के भीतर, सीवन सामग्री के विस्तारित खंड ों में भी नाटकीय रूप से विश्लेषण के लिए उपलब्ध रोगग्रस्त ऊतकों की मात्रा में वृद्धि होती है और इसके परिणामस्वरूप पशु उपयोग में उल्लेखनीय कमी हो सकती है। इसका कारण यह है कि सभी विषयों को विश्लेषण में शामिल किया जा करने में सक्षम हैं, और ऊतक की पूलिंग और कुल्ला नमूनों की आवश्यकता नहीं है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रभावित ऊतक क्षेत्रकोबढ़ाने के लिए पहले बताई गई तकनीकों का उपयोग करते हुए कॉन्ट्रालेटरल मैक्सिलरी मोलर दंत चिकित्सा को उत्पन्न करना संभव है । हालांकि, यह संशोधन उन मामलों में संभव नहीं है जहां एक स्प्लिट-माउथ डिजाइन की आवश्यकता होती है, इस नए प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए समर्थन उधार देना। अंत में, पिछले लिगेचर-प्रेरित पीरियोटोंटाइटिस प्रोटोकॉल के समान, इस तकनीक का उपयोग 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों तक सीमित नहीं है। प्रायोगिक डिजाइन के आधार पर बड़ी उम्र के चूहे, या तो सेक्स और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि स्वीकार्य हो सकते हैं।

दुर्भाग्य से, इस मॉडल में अभी भी कुछ तकनीकी और पद्धतिगत गलतियां हैं। ऊपर विस्तृत रूप से विशिष्ट रोगजनक मुक्त चूहों का उपयोग मानव पीरियोडोंटाइटिस की प्रगति की नकल नहीं कर सकता। यह उनके कॉमेसल मौखिक बायोफिल्म्स की संरचना के बीच कई मतभेदों के कारण है, जो बैक्टीरिया-बैक्टीरिया और बैक्टीरिया-होस्ट इंटरैक्शन45के मूल्यांकन की बाहरी वैधता को सीमित करता है। यह सैद्धांतिक रूप से रोगाणु मुक्त चूहों के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है, जो प्रोटोकॉल को काफी जटिल बनाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त प्रयासों और संसाधनों की आवश्यकता होती है कि आवास और शल्य चिकित्सा हेरफेर के दौरान पशु विषय रोगाणु मुक्त रहें। पीरियोडोंटाइटिस विकसित करने के लिए आगे के उपाय भी किए जाने चाहिए, क्योंकि ये चूहे बैक्टीरियल संचय46,47के अभाव में लिगेचर-प्रेरित पीडी के प्रतिरोधी हैं।

इसके अलावा, मोनो-इंफेक्शन और सह-संक्रमण लिगेचर मॉडल मानव स्थिति को फिर से तैयार करने से कम हो जाते हैं, क्योंकि पीरियोडोन्टल रोग बायोफिल्म और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच अधिक जटिल पॉलीमाइक्रोबियल बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है। इन परिस्थितियों में, मानव मौखिक बैक्टीरिया की एक सीमित संख्या के बीच भूमिकाओं को स्पष्ट करना, और संभावित रूप से हानिकारक माना जा सकता है, विशेष रूप से पीरियोडोंटियम इम्यूनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के संदर्भ में।

अंत में, हाल के सबूतों ने इस बात को फंसाया है कि मैस्टिकेशन की ताकतें टी हेल्पर 17 कोशिकाओं के संचय के माध्यम से गिंगवल इम्यूनोससर्विलांस को संशोधित करने में सक्षम हैं, जो बाधा प्रतिरक्षा48का एक अभिन्न मध्यस्थ है। जैसे, एक नरम आहार का उपयोग, विशेष रूप से पुराने जानवरों में, एक संभावित confounder कार्य कर सकते हैं । इससे उन क्षेत्रों में सामान्य शारीरिक हड्डी हानि की संभावना कम हो सकती है जहां लिगेचर लागू किए गए हैं। इस साक्ष्य के आलोक में, वृद्ध पशुओं और उचित आयु-मिलान नियंत्रणों के उपयोग पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए जहां इन निष्कर्षों को सबसे प्रमुख माना गया है ।

इस अपेक्षाकृत सरल मॉडल का उपयोग माइक्रो-कंप्यूट टोमोग्राफी, अल्वेलर हड्डी और आसपास के संलग्न जिंगिवा दोनों के इतिहासिक विश्लेषण, और मौखिक माइक्रोबायोटा लक्षण वर्णन का मूल्यांकन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिनमें से सभी मौजूदा लिगाचर-प्रेरित पीडी मॉडल33,49के साथ पूरा किया गया है। हालांकि शायद ही कभी चर्चा या उपयोग किया जाता है, उपचार के प्रभावों का आकलन करना भी संभव है, (साथ ही साथ लिगेचर-प्रेरित मूत्र पीरियोडोंटाइटिस की स्थापना में) ठीक-बिंदु किरच संदंश39के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत लिगेचर को हटाकर। अंत में, इस मॉडल का उपयोग एक से अधिक दांतों के लिगेशन के कारण बढ़ते भड़काऊ भार के कारण पीरियोडोन्टल रोग के प्रणालीगत प्रभावों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, साथ ही यदि वांछित हो तो बाएं और दाएं अधिकतम मोलरी मोलर दंतचिकित्सा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जे डब्ल्यू सी कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (CIHR) द्वारा समर्थित है । लेखक ट्राइपैन ब्लू धुंधला प्रदर्शन में उनकी सहायता के लिए डॉ चुनजियांग सन का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 155 पीरियोडोंटाइटिस लिगेचर गिंगिवा पीरियोडोंटियम अल्वेलर बोन एनिमल मॉडल फ्लो साइटोमेट्री न्यूट्रोफिल इम्यूनोलॉजी सूजन
ओरल न्यूट्रोफिल्स के मूल्यांकन के लिए मोनी पेरिन पीरियोडोंटाइटिस का मजबूत लिगेचर-प्रेरित मॉडल
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Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust … More

Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

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