Summary
Denne artikel præsenterer en protokol til etablering af en ligatur-induceret model af murine parodontitis involverer flere maxillær molars, hvilket resulterer i større områder af de involverede gingival væv og knogler til efterfølgende analyse samt reduceret dyre brug. En teknik til at vurdere orale neutrofiler på en måde, der svarer til forsøgspersoner, er også beskrevet.
Abstract
De vigtigste fordele ved at studere Patofysiologi af Periodontal sygdom udnytter murine modeller er de reducerede udgifter til dyr, vifte af genetisk modificerede stammer, det store antal analyser, der kan udføres på høstede bløde og hårde væv. Mange af disse systemer er imidlertid genstand for en proceduremæssig kritik. Alternativt kan den ligatur-inducerede model for Periodontal sygdom, der drives af lokal udvikling og fastholdelse af et dysbiotisk oralt mikrobiom, anvendes, hvilket hurtigt induceres og er relativt pålideligt. Desværre, varianterne af ligatur-induceret murine parodontitis protokol er isoleret til fokale regioner af periodontium og underlagt for tidlig avulsionsfrakturer af den installerede ligatur. Dette minimerer mængden af væv til rådighed for efterfølgende analyser og øger antallet af dyr, der kræves for undersøgelse. Denne protokol beskriver de præcise manipulationer, der kræves for at placere udvidede molære ligaturer med forbedret fastholdelse og brug af en ny skylle teknik til at inddrive orale neutrofiler i mus med en alternativ tilgang, der mindsker ovennævnte tekniske udfordringer.
Introduction
Periodontal disease (PD) er en osteolytisk tilstand forbundet med signifikant vært sygelighed og økonomiske byrde, som er manifesteret ved gingival betændelse og tab af både blødt væv vedhæftet fil og ossøse støtte til den berørte tandsæt1,2,3,4. Denne proces styres af interaktioner mellem den orale mikrobiota og det medfødte immunsystem af værten. Det er også forbundet med forværring af andre systemiske inflammatoriske sygdomme, herunder diabetes, hjerte-kar-sygdom, og kræft5,6,7,8. Historisk set var det en hypotese, at PD patogenesen er afhængig af store mængder af specifikke bakterier såsom Porphyromonas gingivalis9. Nylige beviser tyder imidlertid på, at den mikrobielle bestanddel af PD er medieret af Dental biofilm. Biofilm er et organiseret, komplekst fællesskab af talrige mikroorganismer, der kan eksistere i sunde symbiotiske og destruktive dysbiotiske tilstande10,11. Den orale biofilm giver normalt resistens over for værten ved at forhindre etablering af Foci af patogene bakterier og fremmer ideelle gingival væv struktur og funktion gennem regulering af værten immunrespons12,13. Perturbationer af det ækvibriske forhold mellem kommensal organismer i mundhulen og værts immunsystemet kan føre til ændringer i vævs homøostase, hvilket resulterer i dysbacteriosis og udvikling af kendetegnende kliniske og radiografiske optrædener af PD5,10,12,13,14.
Interessant, etablering af en mundtlig dysbacteriosis, mens det er nødvendigt for initiering af PD, er ikke tilstrækkelig til at drive PD i alle individer, glemt mod evnen af værten immunrespons til at undergrave overgangen af mikrobiota mellem symbiotiske og dysbiotiske stater15. Dette placerer et særligt fokus på de midler, hvorigennem PD påvirker en af de førende tegn i det medfødte immunsystem, nemlig polymorphonukleen granulocyt (PMN), eller neutrofile, fra lokale og systemiske perspektiver16,17.
Hos mennesker rekrutteres Pmn'er fra cirkulationen med en hastighed på ~ 2 x 106 celler/h i sunde parodontal bindevæv, hvor de er den dominerende leukocyt population. Her er de efterfølgende bortvist fra gingival sulcus i mundhulen som en bestanddel af gingival crevicular væske. I nærværelse af PD, neutrofili manifesterer inden for cirkulation og mundhulen, hvor disse Effector celler besidder en hyperinflammatorisk fænotype, der fører til ovennævnte ødelæggelse af periodontium17,18,19,20,21,22. Derfor er forståelse af PMNs rolle i PD og andre systemiske inflammatoriske tilstande af yderste vigtighed.
Selv om det er almindeligt anerkendt, at kroniske sygdomme er gensidigt forbundet med PD, er de underliggende mekanismer endnu ikke belyst, hvilket bidrager til vanskeligheder med håndteringen af disse morbid og potentielt dødelige systemiske tilstande. Flere eksperimentelle dyremodeller, hver med unikke fordele og ulemper, er blevet udnyttet til at studere Patofysiologi af PD23,24. Fokus specifikt på murine modeller, der er en række protokoller, hvorigennem undersøgelsen af PD lettes; men de besidder flere tekniske og fysiologiske mangler25,26,27,28,29,30,31.
Første, den orale sonde musemodel kræver talrige orale vaccinationer af humane Periodontal patogener til at generere gingival inflammation og knogletab. Derudover, det er generelt forud for en periode med antibiotisk behandling til at undergrave murine kommensal oral flora25. Denne model kræver ofte specialiseret træning til sikkert at udføre den orale sonde, bruger kun en lille brøkdel af Periodontal patogener fra det mere komplekse humane orale mikrobiom, og kræver flere måneder til at etablere alveolært knogletab.
I modsætning hertil anvender kemisk inducerede murine modeller oral levering af trinitrobenzen sulfonsyre (TNB'ER) eller dextran sulfat natrium (DSS), agenter, der almindeligvis anvendes til at etablere murine-modeller af colitis over en periode på flere måneder for at inducere Periodontal knogletab26. Intraorale og ekstra abscess-baserede modeller er tilgængelige, som involverer murine-incisorer og væv i dorsum samt calvarium, hhv. I den tidligere byld model, flere injektioner af bakterier administreres, skabe flere gingival abscesser og en mangel på alveolær knogletab, begrænse deres anvendelse i studiet af PD. Sidstnævnte byld modeller er betydeligt mere tilbøjelige til at studere bakteriel virulens, inflammation, og knogleresorption på steder uden for mundhulen, som eliminerer evaluering af periodontium og orale mikrobiom27,28,29,30,31.
Ved hjælp af ligatur-induceret model af periodontitis, en flettet silke sutur er almindeligt blevet installeret omformet omkring den anden Molar. Alternativt kan der indsættes et enkelt lineært segment af suturmateriale mellem første og anden molarer32,33. Målet med ligatur placeringen er at lette bakterie ophobning og generere dysbiosis i gingival sulci, resulterer i Periodontal væv betændelse og ødelæggelse af væv komponere periodontium. Mest bemærkelsesværdigt, denne model er i stand til at producere betydeligt mere alveolært knogletab i forhold til de mere almindeligt anvendte oral sonde model34. Yderligere komplicere brugen af oral sonde model er den naturlige modstand af flere stammer af mus (dvs., C57BL/6) til at udvikle alveolær knogletab. Dette er også problematisk, da denne stamme er den hyppigst anvendte i murine-baseret dyreforskning35.
De eksisterende procedurer beskrevet af marchesan et al. og abe og hajishengallis blev udtænkt for at forenkle den tekniske handling med at placere ligatur33,36. Desværre kræver den tidligere protokol specialiseret 3D-printet udstyr og besidder potentialet for for tidligt ligatur tab, hvilket øger dyrenes brug og omkostningerne forbundet med ekstra tid tilbragt i operationsstuen. Desuden genererer begge protokoller kun små områder af det syge periodontium, der er til rådighed til en undersøgelse.
De fordele, der ligger med denne teknik er jordet i den samtidige undersøgelse af oral dysbiosis og Immunologi, der regulerer periodontium, udnyttelse af lavpris dyr med forskellige genetiske baggrunde, og enkle boliger og opdrætspraksis. Som sådan bør målene være at maksimere mængden af sygt væv og, i forsøget på at praktisere principperne for reduktion af dyreforsøg, reducere dyre forbruget til et niveau så lavt som muligt. Dette kræver, at alle dyr kan indgå i eksperimentelle analyser37. Men, det skal bemærkes, at uanset hvilken dyremodel af Periodontal sygdom udnyttes, der er ingen enkelt model, der omfatter alle elementer af menneskelig PD patofysiologi.
Denne nye protokol beskæftiger placeringen af en ligatur omkring flere maxillær Molar tænder ved hjælp af instrumentering og materialer, der findes inden for de fleste laboratorier. Det giver en tilstrækkelig mængde tid til nemt og trygt at installere en ligatur, der er usandsynligt at avulse for tidligt. Endelig, som PMNs koordinere ødelæggelse af periodontium i PD, en ny metode til at inddrive orale neutrofiler på en måde svarende til mennesker er også præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle murine undersøgelser overholdt de relevante etiske regler og blev godkendt af University of Toronto Animal Care udvalg og Forskningsetiske Råd (protokol 20011930).
1. montering af ligatur
Bemærk: Dette er en ikke-steril kirurgisk procedure, der kan udføres i en standard Operations Theater. Brugen af kimfri dyr (ikke dækket her) mandater håndtering i en biosikkerhed kabinet, brug af sterile instrumenter, og inokulering af mundhulen med Periodontal patogener til at forårsage de kliniske manifestationer af periodontitis.
- Indgiv intraperitoneal anæstesi til 8 – 12 uger gamle mandlige C57BL/6 mus, som skal akklieres til deres bolig anlæg, ved hjælp af en 0,5 "26 G steril hypodermic nål og 1 mL sprøjte i henhold til godkendte institutionelle dyrepasning og brug Komité (IACUC) retningslinjer.
Bemærk: en kombination af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) anæstetika hurtigt og pålideligt inducerer passende niveau af anæstesi i varigheden af proceduren. - Vurder anæstetikdybden før og hver 15 min under proceduren, som det fremgår af tabet af pedal refleksen.
- Placer musen på en opvarmet kirurgisk platform (figur 1a). Stabilisere kæben og mandiblen i åben stilling ved hjælp af elastiske bånd og prop halsen med en bomulds rulle for at hjælpe med at opretholde kæben i en mere horisontal orientering (figur 1B). Dæk krop og hale af dyret for at afbøde varmetab under proceduren.
- Placer det kirurgiske mikroskop ved den ønskede forstørrelse og belysning (hvis det ikke er monteret direkte til mikroskopet) over mundhulen for visualisering af dentiteten. Mens den ønskede forstørrelse er operatør afhængig, opnås optimal visualisering af mundhulen ved 16x.
- Installer en steril 5-0 flettet silke sutur omkring den første (M1) og anden (m2) maxillær molarer inden for gingival sulcus ved hjælp af Splinter pincet.
Bemærk: flettet silke suturer af en mindre måler kan bruges til dette formål for at lette hurtigere installation og reducere muligheden for iatrogene bløddelsskader.- Placer den distale hale af suturen på den palatal side af tandets og Indsæt det proksimale segment mellem kontakten på m2 og M3 (figur 2A).
- Wrap suturen omkring den buccale overflade af m2 og indsætte det mellem kontakten af M1 og m2. Sørg for, at begge ender af suturen trækkes stramt for at føre suturen ind i gingival sulcus og fjerne alle slæk (figur 2B).
- Wrap det proximale sutur segment omkring M1, under dets højde af kontur, og indsætte det mellem kontakten af M1 og m2. Træk den proksimale hale af suturen stramt for at føre suturen ind i gingival sulcus og fjern alt slæk (figur 2C).
Bemærk: Hvis der observeres modstand ved indsættelse af suturen mellem M1 og m2 eller m2 og M3, kan kontakten være åben en anelse ved hjælp af en standard tandlæge. - Binde enderne af suturen med en kirurgens knude og trim haler så kort som muligt. Knude i gingival embrasure mellem M1 og m2 på den palatal side af maxillær tandsæt (figur 2D).
Bemærk: trin 1.4.1-1.4.4 kan gentages på den kontralaterale side, hvis det er nødvendigt. - Steriliser de kirurgiske instrumenter i en varm glasperle sterilisator mellem hvert dyr emne.
Forsigtig: spidsen af pincet er ekstremt skarpe og kan nemt forårsage orale traumer og signifikant blødning. Forbered små segmenter af gaze for at fjerne blod fra mundhulen og anvende tryk til aktivt at bløde sår.
- Efter ligatur installation, fjerne musen fra det kirurgiske apparat, sted i en ren bur under en varmelampe og Monitor, indtil fuldt genvundet.
- Individuelt huse hver mus med passende miljømæssig berigelse og tillade ad libitum adgang til filtreret vand og mosede standard Chow i et temperatur-og fugtigheds kontrolleret miljø (12-h lys/12-h mørk cyklus) i 7 – 11 dage.
Bemærk: mosede Chow nedsætter de kræfter, der kræves for masement og derved reducere smerter forbundet med fodring, og aids i at forhindre for tidligt tab af den installerede ligatur.
2. indsamling af prøver
- Euthanize mus i henhold til de godkendte IACUC retningslinjer.
Bemærk: individuel eutanasi ved hjælp af et CO2 kammer efterfulgt af livmoderhals dislokation er den foretrukne metode til denne protokol. Dette kan ændres afhængigt af eksperimenter, der kræver høst af yderligere væv. - Ved hjælp af en pipette skylles mundhulen straks med 100 μL steriliseret 4 °C 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) uden calcium og magnesium i 10 s.
- Gentag trin 2,2 2x og Placer hver skylning i et enkelt 15 mL konisk polypropylen-sterilt prøveglas.
- Overfør indholdet til et 50 mL konisk polypropylen sterilt reagensglas ved at køre dem gennem et 40 μm nylon mesh-filter.
- Dette indhold overføres til et nyt 15 mL konisk, sterilt prøveglas af polypropylen.
Bemærk: den endelige overførsel af prøven til et mindre rør giver mulighed for forbedret visualisering af den cellulære pellet i de kommende trin.- Hvis det ønskes, fjernes molære ligatur (r) og placeres i 300 μL steriliseret 1x PBS (4 °C, uden calcium og magnesium) i en separat 15 mL konisk polypropylen steril test tube. Rystes forsigtigt og fjern suturen fra røret. Denne prøve behandles identisk med den orale skylle prøve fra dette punkt fremad.
- Tilsæt 33,3 μL 16% PARAFORMALDEHYD (PFA) for at lette prøve fiksering.
- Hvirvel prøverne straks og inkubere på is i 15 min.
- Fyld røret til 15 mL med 1x PBS for at fortynde PFA, derefter centrifugeres ved 1000 x g og 4 °c i 5 min.
- Du aspirerer supernatanten og opslæmmer pellet i 1 mL fluorescens-aktiverede celle sorterings buffer (FACS) ved 4 °C. Tæl celler på en hemocytometer eller automatiseret celle tæller.
- Prøven centrifugeres igen ved 1000 RCF og 4 °C i 5 minutter.
- Du aspirerer supernatanten og opslæmmer pellet i en passende mængde FACS buffer for en endelig koncentration på 0,5 – 1,0 x 106 celler/50 ΜL FACS buffer.
3. antistof farvning for flow cytometrisk analyse
Bemærk: etiketten og chill alle nødvendige FACS rør før brug.
- Tilsæt 1 μL rotte serum og 2 μL anti-muse-IgG-antistoffer til 50 μL af prøven, vortex straks, og Bloker på is i 20 min.
- Tilsæt de relevante antistoffer til hver prøve, vortex straks, og inkubere på is i 30 minutter i mørket.
Bemærk: udvælgelse og volumen af antistoffer afhænger af forudgående optimering pilot eksperimenter skræddersyet til denne specifikke teknik. - Prøverne vaskes med 1 mL FACS-buffer, som kortvarigt hvirfler op og centrifugerer i 5 minutter ved 1000 x g og 4 °c. Gentag dette trin 2x.
- Resuspension prøver i 250 μL af FACS buffer, Cover rør med paraffin film, wrap i aluminiumsfolie, og hold ved 4 °C indtil analyse.
Bemærk: det er ideelt at analysere prøver inden for timer for at fuldføre protokollen på grund af tabet af fluorescerende signal under lange opbevaringsperioder. Men, prøver kan analyseres 2 – 3 dage senere, hvis absolut påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative flow cytometri data fra orale skylle prøver af en naiv (figur 3a) og betændset (figur 3B) murine mundhulen sekundær til ligatur-induceret parodontitis er tilvejebragt. Der påvises også genoprettelse af Pmn'er fra en installeret ligatur (figur 3C). Flow flowcytometer kanal spændinger blev kalibreret manuelt, og kompensation blev udført med enkelt plettet kompensation perler. PMNs blev defineret som Ly6G+ veF4/80-ve ved hjælp af den skitserede gating-strategi38. Der blev opnået mindst 500 gated PMN-hændelser fra hver oral skylle-og ligatur prøve. PMN-levedygtigheden var fast besluttet på at være ca. 37% af trypan og et Blue-farvning. Repræsentative billeder af alveolære knogle niveauer målt fra alveolært knogle emblem (ABC) til cementoenamel Junction (CEJ) for raske (figur 4A) og Ligerede mus (figur 4B). De relative forskelle mellem disse målinger (figur 4C) er angivet.
Figur 1: placering af dyr til molær ligation. A) adgang til mundhulen opnås ved at holde mandiblen i en nedtrykket position ved at placere mild trækkraft på det maxillære og mandibulære fortand dentition. B) gaze anbringes under kraniet for at forhindre bevægelse af hovedet og placere kæben i en relativt horisontal position. Kroppen og halen er dækket for at forhindre varmetab før du flytter Operations stadiet under mikroskopet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sekventiel fotografi af ligatur installation. A) suturens distale hale er anbragt på den palatal side af tandprodu teten, og det proximale segment indsættes mellem kontakten mellem m2 og M3. B) suturen viklet rundt om den bukkatiske overflade på m2 og indsættes mellem M1-og m2-kontakten. C) det proksimale sutur segment er indpakket omkring M1 under dets højde af kontur og derefter indsat mellem kontakten M1 og m2. (D) enderne af suturen er bundet med en kirurg knude og trimmet så tæt som muligt på knude. Knude er placeret i gingival embrasure mellem M1 og m2 på den palatal side af maxillær dentition. Alle fotografier blev erhvervet på dissekeret kæben til optagelse af proceduremæssige skridt med en uhindret udsigt over Molar dentition. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative FACS-plot og gating-strategi, som viser oral neutrofiltilstede værelse. Neutrofiler blev genvundet fra følgende prøver og vurderet ved flowcytometri: (A) oral skylning fra en naiv mus, (B) oral skylning, og (C) genvundne ligaturer fra en mus med ligatur-induceret parodontitis (bilateralt). Repræsentative gating strategi scatterplots er vist. Singlets (SSC-H x SSC-W og FSC-H x FSC-W) og neutrofiler (Ly6G+ ve/F480-ve) blev indhegnet som vist. Numeriske værdier afspejler procentdelen af celler i hver port. SSC-A = side scatter område; SSC-W = side scatter bredde; SSC-H = side scatter højde; FSC-A = fremadgående punkt område; FSC-W = fremadgående scatter bredde; FSC-H = fremad scatter højde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: alveolær knogletab forskelle mellem kontrol og ligerede dyr. Repræsentative fotos, der påviser forskelle i alveolært knogletab mellem (A) kontrol og (B) ligerede mus. C) målinger fra cementoenamel Junction (cej) til alveolær knogle emblem (ABC) sammen med de mesiopalatale og distopalatal linje vinkler på M1 og m2 vises (gennemsnit ± SEM, n = 3). P-værdier blev bestemt af to-vejs ANOVA med en post-hoc Fishers LSD-test. (* p < 0,01; * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske element i forbindelse med brugen af murine ligatur-induceret model af parodontitis er centreret omkring fastholdelse af ligatur indtil tidspunktet for offer eller forsætlig fjernelse. Den installerede biofilm-retentive ligatur er i stand til at inducere et betydeligt tab af alveolær knogle højde i så få som 6 dage, plateauing mellem den 11 – 16 dages periode39. Beslutningen om at ofre dyremotiver før den maksimale periode af knogletab, hvilket gør dette til en meget kortere model af ligatur-induceret periodontitis, blev udvalgt til yderligere at reducere forekomsten af tidlig ligatur avulsion, defineret som tabet af ligatur før tidspunktet for offer, som bevirker, at dyret ikke-diagnostisk.
Den hyppigst citerede ulempe ved denne model fremhæver den opfattede tekniske vanskelighed ved at installere ligatur på grund af de minimale dimensioner af murine Molar dentition, som spænder i omkreds fra 4,4 mm (M1) til 2,6 mm (m3)40. Dette problem kan afbøes gennem involvering af kirurgisk personale/praktikanter for ligatur installation, som kræver (højst) 10 min/dyr og omfatter levering af anæstesi. Desuden er placering af ligatur en færdighed mestrer gennem gentagelse, og det er ikke mere intensiv end mange fælles Lab-baserede teknikker, der kræver en forhøjet grad af manuel fingerfærdighed. Fra et proceduremæssigt synspunkt, brugen af intraperitoneal anæstesi giver omfattende tid til at lette ligatur installation. Hvis det er nødvendigt, det giver også mulighed for udskiftning af alle ligaturer, der ikke er installeret på en tilfredsstillende måde, som lokalisering af suturen til gingival sulcus og knude mellem kontakt af M1 og m2 er ideel til fastholdelse.
De foreslåede ændringer af disse protokoller, som kræver enten 1) ligering af en enkelt Molar ved hjælp af en circumferentiel sutur eller 2) en enkelt lineær segment af sutur placeret mellem en enkelt kontakt af Molar dentition, giver flere fordele. Ud fra et teknisk synspunkt anvender protokollen udstyr, der enten er let tilgængeligt eller kan konstrueres fra allerede eksisterende udstyr på samme måde som abe og Hajishengallis. Dette forebygger behovet for specialordrer eller fremstilling af udstyr ved 3D-udskrivning33. Installationen af en kontinuerlig silke sutur slynge rundt flere tænder sikret med en kirurgens knude, der ikke kan forstyrres af tungen kan også forbedre ligatur retention.
I løbet af denne protokol, sammenlignet med den teknik, der er foreslået af Marchesan et al. i hvilke tab på op til 20% forventes, var et fuldstændigt fravær af for tidlig ligatur avulsionsfrakturer36. Mens forekomsten af ligatur tabet ikke blev vurderet direkte af abe og hajishengallis, er teknikken blevet anvendt i en række undersøgelser41,42,43,44. Fra et teknisk synspunkt blev der undgået iatrogene bløddelsskader i ligerede dyr. Faktorer, der bidrager til dette fænomen omfatter en kontinuerlig observation af mundhulen gennem et mikroskop, konstant visualisering af spidser af pincet, og brug af rene pincet for at forhindre glider ud af suturen under placering.
Inden for mundhulen, de aflange segmenter af suturmateriale også dramatisk øge mængden af syge væv til rådighed for analyse og kan resultere i en markant fald i brugen af dyr. Dette skyldes, at alle er i stand til at indgå i analysen, og pooling af væv og skylle prøver er ikke påkrævet. Det skal bemærkes, at det er muligt at ligere den kontralaterale maxillær Molar tandsæt udnytter de tidligere rapporterede teknikker til at øge det berørte vævs område41. Denne ændring er dog ikke mulig i tilfælde, hvor der er behov for et design med delt mund, som støtter anvendelsen af denne nye protokol. Endelig, beslægtet med de tidligere ligatur-induceret parodontitis protokoller, brug af denne teknik er ikke begrænset til 8 – 12 uge-gamle mandlige C57BL/6 mus. Mus af ældre alder, enten køn, og forskellige genetiske baggrunde kan være acceptabelt afhængigt af eksperimentel design.
Desværre er denne model stadig besidder nogle tekniske og metologiske fejl. Brugen af specifikke patogenfrie mus som beskrevet ovenfor kan ikke efterligne progression af human periodontitis. Dette skyldes flere forskelle mellem sammensætningen af deres kommensal orale biofilms, som begrænser den eksterne gyldighed af at evaluere bakterier-bakterier og bakterier-vært interaktioner45. Dette kan teoretisk begrænses ved brug af kimfri mus, hvilket komplicerer protokollen betydeligt. Der er behov for yderligere indsats og ressourcer for at sikre, at dyre forsøgspersoner forbliver kimfri under opstaldning og kirurgisk manipulation. Yderligere foranstaltninger skal også iværksættes for at udvikle periodontitis, da disse mus er resistente over for ligatur-induceret PD i fravær af bakterie ophobning46,47.
Desuden, mono-infektion og co-infektion ligatur modeller ikke er i stand til at rekapitulere den menneskelige tilstand, som Periodontal sygdom repræsenterer en mere kompleks polymikrobiel interaktion mellem biofilm og vært immunsystem. Under disse omstændigheder, belyse roller og interaktioner mellem et begrænset antal humane orale bakterier kan betragtes som mangelfuld og potentielt ufordelagtigt, især i forbindelse med studiet af periodontium immunobiologi.
Endelig, nylige beviser har impliceret, at de kræfter af masement er i stand til at ændre gingival immun overvågning gennem ophobning af T Helper 17 celler, en integreret mægler af barriere immunitet48. Som sådan, brug af en blød kost, især i ældre dyr, kan handle en potentiel confounder. Dette kan reducere potentialet for det normale fysiologiske knogletab i områder, hvor ligaturer er blevet anvendt. I lyset af disse oplysninger bør der tages nøje hensyn til brugen af aldersfordelte dyr og passende alders matchede Kontroller, hvis disse fund er blevet konstateret at være mest fremtrædende.
Brugen af denne relativt simple model kan udvides til at evaluere alveolært knogletab ved mikro-computertomografi, histologiske analyser af både den alveolære knogle og omgivende fastgjort gingiva, og gennemføre oral mikrobiota karakterisering, som alle er blevet udført med de eksisterende ligatur-induceret PD modeller33,49. Selv om det sjældent diskuteres eller udnyttes, er det også muligt at vurdere virkningerne af behandlingen, (samt reparation og regenerering af periodontium) i fastsættelsen af ligatur-induceret murine parodontitis ved at fjerne ligatur under generel anæstesi med fine-punkt Splinter pincet39. Endelig kan brugen af denne model udvides til at studere de systemiske virkninger af Periodontal sygdom på grund af den øgede inflammatoriske belastning forårsaget af ligationen af mere end én tand, samt venstre og højre maxillær Molar dentition, hvis det ønskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
J. W. C. støttes af de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR). Forfatterne vil gerne takke Dr. Chunxiang Sun for hendes hjælp til at udføre trypan og et blå farvning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W.
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D.
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P.
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A.
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P.
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
